CN105997938A - 一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，制备方法及其应用 - Google Patents

一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡；载siRNA微泡为PLGA包裹siRNA微泡；载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡混合物。载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡的混合物。其制备方法包括载紫杉醇微泡的制备及载siRNA微泡的制备。本发明将其应用于制备抑制宫颈癌的药物上。实验表明超声介导载紫杉醇及载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞分别有一定的抑制作用，两者联合应用，其协同抑制宫颈癌Caski细胞增殖的效果更好。

Description

一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，制备方法及其应用
技术领域
本发明提供一种利用超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡联合靶向抑制宫颈癌的技术方案，属于生物医药领域。
背景技术
据世界卫生组织国际癌症研究署(International Agency forResearch on Cancer，IARC)统计，宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，全球宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，占所有女性恶性肿瘤的13％。有调查统计，我国的宫颈癌发病率为12.96/10万，死亡率为4.32/10万，呈明显增长趋势。目前,宫颈癌的传统治疗方式主要有手术治疗、放疗、化疗等，但这些治疗方法均存在着相对的不足。
近年来，有学者通过利用不同的超声物理学参数，不同种类的药物载体如微泡、微胶粒和脂质体等，以及不同的超声生物学效应(高热、声孔效应等)，来验证利用超声给药是一种新型的有前途的给药方式。超声介导超声微泡作为一种安全有效地给药途径，可以大力推广。近年，有国外学者采用可降解生物高分子聚合材料，制备的显影效果好、抗压性强的新型高分子材料超声微泡，可使药物释放时间及降解时间延长，并减少药物毒性及对组织的损伤，显示出这类新型微泡对肿瘤靶向释药能力及药物治疗作用的优势。
发明内容
本发明利用超声介导载紫杉醇微泡及载siRNA微泡，进行药物靶向释放，用于治疗宫颈癌的实验研究。通过自制高分子材料PLGA为外壳，包裹紫杉醇及针对HPV16E6、E7特异性的siRNA，制备载药、载siRNA微泡，在体外作用于宫颈癌细胞，初步评价超声介导载紫杉醇及载siRNA微泡联合应用对宫颈癌的协同抑制效果，为进一步临床应用研究提供实验依据。
方法：(1)利用改良型双乳剂挥发法和低温真空干燥技术，自制出载紫杉醇和载siRNA的PLGA超声微泡。(2)实验将宫颈癌Caski细胞分为四组：空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组、联合载紫杉醇及载siRNA微泡组。按照最佳参数给予相同频率及时间强度的超声辐照，48小时后，进行WB检测凋亡蛋白、FCM检测细胞凋亡率及细胞周期的改变，评价超声介导载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡对宫颈癌细胞协同抑制作用的效果。具体如下：
一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡；载siRNA微泡为PLGA包裹siRNA微泡；载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡混合物。所述的载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡的混合物。
载紫杉醇和/或载siRNA微泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)载紫杉醇微泡，取紫杉醇溶于聚乙二醇400作为内水相(W1)，聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷作为油水相(O)，配置质量浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液；混合内水相W1和油水相O得到初乳(W/O)，配制质量浓度为3-8％聚乙烯水溶液作外水相(W2)，将外水相加入到初乳中，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌3-8min乳化形成复乳(W/O/W)，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，即为载紫杉醇微泡。
(2)载siRNA微泡，将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于质量浓度为0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶；将DEPC水重悬siRNA，得到已溶解的siRNA溶液；称量聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶于二氯甲烷中，配置浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液；将已溶解的siRNA溶液加入到混合好的二氯甲烷聚乳酸羟基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌30-40s，形成乳白色油包水乳液，配制质量浓度为3-8％的聚乙烯PVA水溶液，为外水相；将外水相加入到上述siRNA与PLGA乳白色油包水乳液，形成复乳，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌3-8min，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，得到载siRNA微泡；
(3)载紫杉醇和siRNA微泡，经步骤(1)中的载紫杉醇微泡与步骤(2)中的载siRNA微泡混合得到。
本发明将所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡在制备抑制宫颈癌的药物上的应用。该应用是超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞的抑制。具体方法为：配制浓度为2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液，浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液，及2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液与浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液的混合液，将实验分为四组：空白对照组，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，载紫杉醇微泡及载siRNA微泡组，四组不同处理溶液加入宫颈癌Caski细胞中，用频率为1.5W/cm2的超声基因转染仪辐照35s，将处理后的四组24孔板放置CO2细胞培养箱中，48h小时后，完成超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞。
结果：(1)通过改良型双乳剂挥发法和真空冷冻干燥技术，制备出载紫杉醇和载siRNA的PLGA超声微泡，形态规则呈球形，粒径分布均匀，包封率达到89.58％，载药率达到11.86％，达到进一步实验的要求。(2)与空白对照组相比，载紫杉醇微泡组宫颈癌Caski细胞增殖受到一定程度抑制，载siRNA微泡组宫颈癌Caski细胞增殖有一定抑制，联合载紫杉醇及载siRNA微泡组宫颈癌Caski细胞增殖的抑制作用更加明显；载紫杉醇组及载siRNA组的Bax、Caspase3促凋亡蛋白的表达均上调，联合组的上调幅度更大(p<0.05)，载紫杉醇组及载siRNA组的Bcl2抑凋亡蛋白下调，联合组的下调幅度更大(p<0.05)；流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组、联合组的细胞凋亡率分别为：(8.39±0.24)％、(21.56±2.20)％、(11.00±0.14)％、(27.9±0.76)％，与空白对照组相比，载紫杉醇组与载siRNA组的凋亡率均增高，联合组的凋亡率最高(p<0.05)；流式细胞仪检测细胞周期的变化显示，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，联合组阻滞在G2/M期细胞数目增加，其中联合组的阻滞在G2/M期细胞数目明显高于其余三组(p<0.05)。自制PLGA超声微泡，其形态、粒径分布、包封率、载药率达到实验要求。体外实验表明，超声介导载紫杉醇及载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞分别有一定的抑制作用，两者联合应用，其协同抑制宫颈癌Caski细胞增殖的效果更好。本实验研究结果为临床上探索宫颈癌治疗提供了一种新的思路。
附图说明
图1为PLGA载紫杉醇微泡的扫描电镜图。
图2为PLGA载siRNA微泡的扫描电镜图。
图3为流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫
杉醇微泡联合载siRNA微泡组的细胞凋亡率(与空白对照组相比，*p<0.05,**p<0.01)。其中，N为空白对照，P为载紫杉醇微泡组，S为载siRNA微泡组，PS为载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组。
图4为流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组的细胞凋亡率。其中，N为空白对照，P为载紫杉醇微泡组，S为载siRNA微泡组，PS为载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组。
图5为流式细胞仪分析空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组对细胞周期的影响。其中，N为空白对照，P为载紫杉醇微泡组，S为载siRNA微泡组，PS为载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组。
图6为Western Blotting检测Bax、Caspase3、Bcl2的蛋白表达水平(*p<0.05,**p<0.01)。其中，N为空白对照，P为载紫杉醇微泡组，S为载siRNA微泡组，P+S为载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组。
图7为紫杉醇微泡、siRNA微泡及紫杉醇微泡联合载siRNA微泡对Bax、Caspase3、Bcl2的蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
实施例1
实验瘤株 人宫颈癌Caski细胞：由三峡大学医学院肿瘤微循环与免疫治疗实验室保存。
主要仪器及试剂 仪器：数显高速均质机(上海)、冷冻干燥仪(PLPHA2-4LSC，德国)、扫描电镜(JSM-7500F、日本)、UGT1025超声基因转染治疗仪(重庆医科大学超声影像学研究所研制)、JL-1177型激光粒度分布测试仪(成都精新粉体测试设备公司)。试剂:紫杉醇原料(成都曼斯特)、siRNA合成(江苏吉玛基因股份有限公司)
PLGA载紫杉醇微泡制备 称取40mg紫杉醇溶于1ml聚乙二醇400作为内水相(W1)，取适量聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于10ml二氯甲烷作为油水相(O)，配置质量浓度为0.2g/ml的聚乳酸羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液；混合W1和O得到初乳(W/O)，配制质量浓度为3-8％聚乙烯溶液作外水相(W2)10ml，加入初乳中，均质机乳化形成复乳(W/O/W)，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，即为载紫杉醇微泡。
PLGA载siRNA微泡制备 将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒灭菌后放置于0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶；将1ml的DEPC水重悬1OD的siRNA，得到已溶解的siRNA溶液；称量聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶于6ml二氯甲烷中，配置浓度为0.2g/ml的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液；将已溶解的siRNA溶液1ml加入到上述混合好的二氯甲烷聚乳酸羟基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，超声均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌30-40s，形成乳白色油包水乳液；配制质量浓度为3-8％PVA溶液10ml，为外水相；将外水相加入到上述siRNA与PLGA混合液中，形成复乳，超声均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌3-8min，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末。
微泡相关物理特性的检测 描电镜观察微泡形态，粒径分布仪检测微泡粒径大小和分布，紫外分光光度计分析紫杉醇浓度，计算：载药量＝(微泡中紫杉醇质量/微泡总质量)x100％、包封率＝(微泡中紫杉醇质量/投入紫杉醇总质量)xl00％。
实验分组及处理 观察24孔板内铺的细胞，待细胞贴壁良好，长到70％左右时，进行分组处理。根据前期实验摸索及参考国内外文献，提前配制浓度为2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液，浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液，及2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液与浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液的混合液。将实验分为四组：空白对照组，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，载紫杉醇微泡组联合载siRNA微泡组，四组不同处理溶液加入细胞中，用频率为1.5W/cm2的超声基因转染仪辐照35s。将处理后的四组24孔板放置CO2细胞培养箱中，48h小时后，通过Western Blot及流式细胞仪等检测相关参数。
Western Blot检测Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白的表达 提取细胞总蛋白，BCA方法进行蛋白定量，加入同体积蛋白上样缓冲液，沸水浴5min。取总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，加入兔抗人Bax抗体(1：800)、兔抗人Caspase3抗体(1：800)、兔抗人Bcl-2抗体(1：800),4℃过夜，分别加入HRP标记的羊抗兔IgG(1:50000)，显色液显色，以β-actin为内参，凝胶成像系统拍照。蛋白相对表达水平＝目的蛋白灰度/内参灰度。
流式检测细胞凋亡 使用没有EDTA的0.25％胰酶对细胞进行消化，终止消化后，收集细胞，1500rpm，5min离心，去上清，加PBS重悬。以1500rpm，5min的条件，用PBS将细胞润洗2次。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测，流式细胞仪上机检测。
流式检测细胞周期 使用没有EDTA的0.25％胰酶对细胞进行消化，终止消化后，收集细胞，1500rpm，5min离心，去上清，加PBS重悬。以1000rpm，5min的条件离心，去上清液，重悬细胞，缓慢加入预冷的80％无水乙醇，使无水乙醇的终浓度为70％。4℃固定4小时以上。以1000rpm，5min的条件离心，预冷PBS润洗2次。加入100ul的RNase(50ug/ml)，37℃水浴处理30min。加入400ul PI(50ug/ml)，4℃避光染色30min，流式细胞仪上机检测。
统计学方法 数据采用SPSS18.0软件进行统计学分析，结果用表示，各组之间的比较使用单因素方差分析，P<0.05为差别具有统计学意义。
自制高分子PLGA超声微泡的形态观察
制备出的PLGA载紫杉醇微泡及载siRNA微泡经冷冻干燥后外观为白色粉末状，在扫描电镜下分别观察载紫杉醇微泡，见图1，与载siRNA微泡，见图2。扫描电镜下可见微泡形态呈规则的圆球形，表面光滑，微泡的大小分布均一。
通过粒径分布仪的数据计算出载紫杉醇微泡的粒径大小约1.91±0.96um，载siRNA微泡的粒径大小约1.98±0.99um。通过紫外分光光度计的检测，计算得出PLGA超声微泡的包封率为89.58％，载药率为11.86％。
流式细胞术分析联合微泡对细胞凋亡的影响
通过流式细胞仪，用荧光标记试剂Annexin V-FITC/PI检测实验各组的凋亡率：空白对照组的细胞凋亡率为(8.39±0.24)％，载紫杉醇微泡组的细胞凋亡率为(21.56±2.20)％，载siRNA组微泡组的细胞凋亡率为(11.00±0.14)％，联合组的细胞凋亡率为(27.9±0.76)％，经过统计学软件分析，与空白对照组相比，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组与联合组的凋亡率均有统计学意义，(P〈0.01)，其中，联合组凋亡率最高，分别是单纯载紫杉醇微泡组及单纯载siRNA微泡的1.3倍、2.5倍，见图3、图4。图3为流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组的细胞凋亡率(与空白对照组相比，*p<0.05,**p<0.01)。
图4为流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组的细胞凋亡率。
流式细胞术分析联合微泡对细胞周期的影响
结果显示，图5为流式细胞仪分析空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组对细胞周期的影响。结果表明载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，联合组阻滞在G2/M期的细胞数目增加，其中联合组阻滞在G2/M期细胞数目明显高于其余三组。
Western Blotting检测Bax、Caspase3、Bcl2三种凋亡蛋白的表达
结果显示，图6为Western Blotting检测Bax、Caspase3、Bcl2的蛋白表达水平(*p<0.05,**p<0.01)。图7为紫杉醇微泡、siRNA微泡及紫杉醇微泡联合载siRNA微泡对Bax、Caspase3、Bcl2的蛋白表达水平的影响。载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，联合微泡组，三组的Bax、Caspase3促凋亡蛋白的表达均上调，但联合组的Bax、Caspase3促凋亡蛋白的表达更加明显(p<0.01)。载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，联合组Bcl2抑凋亡蛋白的表达均下调，但联合组的Bcl2抑凋亡蛋白的下调更加明显(p<0.01)。

Claims (6)

1.一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，其特征在于，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡；载siRNA微泡为PLGA包裹siRNA微泡；载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡混合物。
2.权利要求1所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡，其特征在于，载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡的混合物。
3.权利要求1所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)载紫杉醇微泡，取紫杉醇溶于聚乙二醇400作为内水相(W1)，聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷作为油水相(O)，配置质量浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液；混合内水相W1和油水相O得到初乳(W/O)，配制质量浓度为3-8％聚乙烯水溶液作外水相(W2)，将外水相加入到初乳中，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌3-8min乳化形成复乳(W/O/W)，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，即为载紫杉醇微泡。
(2)载siRNA微泡，将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于质量浓度为0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶；将DEPC水重悬siRNA，得到已溶解的siRNA溶液；称量聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶于二氯甲烷中，配置浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液；将已溶解的siRNA溶液加入到混合好的二氯甲烷聚乳酸羟基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌30-40s，形成乳白色油包水乳液，配制质量浓度为3-8％的聚乙烯PVA水溶液，为外水相；将外水相加入到上述siRNA与PLGA乳白色油包水乳液，形成复乳，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌3-8min，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，得到载siRNA微泡；
(3)载紫杉醇和siRNA微泡，经步骤(1)中的载紫杉醇微泡与步骤(2)中的载siRNA微泡混合得到。
4.权利要求1-3任一项所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡在制备抑制宫颈癌的药物上的应用。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，该应用是超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞的抑制。
6.权利要求4所述的应用，其特征在于，超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞的方法为：配制浓度为2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液，浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液，及2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液与浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液的混合液，将实验分为四组：空白对照组，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，载紫杉醇微泡及载siRNA微泡组，四组不同处理溶液加入宫颈癌Caski细胞中，用频率为1.5W/cm2的超声基因转染仪辐照35s，将处理后的四组24孔板放置CO2细胞培养箱中，48h小时后，完成超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110772646A (zh) * 2019-10-15 2020-02-11 天津大学 共载多烯紫杉醇与crispr/cas9脂质体及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102357071A (zh) * 2011-10-26 2012-02-22 重庆医科大学附属儿童医院 载紫杉醇纳米微泡及其制备方法
CN102920649A (zh) * 2012-08-24 2013-02-13 中国科学院深圳先进技术研究院 载药纳米胶束及其制备方法和应用
WO2015038924A1 (en) * 2013-09-12 2015-03-19 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Modified paramagnetic nanoparticles for targeted delivery of therapeutics and methods thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102357071A (zh) * 2011-10-26 2012-02-22 重庆医科大学附属儿童医院 载紫杉醇纳米微泡及其制备方法
CN102920649A (zh) * 2012-08-24 2013-02-13 中国科学院深圳先进技术研究院 载药纳米胶束及其制备方法和应用
WO2015038924A1 (en) * 2013-09-12 2015-03-19 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Modified paramagnetic nanoparticles for targeted delivery of therapeutics and methods thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEN-PIN SU ET AL.: ""PLGA nanoparticles codeliver paclitaxel and Stat3 siRNA to overcome cellular resistance in lung cancer cells"", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》 *
姜昕: ""包载紫杉醇的高分子超声微球抑制卵巢癌裸小鼠的实验研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
张雷等: ""携SiRNA的聚乳酸羟基乙酸微球对Bel-7402/5-Fu细胞MDR1基因沉默作用的研究"", 《世界科技研究与发展》 *
苏子涵等: ""超声介导超声微泡治疗宫颈癌的研究进展"", 《中国妇幼保健》 *
苏子涵等: ""靶向超声微泡在卵巢癌治疗中的研究进展"", 《海南医学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110772646A (zh) * 2019-10-15 2020-02-11 天津大学 共载多烯紫杉醇与crispr/cas9脂质体及应用

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