一系列双重生物活性的融合蛋白及其医疗应用
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域,具体地说,涉及编码能够同时抑制肿瘤坏死因子和粒-巨噬细胞集落刺激因子或白细胞介素-6的双重生物活性的融合蛋白的DNA序列、其所编码的融合蛋白、该融合蛋白的药物用途、含有该融合蛋白的药物及其制剂。
背景技术
肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor α,简称为TNFα)是一种多功能细胞因子,在炎症反应、免疫调节、和抗感染等生物机制中起重要作用(Aggarwal,Nature Reviews Immunology,2003,3,745-756)。TNFα有二种广泛表达的细胞表面受体:TNFR1(又称为p55或CD120a)和TNFR2(又称为p75或CD120b),TNFα和TNFR1或TNFR2相结合后可引发一系列的生物反应,包括细胞分化、活化、促炎因子的释放、细胞凋亡等。适量释放TNFα是机体对抗感染和炎症的重要手段,但是在多种自身免疫性疾病中,包括类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,简称为RA)、克隆病(Crohn’s Disease)、牛皮癣(Psoriasis)、强直性脊柱炎(Ankylosing Spondyliti,简称AS)等,TNFα的过量表达是炎症反应对机体自身攻击的重要因素,因此抑制TNFα是控制这些疾病症状的有效治疗手段(Furst et al,Annals of the Rheumatic Diseases,2003,62(suppl2):ii2-ii9)。现在美国市场上有三种抑制TNFα的抗炎症生物药物获得了批准以治疗各种自身免疫性疾病:Enbrel、Remicade、和Humira,它们在2005年的销售总额为90亿美元。虽然现有的TNFα抑制剂获得了巨大成功,但它们只对40%的患者有疗效,剩余的大部分病患缺乏有效的治疗方法,所以开发新一代的抗炎症产品具有重大意义。
粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage-colony stimulatingfactor,简称为GM-CSF)是一种在炎症反应和免疫系统中起重要作用的骨髓细胞生长因子和多功能调节因子(Fleetwood et al,Critical Review in Immunology,2005,25(5):405-428),它不但控制粒细胞和巨噬细胞等多种血液细胞的生长和活化,而且还可以帮助巨噬细胞释放促炎因子TNFα和IL-1(白细胞介素-1)以加强炎症反应。GM-CSF的作用是通过和多种细胞表面上的GM-CSF特异性受体相结合来传导的,该受体由α和β二条链组成的,其中α链提供对GM-CSF的特异性,而β链能提高受体对GM-CSF的亲和力,并起主要的信号传递作用。GM-CSF在多种人体自身免疫性\炎症性疾病中有着重用作用,包括类风湿性关节炎、肾小球肾炎(Glomerulonephritis)、多重硬化症(multiple sclerosis,简称为MS)、哮喘(Asthma)、慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease,简称为COPD)等疾病,比如在类风湿性关节炎患者的关节中发现了GM-CSF的表达水平异常升高(Xu et al,The Journal of Clinical Investigation,1989,83:876-882);又如在GM-CSF基因敲除(Gene knock-out)的小鼠中不能引发类风湿性关节炎或多重硬化症(Campbell et al,The American Association of Immunologists,1998,22-1767:3639-3644;McQualter et al,The Journal of Experimental Medicine,2001,194(7):873-881);又如在类风湿性关节炎的小鼠模型中,针对GM-CSF的单克隆抗体拥有很好的治疗效果(Cook et al,Arthritis Research,2001,3:293-298)。因此GM-CSF是开发抗炎症新药的重要分子靶标,抑制GM-CSF的生物分子可能对自身免疫性\炎症性疾病起到治疗作用。
白细胞介素-6(Interleukin-6,简称为IL-6)是一种多功能的调节免疫和炎症反应的细胞因子,而且在很多人体疾病中起重要作用,包括各种感染、炎症、自身免疫性疾病、和多种癌症(Ishihara et al,Cytokine Growth Review,2002,13:357-368)。人体内IL-6的生理作用非常复杂,对B细胞、T细胞、骨髓干细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、蚀骨细胞等多种细胞的生长、分化、和成熟起重要的调节作用,同时对炎症反应在不同的条件下可以有促进、或抑制的作用。多项研究表明,IL-6的浓度在多种癌症、自身免疫性疾病、和其他疾病患者体内出现异常升高,而且IL-6的作用和这些疾病的症状程度有直接关系,因此阻断IL-6的作用是尝试治疗这些疾病的当然选择(Trikha et al,Clinical Cancer Research,2003,9:4653-4665)。目前已经有多种阻断IL-6或IL-6受体的抑制剂正在欧美进行癌症和多种自身免疫性疾病的临床试验,包括类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus)、克隆病(Crohn’s Disease)、幼年型特发性关节炎(Juvenile idiopathic arthritis)等,而且日本在2005年已经批准了一个针对IL-6受体的单克隆抗体新药Actemra以用于治疗Castleman病(一种罕见的淋巴增殖性疾病),因此开发阻断IL-6的抑制剂在抗炎医疗应用上拥有重要意义。
本发明描述一系列创新的双活性融合蛋白质可以在抑制TNFα的同时,也抑制GM-CSF或IL-6的生物活性,从而达到抗炎目的。该类蛋白质和现有的TNFα抑制剂相比,对类风湿性关节炎等自身免疫性疾病拥有更好的治疗效果,而且可以适用于更大比例的患者。
发明内容
本发明目的之一是提供一个同时抑制TNFα和GM-CSF的双活性融合蛋白,其包括TNFR2的细胞外片段、一个可以结合GM-CSF的短肽链、和人免疫球蛋白Fc区域,该融合蛋白在体内外都具有优良的稳定性和生物活性,并能阻断TNFα和GM-CSF的信号传递,从而抑制炎症的发展。
本发明目的之二是提供一系列同时抑制TNFα和IL-6的双活性融合蛋白,其包括TNFR2的细胞外片段、一系列可以结合IL-6的多肽链、和人免疫球蛋白Fc区域,该融合蛋白在体内外都具有优良的稳定性和生物活性,并能阻断TNFα和IL-6的信号传递,从而抑制炎症的发展。.
本发明目的之三是提供编码所述融合蛋白的核苷酸序列。
本发明目的之四是提供含有编码所述融合蛋白的核苷酸序列,其表达载体和由该载体转化的重组体,以及表达细胞。
本发明的目的之五是提供所述融合蛋白作为抗炎药物在治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中的应用,还有包含上述融合蛋白及可药用载体的药物组合物及其在治疗相关疾病中的应用。
本发明的要点在于根据现有的抗炎药物的生物机理和临床治疗上的不足,设计了新一代的具有双重生物活性的抗炎药物,从而大大提高了其治疗效果,而且大大提高了其可适用的患者比例。现有的抗炎药物Enbrel、Remicade、和Humira都是针对TNFα的特异性阻断剂,它们的生物机理在于降低患者体内TNFα的有效浓度以达到减少炎症反应症状的目的,因此它们的治疗效果直接取决于该病患对TNFα的敏感程度。临床经验表明,TNFα抑制剂只对少部分的患者有效,例如对于类风湿性关节炎患者,Enbrel有效的比例大约为40%。所以为了提高抗炎药物在患者中的适用度,必须考虑新的生物靶标以用于对TNFα不敏感的患者。除TNFα外,还有一系列生物因子具有明显的促炎作用,包括GM-CSF、IL-1、IL-6等,它们在各种自身免疫性疾病的病理中也起相当重要的作用,因此对于TNFα不敏感的患者可以通过阻断别的促炎因子来达到治疗效果。本发明就是基于此原理提供了一系列可以同时抑制TNFα和GM-CSF、或TNFα和IL-6的重组融合蛋白,以用来治疗包括类风湿性关节炎在内的多种自身免疫性疾病。
研究表明,TNFα受体TNFR2的细胞外片段对TNFα具有较高的亲和力(100pM),通过DNA重组技术可以和人免疫球蛋白Fc形成融合蛋白,该蛋白在哺乳动物细胞系统表达后二聚化,对TNFα的亲和力可以比单体增加100倍,并且在体内具有阻断TNFα信号的作用(US专利5605690)。Enbrel就是这样的融合蛋白,在临床中已经显示了明显的抑制TNFα的作用。另外GM-CSF受体α链细胞外区域中有一段包含17个氨基酸的短肽链(238-254)在单独表达的条件下可以直接结合GM-CSF(Di Bartolo et al,Journal of Receptor and Signal TransductionResearch,1996,16:77-92)。本发明利用了上述二种TNFα和GM-CSF的结合体,把它们和人免疫球蛋白Fc一起形成二聚化的融合蛋白,从而得到了一个可同时结合TNFα和GM-CSF的、具有双重生物活性的生物分子,可以用来在体内外抑制TNFα和GM-CSF的促炎信号,达到治疗自身免疫性\炎症性疾病的治疗作用。
为了阻断IL-6,本发明利用了三个可以在体外有效地结合IL-6的重组多肽(Silverman et al,Nature Biotechnology,2005,23(12):1556-1561),把它们和TNFR2的细胞外片段、以及人免疫球蛋白Fc一起形成二聚化的融合蛋白,从而得到了可同时结合TNFα和IL-6的、具有双重生物活性的生物分子,可以用来在体内外抑制TNFα和IL-6的促炎信号,达到治疗自身免疫性\炎症性疾病的治疗作用。
本发明描述的融合蛋白是通过常规的基因重组技术所建造,具体实验步骤如<<分子克隆>>第二版(Joseph Sambrook,科学出版社)及类似的实验手册所记载。
本发明提供一种融合蛋白质,该融合蛋白质由PEP,P75和Fc构成,其中PEP和P75、P75和Fc之间各由一个优化肽连接段相连,该肽连接段选自以下组:
a.Gly Gly Gly Gly Gly Gly,表示为G6;
b.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly,表示为G12;
c.任何一个长度为4到30的氨基酸序列,其具有弹性结构并能增加融合蛋白的结构稳定性和生物活性。
本发明的融合蛋白质,其中PEP为一重组多肽,选自以下氨基酸序列组:
d.序列表中SEQ ID NO.2序列;
e.序列表中SEQ ID NO.4序列;
f.序列表中SEQ ID NO.5序列;
g.序列表中SEQ ID NO.6序列;
h.任一可结合GM-CSF的、长度不超过50的短肽链;
I.任一可结合IL-6的、长度不超过120的多肽链。
以下为本发明的融合蛋白所包括的组成部分:
同时抑制TNFα和GM-CSF的双重生物活性融合蛋白包括以下几个部分:
1.P75为TNFR2细胞外片段,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2.GM-CSF受体α链细胞外区域中的包含17个氨基酸的短肽链,表示为PEP17,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
3.人免疫球蛋白Fc来自于IgG1,表示为Fc,氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所述。
4.P75和PEP17之间的肽连接段,表示为G6,氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.7所述。
5.Fc之前的肽连接段,表示为G6’,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所述。
6.Fc之前的另一种肽连接段,表示为G12,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所述。
同时抑制TNFα和IL-6的双重生物活性融合蛋白包括以下几个部分:
1.TNFR2细胞外片段,表示为P75,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2.可结合IL-6的重组多肽,表示为M123,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。
3.可结合IL-6的重组多肽,表示为M12,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所述。
4.可结合IL-6的重组多肽,表示为M2,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所述。
5.人免疫球蛋白Fc来自于IgG1,表示为Fc,氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所述。
6.结合IL-6的多肽和P75之间的肽连接段,表示为G6,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所述。
7.P75和Fc之间的肽连接段,表示为G12,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所述。
如图1所示,本发明优选的融合蛋白有六种形式,其中TG-001为TNFR2细胞外片段和Fc的融合蛋白,是与Enbrel类似的TNFα特异性阻断剂;TG-002和TG-003为包含TNFR2细胞外片段和PEP17的Fc融合蛋白,具有同时抑制TNF和GM-CSF的双重生物活性;TG-004、TG-005、和TG006为包含TNFR2细胞外片段和IL-6结合肽的Fc融合蛋白本,具有同时抑制TNFα和IL-6的双重生物活性:
1.TG-001:P75-G12-Fc
2.TG-002:P75-G6-PEP17-G6’-Fc
3.TG-003:PEP17-G6-P75-G12-Fc
4.TG-004:M123-G6-P75-G12-Fc
5.TG-005:M12-G6-P75-G12-Fc
6.TG-006:M2-G6-P75-G12-Fc
以上6种本发明优选的融合蛋白,其编码DNA序列见序列表中的SEQ IDNO.10-15。
上述融合蛋白及其编码DNA可通过常规的基因重组技术获得。所需编码TNFR2、GM-CSF受体α链、和Fc的DNA序列由NCBI(National Center forBiotechnology Information)的GenBank中获得后,将编码上述融合蛋白的DNA序列由PCR合成后分别克隆到载体中,所用载体可以是分子生物学所常用的质粒、病毒或DNA片段。在编码上述融合蛋白的DNA序列的末端前加上蛋白分泌信号序列,以保证蛋白质从细胞中分泌出来。载体序列中包括用于驱动基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中有抗菌素抗性基因,以利于载体在宿主细胞,如细菌中繁殖。另外,载体中还包括真核细胞选择性基因,用于稳定转染宿主细胞株的选择。
由于TNFR2的细胞外片段可以允许一定的氨基酸删除和变异,仍然保持对TNFα的亲和力;GM-CSF受体α链中细胞外区域中的短肽链PEP17可以允许一定的氨基酸增删和变异,同时保持对GM-CSF的亲和力;多肽M123、M12、和M2可以允许一定的氨基酸删除和变异,仍然保持其分别对IL-6的亲和力,所以本发明所涉及的双活性融合蛋白质的氨基酸序列也可以有一定的变化,它们都属于本发明的范围。
上述融合蛋白中的Fc来自人免疫球蛋白IgG1,也可以是亚型IgG2、IgG3、IgG4、或者人免疫球蛋白IgM和IgA,该免疫球蛋白Fc片段可以为Fc全长或部分Fc序列,如选自CH2片断、CH3片断或绞合区域片段,它们都属于本发明的范围。
上述融合蛋白中的肽连接段G6、G9、和G12的目的在于提供良好的弹性和可塑性,因此其氨基酸序列和长度都可以有一定的变化,也可以由一个完全随机的肽链文库中筛选而得,它们都属于本发明的范围。
在完成含编码上述融合蛋白的DNA序列的质粒构建以后,即可用该重组载体转染或转化宿主细胞,表达相应的融合蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种,可以是真核细胞也可以是原核细胞,它们包括(但不限于)哺乳动物细胞、细菌、酵母、昆虫细胞等。由于本发明的融合蛋白质的氨基酸序列中包括可糖基化的氨基酸,因此,哺乳动物细胞是表达这些蛋白质的最佳系统。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种,例如293细胞、CHO细胞、SP20细胞、NSO细胞、COS细胞、BHK细胞或PerC6细胞等,许多其他细胞也可用于这些蛋白质的表达和生产,因此都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述融合蛋白的重组质粒可经转染进入宿主细胞,转染细胞的方法有多种,其中包括但不限于:电钻孔法(electroporation)、脂质体介导法、钙介导法等。这些融合蛋白也可以由反转录病毒载体(retroviral vectors)或其他病毒载体来编码,然后利用重组病毒感染哺乳动物细胞后表达。
一种较佳的表达方法是在已稳定转染的宿主细胞中对重组载体进行基因扩增,以提高相应重组融合蛋白的表达量,例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后,可在细胞培养液中增加氨甲喋呤(MTX)的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量;又例如对表达谷氨酰胺合成酶(GS)的稳定转染宿主细胞,利用增加培养液中甲硫氨酸亚砜(MSX)的浓度可扩增重组载体的拷贝数量。
哺乳动物细胞以外的其他表达系统,例如细菌、酵母或昆虫细胞等也能用于表达这些融合蛋白,它们也包括在本发明所能使用的细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞的为高,但是,所表达的蛋白质缺乏糖基化或者所形成的糖链与哺乳动物细胞不同。
双活性融合蛋白质表达后,可用酶联免疫吸附试验(ELISA)或其他方法测定细胞培养液中融合蛋白质的浓度。由于这些融合蛋白质包含免疫球蛋白Fc,因此可用蛋白A亲和层析法来提纯所表达的融合蛋白质。
从重组体培养液中获得相应的融合蛋白质后,可利用体外结合实验来检测其对TNFα和GM-CSF、或IL-6的亲和力。实验结果证明,TG-003可以有效地结合TNFα和GM-CSF,而TG-004、TG-005、TG-006可以有效地结合TNFα和IL-6,并且TG-003、TG-004和TG-005在小鼠内能够大大减轻胶原诱导性关节炎的症状,因此本发明所构建的双活性融合蛋白具有优良的抗炎效果,可以用来治疗各种自身免疫性\炎症性疾病,它们包括但不限于包括类风湿性关节炎、克隆病、牛皮癣、强直性脊柱炎、肾小球肾炎、多重硬化症、哮喘、慢性阻塞性肺病等。
本发明还提供了含有本发明融合蛋白和药用载体的药物组合物。该药物组合物可以按照制剂学常规技术制成各种形式的药物制剂,优选的是注射剂,最优选的是冷冻干燥注射剂。
附表说明
表1列举了ELISA实验中融合蛋白结合TNFα的EC50
| TG-001 | TG-002 | TG-003 | TG-004 | TG-005 | TG-006 |
EC50(nM) | 1.1 | 1.2 | 1.0 | 1.1 | 0.9 | 1.1 |
标准偏差(nM) | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
表2列举了ELISA实验中融合蛋白结合IL-6的EC50
| TG-004 | TG-005 | TG-006 |
EC50(nM) | 1.2 | 5.6 | 145.0 |
标准偏差(nM) | 0.3 | 0.4 | 12.7 |
附图说明
图1描述了本发明提供的融合蛋白的组成结构,其中TNFR2的细胞外片段表示为P75,GM-CSF受体α链细胞外区域中的包含17个氨基酸的短肽链表示为PEP17,结合IL-6的多肽表示为M123、M12、和M2,人免疫球蛋白Fc区域表示为Fc,三种肽连接段表示为G6、G6’、和G12。
图2显示了在本发明一较佳实施例中融合蛋白TG-001、TG-003、和TG-004在体外结合TNFα的实验结果。
图3显示了在本发明一较佳实施例中融合蛋白TG-001、TG-002、和TG-003在体外结合GM-CSF的实验结果。
图4显示了在本发明一较佳实施例中融合蛋白TG-004、TG-005、和TG-006在体外结合IL-6的实验结果。
图5A TG-001和TG003的结果比较,显示了在本发明一较佳实施例中双活性融合蛋白TG-001和TG-003在小鼠中有效地抑制胶原诱导性关节炎的实验结果。
图5B TG-001、TG-004、和TG-005的结果比较,显示了在本发明一较佳实施例中双活性融合蛋白TG-001、TG-004和TG-005在小鼠中有效地抑制胶原诱导性关节炎的实验结果。
具体实施方式
以下实施例对本发明所涉及的双活性融合蛋白构建、试验和应用作了详细说明。但是本发明的内容及用途并不限制于实例的范围。
实施例1:克隆编码双活性融合蛋白的DNA序列及构建重组载体
本发明中双活性融合蛋白的编码DNA是通过聚合酶酶链反应(PCR)由TNFR2、IL-6结合肽M123、和免疫球蛋白IgG1Fc的cDNA以不同的引物扩增而得。
例1构建TG-001基因及重组载体
TG-001由TNFR2的细胞外片段P75和人免疫球蛋白Fc融合而成,其N端包含了TNFR2的信号肽以保证其细胞外的分泌,在P75和Fc之间有一包含12个氨基酸(G12)的肽连接段。
其中P75的PCR片段(824bp)是以质粒pORF9-hTNFRSF1B(s)(Invivogen公司)为模板和如下引物扩增而得:
引物1:5’-GGCTAGCCTCGAGAATTCGCAACCACCATGGCGCCCGTC GCCGTCTG-3’
引物2:5’-CCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCGTCGCCAGTGCTC CCTTCAG-3’
其中Fc的PCR片段(724bp)是从人淋巴结cDNA(BD Clontech公司)为模板和如下引物扩增而得:
引物3:5’-CTATCTCACACATCGACAATTCGAAGACAAAACTCACA CATGCCCAC-3’
引物4:5’-AAGGGAATCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACA GGGAG-3’
然后P75-Fc的融合片段(1539bp)是以上述P75和Fc的PCR片段为模板,由引物1和引物4拼接PCR扩增所得。
编码TG-001的DNA克隆由上述P75-Fc融合片段的EcoRI和NotI酶切产物(1507bp)插入到载体质粒pCI-neo(Promega公司)的EcoRI和NotI酶切点所得。该重组质粒利用CMV启动子来表达TG-001,并包含SV40的多聚腺苷酸(PolyA)序列以保证其最佳的表达量。该重组质粒还包含氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因以利于在细菌中的繁殖,和新霉素(Neomycin)抗性基因以用于稳定转染哺乳细胞的选择。将编码TG-001的重组质粒转染E.coli(DH5α)后加入LB培养基培养过夜,由Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒后进行酶切及测序鉴定,所获得的编码TG-001的DNA序列如SEQ ID NO.10所述。
例2构建TG-002基因及重组载体
TG-002由TNFR2的细胞外片段P75、GM-CSF受体α链中的肽链PEP17、和人免疫球蛋白Fc融合而成,其N端包含了TNFR2的信号肽以保证其细胞外的分泌,在P75和PEP17、及PEP17和Fc之间都有一包含6个甘氨酸的肽连接段。TG-002的建造是以TG-001质粒为模板,通过拼接PCR(Bridge PCR)的方法构造而得。
TG-002编码DNA的建造首先以引物5和6,及引物8和9分别PCR扩增TG-001质粒得到二个PCR产物(168bp和273bp),然后以它们为模板,以引物1和6进行拼接PCR所得(421bp)。
引物5:5’-TCCACACGATCCCAACACAC-3’
引物6:5’-GTCCAGGTACGACAGCTTCTGATAGGTCCTGGGCTGTTTGCCA CCTCCGCCTCCACCGTC-3’
引物7:5’-AGAAGCTGTCGTACCTGGACTTTCAGTACCAGGGAGGTGGAGGC GGTGGTGACAAAACTC-3’
引物8:5’-GCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGC-3’
随后ApaI和SacII酶切后(333bp)插入到TG-001质粒的ApaI和SacII酶切点,得到编码TG-002的重组质粒。转染E.coli(DH5α)后获得编码TG-002的重组质粒,所获得的编码TG-002的DNA序列如SEQ ID NO.11所述。
例3构建TG-003基因及重组载体
TG-003由GM-CSF受体α链中的肽链PEP17、TNFR2的细胞外片段P75、和人免疫球蛋白Fc融合而成,其N端包含了人α-乳球蛋白(alpha-lactalbumin)的信号肽以保证其细胞外的分泌,在PEP17和P75、及P75和Fc之间各有一包含6个或12个甘氨酸的肽连接段。TG-003的建造是以TG-002质粒为模板,通过拼接PCR(Bridge PCR)的方法构造而得。
TG-003编码DNA的建造首先以引物9和10PCR扩增TG-002质粒得到PCR产物(127bp),然后以其为模板,以引物11和10扩增PCR得到产物169bp,然后再以TG-002为模板以引物12和13扩增PCR得到产物329bp。最后,TG-003的编码DNA由以上述169bp和329bp PCR产物为模板,以引物11和13进行拼接PCR所得(477bp)。
引物9:5’-GCTCCTGGTTGGCATCCTATTCCATGCCACCCAGGCCAAACAGCC CAGGACCTATCAG-3’
引物10:5’-AAATGCCACCTGGGCGGGCAAACCACCGCCTCCACCTCCCTG-3’
引物11:5’-GCCTCGAGAATTCGCAACCACCATGATGTCCTTTGTCTCTCTGC TCCTGGTTGGCATCC-3’
引物12:5’-TTGCCCGCCCAGGTGGCATTTAC-3’
引物13:5’-TCCTGCTTGCTCAGCGCGCAGTACC-3’
随后EcoRI和Bpu1102I酶切后(456bp)插入到TG-002质粒的EcoRI和Bpu1102I酶切点,得到编码TG-003的重组质粒。转染E.coli(DH5α)后获得编码TG-003的重组质粒,所获得的编码TG-003的DNA序列如SEQ ID NO.12所述。
例4构建TG-004基因及重组载体
TG-004由结合IL-6的多肽M123、TNFR2的细胞外片段P75、和人免疫球蛋白Fc融合而成,其N端包含了人α-乳球蛋白的信号肽以保证其细胞外的分泌,在M123和P75、P75和Fc之间各有一包含6个或12个谷氨酸的肽连接段。
其中M123的PCR片段(432bp)是以质粒IL6BP-1(中国专利申请号200610090787.0)为模板,由以下引物扩增PCR而得:
引物14:5’-CTGCTCCTGGTTGGCATCCTATTCCATGCCACCCAGGCCTGTC TGCCGGACCAGTTCC-3’
引物15:5’-TGCCACCTGGGCGGGCAAACCACCGCCTCCACCTCCCGTAT GCTCTGTACAGTCTTC-3’
然后再以TG-003为模板以引物12和13扩增PCR得到产物329bp,最后,TG-004的编码DNA由以上述432bp和329bp PCR产物为模板,以引物11和13进行拼接PCR所得(783bp)。随后EcoRI和Bpu1102I酶切后(762bp)插入到TG-003质粒的EcoRI和Bpu1102I酶切点,得到编码TG-004的重组质粒。转染E.coli(DH5α)后获得编码TG-004的重组质粒,所获得的编码TG-004的DNA序列如SEQ ID NO.13所述。
例5构建TG-005基因及重组载体
TG-005的构造方法和例4中TG-004的构造方法几乎完全相同,唯一的区别是以引物16代替了引物15:
引物16:5’-TGCCACCTGGGCGGGCAAACCACCGCCTCCACCTCCCG TAGGTACGGAGCCTGCAC-3’
得到编码TG-005的重组质粒后,转染E.coli(DH5α)后获得编码TG-004的重组质粒,所获得的编码TG-005的DNA序列如SEQ ID NO.14所述。
例6构建TG-006基因及重组载体
TG-006的构造方法和例5中TG-005的构造方法几乎完全相同,唯一的区别是以引物17代替了引物14:
引物17:5’-CTGCTCCTGGTTGGCATCCTATTCCATGCCACCCAGGCCTGTG CGCCGAGCCAGTTCCAG-3’
得到编码TG-006的重组质粒后,转染E.coli(DH5α)后获得编码TG-006的重组质粒,所获得的编码TG-006的DNA序列如SEQ ID NO.15所述。
实施例2双活性融合蛋白在细胞中的表达和提纯
本发明中的双活性融合蛋白是在293细胞和CHOS细胞中表达并分泌到培养液中的,并利用葡萄球菌A蛋白亲和层析的方法纯化所得。
例5融合蛋白在293T细胞中的瞬时表达
本发明中的双活性融合蛋白重组质粒建造后,通过用质粒DNA提纯药盒(QIAGEN公司)提取高纯度质粒DNA,然后利用Lipofectamine2000质粒转染药盒(INVITROGEN公司)将该重组质粒DNA导入293细胞(ATCC机构)中,在无血清培养液293SFMII(INVITROGEN公司)中培养三天后收集包含表达了优化融合蛋白的上清液。此方法可用于获取少量的优化融合蛋白,其浓度可用ELISA法定量确定。
例6融合蛋白在CHOS细胞中的稳定表达
将编码双活性融合蛋白的重组高纯度质粒利用Lipofectamine2000质粒转染药盒(Invitrogen公司)导入CHOS细胞(Invitrogen公司)中,在无血清培养液CHOS SFMII(Invitrogen公司)中培养二天后加入新酶素,用有限密度稀释法进行克隆培养,大约14天后挑取新酶素抗性克隆进行细胞的扩大培养并在液氮中冷冻收藏。稳定转染后的CHOS细胞可在转鼓培养瓶中培养生产优化融合蛋白,此方法可用于获取大量的优化融合蛋白,其浓度可用ELISA法定量确定。
例7融合蛋白的纯化
包含融合蛋白的细胞培养液可采取葡萄球菌A蛋白亲和层析的方法进行纯化。将蛋白A-Sepharose层析柱以PBS缓冲液洗以平衡后,以2毫升/分钟的速度将超滤器浓缩过的培养液上样,用PBS缓冲液洗直至未结合的蛋白全被洗脱(以A280进行监测),然后用100mM的柠檬酸(PH3)洗脱结合蛋白,立刻以足够多的2M Tris进行中和。纯化后的融合蛋白可用ELISA法或A280吸收法确定浓度,并可置-20℃储存。
实施例3融合蛋白与TNFα的体外结合实验
在本实验中,以每孔100ng的TNFα(ProSpec-Tany TechnoGene公司)为底物直接加样至ELISA板孔底部,然后加入不同浓度的融合蛋白TG-001、TG-002、TG-003、TG-004、TG-005、或TG-006温育后,再加酶结合物Goat anti-human Fc HRP(Sigma公司),最后加TMB显色以检测结合TNFα的融合蛋白,结果表明这六种融合蛋白与TNFα具有相同的亲和力,比色仪测量结果经Prism4软件(GraphPad公司)Sigmoidal非线性拟合后所得到的EC50及其标准偏差在表1中显示,其中TG-001、TG-003、和TG-004的比色仪原始实验结果在图2中显示。
实施例4融合蛋白与GM-CSF的体外结合实验
在本实验中,以每孔500ng的GM-CSF(ProSpec-Tany TechnoGene公司)为底物直接加样至ELISA板孔底部,然后加入不同浓度的融合蛋白TG-001、TG-002、或TG-003温育后,再加酶结合物Goat anti-human Fc HRP(Sigma公司),最后加TMB显色以检测结合GM-CSF的融合蛋白,比色仪测量的结果原始实验结果在图3中显示。结果表明TG-001和TG-002在这种条件下没有与GM-CSF结合,只有TG-003显示了有效结合GM-CSF的活性,经Prism4软件(GraphPad公司)Sigmoidal非线性拟合后得到的EC50为148nM,标准偏差为36nM。
实施例5融合蛋白与IL-6的体外结合实验
在本实验中,以每孔100ng的IL-6(R&D公司)为底物直接加样至ELISA板孔底部,然后加入不同浓度的融合蛋白TG-004、TG-005、或TG-006温育后,再加酶结合物Goat anti-human Fc HRP(Sigma公司),最后加TMB显色以检测结合IL-6的融合蛋白,比色仪测量的结果原始实验结果在图4中显示。结果表明这三种融合蛋白都可以结合IL-6,经Prism4软件(GraphPad公司)Sigmoidal非线性拟合后所得到的EC50及其标准偏差在表2中显示。
实施例6双活性融合蛋白TG-003、TG-004和TG-005在小鼠中抑制胶原诱导性关
节炎
胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,简称为CIA)引起的滑膜增生、细胞浸润、软骨侵蚀、骨吸收和重塑等症状和关节病理与类风湿性关节炎相似,是一种最常用的模拟类风湿性关节炎的动物模型(Wooley PH,The AmericanJournal of the Medical Sciences,2004,327:217-226),本实验显示了双活性融合蛋白TG-003、TG004和TG-005可以在这种动物模型中起到治疗关节炎症状的作用。
对8-10个星期的健康雄性DBA/1小鼠皮内注射200微克鸡II型胶原(TypeII collagen)加完全佛氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,简称为CFA),21天后再注射200微克鸡II型胶原加不完全佛氏佐剂后,通常从第23天起约80-100%的这些小鼠开始出现四肢远端关节肿胀和红斑的关节炎症状。本实验中出现关节炎症状的小鼠随机分为3组(每组9-12只小鼠),从发病日开始的10天内,每天各组分别接受腹腔内注射100微克的TG-001、TG-003、TG-004、TG-005或PBS,同时接受对关节炎严重程度的目测分级评估,每足病损由以下标准分成0—4级:0—正常;1—1或2个足趾出现红肿;2—3个以上足趾出现红肿、或踝\腕关节轻度肿胀;3—整个手\足掌红肿;4—红肿延至膝\肘关节、关节僵硬畸形、丧失功能。关节炎指数(Arthritis index,AI)为四肢关节评分之和;平均关节炎指数(Meanarthritis index,MAI)为总关节炎指数/每组小鼠的总数。图4显示了各组小鼠在发病后10天内的MAI,与参照组PBS相比,TG-001、TG-003、TG004和TG-005都显著减轻了小鼠的关节炎症状,其中TG-003、TG-004和TG-005比TG-001的效果略微更好一些。
综上所述,融合蛋白TG-003具有结合TNFα和GM-CSF的双重生物活性,而融合蛋白TG-004、TG-005、和TG006具有结合TNFα和IL-6的双重生物活性,它们并且能够在小鼠中有效地抑制胶原诱导性关节炎的产生,是一种创新的抗炎药物。
序列表
<110>余波
<120>一系列双重生物活性的融合蛋白及其医疗应用
<160>15
<210>1
<211>235
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>227
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
<210>5
<211>80
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
<210>6
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
<210>7
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
<210>8
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
<210>9
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
<210>10
<211>1491
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
<210>11
<211>1542
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
<210>12
<211>1551
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
<210>13
<211>1800
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
<210>14
<211>1683
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
<210>15
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15