CN109942719A - 一种金黄色葡萄球菌融合蛋白及其蛋白表达载体和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含金黄色葡萄球菌SSL6蛋白‑小鼠粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子GM‑CSF融合蛋白及其表达载体以及纯化方法，本发明的融合蛋白由SSL6(CD47的配基)和GM‑CSF组成，一方面可望发挥SSL6的抗肿瘤免疫调节作用，另一方面可望发挥GM‑CSF介导的肿瘤微环境的免疫优化作用，诱导树突细胞成熟，促进Th1免疫型应答及CD8+CTL杀伤效应，从而协同发挥抗肿瘤作用。

Description

一种金黄色葡萄球菌融合蛋白及其蛋白表达载体和纯化方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体明涉及一种包含金黄色葡萄球菌蛋白SSL6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF的融合蛋白及其表达载体、纯化方法。

技术背景

恶性肿瘤是危害人类生命健康最重要的恶性疾病之一，其发病率及死亡率在我国乃至世界均居高不下。目前，肿瘤的治疗主要是通过手术切除、放疗及化疗等方法。但由于肿瘤细胞易发生转移、扩散及对放化疗药物不敏感等特性，常导致了肿瘤治疗的失败。在传统治疗方法基础上，新兴的肿瘤治疗方法也应运而生，如肿瘤免疫治疗，已成为肿瘤研究最活跃的领域之一。肿瘤免疫治疗主要通过纠正肿瘤微环境的免疫抑制状态，调动机体自身免疫反应杀伤肿瘤，且其与放、化疗方法联用可增强治疗效果。肿瘤免疫治疗主要包括增强机体的抗肿瘤免疫应答和阻断免疫检查点。目前，免疫检查点阻断已成为肿瘤免疫治疗领域的热点方向，其主要是通过抗体或经修饰的配体/受体重组形式，将对免疫系统产生抑制功能的免疫检查点通路信号阻断，以调动自身免疫系统，阻止肿瘤的免疫逃逸。目前，该技术的关注点主要集中在通过调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应，其关键的阻断靶点是T细胞表面抗原分子如细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen-4,CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白-1(Programmed death-1，PD-1)及肿瘤细胞表面表达的PD-1配体(PD-L1)。尽管针对CTLA-4、PD-1及PD-L1分子的阻断药物如单克隆抗体已进入临床并针对黑色素瘤、淋巴瘤等部分肿瘤的治疗取得了一定的效果，但由于治疗引起的免疫副反应，以及治疗的特异性等问题仍有待进一步改善。

鉴于CTLA-4、PD-1及PD-L1免疫抑制分子在抗肿瘤免疫治疗应用中的不足，其它一些新的免疫检查点阻断靶分子也相继被报道，如细胞表面表达的跨膜糖蛋白CD47。CD47也被称为整合素相关蛋白(Integrin-associated protein，IPA)，在所有组织中均广泛表达，然而在肿瘤组织中高表达。研究发现，阻断CD47可通过激活自然杀伤细胞(Natural killercell，NK)介导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(Complement-dependentcytotoxicity，CDC)杀伤肿瘤细胞，或通过含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinylaspartate specific proteinase，caspase)非依赖的细胞凋亡途径直接诱导肿瘤细胞凋亡。此外，阻断CD47还可通过干扰CD47与巨噬细胞等吞噬细胞表面表达的受体信号调节蛋白α(Signal regulatory protein alpha，SIRPα)相互作用，逆转SIRPα介导的吞噬抑制作用，促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬及清除；以及通过增加巨噬细胞对肿瘤抗原的抗原递呈，促进肿瘤抗原特异性T细胞增殖，杀伤肿瘤细胞。目前，通过阻断CD47-SIRPα信号的单克隆抗体已在临床试验，并在急性淋巴性白血病、非霍奇金淋巴瘤及骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤中取得了良好的疗效。另外，通过阻断CD47-SIRPα治疗实体瘤病人的单克隆抗体药物，也已进入临床试验并显示出巨大应用前景。然而，由于抗体治疗的弊端，如抗体依赖性的ADCC效应、抗体半衰期短、制备成本高等缺点，严重限制了CD47-SIRPα免疫检查点阻断技术在抗肿瘤治疗中的应用及发展。

近年来，研究发现采用灭活细菌或细菌相关组分具有明显的抗肿瘤作用。将基因工程改造的减毒沙门氏菌、李斯特菌及梭状芽胞杆菌等细菌用于小鼠黑色瘤、乳腺癌及结肠癌等癌症的治疗，可显著抑制肿瘤生长。采用细菌毒素如铜绿假单胞菌外毒素A(ExotoxinA)、大肠杆菌素等处理小鼠肿瘤细胞，其表现出明显的细胞毒性。此外，研究表明多种细菌蛋白如结核分枝杆菌脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸(proline-proline-glutamic acid，PPE)家族蛋白PPE26和PPE57、布鲁氏杆菌细胞表面蛋白BCSP31具有明显的促进巨噬细胞促炎型极化及Th1应答的作用，提示将具有免疫激活效应的细菌蛋白用于肿瘤的治疗，可逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态，发挥抗肿瘤作用。因此，开发用于抗肿瘤免疫治疗的细菌相关组分及蛋白，具有重要的研究意义及临床应用前景。

金葡菌超抗原样蛋白6(Staphylococcal superantigen-like 6，以下本文简称“SSL6蛋白”)是金黄色葡萄球菌的一种分泌型蛋白。据报道，SSL6是目前唯一发现可与CD47结合的细菌蛋白，其可能是通过竞争性与CD47结合，促进caspase非依赖的细胞凋亡、巨噬细胞吞噬能力、肿瘤抗原特异性T细胞增殖与活化等多种途径促进肿瘤的杀伤及清除。与传统的单克隆抗体相比，SSL6是细菌性蛋白，其可通过原核表达系统大规模表达并纯化具有生物学活性的蛋白，生产成本大大降低，且将其用于治疗癌症，同时也可避免机体产生的抗体依赖性ADCC效应，大大降低了免疫毒性作用。

本发明人研究发现，将SSL6蛋白与免疫刺激因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)进行融合表达，可一方面发挥SSL6的抗肿瘤免疫调节作用，另一方面发挥GM-CSF介导的肿瘤微环境的免疫优化作用，如诱导树突细胞成熟，促进Th1免疫型应答及CD8+CTL杀伤效应等。本发明拟通过构建SSL6与GM-CSF的融合基因(S6GMFT)，并根据大肠杆菌密码子优化该基因(optS6GMFT)，并将密码子优化前及优化后的该基因在大肠杆菌表达系统中表达，通过比较两种方式表达S6GMFT蛋白的差异，明确S6GMFT基因密码子的优化及相关表达载体在S6GMFT蛋白表达中的优势。该融合蛋白及载体可能用于肿瘤免疫治疗的临床转化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种S6GMFT融合蛋白，包含金葡菌超抗原样6(SSL6)蛋白和免疫刺激因子。

本发明的所述的融合蛋白，是由金葡菌超抗原样(SSL6)蛋白和免疫刺激因子进行融合表达而得。

上述本发明的融合蛋白，所述免疫刺激因子为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

上述本发明的融合蛋白(优化前)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

上述本发明的融合蛋白，优选的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

上述本发明的融合蛋白，优选的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3。

本发明还提供了一种融合蛋白表达载体，包含权利要求1的S6GMFT融合蛋白和表达载体质粒pET15b-optS6GMFT。

上述本发明的蛋白表达载体，所述载体质粒，其宿主菌为大肠杆菌BL21。

本发明还提供了一种含有S6GMFT融合蛋白重组工程菌，为pET15b-optS6GMFT/BL21。

本发明还提供了一种重组工程菌pET15b-optS6GMFT/BL21的构建方法，包括以下步骤：

1)大肠杆菌BL21感受态细胞的制备；

2)pET15b-optS6GMFT质粒转化BL21感受态细胞；任选的

3)对pET15b-optS6GMFT/BL21进行阳性菌鉴定。

另一方面，本发明提供一种权利要求1的融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

1)S6GMFT蛋白的诱导表达

复苏pET15b-optS6GMFT/BL21菌株于LB液体培养基中培养，然后分离获取细菌沉淀；

2)S6GMFT蛋白的纯化

①取步骤1)诱导表达的细菌沉淀加入PBS，冰浴超声；

②离心分离出细菌沉淀，加入尿素结合缓冲液，室温搅拌溶解；

③离心，取上清，滤膜过滤,得到细菌沉淀溶解液；

④柱子平衡：取尿素结合缓冲液平衡Ni-NTA柱；

⑤蛋白上样：取步骤③过滤后的细菌沉淀溶解液过Ni-NTA柱；

⑥柱子复平衡：尿素结合缓冲液平衡Ni-NTA柱；

⑦蛋白洗脱：采用含20、50、100、200、500mM咪唑的尿素结合缓冲液洗脱蛋白；

⑧将蛋白洗脱液放入截留分子量3000Da的透析袋中，用50％甘油PBS透析，期间换液3次，获得纯化的S6GMFT蛋白。

本发明的金黄色葡萄球菌融合蛋白及其蛋白表达载体的效果：本发明人在S6GMFT融合蛋白研究过程中发现S6GMFT蛋白在pET28a-S6GMFT/BL21菌株中未能成功表达，经过生物工程修饰优化得到的optS6GMFT基因，其蛋白在pET15b-optS6GMFT/BL21菌株中成功表达，表明优化的S6GMFT基因密码子可显著促进S6GMFT蛋白在原核表达系统中表达。基于其组成成分，该融合蛋白及载体有望用于肿瘤免疫治疗的临床转化。

附图说明

图1为S6GMFT基因密码子优化前后对比图；

图2为菌液PCR鉴定S6GMFT基因电泳图；

图3为质粒的双酶切鉴定电泳图；

图4为质粒的测序鉴定测序图；

图5为菌液PCR鉴定S6GMFT基因电泳图；

图6为S6GMFT蛋白在不同重组工程菌中的表达差异；

图7为SDS-PAGE鉴定S6GMFT蛋白可溶性电泳图；

图8为SDS-PAGE鉴定S6GMFT蛋白纯度电泳。

具体实施方式

以下实施例仅作为代表性的，以阐明和理解本发明的实质，但不以任何方式限制本发明的范围。

一、材料和试剂

(一)菌株和质粒

大肠杆菌DH5α、BL21菌株、pET28a和pET15b质粒由本实验室保存。

(二)主要试剂

(三)主要仪器设备

(四)主要溶液及试剂配制

1.LB液体培养基

称取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加800ml ddH₂O溶解。NaOH调pH值至7.4，加入ddH₂O定容至1000ml，高压蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。

2.LB固体培养基

在LB液体培养基基础上，加入终浓度为15g/L的琼脂粉，高压蒸汽灭菌20min，倾倒平板，待凝固后用塑料袋封装，4℃保存备用。

3.0.01M PBS(pH7.4)缓冲液配制

称取NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH₂PO4 0.20g，NaH₂PO4·H₂O 1.56g，加入ddH₂O定容至1000ml，高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。

4.50×TAE电泳缓冲液储存液

称取Tris碱242g、Na₂EDTA·2H₂O 37.2g、冰乙酸57.1ml，加入ddH₂O定容至1000ml。

5.1％琼脂糖电泳凝胶制备

称取琼脂糖1g，加入100ml 1×TAE缓冲液，微波炉加热溶解，待温度降至65℃后，加入10mg/ml的EB 10μl，混匀后倾入电泳模具中，插入梳子，待凝胶凝固后使用。

6.8 M尿素结合缓冲液配制

称取尿素480g、Tris 2.42g、NaCl 29g，500ml ddH₂O溶解尿素后，加入ddH₂O定容至1000ml。

7.50×Tri-甘氨酸蛋白电泳缓冲液

称取甘氨酸47g、Tris碱7.55g、SDS 2.5g，加入ddH₂O定容至500ml。

8.10％分离胶配制

9.5％浓缩胶配制

二、实验方法

1.S6GMFT融合基因设计及合成

通过查找NCBI的Gene Bank数据库，获取金黄色葡萄球菌SSL6基因编码区序列(Accession NO.LR134085.1)及小鼠GM-CSF基因编码区序列(Accession NO.NM_009969.4)。拟通过3×GGGS柔性氨基酸linker对应核酸序列将两者进行连接，构建SSL6-GM-CSF融合基因(即S6GMFT融合基因)。此外，拟依据大肠杆菌遗传密码偏嗜性将S6GMFT融合基因序列进行全基因的密码子优化，构建密码子优化后的optiS6GMFT融合基因。上述融合基因由上海生工生物工程有限公司采用常规的全基因合成方法进行全基因合成。S6GMFT和optiS6GMFT融合基因密码子优化前后序列及比对结果如下(黑框前序列为SSL6，黑框内序列为linker，黑框后序列为GM-CSF)：

SEQ ID NO.1为S6GMFT核酸序列,其中，序列中第604-648位核苷酸(即“ggtggtggtggttctgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttct”)为linker序列，linker序列的前部分序列为SSL6序列，linker序列的后部分序列为GM-CSF序列。

SEQ ID NO.2为密码子优化后的optS6GMFT核酸序列，其中，序列中第604-648位核苷酸(即“ggcggcg gtggttctgg cggtggcggc tccggcggtg gcggctcc”)为linker序列，linker序列的前部分序列为SSL6序列，linker序列的后部分序列为GM-CSF序列。

SEQ ID NO.3：S6GMFT氨基酸序列,序列中第101-115位氨基酸(即“GGGGSGGGGSGGGGS”)为linker序列，linker序列的前部分序列为SSL6序列，linker序列的后部分序列为GM-CSF序列。

SEQ ID NO.4：S6GMFT基因密码子优化前后核酸序列比对(见附图1)

2.重组质粒pET15b-S6GMFT/optS6GMFT构建及鉴定

2.1 S6GMFT/optS6GMFT基因片段的大量获取

以上述S6GMFT/optS6GMFT全基因合成的DNA片段为模板，通过PCR大量扩增S6GMFT/optS6GMFT基因DNA片段。引物及PCR反应体系如下：

①引物序列：

S6GMFT基因扩增引物

上游引物：

下游引物：

optS6GMFT基因扩增引物

上游引物：

下游引物：

②PCR反应体系

热循环参数：94℃3min；(94℃30s，55℃30s，72℃60s)×32循环；72℃5min。

2.2 S6GMFT/optS6GMFT基因片段酶切

取2.1中经PCR扩增获取的S6GMFT或optS6GMFT DNA片段分别进行BamHI/HindIII或NdeI/XhoI双酶切，体系如下：

37℃反应4h后，取双酶切DNA片段进行核酸电泳，切取凝胶相应DNA条带，采用常规胶回收试剂盒回收DNA片段。

2.3 pET28a/pET15b质粒提取及酶切

接种pET28a/DH5α或pET15b/DH5α菌株于LB培养基(含氨苄抗生素50μg/ml)中，37℃、180rpm培养12h。取5ml细菌沉淀采用常规质粒提取试剂盒提取pET28a和pET15b质粒。NanoDrop仪器测定质粒浓度，并进行BamHI/HindIII或NdeI/XhoI双酶切，体系如下：

2.4双酶切DNA基因片段与质粒的连接及转化

将2.2和2.3步骤获得的经BamHI/HindIII或NdeI/XhoI双酶切的S6GMFT/optS6GMFT基因片段和pET28a/pET15b双酶切质粒，采用如下反应体系进行连接：

连接产物16℃反应过夜。取连接产物与100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热休克90s。取热激后大肠杆菌加入至1ml LB培养基中，37℃200rpm振荡培养1h。取100μl振荡培养菌液涂布于含氨苄抗生素的LB(Amp^R)平板。37℃静置培养约24h至长出单菌落。

2.5质粒的PCR鉴定

挑取LB(Amp^R)平板上单菌落，接种于LB(Amp^R)液体培养基中，37℃200rpm振荡培养12h。取菌液通过菌液PCR鉴定重组质粒pET28a-S6GMFT或pET15b-optS6GMFT上的插入片段S6GMFT或optS6GMFT，体系如下：

热循环参数：94℃3min；(94℃30s，55℃30s，72℃60s)×32循环；72℃5min。

取上述PCR产物5μl，通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。本次实验共挑取6个克隆，其中第3、4及5泳道对应的克隆经菌液PCR后均扩增出与S6GMFT/optS6GMFT理论分子量一致的PCR条带，实验结果见图2。图中，M:DNA Marker；泳道1-3：pET28a-S6GMFT/DH5α不同细菌克隆鉴定；泳道4-6：pET15b-optS6GMFT/DH5α不同细菌克隆鉴定。

2.6质粒的双酶切鉴定

取2.5步骤获取的pET28a-S6GMFT/DH5α或pET15b-optS6GMFT/DH5α菌液5ml，采用质粒提取试剂盒提取质粒。通过BamHI/HindIII或NdeI/XhoI双酶切鉴定，体系如下：

取上述酶切产物10μl，通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。由电泳结果可见，采用该酶切体系成功获取S6GMFT基因片段，其长度与理论分子量一致，实验结果见图3。图中M:DNAMarker；泳道1和3：pET28a-S6GMFT质粒；泳道2和4：pET28a-S6GMFT质粒经BamHI/HindIII双酶切。泳道5和7：pET15b-optS6GMFT质粒；泳道6和8：pET15b-optS6GMFT质粒经NdeI/XhoI双酶切。

2.7质粒测序鉴定

将2.6步骤获取的pET28a-S6GMFT和pET15b-optS6GMFT质粒送至华达基因进行测序鉴定，测序结果与理论序列一致，结果见图4(部分测序结果)。

3.重组工程菌构建及鉴定

3.1大肠杆菌BL21感受态细胞的制备

接种大肠杆菌BL21于2ml LB液体培养基中，37℃、180rpm振摇培养过夜。次日按1％转种于200ml LB液体培养基中，37℃，240rpm培养至对数生长早期(OD₆₀₀＝0.3～0.5)。4℃、6000rpm离心10min，取沉淀加入20ml预冷的100mM CaCl₂溶液重悬细菌，冰浴30min，离心取沉淀，采用预冷的含15％甘油的100mM CaCl₂溶液重悬细菌，100μl/只分装于-70℃保存备用。

3.2质粒转化BL21感受态细胞

取pET28a-S6GMFT或pET15b-optS6GMFT质粒20ng与100μl BL21感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热休克90s。将热激后细菌加入至1ml LB培养基中，37℃200rpm振荡培养1h。取100μl振荡培养菌液涂布于含氨苄抗生素的LB(Amp^R)平板。37℃静置培养约24h至长出单菌落。

3.3阳性克隆鉴定

挑取3.2步骤获取的细菌单菌落，接种于LB(Amp^R)液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜。采用质粒提取试剂盒提取pET28a-S6GMFT或pET15b-optS6GMFT质粒，通过PCR鉴定阳性克隆，反应体系如下：

热循环参数：94℃3min；(94℃30s，55℃30s，72℃60s)×32循环；72℃5min。

取上述PCR产物5μl，通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。由实验结果可见，PCR反应可成功扩增质粒中S6GMFT和optS6GMFT片段，表明pET28a-S6GMFT/BL21或pET15b-optS6GMFT/BL21重组工程菌构建成功(见图5)。图中，M:DNAMarker；泳道1和2：pET28a-S6GMFT/BL21菌株不同克隆；泳道3-4：pET15b-optS6GMFT/BL21菌株不同细菌克隆。

4.S6GMFT蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

4.1 S6GMFT蛋白的诱导表达

复苏pET28a-S6GMFT/BL21或pET15b-optS6GMFT/BL21菌株于20ml LB(Amp^R)液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜。采用三线法接种复苏的重组菌菌株于LB(Amp^R)固体平板。挑取单菌落接种于20ml LB(Amp^R)液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.3～0.5。以1:100转接活化后的菌株于500ml LB(Amp^R)液体培养基中，37℃220rpm振荡培养6h。菌液加入IPTG至终浓度0.5mM，37℃220rpm继续振荡培养4h。4℃、6000rpm离心10min获取细菌沉淀。沉淀加入1×SDS上样缓冲液，煮沸5min。10％SDS-PAGE电泳鉴定S6GMFT蛋白表达，实验结果可见S6GMFT蛋白在pET28a-S6GMFT/BL21菌株中未能成功表达，而在pET15b-optS6GMFT/BL21菌株中成功表达，表明优化S6GMFT基因密码子可显著促进S6GMFT蛋白在原核表达系统中表达(见图6)。图中，M:蛋白Marker；泳道1：pET28a-S6GMFT/BL21未经IPTG诱导；泳道2：pET28a-S6GMFT/BL21经IPTG诱导；泳道3：pET15b-optS6GMFT/BL21未经IPTG诱导；泳道4：pET15b-optS6GMFT/BL21经IPTG诱导。

4.2 S6GMFT蛋白的可溶性鉴定

取4.1步骤获取的pET15b-optS6GMFT/BL21细菌沉淀0.1g加入1ml PBS缓冲液，冰浴超声5min(超声条件：超5s、停10s，振幅30％)。超声裂解菌液以4℃、8000rpm离心5min后，分别取超声上清及沉淀加入1×SDS上样缓冲液，煮沸5min。10％SDS-PAGE电泳鉴定S6GMFT蛋白在超声上清及沉淀的表达，实验结果可见，S6GMFT蛋白主要在菌体超声沉淀中表达，表明pET15b-optS6GMFT/BL21诱导表达的S6GMFT蛋白主要以包涵体形式表达(图7)。图中，M:蛋白Marker；泳道1：未经IPTG诱导的pET15b-optS6GMFT/BL21菌体；泳道2：pET15b-optS6GMFT/BL21经IPTG诱导后菌体；泳道3：IPTG诱导的该菌体经超声破菌后上清；泳道4：IPTG诱导的该菌体经超声破菌后沉淀。

4.3 S6GMFT蛋白的纯化

根据4.2步骤的鉴定结果，该pET15b-optS6GMFT/BL21重组菌S6GMFT蛋白表达主要以包涵体形式表达，因此采用包涵体蛋白纯化方式进行蛋白纯化。主要步骤如下：

①取4.1步骤诱导表达的细菌沉淀加入400ml PBS，冰浴超声15min(超声条件：超5s、停10s，振幅30％)。

②4℃、8000rpm离心10min，取细菌沉淀加入200ml8 M尿素结合缓冲液，室温搅拌溶解1h。

③4℃、8000rpm离心10min，取上清，0.22μm滤膜过滤。

④柱子平衡：8M尿素结合缓冲液平衡Ni-NTA柱10个柱体积。

⑤蛋白上样：取上述过滤后的细菌沉淀溶解液以1ml/min流速上样。

⑥柱子复平衡：8M尿素结合缓冲液平衡Ni-NTA柱10个柱体积。

⑦蛋白洗脱：采用含20、50、100、200、500mM咪唑的8 M尿素结合缓冲液洗脱蛋白，每个梯度洗脱5个柱体积。

⑧将蛋白洗脱液放入截留分子量3000Da的透析袋中，4℃50％甘油PBS透析24h，期间换液3次即得纯的S6GMFT蛋白。

4.4 S6GMFT蛋白的纯度鉴定

参照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社2002[美]J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，黄培堂等译)方法配制蛋白凝胶(积层胶5％，分离胶10％)并进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳。经蛋白电泳及灰度扫描分析，S6GMFT蛋白纯度可达96％，实验结果见图8。图中，M:蛋白Marker；泳道1：未经IPTG诱导的pET15b-optS6GMFT/BL21菌体；泳道2：IPTG诱导后菌体；泳道3：50mM咪唑洗脱蛋白；泳道4：100mM咪唑洗脱蛋白；泳道5：200mM咪唑洗脱蛋白。

4.5 S6GMFT蛋白浓度测定

采用BCA方法测定蛋白浓度，方法参照试剂盒说明书进行。配制不同稀释度的BSA标准品：1、0.5、0.25、0.125、0.0625及0mg/ml，通过标准曲线计算蛋白浓度。经BCA方法测定S6GMFT蛋白浓度为0.16mg/ml，共计获得3mg。

4.6 S6GMFT蛋白内毒素含量测定

采用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂凝胶半定量方法测定蛋白内毒素含量，实验方法参照试剂盒说明书进行。经测定S6GMFT蛋白内毒素为0.5EU/ml。

序列表

<110> 陆军军医大学第二附属医院

<120> 一种金黄色葡萄球菌融合蛋白及其蛋白表达载体和纯化方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1015

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 1

cagaatcaac tcaaggtcaa cacaattata aatcgttaaa atactactat agcaagccag 60

tatagagtta aaaaatcttg atggtttgta tagacagaaa gtgacagata aaggagtaat 120

gtttggaagg atcgaaaaga ttattttgtt ggcttgcttg gtaaagatat tgaaaaaacc 180

ctcaaggtga gcatgataag caagatgcat ttttagtcat cgaggaggaa actgttatgg 240

aagacaatat tcaattggtg gtttaagtaa gacaaatagt aaagaattta gtaaagaagt 300

cgatgttaaa gtaacaagaa aaattgatga atcatcggaa aagtctaaag atagtaaatt 360

taaaattact aaagaagaaa tctcgttaaa agagttggac tttaaattaa gaaaaaaatt 420

gatggaagaa gaaaaattat atggtgctgt taataataga aaaggtaaaa ttgtagttaa 480

aatggaagat gataagtttt atactttcga acttacaaaa aaactacaac cgcatcgcat 540

gggtgacacg atagatggta ccaaaatcaa agaaattaat gttgagctag aatataaagg 600

tggtggtggt tctggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctgcaccca cccgctcacc 660

catcactgtc acccggcctt ggaagcatgt agaggccatc aaagaagccc tgaacctcct 720

ggatgacatg cctgtcacgt tgaatgaaga ggtagaagtc gtctctaacg agttctcctt 780

caagaagcta acatgtgtgc agacccgcct gaagatattc gagcagggtc tacggggcaa 840

tttcaccaaa ctcaagggcg ccttgaacat gacagccagc tactaccaga catactgccc 900

cccaactccg gaaacggact gtgaaacaca agttaccacc tatgcggatt tcatagacag 960

ccttaaaacc tttctgactg atatcccctt tgaatgcaaa aaaccaggcc aaaaa 1015

<210> 2

<211> 1020

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 2

gctgaaagca cccagggtca gcacaactac aaatctctga aatactacta cagcaaaccg 60

agcatcgaac tgaaaaacct ggatggcctg taccgtcaga aagtgaccga taaaggcgtt 120

tacgtttgga aagatcgtaa agattacttc gtgggcctgc tgggcaaaga catcgaaaaa 180

tacccgcagg gcgaacacga caaacaggat gcgttcctgg ttatcgaaga agaaaccgtt 240

aacggccgtc agtacagcat cggcggcctg tccaaaacca acagcaaaga gttctccaaa 300

gaagtggacg ttaaagttac ccgcaaaatc gatgaatcct ccgaaaaatc taaagatagc 360

aaatttaaaa tcaccaaaga agaaatctct ctgaaagaac tggacttcaa actgcgtaaa 420

aaactgatgg aagaagaaaa actgtacggc gccgtgaaca accgtaaagg caaaatcgtt 480

gttaaaatgg aagatgataa attctacacc ttcgaactga ccaaaaaact gcagccgcac 540

cgtatgggcg ataccatcga tggtaccaaa atcaaagaaa tcaacgtgga actggaatac 600

aaaggcggcg gtggttctgg cggtggcggc tccggcggtg gcggctccgc gccgacccgc 660

agcccgatca ccgtgacccg cccgtggaaa cacgttgaag cgatcaaaga agcgctgaac 720

ctgctggacg acatgccggt gaccctgaac gaagaagtgg aagttgttag caacgagttc 780

agcttcaaaa aactgacctg cgttcagacc cgtctgaaaa tcttcgaaca gggtctgcgt 840

ggcaacttca ccaaactgaa aggtgcgctg aacatgaccg cgagctacta ccagacctac 900

tgcccgccga ccccggaaac cgactgcgaa acccaggtga ccacctacgc ggacttcatc 960

gacagcctga aaaccttcct gaccgatatc ccgttcgaat gcaaaaaacc gggccagaaa 1020

<210> 3

<211> 340

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 3

Ala Glu Ser Thr Gln Gly Gln His Asn Tyr Lys Ser Leu Lys Tyr Tyr

1 5 10 15

Tyr Ser Lys Pro Ser Ile Glu Leu Lys Asn Leu Asp Gly Leu Tyr Arg

20 25 30

Gln Lys Val Thr Asp Lys Gly Val Tyr Val Trp Lys Asp Arg Lys Asp

35 40 45

Tyr Phe Val Gly Leu Leu Gly Lys Asp Ile Glu Lys Tyr Pro Gln Gly

50 55 60

Glu His Asp Lys Gln Asp Ala Phe Leu Val Ile Glu Glu Glu Thr Val

65 70 75 80

Asn Gly Arg Gln Tyr Ser Ile Gly Gly Leu Ser Lys Thr Asn Ser Lys

85 90 95

Glu Phe Ser Lys Val Asp Val Lys Val Thr Arg Lys Ile Asp Glu Ser

100 105 110

Ser Glu Lys Ser Lys Asp Ser Lys Phe Lys Ile Thr Lys Glu Glu Ile

115 120 125

Ser Leu Lys Glu Leu Asp Phe Lys Leu Arg Lys Lys Leu Met Glu Glu

130 135 140

Glu Lys Leu Tyr Gly Ala Val Asn Asn Arg Lys Gly Lys Ile Val Val

145 150 155 160

Lys Met Glu Asp Asp Lys Phe Tyr Thr Phe Glu Leu Thr Lys Lys Leu

165 170 175

Gln Pro His Arg Met Gly Asp Thr Ile Asp Gly Thr Lys Ile Lys Glu

180 185 190

Ile Asn Val Glu Leu Glu Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val

210 215 220

Thr Arg Pro Trp Lys His Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu

225 230 235 240

Leu Asp Asp Met Pro Val Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser

245 250 255

Asn Glu Phe Ser Phe Lys Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys

260 265 270

Ile Phe Glu Gln Gly Leu Arg Gly Asn Phe Thr His Lys Leu Lys Gly

275 280 285

Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr

290 295 300

Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile

305 310 315 320

Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys

325 330 335

Pro Gly Gln Lys

340

Claims (10)

1.一种S6GMFT融合蛋白，包含金葡菌超抗原样6(SSL6)蛋白和免疫刺激因子GM-CSF。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，是由金葡菌超抗原样蛋白和免疫刺激因子进行融合表达而得。

3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，所述免疫刺激因子为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

4.如权利要求3所述的融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。

5.如权利要求3所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3。

6.一种蛋白表达载体，包含权利要求1的融合蛋白和表达载体质粒pET15b-optS6GMFT。

7.如权利要求6所述的蛋白表达载体，所述载体质粒，其宿主菌为大肠杆菌BL21。

8.一种含有权利要求1的融合蛋白重组工程菌，为pET15b-optS6GMFT/BL21。

9.一种重组工程菌pET15b-optS6GMFT/BL21的构建方法，包括以下步骤：

1)大肠杆菌BL21感受态细胞的制备；

2)pET15b-optS6GMFT质粒转化BL21感受态细胞；任选的

3)对pET15b-optS6GMFT/BL21进行阳性菌鉴定。

10.一种权利要求1的融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

1)S6GMFT蛋白的诱导表达

复苏pET15b-optS6GMFT/BL21菌株于LB液体培养基中培养，然后分离获取细菌沉淀；

2)S6GMFT蛋白的纯化

①取步骤1)诱导表达的细菌沉淀加入PBS，冰浴超声；

②离心分离出细菌沉淀，加入尿素结合缓冲液，室温搅拌溶解；

③离心，取上清，滤膜过滤,得到细菌沉淀溶解液；

④柱子平衡：取尿素结合缓冲液平衡Ni-NTA柱；

⑤蛋白上样：取步骤③过滤后的细菌沉淀溶解液过Ni-NTA柱；

⑥柱子复平衡：尿素结合缓冲液平衡Ni-NTA柱；

⑦蛋白洗脱：采用含20、50、100、200、500mM咪唑的尿素结合缓冲液洗脱蛋白；

⑧将蛋白洗脱液放入截留分子量3000Da的透析袋中，用50％甘油PBS透析，期间换液3次，获得纯化的S6GMFT蛋白。