CN102114239A - 细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，所述细胞因子为表皮生长因子或血管内皮细胞生长因子，所述超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素A的超抗原。所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够动员人T淋巴细胞，并将所述T淋巴细胞靶向性地定位到肿瘤细胞周围，所述人T淋巴细胞具有CD4⁺或CD8⁺特征。能诱导人T淋巴细胞分泌细胞因子白细胞介素-2、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。所述EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白能有效抑制乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌。

Description

细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白的用途，特别是涉及一种细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用。

背景技术

表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)和血管内皮细胞生长因子(Vascularendothelial cell growth factor，VEGF)等的受体在各种肿瘤组织中大量表达，例如在肠黏膜肿瘤中的EGF受体比正常组织高出300倍(Gastroenterology，98，961-967，1990)。所以，异常高表达的EGF受体和VEGF受体成为一个引人注目的肿瘤治疗靶点(Ann Oncol，17Suppl 7：vii109-114，2006；Clin Cancer Res，12，5018-5022，2006)。

表皮生长因子连接到一种毒素蛋白或RNA水解酶上可选择性杀伤高表达EGF受体的肿瘤细胞(Clin Cancer Res，11，329-334，2005；Protein Eng，11，1285-1292，1998)，同样血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor，VEGF)也能与毒素形成融合蛋白质来抑制肿瘤(Proc Natl Acad Sci USA，99，7866-7871，2002)。这里的EGF-毒素或VEGF-毒素的融合蛋白是利用EGF或VEGF与肿瘤细胞上的EGF受体(EGFR)或VEGF受体(VEGFR)相互作用而将融合蛋白定位到肿瘤细胞上，再通过融合蛋白中的毒素蛋白来直接杀伤肿瘤细胞。但这种方式不是依靠免疫系统例如淋巴细胞等攻击肿瘤。

肿瘤细胞是由正常细胞转变而来的，肿瘤细胞的抗原是自身抗原，所以肿瘤细胞能够逃避免疫系统的监视。人们一直在寻找新的抗肿瘤方法来提高肿瘤病人的免疫力，特别是针对肿瘤细胞的特异性免疫力。因此，本领域迫切需要一种特别针对肿瘤细胞的强有力的新的抗肿瘤药物用于治疗目的。

中国专利申请号200310109829.7“一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产方法”公开了一种构建细胞因子和超抗原的融合蛋白的方法以及这种融合蛋白质在大肠杆菌中表达和纯化方法。

中国专利申请号201010118438.1“细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用”公开了细胞因子-超抗原融合蛋白可以抑制小鼠肉瘤肿瘤Sarcoma 180(S180)。

上面两个专利所使用的融合蛋白中的超抗原是金黄色葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal-enterotoxin A，SEA)，并且在基因序列中显示第227位置上有一个将Asp改变为Ala的点突变。而专利文献中的EGF和VEGF是根据公开文献(EGF基因文献：NucleicAcids Res，10，4467-4482，1982；Nature，303，722-725，1983；VEGF基因文献：Science，246，1306-1309，1989；Science，246，1309-1312，1989；J Biol Chem，266，11947-11954，1991)制备的，属于人来源的EGF和VEGF基因，从而构建成EGF-SEA和VEGF-SEA两种超抗原融合蛋白。

SEA不需要抗原提呈细胞的加工处理，而以完整蛋白质形式直接与细胞膜上的主要组织相容性抗原-II(Major histocompatibility complex class，MHC-II)类分子结合形成复合物，识别T cell receptor(TCR)的Vβ片段，激活比普通抗原多得多T细胞(包括CD4⁺，CD8⁺)，并释放大量细胞因子，对靶细胞产生强而有力的细胞毒作用。瑞典的一个小组的抗体超抗原融合蛋白对于B16黑色素瘤的肺转移进行了很多研究(Proc Natl Acad Sci USA，92，9791-9795，1995；Eur Surg Res，35，457-463，2003)。为了减轻SEA的副作用，在它的第227位置上引入了一个点突变，将Asp改变为Ala(Proc Natl Acad Sci USA，94，2489-2494，1997)。

中国专利申请号201010118438.1“细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用”公开了EGF-SEA和VEGF-SEA可诱导动物体内由T细胞分泌的细胞因子例如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)和白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)，还可以诱导T细胞分泌分泌穿孔素和颗粒酶，细胞因子TNF-α和IFN-γ可以诱导肿瘤细胞凋亡，而穿孔素和颗粒酶可直接杀伤肿瘤细胞(Immunol Today 16，194-201，1995；Immunol Today 16，202-206，1995；Cell Mol Immunol，6，15-25，2009)，专利的融合蛋白中的超抗原SEA含有D227A的点突变。这些由T细胞产生的杀伤肿瘤细胞的作用被称是细胞毒作用(Cytotoxicity)。

所以这里所描述的EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白的作用方式与抗体是不同的，而且与很复杂的抗体人源化的基因工程操作以及高成本的动物细胞培养体系来比较，EGF-SEA和VEGF-SEA是很方便的抗癌手段。

根据大量文献报道，大多数实体肿瘤的癌细胞有大量EGFR和VEGFR表达(Nat Rev ClinOncol，6，569-579，2009)，特别是乳腺癌(Oncologist，14，378-390，2009；Breast Cancer，14，132-149，2007)、结肠癌(Cl in Transl Oncol，10，6-13，2008；Adv Exp Med Biol，587，251-275，2006)、胃癌(Jpn J Clin Oncol，39，543-551，2009；J Cancer Res Clin Oncol，135，855-866，2009；Cancer Treat Rev，30，451-459，2004)、肝癌(Histol Histopathol，24，493-502，2009；Hepatology，48，1312-1327，2008；Curr Pharm Des，13，3301-3304，2007)和肺癌(Clin Lung Cancer，11，82-90，2010；Expert Opin Pharmacother，11，2363-2389，2010；Curr Med Chem，14，3157-3165，2007)等，这些肿瘤上的EGFR和VEGFR就成为抗癌药物的靶点。

因为乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌肿瘤细胞表达大量EGFR和VEGFR，就可用EGF-SEA和VEGF-SEA诱导和刺激T淋巴细胞来杀伤乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用。

本发明的技术方案概述如下：

细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，所述细胞因子为表皮生长因子或血管内皮细胞生长因子，所述超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素A的超抗原。

所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够动员人T淋巴细胞，并将所述T淋巴细胞靶向性地定位到肿瘤细胞周围，所述人T淋巴细胞具有CD4⁺或CD8⁺特征。

所述细胞因子-超抗原融合蛋白能诱导人T淋巴细胞分泌细胞因子白细胞介素-2、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。

所述癌为乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌或肺癌。

所述乳腺癌为人乳腺癌。

所述结肠癌为人结肠癌。

所述胃癌为人胃癌。

所述肝癌为人肝癌。

所述肺癌为人肺癌。

本发明的优点：

EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白虽然与EGF-毒素或VEGF-毒素融合蛋白同样利用EGF或VEGF与EGF受体或VEGF受体相互作用而达到肿瘤细胞定位目的，但EGF-SEA和VEGF-SEA是利用T淋巴细胞来杀伤肿瘤的，这与EGF-毒素或VEGF-毒素融合蛋白的抑制肿瘤的作用原理不同。细胞因子-超抗原融合蛋白实际上是代替现有技术的抗体的，也具有靶向作用，是区别于抗体的新的可期待的抗肿瘤药物，实验证明，它可以制备抗人乳腺癌、人结肠癌、人胃癌、人肝癌和人肺癌肿瘤细胞的药物。

所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够动员和激活T淋巴细胞，所述T淋巴细胞具有CD4⁺或CD8⁺特征，并将T淋巴细胞靶向性地定位到肿瘤细胞周围。

所述细胞因子-超抗原融合蛋白诱导T细胞分泌白细胞介素-2、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。

所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人乳腺癌肿瘤细胞周围并诱导和激活T淋巴细胞杀伤人乳腺癌肿瘤细胞。

所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人结肠癌肿瘤细胞周围并诱导和激活T淋巴细胞杀伤人结肠癌肿瘤细胞。

所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人胃癌肿瘤细胞周围并诱导和激活T淋巴细胞杀伤人胃癌肿瘤细胞。

所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人肝癌肿瘤细胞周围并诱导和激活T淋巴细胞杀伤人肝癌肿瘤细胞。

所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人肺癌肿瘤细胞周围并诱导和激活T淋巴细胞杀伤人肺癌肿瘤细胞。

附图说明

图1为被LSS670蛋白染料标记的EGF-SEA和VEGF-SEA分别与T淋巴细胞结合的流式细胞实验的细胞分布。(图中：1-1为不加蛋白，1-2为EGF-SEA，1-3为VEGF-SEA)

图2为SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA诱导T淋巴细胞分泌细胞因子：IL-2、IFN-γ和TNF-α。

图3为被LSS670蛋白染料标记的EGF-SEA和VEGF-SEA分别与MCF-7乳腺癌肿瘤细胞结合的流式细胞实验的细胞分布。(图中：3-1为不加蛋白，3-2为EGF-SEA，3-3为VEGF-SEA)

图4为根据流式细胞实验所得到的MCF-7乳腺癌、Caco-2结肠癌、NCI-N87胃癌、HepG2肝癌和A549肺癌人肿瘤细胞分别与被标记的EGF-SEA或VEGF-SEA结合的百分比数。

图5为在不加蛋白、分别加SEA、EGF-SEA或VEGF-SEA情况下，肿瘤细胞周围的T细胞数量分布。

图6为显微镜观察MCF-7肿瘤细胞。(图中：6-1为EGF-SEA组，6-2为VEGF-SEA组)

图7为显微镜观察Caco-2肿瘤细胞。(图中：7-1为不加蛋白的对照组，7-2为SEA组，7-3为EGF-SEA组，7-4为VEGF-SEA组)

图8为T细胞对5种肿瘤细胞杀伤的细胞毒作用。

图9为单克隆MCF-7肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中：9-1和9-2为表达EGF-SEA，9-3和9-4表达VEGF-SEA，9-1和9-3为普通显微镜观察，9-2和9-4为荧光显微镜观察)

图10为单克隆Caco-2肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中：10-1和10-2为表达EGF-SEA，10-3和10-4表达VEGF-SEA，10-1和10-3为普通显微镜观察，10-2和10-4为荧光显微镜观察)

图11为单克隆NCI-N87肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中：11-1和11-2为表达EGF-SEA，11-3和11-4表达VEGF-SEA，11-1和11-3为普通显微镜观察，11-2和11-4为荧光显微镜观察)

图12为单克隆Hep G2肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中：12-1和12-2为表达EGF-SEA，12-3和12-4表达VEGF-SEA，12-1和12-3为普通显微镜观察，12-2和12-4为荧光显微镜观察)

图13为单克隆A549肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中：13-1和13-2为表达EGF-SEA，13-3和13-4表达VEGF-SEA，13-1和13-3为普通显微镜观察，13-2和13-4为荧光显微镜观察)

图14为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆MCF-7肿瘤细胞。(图中：14-1和14-2为表达EGF-SEA组，14-3和14-4为表达VEGF-SEA组，14-1和14-3为普通显微镜观察，14-2和14-4为荧光显微镜观察)

图15为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆Caco-2肿瘤细胞。(图中：15-1和15-2为表达EGF-SEA组，15-3和15-4为表达VEGF-SEA组，15-1和15-3为普通显微镜观察，15-2和15-4为荧光显微镜观察)

图16为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆NCI-N87肿瘤细胞。(图中：16-1和16-2为表达EGF-SEA组，16-3和16-4为表达VEGF-SEA组，16-1和16-3为普通显微镜观察，16-2和16-4为荧光显微镜观察)

图17为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆Hep G2肿瘤细胞。(图中：17-1和17-2为表达EGF-SEA组，17-3和17-4为表达VEGF-SEA组，17-1和17-3为普通显微镜观察，17-2和17-4为荧光显微镜观察)

图18为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆A549肿瘤细胞。(图中：18-1和18-2为表达EGF-SEA组，18-3和18-4为表达VEGF-SEA组，18-1和18-3为普通显微镜观察，18-2和18-4为荧光显微镜观察)

具体实施方式

本发明利用细胞因子-超抗原融合蛋白质，其中的促进癌细胞生长的细胞因子可以将融合蛋白质定位到肿瘤细胞上，而超抗原则在肿瘤细胞周围引起抗癌的免疫反应，即超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(Superantigen-dependent-cellular-cytotoxicity，SDCC)。利用此方法就可以将这种类型的融合蛋白质特异地定位到肿瘤细胞上并在肿瘤细胞周围引起抗癌的细胞毒免疫反应。下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1融合蛋白诱导T淋巴细胞活性

外周血细胞购自天津血液中心以及从健康人获得，用Ficoll密度离心和尼龙毛柱方法法取得T淋巴细胞(J Clin Invest，91，1490-1498，1993)，以后再用利用试剂盒Human CD4⁺T Cell Enrichment Column和Human CD8⁺T Cell Enrichment Column(R&D Systems公司)分离纯化CD4和CD8阳性T淋巴细胞，将CD4和CD8细胞分别计数并等量混合。

利用已申请专利(中国专利申请号200310109829.7“一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产方法”和中国专利申请号201010118438.1“细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用”)中的SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA来诱导这些T细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α。这里的超抗原SEA含有D227A的点突变，融合蛋白中的EGF和VEGF都是人的EGF和VEGF的基因，而且蛋白都经过变复性以及纯化等操作。

为了分析EGF-SEA和VEGF-SEA与T细胞相互作用，用流式细胞方法。按照LSS670蛋白染料(Kodak公司)说明书的方法将染料分别标记到EGF-SEA和VEGF-SEA，1500rpm离心收集肿瘤细胞，PBS重悬浮。CD4和CD8细胞等量混合T细胞(2x 10⁶)分别用50pmol的LSS670染料标记的EGF-SEA或VEGF-SEA蛋白4℃孵育30分钟，然后用冷PBS洗3次。通过流式细胞仪BD FACS Calibur分析EGF-SEA和VEGF-SEA结合T细胞能力。图1表明90-95％以上的T细胞能与被标记的EGF-SEA(图1-2)或VEGF-SEA(图1-3)结合，而图1-1是不加蛋白仅仅是T细胞的对照样品。同时对于SEA进行了同样的操作，发现90％以上T细胞也能与SEA结合。所以EGF-SEA和VEGF-SEA与SEA一样有着同样的与T细胞相互作用的功能。

用DMEM培养基培养纯化后的T细胞，然后分别加入SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA蛋白，用ELISA试剂盒(R&D Systems公司)检测培养基中由T细胞受到SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA诱导后分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的量。图2表明EGF-SEA和VEGF-SEA能和SEA一样诱导和刺激T细胞分泌细胞因子，也就是能够诱导和激活T淋巴细胞。

上面的实验说明了EGF-SEA和VEGF-SEA通过融合蛋白中的超抗原SEA来诱导和激活T淋巴细胞，促使被活化的T细胞分泌各种细胞因子。

实施例2融合蛋白与人肿瘤细胞相互作用

所有人肿瘤细胞株从美国ATCC(American Type Culture Collection)机构和中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库等细胞库购得。用被LSS670染料标记的EGF-SEA和VEGF-SEA来分析融合蛋白与肿瘤细胞的相互作用，即进行流式细胞实验分析，各种肿瘤细胞(2x10⁶)分别用50pmol的LSS670染料标记的EGF-SEA或VEGF-SEA蛋白4℃孵育30分钟，然后用冷PBS洗3次，通过流式细胞仪分析EGF-SEA和VEGF-SEA结合肿瘤细胞的能力。

图3是被标记融合蛋白分别与MCF-7人乳腺癌肿瘤细胞进行流式细胞实验的细胞分布，显示85％以上的肿瘤细胞能够与标记的EGF-SEA(图3-2)或VEGF-SEA(图3-3)相结合，而图3-1是不加蛋白仅是MCF-7肿瘤细胞的对照样品。图4是根据流式细胞实验所得的MCF-7人乳腺癌、Caco-2人结肠癌、NCI-N87人胃癌、Hep G2人肝癌和A549人肺癌的肿瘤细胞分别与标记EGF-SEA或VEGF-SEA结合的百分比数，在只有标记蛋白存在的情况下，显示80％以上肿瘤细胞与标记融合蛋白结合，而在等量标记蛋白和未标记蛋白一起孵育即有竞争性结合的情况下，肿瘤细胞与标记融合蛋白结合数下降到50％左右，这表明EGF-SEA和VEGF-SEA不仅能与这些人肿瘤细胞相互作用，而且这些肿瘤细胞表面上有大量EGFR和VEGFR存在。

实施例3融合蛋白诱导T淋巴细胞集结在肿瘤细胞周围并杀伤肿瘤细胞

在6孔板上用DMEM培养基培养人肿瘤来源的MCF-7、Caco-2、NCI-N87、Hep G2和A549肿瘤细胞，浓度为2x10⁵个/孔，然后加入T细胞，再分别加入SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA。

细胞毒作用或癌细胞杀伤效果采用MTT(Methabenzthiazuron)法测定(Immunology，82，117-125，1994)，细胞生长抑制用100-[(A_test-A_b)/(A_c-A_b)]x 100公式计算，A_test指的是有T细胞加入下的癌细胞生长，A_b指的是孔中只有培养基，A_c指的是癌细胞生长。以后每种癌细胞杀伤实验的次数都在20以上。

实验一、在不同效靶比条件下杀伤肿瘤细胞

效靶比是指T细胞与肿瘤细胞数量之比，在5∶1、10∶1和20∶1的情况下，分别加入10pmol浓度的SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA，结果在表1，随着T细胞数量的增加，肿瘤细胞杀伤效果也增加，在T细胞与肿瘤细胞20∶1条件下，经80小时培养后测定，EGF-SEA和VEGF-SEA杀伤率或细胞毒作用达到60(％)以上(表1)，而SEA的效果要比EGF-SEA和VEGF-SEA低。另外在不加蛋白仅加T细胞的情况下，细胞毒作用发现在10(％)以下。

表1为T细胞与肿瘤细胞不同数量之比的共培养，在SEA、EGF-SEA或VEGF-SEA诱导下，T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒作用。

实验二、在不同蛋白浓度下杀伤肿瘤细胞

在各种肿瘤细胞培养液中加入效靶比为10∶1的T细胞，然后加入各种浓度的蛋白，表2显示随着蛋白浓度的增加，肿瘤细胞杀伤效果也增加，15pmol情况下杀伤效果最好，EGF-SEA和VEGF-SEA的杀伤效果约在60(％)-70(％)之间，而SEA的效果要比EGF-SEA和VEGF-SEA低。另外在不加蛋白的仅加T细胞的情况下，细胞毒作用发现在3(％)-10(％)之间。

表2为在SEA、EGF-SEA或VEGF-SEA不同蛋白浓度的诱导下，T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒作用。

实验三、EGF-SEA和VEGF-SEA集结T细胞于肿瘤细胞周围

以T细胞与肿瘤细胞之比为25∶1条件下与5种肿瘤细胞共培养，再分别加入10pmol的SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA，还有一种是不加蛋白的作为对照，5小时后，收集细胞并1300rpm离心，用DMEM培养基漂洗，在显微镜下计数，大细胞是肿瘤细胞，小细胞是T细胞。

图5是结果，显示在EGF-SEA或VEGF-SEA作用下，有大量的T细胞集结在肿瘤细胞周围，数量都在15个以上，SEA组与不加蛋白组的T细胞很少，只有1-2个。

图6是显微镜观察显示MCF-7肿瘤细胞旁有大量T细胞，黑色箭头所指的小细胞就是T细胞，而大细胞是肿瘤细胞，图6-1是EGF-SEA组，图6-2是VEGF-SEA组。

图7是显微镜观察显示Caco-2肿瘤细胞趋于凋亡现象，深色大细胞就是处于死亡的肿瘤细胞，图7-1是不加蛋白的对照组，图7-2是加SEA组，图7-3是EGF-SEA组，图7-4是VEGF-SEA组，经EGF-SEA和VEGF-SEA诱导后，肿瘤细胞大量死亡。

乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌都有EGFR和VEGFR的高表达，所以EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白中的人来源的EGF和VEGF就能与这些肿瘤细胞上的EGFR和VEGFR相互作用，也就是能够与这些肿瘤细胞相互作用并在细胞表面上集结，T细胞则由于融合蛋白中的SEA存在而被吸引到肿瘤细胞旁。

SEA由于没有EGF或VEGF那样肿瘤细胞靶向定位的功能，不仅肿瘤细胞杀伤能力低(表1和表2)，而且不能集结T细胞在肿瘤细胞周围(图5)，所以凋亡的肿瘤细胞很少(图7-2)。

而不加蛋白的对照组，虽然T细胞与肿瘤细胞共培养，但是T细胞杀伤肿瘤细胞的细胞毒作用都在10％以下，比SEA组更低，几乎没有凋亡的肿瘤细胞(图7-1)。

实施例4带有荧光蛋白GFP的SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA的构建

动物细胞表达的分泌型蛋白要比大肠杆菌表达体系更具有良好的生物活性，而利用绿色荧光蛋白GFP(Green fluorescent protein，GFP)能够实时实地跟踪蛋白的生物活性。

据文献和GenBank的SEA(NC_003923)、EGF-SEA(NM_001963)和VEGF(NM-003376)序列合成基因(大连宝生物公司)。先将SEA基因片段插入到pEGFP-N1载体(Clontech公司)上的Kpn I和Apa I位点之间，同时在SEA之前增加一个Pvu II限制性酶切位点，然后将信号肽序列插入到SEA之前的Pst I位点处，同时在信号肽序列之后增加一个Sfi I限制性酶切位点，由此在信号肽和SEA直接共有五个酶切位点：Sfi I，PstI，Sal I，Kpn I和Pvu II。信号肽序列采用人白蛋白(CAA00844)的18个氨基酸信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS)。

这五个限制酶位点区可供各种基因片段的插入，以及用作后续实验中的单双酶切位点，最后将EGF-SEA或VEGF基因片段插入到信号肽序列和SEA之间，这样就产生了SEA(GFP)、EGF-SEA(GFP)和VEGF-SEA(GFP)三种带有荧光蛋白标记的蛋白。

实施例5带有荧光蛋白GFP的EGF-SEA和VEGF-SEA诱导T细胞来杀伤肿瘤细胞

把含有SEA、EGF-SEA、VEGF-SEA片段的三种pEGFP-N1载体利用脂质体Lipofectamine^TM2000(Invitrogen公司)方法转入MCF-7、Caco-2、NCI-N87、Hep G2和A549人肿瘤细胞，用G418抗生素进行多次筛选，得到瞬间暂时表达型和永久表达单克隆细胞株，这些细胞都能表达分泌型的带有GFP的SEA、EGF-SEA、VEGF-SEA，在荧光显微镜下可看到发绿光细胞。

在与T细胞共培养下，EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白能够诱导T细胞来杀伤肿瘤细胞。表3是与肿瘤细胞共培养下的T细胞在5种单克隆细胞株(MCF-7、Caco-2、NCI-N87、Hep G2和A549)分别永久表达SEA、EGF-SEA、VEGF-SEA的诱导下对肿瘤细胞(即单克隆细胞)的细胞毒作用，T细胞与肿瘤细胞之比是10∶1，30小时及80小时培养后进行测定。结果显示SEA组的肿瘤细胞杀伤作用不超过12(％)，而EGF-SEA和VEGF-SEA组的五种肿瘤细胞杀伤作用超过50(％)甚至达到70(％)。而不加蛋白的对照组即只转染空质粒pEGFP-N1的肿瘤细胞与T细胞共培养时，T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用低于SEA组，不到3(％)(图8)。

表3为T细胞与表达SEA、EGF-SEA或VEGF-SEA单克隆肿瘤细胞共培养下，T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒作用。

图8是对于上面T淋巴细胞与肿瘤细胞(10∶1)共培养时间经过3天即72小时后检查T细胞对于肿瘤细胞的杀伤作用，结果表明在单克隆肿瘤细胞分泌表达EGF-SEA或VEGF-SEA的诱导下，T细胞对于肿瘤细胞的杀伤作用即细胞毒作用都超过了50(％)，而T细胞对于SEA组的肿瘤细胞的杀伤力很低，而对照组即只转染空质粒pEGFP-N1的肿瘤细胞与T细胞共培养时，T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用不到3(％)。

图9至图13是分别表达EGF-SEA和VEGF-SEA的MCF-7、Caco-2、NCI-N87、Hep G2和A549单克隆细胞，荧光显微镜下发光细胞是表达带有GFP荧光蛋白的融合蛋白的肿瘤细胞。

图9是MCF-7肿瘤细胞表达EGF-SEA(图9-1和9-2)和VEGF-SEA(图9-3和9-4)，图9-1和图9-3是普通显微镜观察，图9-2和图9-4是荧光显微镜观察。图10是Caco-2肿瘤细胞表达EGF-SEA(图10-1和10-2)和VEGF-SEA(图10-3和10-4)，图10-1和图10-3是普通显微镜观察，图10-2和图10-4是荧光显微镜观察。图11是NCI-N87肿瘤细胞表达EGF-SEA(图11-1和11-2)和VEGF-SEA(图11-3和11-4)，图11-1和图11-3是普通显微镜观察，图11-2和图11-4是荧光显微镜观察。图12是Hep G2肿瘤细胞表达EGF-SEA(图12-1和12-2)和VEGF-SEA(图12-3和12-4)，图12-1和图12-3是普通显微镜观察，图12-2和图12-4是荧光显微镜观察。图13是A549肿瘤细胞表达EGF-SEA(图13-1和13-2)和VEGF-SEA(图13-3和13-4)，图13-1和图13-3是普通显微镜观察，图13-2和图13-4是荧光显微镜观察。

图14至图18是被单克隆肿瘤细胞表达的EGF-SEA和VEGF-SEA所诱导的T细胞集结在这些肿瘤细胞周围并攻击肿瘤细胞，从而导致肿瘤细胞凋亡(结果在表3)，荧光显微镜下发光细胞是表达带有GFP荧光蛋白的融合蛋白的肿瘤细胞。

图14是T细胞攻击表达EGF-SEA(图14-1和14-2)或VEGF-SEA(图14-3和14-4)的MCF-7肿瘤细胞，图14-1和图14-3是普通显微镜观察，小细胞是T细胞，集结在肿瘤细胞周围(大细胞)，图14-2和图14-4是荧光显微镜观察。图15是T细胞攻击表达EGF-SEA(图15-1和15-2)或VEGF-SEA(图15-3和15-4)的Caco-2肿瘤细胞，图15-1和图15-3是普通显微镜观察，小细胞是T细胞，集结在肿瘤细胞周围(大细胞)，图15-2和图15-4是荧光显微镜观察。图16是T细胞攻击表达EGF-SEA(图16-1和16-2)或VEGF-SEA(图16-3和16-4)的NCI-N87肿瘤细胞，图16-1和图16-3是普通显微镜观察，小细胞是T细胞，集结在肿瘤细胞周围(大细胞)，图16-2和图16-4是荧光显微镜观察。图17是T细胞攻击表达EGF-SEA(图17-1和17-2)或VEGF-SEA(图17-3和17-4)的Hep G2肿瘤细胞，图17-1和图17-3是普通显微镜观察，小细胞是T细胞，集结在肿瘤细胞周围(大细胞)，图17-2和图17-4是荧光显微镜观察。图18是T细胞攻击表达EGF-SEA(图18-1和18-2)或VEGF-SEA(图18-3和18-4)的A549肿瘤细胞，图18-1和图18-3是普通显微镜观察，小细胞是T细胞，集结在肿瘤细胞周围(大细胞)，图18-2和图18-4是荧光显微镜观察。

上面一系列实施例表明EGF-SEA和VEGF-SEA能够与MCF-7乳腺癌、Caco-2结肠癌、NCI-N87胃癌、Hep G2肝癌和A549肺癌肿瘤细胞相互作用，又能诱导和刺激T淋巴细胞集结于这些肿瘤细胞周围，从而产生强大的杀伤肿瘤细胞的细胞毒作用。

上述实验结果表明细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，所述细胞因子为表皮生长因子或血管内皮细胞生长因子，所述超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素A的超抗原。

所述癌为人乳腺癌、人结肠癌、人胃癌、人肝癌或人肺癌。

本发明选择了一个崭新的战略，将超抗原连接到细胞因子上，这样产生了新型的细胞因子-超抗原融合蛋白质，作为一个模型，本发明使用EGF和VEGF分别与SEA来构建这种新型的融合蛋白质。在此虽然只选择超抗原SEA，超抗原还可以选自：金黄色葡萄球菌肠毒素家族的SEB、SEC、SED、SEE，链球菌毒素的SPE-A、SPE-B、SPE-C，休克综合征毒素(Shock syndrometoxin)，病毒蛋白以及其氨基酸序列有70％以上的相同性的自然和人为的变异体等，也能够说明本发明的思想。超抗原SEA或其它超抗原的作用是激发机体内的免疫反应。

同样，作为实验材料的表皮生长因子EGF和血管内皮细胞生长因子VEGF只是利用它们肿瘤细胞的定位作用，采用与肿瘤细胞紧密相关的其它细胞因子也能够说明本发明的思想。

这样物质有各种趋化因子(Chemokine)、Ephrin家族、血管生成素(Angiopoietin)、血小板生成素(Thrombopoietin)和血浆第VII因子(Factor VII)、尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator)、促胃液素释放肽(Gastrin-releasingpeptide)、生长激素释放激素(Growth hormone releasing hormone)、促黑激素α-MSH、催乳激素(Prolactin)、催乳激素释放激素(Prolactin releasing hormone)、生长激素(Growthhormone)、促卵泡激素(Follicle stimulating hormone)、胎盘泌乳激素(Placentallactogen)、绒毛膜促性腺激素(Chorionic gonadotropin)和促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin releasing hormone)、生长抑素(Somatostatin)、去唾液酸糖蛋白(Asialoglycoprotein)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein)和转铁蛋白(Transferrin)等，许多肿瘤组织都过量表达这些物质受体，从而趋化因子、酶、激素及其它蛋白等多肽分子配体就可以像细胞因子那样与超抗原连接形成融合蛋白质，将超抗原定位到肿瘤组织内。

融合蛋白质还可以通过化学交联反应等手段分别将细胞因子和超抗原的多肽片段进行连接，例如共价键连接来构建。对于融合蛋白质可以进行化学修饰、缺损融合蛋白质的一部分多肽片段以及将其它多肽连接在这些蛋白质上等一系列的改造。纯化后的融合蛋白质可通过一系列蛋白质的变性和复性过程来完善其包括二硫键在内的空间结构，提高其生物活性。

从更大的范围来看，细胞因子与其癌细胞表面上过度表达的受体实际上是一种配体(Ligand)和受体之间相互作用的关系，利用这种配体和受体的亲和力，将超抗原定位到肿瘤组织。除了细胞因子外，其它有与癌细胞过度表达受体相对应的多肽分子即配体也可用于癌细胞的特异性定位。除了上面所说的与癌细胞上的受体对应的配体外，从噬菌体展示(Phagedisplay)等方法筛选到的与癌细胞上受体或配体有亲和力并有拮抗作用的人工筛选多肽及其它能够直接与癌细胞表面相互作用的多肽分子都可以和超抗原形成融合蛋白质。

作为药物其剂型可以是乳化剂、脂质体、分散剂、稳定剂等一起制成各种注射、口服、敷贴以及手术处理等药物的给药形式。除了融合蛋白质本身可以作为药物外，编码融合蛋白质的核苷酸片段或载体还可以作为基因治疗形式来应用。

本发明的具体实施例中，所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够诱导人来源T淋巴细胞杀伤MCF-7人乳腺癌、Caco-2人结肠癌、NCI-N87人胃癌、Hep G2人肝癌和A549人肺癌肿瘤细胞，而这些肿瘤细胞在许多公开文献以及美国ATCC机构都指出可以形成体内肿瘤。在本发明的启示下本领域的技术人员也应该能够理解，所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够制备抗乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌的药物的用途，包括应用于乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌的体内实体肿瘤治疗药物的用途，以及应用于由乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌所引起的癌转移治疗药物的用途，特别是制备抗人乳腺癌、人结肠癌、人胃癌、人肝癌和人肺癌的药物的用途。

以上实施例和优选实施方式的描述属于对权利要求限定的本发明的示意性说明，而不是限制本发明。需要特别指出的是，只要不脱离本发明的宗旨，所有显而易见的改变以及具有等价代换的相似发明，均包含在本发明的保护范围之内。

序列说明

SEQ ID NO：1的核苷酸序列是编码EGF-SEA融合蛋白；

SEQ ID NO：2是EGF-SEA融合蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO：3的核苷酸序列是编码VEGF-SEA融合蛋白；

SEQ ID NO：4是VEGF-SEA融合蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO：5是连接肽的编码序列；

SEQ ID NO：6是连接肽的氨基酸序列。

Claims (9)

1.细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述细胞因子为表皮生长因子或血管内皮细胞生长因子，所述超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素A的超抗原。

2.根据权利要求1所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够动员人T淋巴细胞，并将所述T淋巴细胞靶向性地定位到肿瘤细胞周围，所述人T淋巴细胞具有CD4⁺或CD8⁺特征。

3.根据权利要求1所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述细胞因子-超抗原融合蛋白能诱导人T淋巴细胞分泌细胞因子白细胞介素-2、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。

4.根据权利要求1所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述癌为乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌或肺癌。

5.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述乳腺癌为人乳腺癌。

6.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述结肠癌为人结肠癌。

7.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述胃癌为人胃癌。

8.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述肝癌为人肝癌。

9.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述肺癌为人肺癌。

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