WO2013075553A1 - 癌靶向超抗原融合蛋白、其制备方法和用途 - Google Patents

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孙嘉琳
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Sun Jialin
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    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Definitions

  • the invention relates to a super antigen fusion protein, a preparation method and application thereof, in particular to a cancer targeting super antigen and a mutant fusion protein thereof, a preparation method and use thereof.
  • the superantigen fusion protein is applied to drug research of cancer, for example, a fusion protein composed of a cytokine and a superantigen (Chinese Patent Application No. 200310109829. 7, "a super antigen fusion protein which can be used for anticancer treatment and a production method thereof"; Chinese Patent Application No. 201010118438. 1, “Application of cytokine-superantigen fusion protein in the preparation of anti-solid tumor drugs”; Chinese Patent Application No. 201010585818. 6, “Application of cytokine-superantigen fusion protein in the preparation of anticancer drugs” ; PLoS One 6, el6642, 2011), a fusion protein constructed by hormone and superantigen (Chinese Patent Application No. 200510078775.
  • SEA Staphylococcal-enterotoxin A
  • active and valuable substances such as compounds, nucleic acids, polypeptides, etc. can increase their activity or utilization value by modifying their structures.
  • large-scale multi-point mutation, fragment replacement, and amino acid removal can be performed by enzymes. Or increase the means to improve the catalytic activity of the enzyme, heat resistance, low temperature resistance, acid resistance, alkali resistance, organic solvent resistance and the like. Therefore, by large-scale point mutation modification of superantigens, it is expected to create a super-antigen with higher biological activity.
  • a second object of the present invention is to provide a method for preparing a superantigen fusion protein.
  • a third object of the invention is to provide a use of a superantigen fusion protein.
  • a cancer-targeting superantigen fusion protein comprising:
  • a ligand that promotes growth of cancer cells and interacts with cancer cells overexpressing a receptor which is a cytokine, hormone or non-antibody non-cytokine non-hormone polypeptide;
  • SEE superantigen Staphylococcal-enterotoxin E
  • the cytokine is selected from the group consisting of transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ) abbreviated as TGF- ⁇ , EGF epithelial growth factor (EGF), vascular endothelial cell abbreviated as VEGF Vascular endothelial cel l growth factor (VEGF); the hormone is selected from the group Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is written as GnRH; the non-antibody non-cytokine non-hormone polypeptide is selected from Gastrin-releasing peptide (GRP) abbreviated as GRP.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • VEGF vascular endothelial cell
  • GnRH Gonadotropin-releasing hormone
  • GRP Gastrin-releasing peptide
  • the SEE is the amino acid sequence of SEQ ID No. 2; the SEE-1 is the amino acid sequence of SEQ ID No. 4; and the SEE-2 is the amino acid sequence of SEQ ID No. 6. SEE-3 is the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 8.
  • the SEE-1 is 20 bits, 21 bits, 24 bits, 27 bits, 34 bits, 39 bits, 40 bits, 1 bit, 42 bits, 44 bits, 49 bits, 74 bits, 75 bits, and 78 bits on the SEE.
  • One or more amino acids at positions 79, 81, 83, 84, 217, 220, 222, 223, 225, and 227 are replaced.
  • the SEE-2 is 20, 21, 24, 27, 34, 35, 39, 40, 41 on the SEE,
  • the SEE-3 is 20, 21, 24, 27, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46 on the SEE , 49, 62, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 83, 84, 188, 190, 217, 218, 219, 220, 221
  • One or more amino acids at position, 222, 223, 224, 225, and 227 are replaced.
  • the fusion protein is: TGF-a-SEE represented by SEQ ID No. 10; EGF-SEE represented by SEQ ID No. 18; VEGF-SEE represented by SEQ ID No. 26; GnRH-SEE represented by ID No. 34; GRP-SEE represented by SEQ ID No. 42; TGF- ⁇ -SEE-1 represented by SEQ ID No. 12; represented by SEQ ID No. 20.
  • VEGF-SEE-2 represented by SEQ ID No. 30; GnRH-SEE-2 represented by ID No. 38; GRP-SEE-2 represented by SEQ ID No. 46; TGF- ⁇ -SEE-3 represented by SEQ ID No. 16; SEQ ID No. EGF-SEE-3 shown in 24; VEGF-SEE-3 represented by SEQ ID No. 32; GnRH-SEE-3 shown by SEQ ID No. 40; or SEQ ID No. 48 GRP-SEE-3.
  • a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding the fusion protein of claim 7, wherein the nucleotide sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 9; and the core encoding SEQ ID No. a nucleotide sequence of SEQ ID No. 11; a nucleotide sequence of SEQ ID No. 14; SEQ ID No. 13; a nucleotide sequence encoding SEQ ID No. 16; SEQ ID No. 15; encoding SEQ ID No. 18. Nucleotide sequence SEQ ID No. 17; nucleotide sequence encoding SEQ ID No. 20 SEQ ID No. 19; nucleotide sequence encoding SEQ ID No.
  • nucleotide sequence of No. 48 is shown in SEQ ID No. 47.
  • a method for preparing a cancer-targeting superantigen fusion protein culturing a host cell containing the above recombinant vector, collecting expression A cancer-targeting superantigen fusion protein.
  • a cancer-targeting superantigen fusion protein for use in the preparation of a medicament for treating cancer and against solid tumors.
  • Figure 1 shows that TGF-ci and SEE or SEE mutants constitute a fusion protein that inhibits S180 tumor growth, indicating tumor growth curve and tumor weight after mouse dissection.
  • Figure 2 is a fusion protein composed of EGF and SEE or SEE mutants to inhibit S180 tumor growth, showing tumor growth curve and tumor weight after mouse dissection.
  • Figure 3 is a fusion protein of VEGF and SEE or SEE mutants to inhibit S180 tumor growth, showing tumor growth curve and tumor weight after mouse dissection.
  • FIG. 4 shows the T cells detected by immunohistochemistry, and the brown dots are T cells.
  • 4-1 is the TGF-ci-SEE-3 administration group
  • 4-2 is the EGF-SEE-3 administration group
  • 4_3 is the VEGF-SEE-3 administration group
  • FIG. 5 shows the interferon-Y (IFN- y) secreted by T cells detected by immunohistochemistry, and the brown part is IFN- y.
  • 5-1 is the TGF-a-SEE-3 administration group; 5-2 is the EGF-SEE-3 administration group; 5-3 is the VEGF-SEE-3 administration group
  • Fig. 6 is GnRH and The SEE or SEE mutants constitute a fusion protein that kills Hep G2 liver cancer cells.
  • Figure 7 shows a fusion protein composed of GRP and SEE or SEE mutants to kill A549 lung cancer cells.
  • FIG. 8 shows cancer cells attacked by T cells, large cells are cancer cells, and small cells are T cells.
  • 8-1 is GnRH-SEE-3 group
  • 8-2 is GRP-SEE-3 group
  • SEA point mutation
  • finding a superantigen that is better than SEA and performing a multi-point mutation in the structure of the protein can greatly improve the biological activity of the superantigen and achieve better cancer treatment.
  • the superantigens derived from S. aureus are SEA, SEB, SEC, SED, SEF, SEG, SEH, SEI, SEJ, etc., which have structural similarities (Infect Immun, 66, 3337-3348, 1998), Therefore, their spatial structure can also be referred to each other, for example, SEA (EMB0 J, 14, 3292-3301, 1995; J Biol Chem, 271, 32212-32216, 1996; J Mol Biol, 269, 270-280, 1997; Structure, 10, 1619-1626, 2002), SEB and SEC (Nature: 368, 711-718, 1994; Nature, 384, 188-192, 1996; J Mol Biol, 277, 61-79, 1998; Structure, 11, 1151 -1161, 2003), SHE (EMBO J, 20, 3306-3312, 2001; J Mol Biol, 302, 527-537, 2000), and other related literature (Nature, 346, 471-473, 1990; Infect Immun, 59, 2126-2
  • the present invention selects SEE, which has a large similarity to SEA but is more stable than SEA (J Biol Chem, 275, 1665-1672, 2000), and can introduce large-scale multipoint mutations in the amino acid sequence of SEE.
  • the basis for point mutation is:
  • the superantigen and tissue can be reduced or reduced.
  • the interaction between compatible antigens can be changed by changing the properties of the amino acid in the region where the superantigen interacts with the histocompatibility antigen, such as changing the polarity and length of the amino acid interacting with the histocompatibility antigen in the superantigen.
  • the modified superantigen fusion protein is selected from a ligand (Ligand) that interacts with a receptor (Receptor) that is abundantly expressed on the surface of cancer cells, such as a cytokine, a hormone or a non-antibody non-cytokine non-hormone polypeptide,
  • a ligand that interacts with a receptor (Receptor) that is abundantly expressed on the surface of cancer cells
  • Receptor receptor
  • the cytokine is TGF-a, EGF or VEGF
  • the hormone GnRH the non-antibody non-cytokine non-hormone polypeptide
  • GRP non-antibody non-cytokine non-hormone polypeptide
  • the superantigen is the superantigen SEE of Staphylococcus aureus enterotoxin E, which is represented by SEQ ID No. 2;
  • the superantigen is a SEE mutant engineered by a multipoint mutation, wherein the mutant SEE-1 is represented by SEQ ID No. 4, the mutant SEE-2 is represented by SEQ ID No. 6, and the mutant SEE-3 is SEQ ID. No. 8;
  • the multi-point mutation occurs at 20, 21, 24, 27, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 49, 62, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 83, 84, 188, 190, 217, 218, 219, 220, 221 222, 223, 224, 225, 227;
  • the amino acid of the multi-point mutation is, at position 20, Arg ⁇ Gly ; at position 21, Asn ⁇ Thr ; at position 24, Ser ⁇ Gly ; at position 27, Arg ⁇ Lys ; at position 34 , Glu ⁇ Ser or Glu ⁇ Ala; at position 35, Lys ⁇ Ser; at position 36, Ala ⁇ Gly; at position 39, Glu ⁇ Ser; at position 40, Asn ⁇ Ser or Asn ⁇ Ala; At position 41, Lys ⁇ Glu; at position 42, Glu ⁇ Lys; at position 44, Asp ⁇ Ala or Asp ⁇ Ser; at position 45, Asp ⁇ Ala ; at position 46, Gln ⁇ Ser; at 49 Position, Glu ⁇ Thr or Glu ⁇ Ser; at position 62, Pro ⁇ Ser; at position 74, Lys ⁇ Thr or Lys ⁇ Ser; at position 75, Asp—Ala or Asp ⁇ Thr; at position 77 , Thr ⁇ Ser ; at 78, Asn ⁇ Ser; at position 79,
  • the present invention utilizes a ligand-modified superantigen fusion protein that interacts with a cancer cell receptor, wherein a ligand that interacts with a cancer cell receptor such as a cytokine, a hormone or a non-antibody non-cytokine non-hormone polypeptide can be fused Proteins localize to tumor cells, and modified superantigens cause a more potent anticancer immune response around tumor cells, superantigen-dependent-cel lular-cytotoxicity (SDCC) .
  • SDCC superantigen-dependent-cel lular-cytotoxicity
  • the cancer cell strain used in the examples of the present invention is a mouse sarcoma tumor Sarcoma (S180) tumor cell, a human liver cancer cell Ifep G2, and a human lung cancer cell A549, which are used to establish a mouse tumor-bearing model. These cancer cell lines were purchased from ATCC.
  • EGF receptor EGFR and VEGF receptor VEGFR on mouse S180 cancer cells have been reported to be associated with human-derived EGF and
  • VEGF interaction PoS One 6, el6642, 2011; Chinese Patent Application No. 201010118438. 1, "Application of cytokine-superantigen fusion protein in the preparation of anti-solid tumor drugs"
  • TGF- ⁇ receptor is the same as EGF
  • Both are EGFR, so S180 cancer cells can be used for experiments in which TGF, EGF or VEGF form a fusion protein with SEE or SEE mutants.
  • Hepatoma cells express the GnRH receptor GnRH-R (Endocrinology, 136, 75-84, 1995; Cancer Res, 60, 3701-3705, 2000), so Hep G2 cancer cells can be used to form fusion proteins with GnRH and SEE or SEE mutants. experiment of.
  • Lung cancer cells express the GRP receptor GRP-R (Oncogene, 20, 1563-1569, 2001; Ann Oncol, 18, 1457-1466, 2007), so ⁇ 549 cancer cells can be used for fusion proteins composed of GRP and SEE or SEE mutants. experiment.
  • ⁇ Ser at position 40, Asn ⁇ Ala; at position 41, Lys ⁇ Glu; at position 42, Glu ⁇ Lys; at position 44, Asp ⁇ Ser; at position 45, Asp ⁇ Ala; at 46 In the position, Gln ⁇ Ser ; in the 49 position, Glu ⁇ Ser; in the 62 position, Pro ⁇ Ser; in the 74th position, Lys ⁇ Ser; in the 75th position, Asp ⁇ Thr; in the 77th position, Thr ⁇ Ser; at position 78, Asn ⁇ Ser; at position 79, Lys ⁇ Glu ; at position 81, Lys ⁇ Glu ; at position 83, Lys ⁇ Ser ; at position 84, Lys ⁇ Thr; at position 188 Above, Ser ⁇ Thr; at position 190, Glu ⁇ Thr; at position 217, Lys ⁇ Ser; at position 218, Thr ⁇ Ser; at position 219, I le ⁇ Leu; at 220, Asn ⁇ Ser; at position 221, Ser ⁇ Thr; at position
  • the DNA nucleic acid sequence encoding SEE is derived from its genetic information (J Bacteriol, 170, 2954-2960, 1988;
  • GenBank database, M21319), and the mutant was designed according to Example 1, and the TAKAM company was commissioned to synthesize a DNA fragment comprising a sequence fragment of the SEE gene or its mutant and a linker peptide (shown by SEQ ID NO. 50).
  • the nucleic acid sequence encoding SEE is represented by SEQ ID NO. 1
  • the nucleic acid sequence encoding SEE-1 is represented by SEQ ID NO. 3
  • the nucleic acid sequence encoding SEE-2 is represented by SEQ ID NO. 5, encoding SEE-3.
  • the nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO.
  • the nucleic acid sequence encoding the linker peptide is shown in SEQ ID NO.
  • the company was commissioned to synthesize a nucleic acid sequence fragment including the TGF- ⁇ gene and a few additional restriction endonuclease sites BamHI and EcoRI in front of TGF- ⁇ . Bases, including restriction endonuclease sites of Sai l and Hindl ll behind the fragment.
  • the synthesized nucleic acid fragment was inserted into the T vector and identified by collision sequencing, and then treated with BamHI and Hindl ll by double digestion, and then inserted into pET22b-SEE, pET22b_SEE_l, pET22b_SEE_2 and respectively in Example 2.
  • TGF-a -SEE SEQ ID NO. 10
  • TGF-a-SEE-1 SEQ ID NO. 12
  • TGF-a-SEE-2 SEQ ID NO. 14
  • TGF-a-SEE-3 SEQ ID NO. 16
  • TAKARA was commissioned to synthesize a nucleic acid sequence fragment including the EGF gene and several additional restriction endonuclease sites BamHI and EcoRI in front of EGF.
  • the base which contains the restriction endonuclease sites of Sai l and Hindl ll behind the fragment.
  • the synthesized nucleic acid fragment was inserted into the T vector and identified by DNA sequencing, and then treated with BamHI and Hindl ll by double digestion, and this fragment was inserted into pET22b-SEE, pET22b_SEE_l, pET22b- in Example 2, respectively.
  • Vectors of SEE-2 and pET22b-SEE-3 thus producing expression vectors pET22b_EGF_SEE, pET22b-EGF_SEE_l, pET22b-EGF-SEE-2 and pET22b-EGF-SEE-3, expressing EGF-SEE (SEQ ID NO) 18), EGF-SEE-1 (SEQ ID NO. 20), EGF-SEE-2 (SEQ ID NO. 22) and EGF-SEE-3 (SEQ ID NO. 24) fusion proteins.
  • TAKARA was commissioned to synthesize a nucleic acid sequence fragment including the VEGF gene (121 Amino acids) and several bases of restriction endonuclease sites BamHI and EcoRI were added in front of VEGF, and restriction endonuclease sites of Sai l and Hindl ll were included after the fragment.
  • the synthesized nucleic acid fragment was inserted into the T vector and identified by DNA sequencing, and then treated with BamHI and Hindl ll by double digestion, and then inserted into pET22b-SEE, pET22b_SEE_l, pET22b_SEE_2 and respectively in Example 2.
  • TAKARA was commissioned to synthesize a nucleic acid sequence fragment including the GnRH gene and a few restriction endonuclease sites BamHI and EcoRI in front of GnRH. Bases, including restriction endonuclease sites of Sai l and Hindl ll at the back of the fragment. Will this A synthetic nucleic acid fragment was inserted into the T vector and identified by DNA sequencing, and then treated with BamHI and Hindl ll by double digestion, and this fragment was inserted into pET22b-SEE, pET22b-SEE-l of Example 2, respectively.
  • pET22b-SEE-2 and pET22b-SEE-3 vectors thus producing expression vectors pET22b_GnRH_SEE, pET22b-GnRH-SEE_l, pET22b-GnRH-SEE-2, and pET22b-GnRH-SEE-3, which can express GnRH- SEE (SEQ ID NO. 34), GnRH-SEE-1 (SEQ ID NO. 36), GnRH-SEE-2 (SEQ ID NO. 38) and GnRH-SEE-3 (SEQ ID NO. 40) fusion proteins.
  • GnRH- SEE SEQ ID NO. 34
  • GnRH-SEE-1 SEQ ID NO. 36
  • GnRH-SEE-2 SEQ ID NO. 38
  • GnRH-SEE-3 SEQ ID NO. 40
  • TAKARA was commissioned to synthesize a nucleic acid sequence fragment including GnRH gene and add restriction endonuclease site BamHI in front of GnRH. And several bases of EcoRI, including the restriction endonuclease sites of Sai l and Hindl ll behind the fragment.
  • the synthesized nucleic acid fragment was inserted into the T vector and identified by DNA sequencing, and then treated with BamHI and Hindl ll by double digestion, and this fragment was inserted into pET22b_SEE, pET22b-SEE-1 in Example 2, respectively.
  • E. coli BL21 (DE3) by electroporation, respectively. Positive bacteria were screened using the antibiotic Amp (Ampici ll in). The expression, denaturation, and renaturation of the various proteins and the purification process are roughly the same, as follows - E. coli BL21 (DE3) containing the expression plasmid was first cultured at 37 ° C in large scale, followed by IPTG (I sopropylthio-e - D-galactoside) was allowed to grow at a concentration of 1 mM and cultured at 30 ° C overnight to induce expression of the protein.
  • IPTG I sopropylthio-e - D-galactoside
  • the inclusion body protein is denatured with 6M urea and then subjected to multi-stage dialysis.
  • the dialysis solution is a stepwise dilution of urea such as 3 M, 2 M and 1 M, followed by 0.5 M urea, 0.4 M L-arginine. 375 ⁇ ⁇ oxidized glutathione GSSG, 1. 875 mM reduced glutathione GSH, centrifuged and dialyzed, the resulting supernatant is a protein renaturation solution.
  • EGF-SEE-3 VEGF-SEE VEGF-SEE-1 VEGF-SEE-2, VEGF_SEE_3, GnRH-SEE, Gn H-SEE-U GnRH-SEE_2, GnRH_SEE_3, GRP_SEE, GRP-SEE-1, GRP-SEE - 2 and GRP-SEE-3.
  • Mouse sarcoma S180 was purchased from ATCC, first cultured in vitro, injected into the peritoneal cavity of ICR mice, and cultured in vitro. Finally, the intraperitoneal cavity was taken out. S180 cells, 2 ⁇ 10 6 mouse sarcoma cells S180 were inoculated into the right axilla of ICR mice.
  • TGF-a-SEE TGF-a-SEE
  • TGF-a-SEE TGF-a-SEE were injected on days 2, 4, 6, and 8 after inoculation of tumor cells.
  • - 1 TGF-a-SEE-2 and TGF-a-SEE-3 fusion protein, the dose was 100 pmol
  • the control group was only injected with normal saline, and the mice were killed on the 9th day.
  • TGF-a-SEE, TGF-a-SEE-1, TGF-a-SEE-2 and TGF-a-SEE-3 inhibited tumor growth, among them, TGF-a-SEE-2 and TGF-a-SEE-3 showed better results, tumors appeared 1 to 2 days later than the other groups, and small tumors appeared on the 7th day of the TGF-a-SEE-3 treatment group (Fig. 1).
  • Example 11 EGF-SEE, EGF-SEE-U EGF-SEE-2 and EGF-SEE-3 fusion proteins inhibit mouse tumor experiments 150 tumor-bearing mice in Example 9 were divided into 5 groups, each group 30 Only, on days 2, 4, 6, and 8 after inoculation of tumor cells, EGF-SEE, EGF-SEE-1, EGF-SEE-2 and E EGF-SEE-3 fusion proteins were injected at a dose of lOO pmol. The control group was only injected with normal saline, and the mice were killed on the 9th day.
  • EGF-SEE, EGF-SEE-K EGF-SEE-2 and EGF-SEE-3 inhibited tumor growth, among which EGF-SEE-2 and EGF-SEE-3 showed better results.
  • VEGF-SEE VEGF-SEE.
  • VEGF_SEE_1, VEGF-SEE-2 and VEGF-SEE-3 fusion proteins inhibit mouse tumors
  • the 150 tumor-bearing mice in Example 9 were divided into 5 groups, 30 in each group.
  • VEGF-SEE, VEGF-SEE-1, and VEGF were injected on days 2, 4, 6, and 8 after inoculation of tumor cells.
  • - SEE-2 and VEGF-SEE-3 fusion protein at a dose of 100 pmol.
  • the control group was injected with only normal saline, and the mice were sacrificed on the 9th day.
  • the results showed that VEGF-SEE, VEGF_SEE_1, VEGF_SEE_2 and VEGF-SEE-3 all inhibited tumor growth.
  • VEGF_SEE_2 and VEGF_SEE_3 showed better results, and tumors appeared 1-2 days later than other groups, VEGF-SEE Small tumors appeared on day 7 of the -3 medication group ( Figure 3).
  • mice administered with various fusion proteins in Examples 10-12 and the mouse S 180 tumor tissues of the control saline were cut into small pieces, embedded in paraffin, and then subjected to immunization. Histochemistry experiments.
  • To detect T cells in tumor tissues Santa Cruz Biotechno log anti-CD3 antibody was used, followed by secondary antibody and avidin-b iotin-perxidase comp l ex (Zymed), and finally with Diaminobenzidine (DAB).
  • DAB Diaminobenzidine
  • Figure 4 (in the figure: 4-1 is the TGF-a-SEE-3 administration group; 4-2 is the EGF-SEE-3 administration group; 4-3 is the VEGF-SEE-3 administration group) only by SEE
  • the experimental results of the fusion protein consisting of -3, T cells detected by immunohistochemistry, brown dots are T cells.
  • TGF_ a _SEE TGF- a - SEE-1, TGF- a -SEE-2, EGF-SEE, EGF-SEE-1, EGF-SEE-2, VEGF-SEE, VEGF-SEE-1 and VEGF
  • TGF_ a _SEE TGF- a - SEE-1, TGF- a -SEE-2, EGF-SEE, EGF-SEE-1, EGF-SEE-2, VEGF-SEE, VEGF-SEE-1 and VEGF
  • the cytokine IFN- ⁇ secreted by T cells in the tumor tissues of Examples 10-12 was examined by an immunohistochemical method similar to that of Example 13, and the antibody was an anti-IFN- ⁇ antibody of Santa Cruz Biotechno log.
  • Figure 5 (In the figure: 5-1 is the TGF- ⁇ -SEE-3 administration group; 5-2 is the EGF-SEE-3 administration group; 5-3 is the VEGF-SEE-3 administration group)
  • the interferon-Y (IFN- ⁇ ) secreted by T cells was detected, and the brown part was IFN- y.
  • TGF_ a _SEE TGF- a- SEE-1, TGF-a-SEE-2, EGF-SEE, EGF-SEE-1, EGF-SEE-2
  • IFN- ⁇ induced by T cells was also found in mouse tumor tissues of the administration group of VEGF-SEE, VEGF-SEE-1 and VEGF-SEE-2 fusion proteins.
  • GnRH-SEE, GnRH-SEE-1, GnRH_SEE_2, GnRH-SEE-3, GRP_SEE, GRP_SEE_1, GRP-SEE-2 and D GRP-SEE-3 fusion proteins used in cancer cell culture experiments The fetal bovine cultured calf serum was diluted and then incubated at 37 ° C for 5 hours, after which all of the fusion proteins used in the experiments of all cancer cells were incubated with calf serum.
  • the incubation experiment here is to test the bioactivity of the fusion protein in the presence of basic antibodies (IgM and IgG, etc.) against calcareous degradation and thermostability in calf serum and anti-superantigen in serum. A change has occurred.
  • Human peripheral blood cells were purchased from the Tianjin Blood Center, and sputum lymphocytes were obtained by Ficoll density centrifugation and nylon hair column method (J Cl in Invest, 91, 1490-1498, 1993). These T cells were cultured in DMEM medium on 6-well plates. And add 10% calf serum.
  • Table 1 shows the ability of GnRH-SEE, GnRH_SEE_l, GnRH-SEE-2 and GnRH-SEE-3 fusion proteins to stimulate T cells, and the cytokine IFN- ⁇ was detected.
  • Table 1 detects the cytokine IFN- Y (pg/ml)
  • Table 2 shows the ability of GRP-SEE, GRP-SEE-U GRP-SEE-2 and GRP-SEE-3 fusion proteins to stimulate T cells, and the cytokine IFN- y was detected.
  • Human cancer cell-derived hepatoma cells Hep G2 and lung cancer cells A549, cancer cells were cultured in DMEM medium on a 6-well plate. The number is 5 x 10 5 cancer cells/well, then T cells are added, which is 10 times that of cancer cells, ie 5 X 10 6 T cells/well, and then added with various doses of GnRH-SEE incubated with calf serum.
  • GnRH-SEE- U GnRH_SEE_2, GnRH_SEE_3, GRP-SEE, GRP-SEE-1, GRP_SEE_2 and GRP_SEE_3 fusion proteins wherein the GnRH superantigen fusion protein is added to the hepatoma cell Hep G2 culture well, and the GRP superantigen fusion protein is added to the lung cancer Cell A549 culture wells.
  • the cytotoxic effect or cancer cell killing effect is determined by the MTT (Methabenzthiazuron) method (Immunology, 82,
  • cell growth inhibition is calculated using the formula 100- [(A t . st _A b ) / (A.- A b ) ] x 100
  • a t6St refers to the growth of cancer cells with T cells added.
  • a b refers to the medium only in the well, A. Refers to the growth of cancer cells. The number of killing experiments for each cancer cell in the future was above 20.
  • Figure 6 is an experimental result showing that GnRH_SEE, GnRH-SEE-U GnRH-SEE_2, and GnRH-SEE-3 have the ability to kill 3 ⁇ 4 ⁇ G2 of liver cancer cells, in which GnRH-SEE-2 and GnRH-SEE-3 are at very low doses. There is a higher cancer cell killing effect.
  • FIG 7 shows the results of experiments showing that GRP-SEE, GRP-SEE-U GRP_SEE_2 and GRP_SEE_3 all have the ability to kill lung cancer cells A549, of which GRP-SEE-2 and GRP-SEE-3 are higher at very low doses. Cancer cell killing effect.
  • Figure 8 shows cancer cells attacked by T cells, large cells are cancer cells, and small cells are T cells. .
  • GnRH-SEE GnRH-SEE-1, GnRH-SEE-2, GRP-SEE, GRP-SEE-1 and GRP-SEE-2 groups also observed the phenomenon of cancer cells attacked by T cells.
  • the present invention selects a superantigen SEE and its mutant, so that the SEE mutant has stronger T cell inducing ability than SEE, and is more resistant to antibody neutralization in blood.
  • TGF-a-SEE, EGF_SEE, VEGF_SEE, GnRH-SEE and GRP-SEE composed of SEE
  • TGF-a-SEE-2 composed of SEE-2, EGF-SEE-2, VEGF-SEE-2, GnRH -SEE-2 and GRP-SEE-2 and TGF_a-SEE_3, EGF_SEE_3, VEGF_SEE_3, GnRH-SEE-3 and GRP-SEE-3 fusion proteins composed of SEE-3
  • the mutants SEE-1, SEE-2 and SEE-3 of the superantigen SEE are selected from SEE and introduce a large number of point mutations. Since SEA and SEE have more than 80% identity in amino acid sequence, Mutants of SEE can also be obtained by point mutation from SEA. In addition, point mutations are introduced into existing SEE mutants to obtain superantibiotics with higher biological activity by molecular biological manipulation methods of various gene point mutations.
  • superantigens such as SEB, SEC, SED, SEF, SEG, SEH, SEI, SEJ, etc. of the Staphylococcus aureus enterotoxin family, SPE-A, SPE_B, SPE_C of streptococcal toxin, shock Shock syndrome toxin, a viral protein-derived superantigen, can enhance the T cell stimulating ability of superantigens, the stability of superantigens, and the neutralization of superantigens against antibodies in blood by multipoint mutation.
  • a polypeptide molecule that interacts with cancer cell surface receptors can be selected.
  • Such polypeptides include basic fibroblast growth factor (bFGF) and FGF family, and leukocyte mediators.
  • Interleukins such as interleukin-2, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-8, interleukin-11, interleukin-13, granulocytes Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), heparin-binding EGF-like growth Heparin-b inding EGF-l ike growth factor (HB-EGF), Insul in-l ike growth factor (IGF), Hepatocyte growth factor (HGF), Platelet-derived growth factor (Platel et-derive growth factor, PDGF), Nerve growth factor (NGF), Placental growth factor (PGF), Stem cel factor (SCF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • FGF FGF
  • leukocyte mediators such as inter
  • polypeptide ligands such as chemokines, enzymes, hormones and other proteins can be linked to costimulatory molecules like cytokines to form fusion proteins, and localize co-stimulatory molecules into tumor tissues.
  • the above fusion protein can also be constructed by linking a cytokine, a hormone or a non-antibody non-cytokine non-hormone polypeptide to a protein fragment of a superantigen by a chemical cross-linking reaction or the like, for example, by covalent bond ligation.
  • a series of modifications can be made to the fusion protein by chemical modification, deletion of a portion of the polypeptide fragment of the fusion protein, and attachment of other polypeptides to these proteins.
  • the purified fusion protein can improve its biological structure including disulfide bonds through a series of protein denaturation and renaturation processes.
  • the cytokine, hormone or non-antibody non-cytokine non-hormone polypeptides used in the experiments herein and the corresponding overexpressed receptors on the surface of cancer cells are actually a ligand and The interaction between the bodies, using the affinity of this ligand and receptor, localizes the superantigen to the tumor tissue.
  • cytokines, hormones or peptides, other proteins or polypeptide molecules, ie, ligands, which correspond to receptors overexpressing cancer cells can also be used for the specific localization of cancer cells.
  • artificially screened proteins or polypeptides that have affinity and antagonism with receptors on cancer cells screened by methods such as Phage di splay And proteins or polypeptide molecules that are screened by other methods and that directly interact with the surface of cancer cells can form fusion proteins with costimulatory molecules.
  • the dosage form of the drug may be an emulsifier, a liposome, a dispersant, a stabilizer, or the like, which is formulated into various administration forms such as injection, oral administration, application, and surgical treatment.
  • a nucleotide fragment or vector encoding a fusion protein can also be used as a gene therapy form.
  • the cytokine-superantigen fusion protein is TGF- ct-SEE, EGF-SEE and VEGF-SEE composed of SEE, and TGF-a consisting of mutant SEE-1 of SEE SEE-1, EGF_SEE_1 and VEGF_SEE_1, TGF-a-SEE_2, EGF-SEE-2 and VEGF_SEE_2 consisting of mutant SEE-2 of SEE, and TGF- ⁇ -SEE-3 consisting of mutant SEE-3 of SEE , EGF-SEE-3 and VEGF-SEE-3;
  • the hormone-superantigen fusion protein is GnRH-SEE composed of SEE, GnRH_SEE_l consisting of SEE mutant SEE-1, and SEE mutant SEE-2 a composition of GnRH-SEE-2, and a GnRH-SEE_3 consisting of the SEE mutant SEE-3;
  • fusion proteins are capable of inducing and stimulating T lymphocytes against sarcoma S180, Ifep G2 liver cancer and A549 lung cancer, respectively, but as long as other types of cancer cells (cells, bones, brain, intestines, skin, etc.)
  • the receptors expressing TGF-a, EGF, VEGF, GnRH and GRP can use the fusion protein here to kill tumors and thus be applied to the treatment of various cancers or malignant tumors.

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Abstract

本发明公开了一种癌靶向超抗原融合蛋白、其制备方法和用途，该融合蛋白含有：a）促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相互作用的配体；b）能引起抗癌免疫反应的超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素E及其突变体。本发明的超抗原SEE比SEA更稳定，而经过多点突变改造后的SEE突变体SEE-1、SEE-2和SEE-3降低了与MHC的相互作用，含有SEE突变体与TGF-α、EGF、VEGF、GnRH或GRP的融合蛋白表现出更高的抗癌和抗肿瘤活性。

Description

癌靶向超抗原融合蛋白、 其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及一种超抗原融合蛋白及制备方法及用途， 特别是涉及一种癌靶向超抗原及其 突变体融合蛋白及制备方法及用途。
背景技术
超抗原融合蛋白被应用于癌症的药物研究，例如细胞因子与超抗原构建的融合蛋白（中国 专利申请号 200310109829. 7， "一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产方法"； 中 国专利申请号 201010118438. 1， "细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用"； 中国专利申请号 201010585818. 6， "细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用"； PLoS One 6， el6642, 2011)、 激素与超抗原构建的融合蛋白（中国专利申请号 200510078775. 1 "癌 靶向超抗原融合蛋白质及其生产方法"）和抗体与超抗原构建的融合蛋白（Proc Natl Acad Sci USA, 91， 8945-8949, 1994； Proc Natl Acad Sci USA, 92, 9791-9795， 1995) , 细胞因子- 超抗原融合蛋白中的细胞因子和激素 -超抗原融合蛋白中的激素是通过与癌细胞上大量表达 的细胞因子受体和激素受体的相互作用而将融合蛋白定位到癌细胞上， 而融合蛋白的另一部 分即超抗原可诱导攻击癌细胞的 T细胞反应的细胞毒作用。
上述超抗原是金黄色葡萄球菌肠毒素 A (Staphylococcal-enterotoxin A, SEA)， 它会 产生全身性淋巴细胞的反应的副作用， 有研究（Proc Natl Acad Sci USA, 94， 2489-2494, 1997) 对它进行了一个点突变的改造。另外，据报道 SEA本身也不稳定（J Biol Chem, 275, 1665-1672, 2000) 要提高超抗原融合蛋白的抗癌效果， 可以选择除了 SEA以为的新超抗原。
另外， 有活性的有利用价值的物质例如化合物、 核酸、 多肽等都可以通过改造它们的结 构而提高其活性或利用价值， 以酶为例， 可以通过大规模多点突变、 片段置换、 氨基酸去除 或增加等手段来提高酶的催化活性、 耐热、 耐低温、 耐酸、 耐碱、 耐有机溶剂等。 所以通过 对超抗原大规模的点突变改造， 期待创造出生物活性更高的超抗原。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足， 提供生物活性更高的一种癌靶向超抗原融合蛋 白。
本发明的第二个目的是提供一种超抗原融合蛋白的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种超抗原融合蛋白的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种癌靶向超抗原融合蛋白， 该融合蛋白含有：
a) 促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相互作用的配体，所述配体是细胞因子、激 素或非抗体非细胞因子非激素的多肽；
b) 能 引 起 抗 癌 免 疫 反 应 的 超 抗 原 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 E (Staphylococcal-enterotoxin E, SEE)及其突变体， 所述金黄色葡萄球菌肠毒素 E用缩写 SEE 表示； 所述金黄色葡萄球菌肠毒素 E的突变体用缩写 SEE-X表示， 所述 X=l-3。
所述细胞因子选自缩写为 TGF- α的转化生长因子 - a (Transforming growth factor- α， TGF- α ) 缩写为 EGF的表皮生长因子（Epidermal growth factor, EGF)、 缩写为 VEGF的血 管内皮细胞生长因子（Vascular endothel ial cel l growth factor, VEGF)； 所述激素选自缩 写为 GnRH的促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)； 所述非抗体非 细胞因子非激素的多肽选自缩写为 GRP 的促胃液素释放肽 (Gastrin-releasing peptide , GRP)。
所述 SEE是 SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列； 所述 SEE-1是 SEQ ID No. 4所示的氨基酸 序列； 所述 SEE-2是 SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列； 所述 SEE-3是 SEQ ID No. 8所示的氨 基酸序列。
所述 SEE-1是 SEE上的 20位、 21位、 24位、 27位、 34位、 39位、 40位、 1位、 42位、 44位、 49位、 74位、 75位、 78位、 79位、 81位、 83位、 84位、 217位、 220位、 222位、 223位、 225位、 227位上的一个或多个氨基酸被替换。
所述 SEE-2是 SEE上的 20位、 21位、 24位、 27位、 34位、 35位、 39位、 40位、 41位、
42位、 44位、 45位、 46位、 49位、 74位、 75位、 78位、 79位、 81位、 83位、 84位、 188 位、 190位、 217位、 219位、 220位、 222位、 223位、 224位、 225位、 227位上的一个或 多个氨基酸被替换。
所述 SEE-3是 SEE上的 20位、 21位、 24位、 27位、 34位、 35位、 36位、 39位、 40位、 41位、 42位、 44位、 45位、 46位、 49位、 62位、 74位、 75位、 77位、 78位、 79位、 81 位、 83位、 84位、 188位、 190位、 217位、 218位、 219位、 220位、 221位、 222位、 223 位、 224位、 225位、 227位上的一个或多个氨基酸被替换。
所述该融合蛋白为：由 SEQ ID No. 10所示的 TGF- a -SEE;由 SEQ ID No. 18所示的 EGF-SEE; 由 SEQ ID No. 26所示的 VEGF-SEE; 由 SEQ ID No. 34所示的 GnRH-SEE; 由 SEQ ID No. 42所 示的 GRP-SEE; 由 SEQ ID No. 12所示的 TGF- α -SEE-1 ; 由 SEQ ID No. 20所示的 EGF-SEE-1 ; 由 SEQ ID No. 28所示的 VEGF-SEE- 1； 由 SEQ ID No. 36所示的 GnRH-SEE- 1； 由 SEQ ID No. 44 所示的 GRP-SEE-1 ;由 SEQ ID No. 14所示的 TGF- α -SEE-2;由 SEQ ID No. 22所示的 EGF-SEE-2; 由 SEQ ID No. 30所示的 VEGF-SEE-2; 由 SEQ ID No. 38所示的 GnRH-SEE-2; 由 SEQ ID No. 46 所示的 GRP-SEE-2;由 SEQ ID No. 16所示的 TGF- α -SEE-3;由 SEQ ID No. 24所示的 EGF-SEE-3; 由 SEQ ID No. 32所示的 VEGF-SEE-3; 由 SEQ ID No. 40所示的 GnRH- SEE- 3; 或由 SEQ ID No. 48 所示的 GRP-SEE-3。
重组载体，含有编码权利要求 7所述融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列为编码 SEQ ID No. 10的核苷酸序列 SEQ ID No. 9； 编码 SEQ ID No. 12的核苷酸序列 SEQ ID No. 11； 编 码 SEQ ID No. 14的核苷酸序列 SEQ ID No. 13； 编码 SEQ ID No. 16的核苷酸序列 SEQ ID No. 15； 编码 SEQ ID No. 18的核苷酸序列 SEQ ID No. 17;编码 SEQ ID No. 20的核苷酸序列 SEQ ID No. 19； 编码 SEQ ID No. 22的核苷酸序列 SEQ ID No. 21 ;编码 SEQ ID No. 24的核苷酸序列 SEQ ID No. 23； 编码 SEQ ID No. 26的核苷酸序列 SEQ ID No. 25;编码 SEQ ID No. 28的核苷酸序列 SEQ ID No. 27； 编码 SEQ ID No. 30的核苷酸序列 SEQ ID No. 29;编码 SEQ ID No. 32的核苷酸序列 SEQ ID No. 31； 编码 SEQ ID No. 34的核苷酸序列 SEQ ID No. 33;编码 SEQ ID No. 36的核苷酸序列 SEQ ID No. 35； 编码 SEQ ID No. 38的核苷酸序列 SEQ ID No. 37;编码 SEQ ID No. 40的核苷酸序列 SEQ ID No. 39； 编码 SEQ ID No. 42的核苷酸序列 SEQ ID No. 41 ;编码 SEQ ID No. 44的核苷酸序列 SEQ ID No. 43； 编码 SEQ ID No. 46的核苷酸序列 SEQ ID No. 45； 或编码 SEQ ID No. 48的核苷酸序列 SEQ ID No. 47所示。
一种癌靶向超抗原融合蛋白的制备方法， 培养含有上述重组载体的宿主细胞， 收集表达 一种癌靶向超抗原融合蛋白。
一种癌靶向超抗原融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤的药物的应用。
本发明的优点- 超抗原 SEE要比 SEA更稳定（J Biol Chem， 275, 1665-1672, 2000) , 而经过大规模多点 突变的改造后的 SEE突变体 SEE-1、 SEE-2和 SEE-3降低了与 MHC的相互作用，所以由 SEE突 变体与 TGF- ci、 EGF、 VEGF、 GnRH或 GRP所组成的融合蛋白表现出很高的抗癌和抗肿瘤的生 物活性。
附图说明
图 1是 TGF- ci与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白抑制 S180肿瘤生长， 表示的是肿瘤生 长曲线和小鼠解剖后的肿瘤重量。
图 2是 EGF与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白抑制 S180肿瘤生长，表示的是肿瘤生长曲 线和小鼠解剖后的肿瘤重量。
图 3是 VEGF与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白抑制 S180肿瘤生长， 表示的是肿瘤生长 曲线和小鼠解剖后的肿瘤重量。
图 4利用免疫组化检测到的 T细胞， 棕色小点是 T细胞。 （图中： 4-1为 TGF- ci -SEE-3 给药组； 4-2为 EGF-SEE-3给药组； 4_3为 VEGF-SEE-3给药组）
图 5利用免疫组化检测到的由 T细胞分泌的干扰素- Y (IFN- y )，棕色部分是 IFN- y。（图 中： 5-1为 TGF- a -SEE-3给药组； 5-2为 EGF-SEE-3给药组； 5-3为 VEGF-SEE-3给药组） 图 6是 GnRH与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白杀伤 Hep G2肝癌细胞。
图 7是 GRP与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白杀伤 A549肺癌细胞。
图 8显示的是被 T细胞攻击的癌细胞， 大细胞是癌细胞， 小细胞是 T细胞。 （图中： 8-1 为 GnRH- SEE- 3组； 8-2为 GRP-SEE-3组）
具体实施方式
本发明的战略思想如下：
通过一个点突变虽然可以提高 SEA的性能， 但是寻找一个比 SEA更好的超抗原并进行蛋 白的多点突变的结构构造则能够大幅度提高超抗原的生物活性， 取得更好的癌症治疗效果。
金黄色葡萄球菌由来的超抗原有 SEA、 SEB、 SEC、 SED、 SEF、 SEG、 SEH、 SEI、 SEJ等， 它们在结构上有一定的相似性（Infect Immun, 66， 3337-3348, 1998)， 所以它们的空间结构 也可以相互参考， 例如 SEA (EMB0 J， 14, 3292-3301， 1995； J Biol Chem, 271, 32212-32216, 1996； J Mol Biol, 269, 270-280， 1997； Structure, 10, 1619-1626， 2002)、SEB和 SEC (Nature: 368， 711-718, 1994； Nature, 384, 188-192， 1996； J Mol Biol, 277, 61-79， 1998； Structure, 11， 1151-1161, 2003) , SHE (EMBO J, 20, 3306-3312, 2001 ; J Mol Biol, 302, 527-537， 2000) , 以及其它有关文献（Nature, 346， 471-473， 1990； Infect Immun, 59, 2126-2134， 1991； J Exp Med, 175， 415-424， 1992； Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7727-7731， 1992； J Exp Med, 177， 175-184, 1993； Infect Immun, 61， 2059—2068， 1993； J Biol Chem, 275, 1665—1672， 2000； Trends Microbiol, 8， 369—375， 2000； Immunity, 14， 331-344, 2001 ; Clin Exp Immunol: 133, 299-306, 2003； J Mol Biol, 333, 893-905， 2003； J Biol Chem, 278, 50412-50421, 2003； Scand J Immunol, 59， 345-355， 2004； Semin Immunol, 19， 262-271, 2007)， 超抗 原包括 SEE和 SEA中的 20-27氨基酸片段被认为是与 T细胞上的 TCR相互作用， 从而激活 T 细胞； 34-49、 74-84、 187-190和 217-227等氨基酸片段被认为是与组织相容性抗原 MHC相 互作用。 通过这些信息可以寻找一个比 SEA更有效的超抗原并通过大范围的多点突变来提高 它的生物活性。
首先本发明选择 SEE, 它与 SEA相比有着很大的相似性但比 SEA更稳定（J Bio l Chem, 275, 1665-1672, 2000) , 在 SEE的氨基酸序列中可以引入大规模多点突变， 点突变的依据是:
1. 加强 TCR的结合能力，强化超抗原与 TCR的作用就可以提高超抗原诱导 T细胞的能力， 在这里可以考虑采用在 SEA相同位置上的氨基酸。
2. 降低与组织相容性抗原 MHC的结合能力， 超抗原 SEE与组织相容性抗原 MHC的相互 作用如同抗体与多肽抗原相互作用类似， 是互补的相互作用。 其作用的方式为：
1) 极性氨基酸的相互作用，即超抗原中的酸性氨基酸与组织相容性抗原中的碱性氨基酸 的相互作用， 或者超抗原中的碱性氨基酸与组织相容性抗原中的酸性氨基酸的相互作用；
2) 非极性亲水氨基酸的相互作用，即超抗原和组织相容性抗原中的非极性亲水氨基酸之 间的相互作用；
3) 非极性疏水性氨基酸的相互作用，即超抗原和组织相容性抗原中的非极性疏水性氨基 酸之间的相互作用；
4) 上面 1-3的氨基酸的相互作用需要合适的空间， 即氨基酸的侧链长度适当，人为改变 上面相互作用的氨基酸的长度也可以降低这些氨基酸的相互作用。
所以， 通过改变超抗原与组织相容性抗原相互作用区域的氨基酸的性质， 例如改变超抗 原中的与组织相容性抗原相互作用的氨基酸的极性和长度等可以降低或减弱超抗原与组织相 容性抗原之间的相互作用。
虽然本发明在下面的实施例 1中披露了点突变的位置， 实际上还可以在这些位置或其旁 边的位置上引入其它类似的理化性质的氨基酸， 也可以获得相似的结果。
作为改进型超抗原融合蛋白的另一部分选自与癌细胞表面上大量表达的受体 (Receptor) 相互作用的配体 (Ligand) , 例如细胞因子、 激素或非抗体非细胞因子非激素的多肽， 在本发 明中， 细胞因子为 TGF- a、 EGF或 VEGF， 激素 GnRH， 非抗体非细胞因子非激素的多肽为 GRP。
超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素 E的超抗原 SEE， 为 SEQ ID No. 2所示；
超抗原为经过多点突变改造的 SEE突变体， 其中突变体 SEE-1为 SEQ ID No. 4所示， 突 变体 SEE-2为 SEQ ID No. 6所示， 突变体 SEE-3为 SEQ ID No. 8所示；
所述的多点突变发生在 20位、 21位、 24位、 27位、 34位、 35位、 36位、 39位、 40位、 41位、 42位、 44位、 45位、 46位、 49位、 62位、 74位、 75位、 77位、 78位、 79位、 81 位、 83位、 84位、 188位、 190位、 217位、 218位、 219位、 220位、 221位、 222位、 223 位、 224位、 225位、 227位；
所述的多点突变的氨基酸是，在 20位上， Arg→Gly ; 在 21位上， Asn→Thr ; 在 24位上， Ser→Gly;在 27位上， Arg→Lys ;在 34位上， Glu→Ser或 Glu→Ala;在 35位上， Lys→Ser; 在 36位上， Ala→Gly ; 在 39位上， Glu→Ser ; 在 40位上， Asn→Ser或 Asn→Ala; 在 41位 上， Lys→Glu ; 在 42位上， Glu→Lys ; 在 44位上， Asp→Ala或 Asp→Ser ; 在 45位上， Asp →Ala; 在 46位上， Gln→Ser ; 在 49位上， Glu→Thr或 Glu→Ser ; 在 62位上， Pro→Ser ; 在 74位上， Lys→Thr或 Lys→Ser ; 在 75位上， Asp—Ala或 Asp→Thr ; 在 77位上， Thr→ Ser ; 在 78位上， Asn→Ser ; 在 79位上， Lys→Glu; 在 81位上， Lys→Glu; 在 83位上， Lys →Ser; 在 84位上， Lys→Ser或 Lys→Thr; 在 188位上， Ser→Thr; 在 190位上， Glu→Thr; 在 217位上， Lys→Thr或 Lys→Ser; 在 218位上， Thr→Ser; 在 219位上， I le→Leu; 在 220位上， Asn→Ser; 在 221位上， Ser→Thr; 在 222位上， Glu→Thr或 Glu→Ser; 在 223 位上， Asn→Ser; 在 224位上， Leu→Ile; 在 225位上， His→Ser; 在 227位上， Asp→Ser。
本发明利用与癌细胞受体相互作用的配体-改进型超抗原融合蛋白质，其中与癌细胞受体 相互作用的配体例如细胞因子、 激素或非抗体非细胞因子非激素的多肽可以将融合蛋白质定 位到肿瘤细胞上， 而改进型超抗原则在肿瘤细胞周围引起更加强大的抗癌免疫反应， 即超抗 原依赖的细胞介导的细胞毒作用（Superantigen-dependent-cel lular-cytotoxicity, SDCC) 。 利用此方法就可以将这种类型的融合蛋白质特异地定位到肿瘤细胞上并在肿瘤细胞周围引起 抗癌的细胞毒免疫反应。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实验用癌细胞株： 作为本发明实施例中所使用的癌细胞株是用于建立小鼠荷瘤模型的小 鼠肉瘤肿瘤 Sarcoma (S180)肿瘤细胞、 人肝癌细胞 Ifep G2和人肺癌细胞 A549， 这些癌细胞 株购自 ATCC。
已有报道小鼠的 S180癌细胞上的 EGF受体 EGFR和 VEGF受体 VEGFR可与人来源的 EGF和
VEGF相互作用（PLoS One 6， el6642, 2011； 中国专利申请号 201010118438. 1， "细胞因子- 超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用 "）， 而 TGF- α的受体与 EGF相同， 都是 EGFR， 所以 S180癌细胞可用于 TGF、 EGF或 VEGF与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白的实验。
肝癌细胞表达 GnRH的受体 GnRH-R (Endocrinology, 136， 75-84， 1995； Cancer Res, 60， 3701-3705, 2000)， 所以 Hep G2癌细胞可用于 GnRH与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白的实 验。
肺癌细胞表达 GRP 的受体 GRP-R (Oncogene, 20, 1563-1569, 2001； Ann Oncol, 18， 1457-1466, 2007) , 所以 Α549癌细胞可用于 GRP与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白的实验。
实施例 1 设计 SEE的突变体
由于 SEA与 SEE在序列上有着很大的相似性（Infect I讓 un， 66， 3337-3348, 1998)， 所 以 SEA 以及其它超抗原的空间结构的研究等可以作为 SEE的参考 (EMB0 J, 14， 3292-3301, 1995； J Biol Chem, 271, 32212-32216, 1996; J Mol Biol, 269, 270—280， 1997； Structure, 10， 1619-1626, 2002； Nature, 368， 711-718, 1994; Nature, 384, 188-192， 1996； J Mol Biol, 277, 61-79， 1998； Structure, 11， 1151-1161， 2003； EMB0 J, 20, 3306-3312, 2001； J Mol Biol, 302, 527-537， 2000) , 另外也参考有关文献（Nature, 346, 471-473， 1990； Infect Immun, 59， 2126-2134, 1991 ; J Exp Med, 175， 415-424, 1992； Proc Natl Acad Sci USA, 89， 7727-7731, 1992； J Exp Med, 177, 175-184， 1993； Infect Immun, 61， 2059-2068, 1993； J Biol Chem, 275, 1665-1672, 2000； Trends Microbiol, 8， 369-375， 2000； Immunity, 14, 331-344, 2001； Cl in Exp Immunol, 133, 299-306, 2003； J Mol Biol, 333, 893-905， 2003； J Biol Chem, 278, 50412-50421, 2003； Scand J Immunol, 59， 345-355， 2004； Semin Immunol, 19， 262-271, 2007) , 通过这些信息以及 SEE 基因信息（J Bacteriol, 170, 2954-2960, 1988； GenBank, M21319)来确定 SEE 点突变的位置， 可考虑的点突变的位置在 SEE中的 20-27、 34-49、 74-84、 187-190和 217-227的氨基酸片段中， 设计如下：
1. 采用 SEA中的与 TCR结合的氨基酸片断， 因为 SEA有着很强大的诱导 T细胞的能力 (Proc Natl Acad Sci USA, 91， 8945-8949, 1994； Proc Natl Acad Sci USA, 92, 9791-9795, 1995)， 这里设计了 SEE序列中的 20-27位置的 4个氨基酸的点突变： 在 20位上， Arg→Gly; 在 21位上， Asn→Thr;在 24位上， Ser→Gly;在 27位上， Arg→Lys。所有 SEE的突变体（SEE- 1、 SEE-2和 SEE-3)在这个区域上的点突变都相同。
2. 减少与组织相容性抗原 MHC 的结合， 将酸性或碱性氨基酸变成极性中性氨基酸 (Ser 或 Thr)或非极性疏水性氨基酸 (Ala)或者改变其极性的性质 (碱性氨基酸变成酸性氨基酸或者 酸性氨基酸变成碱性氨基酸)或者改变氨基酸的侧链长度。
2. 1. SEE-1突变体的设计
在 34位上， Glu→Ser; 在 39位上， Glu→Ser; 在 40位上， Asn→Ser; 在 41位上， Lys →Glu; 在 42位上， Glu→Lys ; 在 44位上， Asp→Ala; 在 49位上， Glu→Thr; 在 74位上， Lys→Thr; 在 75位上， Asp→Ala; 在 78位上， Asn→Ser; 在 79位上， Lys→Glu; 在 81位 上， Lys→Glu; 在 83位上， Lys→Ser; 在 84位上， Lys→Ser; 在 217位上， Lys→Thr; 在 220位上， Asn→Ser; 在 222位上， Glu→Thr; 在 223位上， Asn→Ser; 在 225位上， Hi s→ Ser; 在 227位上， Asp→Ser。 最后得到 SEE- 1的氨基酸序列（SEQ ID NO. 4)„
2. 2. SEE-2突变体的设计
在 34位上， Glu→Ser; 在 35位上， Lys→Ser; 在 39位上， Glu→Ser; 在 40位上， Asn →Ser; 在 41位上， Lys→Glu; 在 42位上， Glu→Lys ; 在 44位上， Asp→Ser; 在 45位上， Asp→Ala; 在 46位上， Gln→Ser; 在 49位上， Glu→Thr; 在 74位上， Lys→Thr; 在 75位 上， Asp→Ala; 在 78位上， Asn→Ser; 在 79位上， Lys→Glu; 在 81位上， Lys→Glu; 在 83位上， Lys→Ser; 在 84位上， Lys→Ser; 在 188位上， Ser→Thr; 在 190位上， Glu→Thr; 在 217位上， Lys→Ser; 在 219位上， I le→Leu; 在 220位上， Asn→Ser; 在 222位上， Glu →Thr; 在 223位上， Asn→Ser; 在 224位上， Leu→I le ; 在 225位上， Hi s→Ser; 在 227位 上， Asp→Ser。 最后得到 SEE-2的氨基酸序列（SEQ ID NO. 6)。
2. 3. SEE-3突变体的设计
在 34位上， Glu→Ala; 在 35位上， Lys→Ser; 在 36位上， Ala→Gly; 在 39位上， Glu
→Ser; 在 40位上， Asn→Ala; 在 41位上， Lys→Glu; 在 42位上， Glu→Lys; 在 44位上， Asp→Ser; 在 45位上， Asp→Ala; 在 46位上， Gln→Ser; 在 49位上， Glu→Ser; 在 62位 上， Pro→Ser; 在 74位上， Lys→Ser; 在 75位上， Asp→Thr; 在 77位上， Thr→Ser; 在 78位上， Asn→Ser; 在 79位上， Lys→Glu ; 在 81位上， Lys→Glu; 在 83位上， Lys→Ser; 在 84位上， Lys→Thr; 在 188位上， Ser→Thr; 在 190位上， Glu→Thr; 在 217位上， Lys →Ser; 在 218位上， Thr→Ser; 在 219位上， I le→Leu; 在 220位上， Asn→Ser; 在 221位 上， Ser→Thr; 在 222位上， Glu→Ser; 在 223位上， Asn→Ser; 在 224位上， Leu→I le; 在 225位上， Hi s→Ser;在 227位上， Asp→Ser。最后得到 SEE-3的氨基酸序列（SEQ ID NO. 8)。
实施例 2 超抗原及其突变体表达载体的构建
编码 SEE 的 DNA核酸序列来源于其基因信息（J Bacteriol, 170, 2954-2960， 1988；
GenBank数据库， M21319) , 而突变体是根据实施例 1的设计， 委托 TAKAM公司合成 DNA片 段， 它包括 SEE基因或它的突变体的序列片段以及一个连接肽（由 SEQ ID NO. 50所示)和在整 个片断的前面 Hindl l l及后面 Xho l限制酶切点的几个碱基， 将合成好的核酸片段分别插入 T 载体并进行 DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用 Hindl l l和 Xho l处理后，把片段分别插 入 pET22b 质粒上， 获得了表达 SEE 基因的载体 pET22b-SEE 以及 SEE 的突变体的载体 pET22b-SEE-l、 pET22b_SEE_2和 pET22b_SEE_3。 由这些载体表达的相应的蛋白序列， SEE为 SEQ ID NO. 2所示， SEE- 1为 SEQ ID NO. 4所示， SEE- 2为 SEQ ID NO. 6所示， SEE- 3为 SEQ ID NO. 8所示。
编码 SEE的核酸序列为 SEQ ID NO. 1所示， 编码 SEE-1的核酸序列为 SEQ ID NO. 3所示， 编码 SEE-2的核酸序列为 SEQ ID NO. 5所示， 编码 SEE-3的核酸序列为 SEQ ID NO. 7所示。
编码连接肽的核酸序列为 SEQ ID NO. 49所示。
实施例 3 TGF- ct与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据 GenBank数据库的人来源的 TGF_ α基因的信息 (ΝΜ— 003236)， 委托 ΤΑΚΑΜ公司合成 一个核酸序列片段包括 TGF- α基因及在 TGF- α前面再增加限制内切酶位点 BamHI和 EcoRI的 几个碱基，在片断的后面包含了 Sai l和 Hindl l l的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片 段插入 T载体并进行碰测序鉴定， 然后再用双酶切方法即用 BamHI和 Hindl l l处理后， 把 这个片段分别插入实施例 2中的 pET22b-SEE、 pET22b_SEE_l、 pET22b_SEE_2和 pET22b_SEE_3 的载体， 这样就产生了表达载体 pET22b-TGF- a -SEE、 pET22b-TGF- a -SEE-U pET22b-TGF- a -SEE-2禾口 pET22b_TGF_ a -SEE-3 , 可表达 TGF- a -SEE (SEQ ID NO. 10)、 TGF- a -SEE-1 (SEQ ID NO. 12)、 TGF- a -SEE-2 (SEQ ID NO. 14)和 TGF— a— SEE—3 (SEQ ID NO. 16)融合蛋白。
实施例 4 EGF与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据 GenBemk数据库的人来源的 EGF基因的信息（匪― 001963和匪― 001178130)， 委托 TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括 EGF基因及在 EGF前面再增加限制内切酶位点 BamHI 和 EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 Sai l和 Hindl l l的限制内切酶位点。将这个合成 好的核酸片段插入 T载体并进行 DNA测序鉴定， 然后再用双酶切方法即用 BamHI和 Hindl l l 处理后， 把这个片段分别插入实施例 2中的 pET22b-SEE、 pET22b_SEE_l、 pET22b-SEE-2和 pET22b-SEE-3 的载体， 这样就产生了表达载体 pET22b_EGF_SEE、 pET22b-EGF_SEE_l、 pET22b-EGF-SEE-2禾口 pET22b- EGF- SEE- 3，可表达 EGF-SEE (SEQ ID NO. 18)、 EGF- SEE- 1 (SEQ ID NO. 20)、 EGF-SEE-2 (SEQ ID NO. 22)和 EGF-SEE—3 (SEQ ID NO. 24)融合蛋白。
实施例 5 VEGF与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据 GenBank数据库的人来源的 VEGF基因的信息（匪― 003376)以及参考论文（J. Biol. Chem. , 266, 11947-11954, 1991)， 委托 TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括 VEGF基因 (121个氨基酸)及在 VEGF前面再增加限制内切酶位点 BamHI和 EcoRI的几个碱基， 在片断的 后面包含了 Sai l和 Hindl l l的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入 T载体并进行 DNA测序鉴定， 然后再用双酶切方法即用 BamHI和 Hindl l l处理后， 把这个片段分别插入实 施例 2中的 pET22b-SEE、 pET22b_SEE_l、 pET22b_SEE_2和 pET22b_SEE_3的载体， 这样就产 生 了 表 达载 体 pET22b-VEGF-SEE 、 pET22b-VEGF-SEE-l 、 pET22b-VEGF-SEE-2 和 pET22b-VEGF-SEE-3 , 可表达 VEGF_SEE (SEQ ID NO. 26)、 VEGF-SEE-l (SEQ ID NO. 28)、 VEGF-SEE-2 (SEQ ID NO. 30)和 VEGF-SEE-3 (SEQ ID NO. 32)融合蛋白。
实施例 6 GnRH与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据 GenBank数据库的人来源的 GnRH基因的信息（丽― 021081和應― 000825等）， 委托 TAKARA 公司合成一个核酸序列片段包括 GnRH基因及在 GnRH前面再增加限制内切酶位点 BamHI和 EcoRI的几个碱基， 在片断的后面包含了 Sai l和 Hindl l l的限制内切酶位点。 将这 个合成好的核酸片段插入 T载体并进行 DNA测序鉴定， 然后再用双酶切方法即用 BamHI和 Hindl l l处理后，把这个片段分别插入实施例 2中的 pET22b-SEE、pET22b-SEE-l、pET22b-SEE-2 和 pET22b-SEE-3的载体， 这样就产生了表达载体 pET22b_GnRH_SEE、 pET22b-GnRH-SEE_l、 pET22b- GnRH- SEE- 2禾口 pET22b- GnRH- SEE- 3，可表达 GnRH- SEE (SEQ ID NO. 34)、GnRH- SEE- 1 (SEQ ID NO. 36)、 GnRH- SEE- 2 (SEQ ID NO. 38)和 GnRH- SEE- 3 (SEQ ID NO. 40)融合蛋白。
实施例 7 GRP与 SEE或 SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据 GenBank 数据库的人来源的 GRP 基因的信息（丽― 002091、 醒— 001012512 和 丽— 001012513等）， 委托 TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括 GnRH基因及在 GnRH前面再 增加限制内切酶位点 BamHI和 EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 Sai l和 Hindl l l的限 制内切酶位点。 将这个合成好的核酸片段插入 T载体并进行 DNA测序鉴定， 然后再用双酶切 方法即用 BamHI 和 Hindl l l 处理后， 把这个片段分别插入实施例 2 中的 pET22b_SEE、 pET22b-SEE-l、 pET22b_SEE_2 和 pET22b_SEE_3 的载体， 这样就产生了表达载体 pET22b-GRP_SEE、 pET22b- GRP- SEE-I、 pET22b-GRP-SEE-2 和 pET22b_GRP-SEE_3， 可表达 GRP- SEE (SEQ ID NO. 42) 、 GRP- SEE- 1 (SEQ ID NO. 44) 、 GRP- SEE- 2 (SEQ ID NO. 46) 和 GRP-SEE-3 (SEQ ID NO. 48)融合蛋白。
实施例 8 各种融合蛋白的表达、 变性和复性以及纯化
将各种表达质粒 pET22b-TGF_ a -SEE、 pET22b_TGF_ a - SEE- 1、 pET22b_TGF_ a _SEE_2、 pET22b-TGF- a -SEE-3 、 pET22b-EGF-SEE 、 pET22b-EGF-SEE-l 、 pET22b-EGF-SEE-2 、 pET22b-EGF-SEE-3 、 pET22b- VEGF- SEE 、 pET22b- VEGF- SEE- 1 、 pET22b- VEGF- SEE- 2 、 pET22b-VEGF-SEE-3 、 pET22b-GnRH-SEE 、 pET22b- GnRH-SEE-l 、 pET22b- GnRH_SEE_2 、 pET22b-GnRH-SEE-3 、 pET22b_GRP_SEE 、 pET22b-GRP_SEE_l 、 pET22b_GRP-SEE_2 和 pET22b-GRP-SEE-3分别用电穿孔法转入大肠杆菌 BL21 (DE3)， 利用抗生素 Amp (Ampici l l in) 筛选阳性菌。 接下来各种蛋白的表达、 变性和复性以及纯化的过程大致相同， 操作如下- 含有表达质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3)先进行大规模 37° C 培养， 然后加入 IPTG (I sopropylthio- e -D-galactoside)使之浓度达到 1 mM并过夜 30° C培养， 从而诱导表达蛋 白。 第 2天离心培养液和收集菌体， 用超声波法破细胞壁， 离心收集包含体沉淀， 这里的蛋 白是以包含体形式存在。包含体蛋白用 6M尿素变性溶解， 然后进行多阶段透析， 透析溶液是 逐步稀释的尿素例如 3 M、 2 M和 1 M， 接下来是 0. 5 M尿素， 0. 4 M L-精氨酸， 375 μ Μ氧 化型谷胱甘肽 GSSG， 1. 875 mM还原型谷胱甘肽 GSH， 透析后进行离心， 所得上清液就是蛋白 的复性溶液。 用 Hi s · Bind Purification Kit试剂盒（Novagen公司）对于蛋白进行纯化， 先 用 Binding Buffer冲洗凝胶柱， 同时也在蛋白溶液里加入 Binding Buffer, 将蛋白样品上 柱， 用 Wash Buffer漂洗， 然后用 Elute Buf f er洗脱， 用蛋白质电泳进行鉴定， 将纯度为一 条带的蛋白用于以后的实验。这样得到各种高纯度融合蛋白 TGF- a -SEE、TGF- ci -SEE-1、TGF- α -SEE-2、TGF- a -SEE-3 EGF-SEE ^ EGF-SEE- 1 EGF-SEE-2 , EGF-SEE-3 VEGF-SEE VEGF-SEE- 1 VEGF-SEE-2 , VEGF_SEE_3、 GnRH-SEE , Gn H-SEE-U GnRH-SEE_2、 GnRH_SEE_3、 GRP_SEE、 GRP- SEE- 1、 GRP- SEE- 2禾口 GRP- SEE- 3。
实施例 9 小鼠肿瘤形成实验
首先选择雄性 ICR小鼠 450只， 4-5周， 18_22g， 小鼠肉瘤细胞 S180是从 ATCC购买， 先进 行体外培养， 再注射到 ICR小鼠腹腔， 进行体内大规模培养， 最后， 取出腹腔内的 S180细胞， 将 2x l06小鼠肉瘤细胞 S180接种于 ICR小鼠的右侧腋下。
实施例 10 TGF- a -SEE , TGF— a _SEE_1、 TGF_ a _SEE_2禾口 TGF_ a -SEE-3融合蛋白抑制 小鼠肿瘤实验
取实施例 9中的 150只荷瘤小鼠， 分成 5组， 每组 30只， 在接种肿瘤细胞后的第 2、 4、 6、 8天分别注射 TGF- a - SEE、 TGF- a - SEE- 1、 TGF- a -SEE-2和 TGF- a - SEE-3融合蛋白， 剂 量是 100 pmo l , 对照组只注射生理盐水， 第 9天杀死小鼠。 结果显示 TGF- a -SEE、 TGF- a - SEE- 1、 TGF- a -SEE-2和 TGF- a -SEE-3对肿瘤的生长都有抑制作用， 其中， TGF- a -SEE-2 和 TGF- a -SEE-3显示了更好的效果，肿瘤出现比其它组晚 1_2天， TGF- a -SEE-3用药组第 7 天才出现很小的肿瘤（图 1)。
实施例 11 EGF-SEE、 EGF-SEE-U EGF-SEE-2和 EGF-SEE-3融合蛋白抑制小鼠肿瘤实验 取实施例 9中的 150只荷瘤小鼠， 分成 5组， 每组 30只， 在接种肿瘤细胞后的第 2、 4、 6、 8天分别注射 EGF- SEE、 EGF-SEE- 1、 EGF-SEE-2禾 H EGF-SEE-3融合蛋白， 剂量是 lOO pmo l , 对照组只注射生理盐水， 第 9 天杀死小鼠。 结果显示 EGF-SEE、 EGF-SEE- K EGF-SEE-2 和 EGF-SEE-3对肿瘤的生长都有抑制作用， 其中， EGF-SEE-2和 EGF-SEE-3显示了更好的效果， 肿瘤出现比其它组晚 1-2天， EGF-SEE-3用药组第 7天才出现很小的肿瘤（图 2)。
实施例 12 VEGF-SEE. VEGF_SEE_1、 VEGF-SEE-2和 VEGF-SEE-3融合蛋白抑制小鼠肿瘤 实验
取实施例 9中的 150只荷瘤小鼠， 分成 5组， 每组 30只， 在接种肿瘤细胞后的第 2、 4、 6、8天分别注射 VEGF- SEE、VEGF-SEE-1、VEGF- SEE- 2和 VEGF-SEE-3融合蛋白，剂量是 100 pmol , 对照组只注射生理盐水， 第 9天杀死小鼠。 结果显示 VEGF-SEE、 VEGF_SEE_1、 VEGF_SEE_2和 VEGF-SEE-3对肿瘤的生长都有抑制作用， 其中， VEGF_SEE_2和 VEGF_SEE_3显示了更好的效 果， 肿瘤出现比其它组晚 1-2天， VEGF-SEE-3用药组第 7天才出现很小的肿瘤（图 3)。
实施例 13 肿瘤组织内 T淋巴细胞的检测
将实施例 10-12中的经过各种融合蛋白给药小鼠的 S180肿瘤组织以及对照组生理盐水的 小鼠 S 180肿瘤组织切成小块， 用石蜡包埋制成石蜡切片， 然后进行免疫组织化学实验。为了 检测肿瘤组织内的 T细胞， 使用 Santa Cruz Biotechno log公司的抗 CD3抗体， 然后用二抗 以及 avidin- b iotin-perxidase comp l ex (Zymed公司)， 最后用 Diaminobenz idine (DAB)显 色。 图 4 (图中： 4-1为 TGF- a -SEE-3给药组； 4-2为 EGF-SEE-3给药组； 4-3为 VEGF-SEE-3 给药组)只是由 SEE-3组成的融合蛋白的实验结果，利用免疫组化方法检测到的 T细胞，棕色 小点是 T细胞。
经实验： TGF_ a _SEE、 TGF- a - SEE- 1、 TGF- a -SEE-2 , EGF- SEE、 EGF- SEE- 1、 EGF- SEE- 2、 VEGF-SEE、 VEGF-SEE-1和 VEGF-SEE-2融合蛋白的给药组的小鼠肿瘤组织内也都发现了 T细 胞的存在。
实施例 14 肿瘤组织内干扰素- Y (IFN- γ )的检测
釆用与实施例 13类似的免疫组织化学方法检测实施例 10-12中的肿瘤组织内由 T细胞分 泌的细胞因子 IFN- Y , 抗体是 Santa Cruz Biotechno log公司的抗 IFN- γ抗体。 图 5 (图中： 5-1为 TGF- α -SEE-3给药组； 5-2为 EGF- SEE-3给药组； 5-3为 VEGF-SEE-3给药组）利用免 疫组化检测到的由 T细胞分泌的干扰素- Y (IFN- γ )， 棕色部分是 IFN- y。
经实验： TGF_ a _SEE、 TGF— a— SEE— 1、 TGF- a -SEE-2 , EGF— SEE、 EGF— SEE— 1、 EGF— SEE— 2、 VEGF-SEE, VEGF-SEE-1和 VEGF-SEE-2融合蛋白的给药组的小鼠肿瘤组织内也都发现了由 T 细胞诱导的 IFN- Y的存在。
实施例 15 小牛血清和融合蛋白的孵育实验
在癌细胞培养实验中所使用的高浓度的 GnRH-SEE、 GnRH-SEE-1、 GnRH_SEE_2、 GnRH-SEE-3, GRP_SEE、 GRP_SEE_1、 GRP-SEE-2禾 D GRP-SEE-3融合蛋白都用癌细胞培养的小 牛血清稀释，然后在 37° C下孵育 5小时， 以后所有癌细胞的实验中所使用的这些融合蛋白都 经过小牛血清的孵育处理。 这里的孵育实验是为了检验在小牛血清中的抵抗蛋白酶降解和热 稳定等以及血清中的抗超抗原的基础性抗体（IgM和 IgG等）的存在的情况下， 融合蛋白的生 物活性是不是发生变化。
实施例 16 GnRH-SEE、 GnRH_SEE_l、 GnRH_SEE_2、 GnRH_SEE_3、 GRP_SEE、 GRP_SEE_1、 GRP-SEE-2和 GRP-SEE-3融合蛋白的诱导 T淋巴细胞活性
人外周血细胞购自天津血液中心， 用 Ficoll密度离心和尼龙毛柱方法取得 Τ淋巴细胞 (J Cl in Invest, 91, 1490-1498， 1993)， 这些 T细胞在 6孔板上用 DMEM培养基培养， 并加入 10% 的小牛血清。 每个孔有 5 X 105个 T细胞， 然后加入 5 pmol量的 GnRH-SEE、 GnRH-SEE-1、 GnRH- SEE- 2、 GnRH- SEE- 3、 GRP- SEE、 GRP- SEE- 1、 GRP- SEE- 2禾口 GRP- SEE- 3融合蛋白， 这些蛋 白者经过小牛血清的孵育， 然后用 enzyme- l inked immunosorbent assay (ELISA)的 IFN- y试 剂盒 (R & D Systems公司）来检测培养基中的 IFN- Y的含量。
表 1为分析 GnRH-SEE、 GnRH_SEE_l、 GnRH-SEE-2和 GnRH- SEE- 3融合蛋白刺激 T细胞的 能力， 检测的是细胞因子 IFN- Y。
表 1 检测的是细胞因子 IFN- Y (pg/ml )
Figure imgf000011_0001
结果表明 GnRH-SEE、 GnRH_SEE_l、 GnRH-SEE-2和 GnRH_SEE_3融合蛋白都有刺激 T细胞 的活力， 其中， GnRH-SEE-2和 GnRH-SEE-3融合蛋白显示了更强的刺激 Τ细胞的活力。
表 2为分析 GRP-SEE、 GRP-SEE-U GRP-SEE-2和 GRP-SEE-3融合蛋白刺激 T细胞的能力， 检测的是细胞因子 IFN- y。
表 2 检测的是细胞因子 IFN- γ (pg/ml )
Figure imgf000011_0002
结果表明 GRP-SEE、 GRP-SEE-U GRP-SEE-2和 GRP-SEE-3融合蛋白都有刺激 T细胞的活 力， 其中， GRP-SEE-2和 GRP-SEE-3融合蛋白显示了更强的刺激 T细胞的活力。
实施例 17 GnRH- SEE、 GnRH- SEE- 1、 GnRH- SEE- 2、 GnRH- SEE- 3、 GRP- SEE、 GRP- SEE- 1、 GRP-SEE-2和 GRP-SEE-3融合蛋白杀伤癌细胞
在 6孔板上用 DMEM培养基培养人癌细胞来源的肝癌细胞 Hep G2和肺癌细胞 A549， 癌细胞 数为 5 x 105个癌细胞 /孔， 然后加入 T细胞， 是癌细胞的 10倍即 5 X 106个 T细胞 /孔， 再分别 加入各种剂量的经过小牛血清孵育的 GnRH-SEE、 GnRH-SEE- U GnRH_SEE_2、 GnRH_SEE_3、 GRP-SEE、 GRP-SEE-1 , GRP_SEE_2和 GRP_SEE_3融合蛋白， 其中， GnRH超抗原融合蛋白加入到 肝癌细胞 Hep G2培养孔， GRP超抗原融合蛋白加入到肺癌细胞 A549培养孔。
细胞毒作用或癌细胞杀伤效果采用 MTT (Methabenzthiazuron)法测定（Immunology, 82,
117-125, 1994) , 细胞生长抑制用 100- [ (At。st_Ab) / (A。- Ab) ] x 100 公式计算， At6St指的是有 T 细胞加入下的癌细胞生长， Ab指的是孔中只有培养基， A。指的是癌细胞生长。 以后每种癌细胞 杀伤实验的次数都在 20以上。
图 6是实验结果， 表明 GnRH_SEE、 GnRH-SEE- U GnRH-SEE_2、 GnRH-SEE-3都有杀伤肝癌 细胞 ¾φ G2的能力， 其中 GnRH-SEE-2和 GnRH-SEE-3在很低的剂量下就有更高的癌细胞杀伤 作用。
图 7是实验结果， 表明 GRP-SEE、 GRP-SEE-U GRP_SEE_2和 GRP_SEE_3都有杀伤肺癌细 胞 A549的能力， 其中 GRP-SEE-2和 GRP-SEE-3在很低的剂量下就有更高的癌细胞杀伤作用。
图 8 (图中： 8-1为 GnRH-SEE-3组； 8-2为 GRP-SEE-3组）显示的是被 T细胞攻击的癌细 胞， 大细胞是癌细胞， 小细胞是 T细胞。
经实验： GnRH-SEE. GnRH- SEE- 1、 GnRH- SEE- 2、 GRP- SEE、 GRP- SEE- 1禾口 GRP- SEE- 2组中 也观察到了 T细胞攻击的癌细胞的现象。
本发明选择了一种超抗原 SEE及其突变体， 使 SEE突变体比 SEE有着更强大 T细胞诱导 能力， 更能抵抗血液中的抗体中和作用。 由 SEE组成的 TGF- a -SEE、 EGF_SEE、 VEGF_SEE、 GnRH-SEE禾口 GRP- SEE, 由 SEE- 2组成的 TGF- a -SEE- 2、 EGF- SEE- 2、 VEGF- SEE- 2、 GnRH-SEE-2 禾口 GRP-SEE-2以及由 SEE- 3组成的 TGF_ a - SEE_3、 EGF_SEE_3、 VEGF_SEE_3、 GnRH-SEE-3和 GRP-SEE-3融合蛋白都有抗癌作用，其中， TGF- a -SEE-2、 EGF-SEE-2、 VEGF-SEE-2、 GnRH-SEE-2、 GRP- SEE- 2TGF- a - SEE- 3、 EGF- SEE- 3、 VEGF- SEE- 3、 GnRH- SEE- 3禾口 GRP- SEE- 3融合蛋白显示 了更强的杀伤癌细胞和抗肿瘤的生物活性。
这里的超抗原 SEE的突变体 SEE-l、SEE-2和 SEE-3选自 SEE并引入了大规模多个点突变， 由于 SEA与 SEE在氨基酸序列上有着 80%以上的相同性， 所以可以从 SEA经过点突变也可以 得到 SEE的突变体。 另外通过各种基因点突变的分子生物学操作方法， 在现有的 SEE突变体 上引入点突变来获得生物活性更高的超抗原。
从实施例 1中所确定的点突变位置， 在这些位置上可以引入其它类似理化性质的氨基酸 也能获得与 SEE突变体相同或者更高的生物活性。
从更大的范围来看， 其它超抗原例如金黄色葡萄球菌肠毒素家族的 SEB、 SEC、 SED、 SEF、 SEG、 SEH、 SEI、 SEJ等，链球菌毒素的 SPE- A、 SPE_B、 SPE_C，休克综合征毒素（Shock syndrome toxin) , 病毒蛋白来源的超抗原都可以通过多点突变手段来加强超抗原的 T细胞刺激能力、 超抗原的稳定性和抵抗血液中抗体的超抗原的中和作用。
作为 SEE及其突变体融合蛋白的另一部分可以选择与癌细胞表面受体相互作用的多肽分 子， 这样的多肽有碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor, bFGF)及 FGF 家族、 白细胞介素家族（Interleukin)例如白细胞介素 -2、 白细胞介素 _3、 白细胞介素 _4、 白 细胞介素一 6、 白细胞介素 -8、 白细胞介素 -11、 白细胞介素 -13、粒细胞巨噬细胞集落剌激因 子 (Granulocyte— macrophage colony-stimulating factor, GM—CSF)、 肝素结合 EGF样生长 因子（Heparin-b inding EGF-l ike growth factor, HB-EGF)、胰岛素样生长因子（Insul in-l ike growth factor, IGF)、 肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor, HGF)、 血小板衍生生 长因子（Platel et- derived growth factor, PDGF)、 神经生长因子（Nerve growth factor, NGF)、胎盘生长因子（Placental growth factor, PGF)、干细胞因子（Stem ce l l factor, SCF) . Heregul in、 erbB 配体、 各种趋化因子（Chemokine)及其家族、 Ephrin 家族、 血管生成素 (Angiopoiet in)、 血小板生成素（Thrombopo i etin)和血浆第 VI I因子（Factor VI I)、 尿激酶 型纤溶醸原激活物（Urokinase-type plasminogen act ivator) , 生长激素释放激素（Growth hormone releasing hormone) , 促黑激素 a _MSH、 催乳激素（Prolactin)、 催乳激素释放激素 (Prolactin re l eas ing hormone) > 生长激素 (Growth hormone) 促卵泡激素 (Fol l i cle st imulating hormone)、胎盘泌乳激素（Placental lactogen)、绒毛膜促性腺激素（Chorionic gonadotrop in)和促肾上腺皮质激素释放激素（Corti cotropin rel easing hormone) , 生长抑 素 (Somatostatin)、 去唾液酸糖蛋白 (Asialoglycoprote in)、 低密度脂蛋白 (Low dens i ty l ipoprotein)和转铁蛋白（Transferrin)等， 以及这些蛋白的氨基酸序列有 70%以上的相同性 的自然和人为的变异体等。 许多肿瘤组织都过量表达这些物质受体， 从而趋化因子、 酶、 激 素及其它蛋白等多肽分子配体就可以像细胞因子那样与共刺激分子连接形成融合蛋白质， 将 共刺激分子定位到肿瘤组织内。
上面融合蛋白质还可以通过化学交联反应等手段分别将细胞因子、 激素或非抗体非细胞 因子非激素的多肽等与超抗原的蛋白质片段进行连接， 例如共价键连接来构建。 对于融合蛋 白质可以进行化学修饰、 缺损融合蛋白质的一部分多肽片段以及将其它多肽连接在这些蛋白 质上等一系列的改造。 纯化后的融合蛋白质可通过一系列蛋白质的变性和复性过程来完善其 包括二硫键在内的空间结构， 提高其生物活性。
从更大的范围来看， 这里实验中所采用的细胞因子、 激素或非抗体非细胞因子非激素的 多肽与其相对应的癌细胞表面上过度表达的受体实际上是一种配体和受体之间相互作用的关 系， 利用这种配体和受体的亲和力， 将超抗原定位到肿瘤组织。 除了细胞因子、 激素或多肽 夕卜， 其它凡是能与癌细胞过度表达的受体相对应的蛋白质或多肽分子即配体也可用于癌细胞 的特异性定位。 除了上面所说的与癌细胞上的受体对应的配体外， 从噬菌体展示（Phage di splay)等方法筛选到的与癌细胞上受体有亲和力并有拮抗作用的人工筛选的蛋白质或多肽 及用其它方法筛选到的能够直接与癌细胞表面相互作用的蛋白质或多肽分子都可以和共刺激 分子形成融合蛋白质。
作为药物其剂型可以是乳化剂、 脂质体、 分散剂、 稳定剂等一起制成各种注射、 口服、 敷贴以及手术处理等药物的给药形式。 除了融合蛋白质本身可以作为药物外， 编码融合蛋白 质的核苷酸片段或载体还可以作为基因治疗形式来应用。
本发明的具体实施例中， 所述细胞因子-超抗原融合蛋白是由 SEE组成的 TGF- ct -SEE、 EGF-SEE和 VEGF-SEE,由 SEE的突变体 SEE-1组成的 TGF- a -SEE-1、EGF_SEE_1和 VEGF_SEE_1， 由 SEE的突变体 SEE-2组成的 TGF- a -SEE_2、 EGF-SEE-2和 VEGF_SEE_2， 以及由 SEE的突变 体 SEE-3组成的 TGF- α -SEE-3、 EGF-SEE-3和 VEGF-SEE-3 ; 所述激素-超抗原融合蛋白是由 SEE组成的 GnRH-SEE， 由 SEE的突变体 SEE-1组成的 GnRH_SEE_l， 由 SEE的突变体 SEE-2组 成的 GnRH-SEE-2， 以及由 SEE的突变体 SEE-3组成的 GnRH-SEE_3 ; 所述非抗体非细胞因子非 激素的多肽-超抗原融合蛋白是由 SEE 组成的 GRP-SEE , 由 SEE 的突变体 SEE-1 组成的 GRP-SEE-1 , 由 SEE的突变体 SEE-2组成的 GRP-SEE-2, 以及由 SEE的突变体 SEE-3组成的 GRP-SEE-3。这些融合蛋白能够诱导和刺激 T淋巴细胞来分别抗肉瘤 S180、Ifep G2肝癌和 A549 肺癌， 但是， 只要其它种类的癌细胞 (各种脏器、 血液中的细胞、 骨骼、 脑、 肠和皮肤等）上 表达 TGF- a、 EGF、 VEGF、 GnRH和 GRP的受体， 都可以采用这里的融合蛋白来杀伤肿瘤， 从 而应用于各种癌症或恶性肿瘤的治疗。
以上实施例和优选实施方式的描述属于对权利要求限定的本发明的示意性说明， 而不是 限制本发明。 需要特别指出的是， 只要不脱离本发明的宗旨， 所有显而易见的改变以及具有 等价代换的相似发明， 均包含在本发明的保护范围之内。

Claims

权 利 要 求
1. 一种癌靶向超抗原融合蛋白， 其特征在于该融合蛋白含有：
a) 促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相互作用的配体， 所述配体是细胞因子、 激 素或非抗体非细胞因子非激素的多肽；
b) 能引起抗癌免疫反应的超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 E及其突变体， 所述金黄色葡萄 球菌肠毒素 E用缩写 SEE表示； 所述金黄色葡萄球菌肠毒素 E的突变体用缩写 SEE-X表示， 所述 X=l-3 o
2. 根据权利要求 1 所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白， 其特征是所述细胞因子选自缩写为 TGF- α的转化生长因子 - α、 缩写为 EGF的表皮生长因子、 缩写为 VEGF的血管内皮细胞生长 因子； 所述激素选自缩写为 GnRH的促性腺激素释放激素； 所述非抗体非细胞因子非激素的多 肽选自缩写为 GRP的促胃液素释放肽。
3. 根据权利要求 1所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白， 其特征是所述 SEE是 SEQ ID No. 2所示 的氨基酸序列； 所述 SEE-1是 SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列； 所述 SEE-2是 SEQ ID No. 6所 示的氨基酸序列； 所述 SEE-3是 SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列。
4. 根据权利要求 3所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白， 其特征是所述 SEE-1是 SEE上的 20位、 21位、 24位、 27位、 34位、 39位、 40位、 1位、 42位、 44位、 49位、 74位、 75位、 78位、 79位、 81位、 83位、 84位、 217位、 220位、 222位、 223位、 225位、 227位上的一个或多 个氨基酸被替换。
5. 根据权利要求 3所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白， 其特征是所述 SEE-2是 SEE上的 20位、 21位、 24位、 27位、 34位、 35位、 39位、 40位、 41位、 42位、 44位、 45位、 46位、 49 位、 74位、 75位、 78位、 79位、 81位、 83位、 84位、 188位、 190位、 217位、 219位、 220 位、 222位、 223位、 224位、 225位、 227位上的一个或多个氨基酸被替换。
6. 根据权利要求 3所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白， 其特征是所述 SEE-3是 SEE上的 20位、 21位、 24位、 27位、 34位、 35位、 36位、 39位、 40位、 41位、 42位、 44位、 45位、 46 位、 49位、 62位、 74位、 75位、 77位、 78位、 79位、 81位、 83位、 84位、 188位、 190 位、 217位、 218位、 219位、 220位、 221位、 222位、 223位、 224位、 225位、 227位上的 一个或多个氨基酸被替换。
7. 根据权利要求 1所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白， 其特征是所述该融合蛋白为： 由 SEQ ID No. 10所示的 TGF- α -SEE;
由 SEQ ID No. 18所示的 EGF-SEE;
由 SEQ ID No. 26所示的 VEGF-SEE;
由 SEQ ID No. 34所示的 GnRH-SEE;
由 SEQ ID No. 42所示的 GRP-SEE;
由 SEQ ID No. 12所示的 TGF- a - SEE- 由 SEQ ID No. 20所示的 EGF-SEE-1 ;
由 SEQ ID No. 28所示的 VEGF-SEE-1 ; 由 SEQ ID No. 36所示的 GnRH-SEE-l ;
由 SEQ ID No. 44所示的 GRP-SEE-1 ;
由 SEQ ID No. 14所示的 TGF- α -SEE-2;
由 SEQ ID No. 22所示的 EGF-SEE-2;
由 SEQ ID No. 30所示的 VEGF-SEE-2;
由 SEQ ID No. 38所示的 GnRH-SEE-2;
由 SEQ ID No. 46所示的 GRP-SEE-2;
由 SEQ ID No. 16所示的 TGF- α -SEE-3;
由 SEQ ID No. 24所示的 EGF-SEE-3;
由 SEQ ID No. 32所示的 VEGF-SEE-3;
由 SEQ ID No. 40所示的 GnRH-SEE-3;
或由 SEQ ID No. 48所示的 GRP- SEE- 3。
8. 重组载体， 其特征在于含有编码权利要求 7所述融合蛋白的核苷酸序列， 所述核苷酸序列 为编码 SEQ ID No. 10的核苷酸序列 SEQ ID No. 9；
编码 SEQ ID No. 12的核苷酸序列 SEQ ID No. 11
编码 SEQ ID No. 14的核苷酸序列 SEQ ID No. 13
编码 SEQ ID No. 16的核苷酸序列 SEQ ID No. 15
编码 SEQ ID No. 18的核苷酸序列 SEQ ID No. 17
编码 SEQ ID No. 20的核苷酸序列 SEQ ID No. 19
编码 SEQ ID No. 22的核苷酸序列 SEQ ID No. 21
编码 SEQ ID No. 24的核苷酸序列 SEQ ID No. 23
编码 SEQ ID No. 26的核苷酸序列 SEQ ID No. 25
编码 SEQ ID No. 28的核苷酸序列 SEQ ID No. 27
编码 SEQ ID No. 30的核苷酸序列 SEQ ID No. 29
编码 SEQ ID No. 32的核苷酸序列 SEQ ID No. 31
编码 SEQ ID No. 34的核苷酸序列 SEQ ID No. 33
编码 SEQ ID No. 36的核苷酸序列 SEQ ID No. 35
编码 SEQ ID No. 38的核苷酸序列 SEQ ID No. 37
编码 SEQ ID No. 40的核苷酸序列 SEQ ID No. 39
编码 SEQ ID No. 42的核苷酸序列 SEQ ID No. 41
编码 SEQ ID No. 44的核苷酸序列 SEQ ID No. 43
编码 SEQ ID No. 46的核苷酸序列 SEQ ID No. 45
或编码 SEQ ID No. 48的核苷酸序列 SEQ ID No. 47所示。
9. 权利要求 1所述一种癌靶向超抗原融合蛋白的制备方法， 其特征在于培养含有权利要求 8 所述重组载体的宿主细胞， 收集表达权利要求 1所述的融合蛋白。
10. 权利要求 1所述的融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤的药物的应用。
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