CN108611309A - 一种表达重组GnRH与GRP融合蛋白的基因工程菌的构建 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，本发明公开提供了关于一种重组GnRH与GRP的大肠杆菌菌株及制备方法。本发明提供的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a‑G3G6，CCTCC NO：M 2018039。该工程菌含有重组质粒pET28a‑GnRH3‑hinge‑MVP‑NRLLLTG‑SSG‑GRP6，质粒上有重组突变GnRH3‑hinge‑MVP‑NRLLLTG‑SSG‑GRP6基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。BL21(DE3)/G3G6菌株经乳糖诱导，可高效表达重组蛋白GnRH3‑hinge‑MVP‑NRLLLTG‑SSG‑GRP6，该蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该重组蛋白预期可以提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，打破免疫耐受，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的，对于抗肿瘤治疗具有很好的临床应用前景。

Description

一种表达重组GnRH与GRP融合蛋白的基因工程菌的构建
技术领域
在基因工程和蛋白质工程领域，本发明公开了一种表达新型重组融合蛋白工程菌及其构建方法，以及该融合蛋白的纯化。
背景技术
基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。可大致分为上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建(即DNA重组技术)；下游技术：基因工程菌(细胞)的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。
肿瘤抗原(tumor antigen)泛指在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质。普遍可分为肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。肿瘤特异性抗原(tumor-specificantigen，TSA)是肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原。肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)是指非肿瘤细胞所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高。针对这些抗原发展起来的肿瘤特异性免疫治疗，是肿瘤生物治疗的重要方法。
肿瘤疫苗(tumor vaccine)是将肿瘤抗原以多种形式导入患者体内，克服肿瘤引起的免疫抑制状态，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。
肿瘤疫苗按抗原成分的类型可分为肿瘤细胞型疫苗、肿瘤抗原多肽及蛋白疫苗、DNA疫苗和树突状细胞疫苗等。无论何种类型的肿瘤疫苗，其研制的关键都在于选择合适的针对肿瘤的靶抗原和提高免疫原性。
促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone，GnRH)主要由下丘脑下部弓状核的GnRH神经元合成并分泌，它可贮存于一种称为伸展细胞的特殊的脑室细胞中，受到性刺激或高级中枢神经递质的刺激时，由丘脑下部以脉冲的方式分泌进入垂体门脉系统到垂体前叶，与垂体细胞膜上高亲和力的GnRH受体(GnRH-receptor，GnRH-R)特异地结合，促进垂体前叶黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的合成和分泌，进而通过血液循环，调节外周靶性腺类固醇激素的产生。
传统的神经内分泌理论认为，垂体促性腺细胞是GnRH的唯一靶器官。最近的研究显示，GnRH在下丘脑和垂体外的其他器官中也有作用。在子宫、卵巢、输卵管、胎盘、乳腺、前列腺、外周血单核细胞、结肠、直肠和肾的肿瘤细胞以及淋巴瘤和黑素瘤中都发现了GnRH受体，且相比与正常的下丘脑、垂体等组织，肿瘤细胞表面呈高表达。这提示我们GnRH及其受体是肿瘤治疗的理想靶点。
一方面可以通过诱导高滴度的抗GnRH抗体来中和机体内的GnRH，可抑制其与垂体上GnRH-R的结合，导致LH和FSH等促性腺激素释放水平明显下降，下调类固醇类激素的合成，达到对激素依赖性肿瘤的治疗作用。另一方面，选择GnRH靶点制成肿瘤疫苗注入患者体内后，激活患者免疫系统，打破肿瘤的免疫逃逸，诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。
GnRH是一种小分子半抗原，十肽物质，故免疫原性很弱，单独将其作为疫苗很难引起免疫应答。为克服这一缺点，本实验室从三方面入手设计GnRH的基因表达序列：其一，利用辅助T表位来提高GnRH的免疫原性且不会产生明显的针对该T表位的抗体。研究表明，麻疹病毒融合蛋白序列(MVP)中的288-302氨基酸片段(SEIKGVIVRLEGVAK)是一个典型的T表位，可用于人用疫苗。其二，含有多拷贝线性连接的自身肽序列蛋白的免疫原性可以得到极大的提高，因而本实验室将编码三段首尾相连的GnRH的核苷酸片段克隆入高效表达载体。其三，半抗原的二聚体能产生很强的免疫原性。选用人IgG1铰链区(hinge region)寡肽片段226-232/226’-232’这一天然免疫蛋白的枢轴，在编码GnRH重复序列和MVP的核苷酸序列之间引入该寡肽片段的相应核苷酸序列，希望GnRH能藉此形成二聚体，增强免疫原性。
蛙皮素(bombesin，BN)是一种含14个氨基酸残基的生物活性多肽，它最初于1971年由Anastasi和Erspamer从欧洲铃蟾皮肤中提取出来。之后在哺乳动物中发现了与之对应具有相似功能的肽，包括胃泌素释放肽(gastric-releasing peptide，GRP)、神经介素B(neuro medin B，NMB)、神经介素C(neuro medin C，NMC)。这些肽在C端部分都是非常保守的，而其C端部分正是其发挥生物活性的重要部位。
胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide，GRP)是哺乳动物中的蛙皮素同系物，是一种胃肠道神经激素，含有27个氨基酸，具有生长因子样作用。其生理功能主要是作为中枢神经系统的神经递质，刺激各种胃肠激素的释放，刺激消化道正常粘膜组织的生长等。研究证实GRP与肿瘤关系密切，在多种肿瘤细胞中，GRP及其受体存在过表达。通过自分泌或旁分泌途径，GRP可以刺激肿瘤细胞的生长，参与肿瘤新生血管的生成，促进肿瘤的转移等。有研究表明GRP是肿瘤特异性治疗的理想靶分子，已有GRP受体拮抗剂和抗GRP单克隆抗体用于抗肿瘤实验研究，取得了不错的结果。通过免疫途径阻断GRP对肿瘤细胞的效应可能会成为肿瘤治疗的另一途径，我们选择人蛙皮素样肽GRP的C端十肽(GRP-10)作为特异性的抗原，并将这10肽重复串联排列，以增加疫苗分子中抗原表位的浓度。
由于单独用GnRH或GRP免疫原性相对较低，且从多个位点共同作用于肿瘤已经成为趋势。本发明将GnRH基因同GRP基因用柔性肽SSG连接起来，组建pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6重组质粒，诱导表达融合蛋白，将其作为疫苗刺激机体产生主动免疫，打破免疫耐受，产生针对GnRH和GRP特异性肽段的抗体，从而抑制肿瘤的生长。
发明内容
本发明公开一种表达重组GnRH与GRP融合蛋白的基因工程菌。
本发明的一个目的是提供该重组菌的制备方法，方法简便，易于操作。
本发明的另一个目的是公开该重组蛋白的纯化方法。
在本发明的第一个方面，该大肠杆菌菌株命名为EscherichiacoliBL21(DE3)/pET28a-G3G6：pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，菌株已提交中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国、武汉、武汉大学。保藏日期：2018年1月16日，保藏编号为CCTCCNO：M2018039，分类命名为EscherichiacoliBL21/pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，其细胞中含有重组质粒pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，质粒中含有SEQIDNO.1所示的重组突变GnRH-GRP基因序列。
在本发明的第二个方面，提供了该重组质粒的制备方法，其技术路线详述如下：
1.重组质粒pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6及相应基因工程菌的构建
根据本实验室已有的关于重组质粒pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和pET28a-mGM-CSF-GRP6的序列信息，利用引物设计软件Primer5和Oligo7来设计引物P1、P2。上游引物P1中引入Nco I，下游引物P2中引入Nhe I酶切位点以及SSG连接肽序列。采用PCR技术从pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG质粒中克隆得到基因GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG。通过酶切、酶连反应和转化技术将PCR的产物GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG插入pET28a-mGM-CSF-GRP6质粒载体的相应酶切位点中，得到重组质粒pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，将重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21获得需要的重组基因的工程菌。
2.融合蛋白的诱导表达
将重组工程菌进行活化，接种至含氨苄霉素的LB培养基中震荡培养过夜，按1∶100转接于新鲜LB培养液中，37℃培养至A600值为0.5-0.8时，加入乳糖(终浓度7mM)进行诱导表达，6h离心收取菌体沉淀，进行15％SDS-PAGE分析，观察目的蛋白条带位置和表达量。
3.融合蛋白的分离纯化
收集菌体，每克湿菌体加入10mL菌体裂解缓冲液溶解，菌体超声裂解，离心收集上清。将沉淀用含2M尿素的包涵体洗涤液进行洗涤后溶于含40mM盐酸的包涵体裂解液中，离心取上清，将上清采用透析复性方法，按照pH梯度3，4，5，6进行缓慢透析复性。离心弃沉淀，上清液过分子筛SephadexG-50做进一步纯化，用pH＝7的50mM的Tris-Hcl洗脱，收集洗脱峰，检测合并目的蛋白峰组分，蒸馏水充分透析后冻干保存。
附图说明
图1 重组质粒构建原理示意图。
图2 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因图。
Lane1：DNA Marker，
Lane2-9：在57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃退火温度下GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTGF的PCR产物
图3 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测GnRH3-GRP6目的基因图。
Lane1：DNA marker；
Lane2-7：来自于不同菌落的重组质粒GnRH3-GRP6的菌落PCR产物
图4 0.8％琼脂糖凝胶电泳重组质粒限制性内切酶验证图。
Lane1：DNA marker；
Lane2：Nco I单酶切验证，
Lane3：Nco I、Hind III双酶切得到G3G6基因
图5 重组质粒pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6的基因正向测序图。
图6 15％SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白的诱导曲线图。
Lane1：重组菌诱导前的全菌蛋白；
Lane2：Protein marker；
Lane3-10：重组菌诱导时间分别为8h、7h、6h、5h、4h、3h、2h、1h后的全菌蛋白
图7 15％SDS-PAGE菌体裂解物分析图。
Lane1：Protein marker；
Lane2：重组菌超声破碎后的上清液；
Lane3：重组菌超声破碎后的沉淀；
Lane4：重组菌诱导后的全菌蛋白
图8 15％SDS-PAGE电泳检测尿素洗涤浓度筛选图。
Lane1：Protein marker；
Lane2-5：经尿素浓度分别为2M，1.5M，1.0M，0.5M洗涤液洗涤后的沉淀；
图9 15％SDS-PAGE分析GnRH/GRP融合蛋白冻干纯化结果图。
Lane1：纯化前重组菌诱导后全菌体蛋白；
Lane2：Protein marker；
Lane3：纯化后的GnRH/GRP融合蛋白
具体实施方式
材料
(1)菌株
载体pET28a-mGM-CSF-GRP6，EscherichiacoliBL21(DE3)，菌株pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG均为本实验室保存。
(2)工具酶和试剂
分子克隆工具酶为Fermentas公司产品；质粒抽提试剂盒为上海捷瑞生物科技有限公司；产物纯化试剂盒以及PCR胶回收试剂盒为上海生工生物科技有限公司的产品。
(3)培养基
LB培养基，配方见参考文献SambrookJ，FristshEF，ManiatisT.MolecularCloning；ALaboratoryManual2nded.NY：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989。
本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、PCR产物的回收、连接酶连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见SambrookJ，FristshEF，ManiatisT.MolecularCloning；ALaboratoryManual2nded.NY：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989，pp.16-340。
实施例1 GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因的克隆
根据本实验室已构建的关于pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG的序列信息，利用引物设计软件Primer、Oligo分别设计两对引物P1、P2：
P1：5′-CATGCCATGGATCCGGAACATTGGA-3′
P2：5′-CGGCTAGCGCCGCTGCTACCAGTCAG-3′
上游引物P1中引入酶切位点Nco I，下游P2中引入柔性肽SSG序列以及酶切位点Nhe I。用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，利用引物P1、P2克隆GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因，PCR反应体系见表1，反应参数见表2。
表1 GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG扩增反应体系
表2 GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG扩增反应参数
0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见说明书附图2)，条带位置与预期的224bp一致。
通过切胶回收获得目的片段GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，将目的片段和pET28a-mGM-CSF-GRP6载体质粒分别经Nco I、Nhe I双酶切，双酶切反应体系见表3、表4。
表3 GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因双酶切反应体系
表4 pET28a-mGM-CSF-GRP6双酶切反应体系
酶切产物通过PCR产物纯化试剂盒纯化，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用E.coli DNA连接酶4℃连接，用冷CaCl2法制备大肠杆菌BL21的感受态细胞，将酶连产物转化感受态细胞后涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养后挑取单菌落，将单菌落接种至LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，分别通过PCR、单酶切和双酶切等方法初筛阳性克隆，并送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确(参见说明书附图3、图4、图5)。
实施例2 GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6基因在大肠杆菌中的表达及培养
重组菌以1％接种量在液体LB培养基试管中37℃振荡培养过夜，再以1％的接种量转接摇瓶大批培养，培养4h后加入终浓度为7mM乳糖诱导表达，诱导5h后收集菌体，留样进行SDS-PAGE分析。融合蛋白在诱导后6h达到稳定的最大表达量，通过Bandscan软件分析融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的55％(参见说明书附图6)。
实施例3 融合蛋白的初步分离纯化
挑选高表达量菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养；过夜培养液转接入LB培养基，37℃扩大培养，选取最优发酵条件获得发酵菌体。5000r/min离心5min，上清及沉淀均留样。将沉淀用配制好的菌体裂解液(20mL/g菌体)溶解，超声裂解菌体。12000r/min离心20min，收集上清及沉淀均留样标记。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白主要存在于菌体上清中，故可判断融合蛋白为包涵体表达(参见说明书附图7)。
实施例4 包涵体的溶解及复性
取重组菌裂解液离心后沉淀重悬于含有0.5M、1M、1.5M、2M尿素的包涵体洗涤液(含50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.0)中，搅拌1h后，12000r/mi n离心10min，上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。包涵体用双蒸水洗涤两次，离心后取沉淀复溶于含有40mM盐酸的包涵体溶解液(含50mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH 8.0)中，4℃磁力搅拌过夜，12000r/min离心15min，收集上清。将收集的上清用复性缓冲液(含Tris-HCl 50mM，EDTA 5mM)进行透析复性，复性缓冲液中加入含氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽至终浓度分别为0.1mM和1mM，复性缓冲呈pH＝2、3、4、5、6，依次将包涵体裂解液pH升高至6，离心取上清，获得初步复性后的目的蛋白。(参见说明书附图8)
实施例5 SephadexG-50分子筛层析
本实验采用SephadexG-50葡聚糖凝胶，分离范围1500-30000。将SephadexG-50葡聚糖凝胶干粉颗粒用20倍体积的双蒸水泡过夜，装柱前煮沸2小时脱气，再将凝胶混匀装入层析柱中，层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接核酸蛋白检测仪，利用缓冲液(pH＝7，50mM Tris-HCl，)进行层析柱的平衡，平衡完毕后以1mL/min的速度进行蛋白溶液的上样操作，上样后重复平衡操作，收集对应峰谱留出液制样，进行SDS-PAGE电泳分析。
实施例6 脱盐冻干
收集蛋白纯度较高的洗脱液，4℃对RO水其用透析过夜，将透析后的洗脱液在冻干机中冻干，刮取蛋白干粉冷冻保存并进行SDS-PAGE电泳分析。(参见说明书附图9)。
除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种表达生产重组蛋白GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6的大肠杆菌菌株，其特征在于大肠杆菌菌株Escherichia coli BL21/pET28a-G3G6：pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，保藏编号：CCTCC NO：M 2018039。
2.根据权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株BL21/pET28a-G3G6，其特征在于：大肠杆菌细胞中含有重组质粒pET28a-G3G6：pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6。
3.根据权利要求书2所述的该大肠杆菌菌株BL21/pET28a-G3G6中重组质粒pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，其特征在于：含有重组的GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，可表达融合蛋白，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
4.一种制备权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株的方法，它包括以下步骤：
(I)用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和pET28a-mGM-CSF-GRP6，通过PCR方法扩增出目的片段GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG。
(II)用限制性内切酶Nco I、Nhe I切割GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和pET28a-mGM-CSF-GRP6质粒，用E.coli DNA连接酶4℃连接过夜，将其转化大肠杆菌菌株，获得含质粒pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6的菌株。
(III)鉴定重组质粒：使用菌落PCR法、单酶切、双酶切方法进行验证，将重组菌株进行测序验证。
5.根据权利要求3所述的一种新型融合蛋白GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，其特征在于：该基因表达的融合蛋白实际分子量约为14.9kDa，其N端为3段串联重复的GnRH序列及IgG的铰链区及麻疹病毒融合蛋白序列中的288-302氨基酸片段MVP，C端为GRP十肽的6段串联重复，N端和C端之间利用SSG柔性肽连接。
6.根据权利要求5所述的GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6蛋白的重组方法，其特征在于：包含抗肿瘤疫苗的抗原表位GnRH、GRP，具有更强的抗肿瘤功能。
7.一种GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6重组蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：
(I)根据权利要求4所述步骤构建宿主菌
(II)通过乳糖诱导，超声破碎，包涵体洗涤，包涵体裂解，透析复性来初步获得重组蛋白
(III)通过Sephadex G-50分离出GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，该融合蛋白纯度可达SDS-PAGE电泳纯。
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