CN1880336A - 癌靶向超抗原融合蛋白质及其生产方法 - Google Patents

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CN1880336A CN 200510078775 CN200510078775A CN1880336A CN 1880336 A CN1880336 A CN 1880336A CN 200510078775 CN200510078775 CN 200510078775 CN 200510078775 A CN200510078775 A CN 200510078775A CN 1880336 A CN1880336 A CN 1880336A
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Abstract

本发明提出了一种融合蛋白,含有:a)促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相对应的配体、与癌细胞受体有亲和力及有拮抗作用的人工筛选多肽或直接与癌细胞表面相互作用的多肽分子;b)能引起抗癌的免疫反应的超抗原。还公开了含有该融合蛋白的表达载体和宿主细胞,制备这种融合蛋白的方法,以及该融合蛋白用于制备治疗癌症或免疫反应的药物的用途。

Description

癌靶向超抗原融合蛋白质及其生产方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,特别是一种融合蛋白。还公开了含有该融合蛋白的表达载体和宿主细胞,及其制备方法。
背景技术
目前对于癌症疾病的药物治疗主要是以化学药物为主,副作用大,化学药物在杀伤癌细胞的同时也伤害了正常细胞,化学药物缺乏针对癌细胞的特异性作用。
为了解决药物的特异性问题,抗体是一类很有效的工具,是一种常用的癌细胞特异性定位导向载体,它可以特异地作用于癌细胞。抗体本身可以封闭癌细胞,它的Fc片段能引起细胞毒作用。抗体也可以接上一个毒素蛋白质,引导毒素蛋白质杀死癌细胞。
超抗原(Superantigen)也能引起细胞毒作用,它是一类特殊的抗原分子,主要是一些细菌的毒素和逆转录病毒基因的产物,不需要抗原提呈细胞的加工处理,而以完整的蛋白质形式直接与细胞膜上的MHC II类分子结合形成复合物,识别TCR的Vβ片段,激活比普通抗原多得多的T细胞(包括CD4+,CD8+),并释放大量细胞因子,对靶细胞产生强而有力的细胞毒作用。
超抗原与人类多种急、慢性疾病的发生有关,但在抗肿瘤研究中也发挥了独特的作用,尝试用它激活的T细胞来杀伤肿瘤,并取得了一定的成果,目前较有研究基础的超抗原主要是金黄色葡萄球菌肠毒素A、B等。因为超抗原无抗肿瘤的特异性,它也会作用于表达MHC II类分子的正常细胞上,直接用于抗肿瘤会产生副作用,临床使用有很多的限制。
为了解决超抗原的无抗肿瘤特异性问题,人们将超抗原连接到抗体上,由抗癌抗体将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal-enterotoxin A,SEA)定位到癌细胞上(M.Dohlsten,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,8945-8949,1994;J.Ihle,et al,Cancer Res.,55,623-628,1995)。该SEA基因早在80年代就报道了(I.Y.Huang,et al,J.Biol.Chem.,262,7006-7013,1987;M.J.Betley and J.J.Mekalanos,J.Bacteriol.,170,34-41,1988)。
除了抗体外,与癌细胞生长有关的细胞因子也被用于癌细胞的特异性定位。例如表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)被连接到RNA水解酶(H.Jinno,et al,Cancer Chemother.Pharmacol.,38,303-308,1996)和毒素(A.Schmidt,et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,277,499-506,2000),碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor,VEGF)和转化生长因子(Transforming growth factor-α,TGF-α)也分别与毒素形成融合蛋白质(Biochem.Biophys.Res.Commun.,277,499-506,2000;L.M.Veenendaal,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99,7866-7871,2002;A.Kihara andI.Pastan,Cancer Res.,54,5154-5159,1994)。而其它的细胞因子也有报告,例如白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)和白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)则分别被连接到毒素上(S.R.Husain,et al,Cancer Res.,58,3649-3653,1998;J.M.Dore,et al,FEBS Lett.,402,50-52,1997)。
以上工作都使用细胞因子与蛋白质毒素或RNA水解酶所组成的融合蛋白质的形式,思想方法是出于同样的战略模式(E.B.Sweeney and J.R.Murphy,Essays Biochem.,30,119-131,1995)。在这些细胞因子的癌细胞定位的作用下,蛋白质毒素和RNA水解酶才特异地杀伤癌细胞。但是这个作用机制不同于抗体的Fc片段以及超抗原,后两者是动员机体的免疫系统来激发抗癌的细胞毒作用。
除了上面提到的细胞因子外,激素多肽也被用于类似的实验,例如促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、催乳激素(Prolactin,PRL)和促黑激素(α-Melanocyte stimulating hormone,α-MSH),它们被连接到一个毒素蛋白而形成融合蛋白质(A.Nechushtan,et al,J.Biol.Chem.,272,11597-11603,1997;Z.Wen,et al,J.Biol.Chem.,266,12289-12293,1991;J.F.Langenheim,et al,Breast Cancer Res.Treat.,90,281-293,2005)。
癌细胞是由正常细胞转变而来的,癌细胞的抗原是自身抗原,所以癌细胞能够逃避免疫系统的监视。人们一直在寻找新的抗癌方法来提高癌症病人的免疫力,特别是针对癌细胞的特异性免疫力。因此,本领域迫切需要一种特别针对癌细胞的强有力的新的抗癌方法。
发明内容
因此,本发明的一个目的是提供一种对癌症具有特异性的,杀伤力强的方法。
在本发明的一个方面,提供了一种融合蛋白,其含有:
a)促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相对应的配体、与癌细胞受体有亲和力及有拮抗作用的人工筛选多肽或直接与癌细胞表面相互作用的多肽分子;
b)能引起抗癌的免疫反应的超抗原。
在该方面的一个优选例中,该配体选自:促胃液素释放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)、生长激素释放激素(Growth hormonereleasing hormone,GHRH)、促性腺激素释放激素GnRH、促黑激素α-MSH、催乳激素(Prolactin,PRL)、催乳激素释放激素(Prolactin releasing hormone,PRLH)、生长激素(Growth hormone,GH)、促卵泡激素(Follicle stimulatinghormone,FSH)、胎盘泌乳激素(Placental lactogen,PL)、绒毛膜促性腺激素(Chorionic gonadotropin,CG)和促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropinreleasing hormone,CRH)等以及其它与癌症或免疫疾病有关联的配体,及其氨基酸序列有70%以上的相同性的自然变异体和人为的变异体。更优选的,选自促胃液素释放肽GRP、生长激素释放激素GHRH、促性腺激素释放激素GnRH、促黑激素α-MSH和催乳激素PRL。
在该方面的另一个优选例中,该超抗原选自:金黄色葡萄球菌肠毒素家族的SEA、SEB、SEC、SED、SEE,链球菌毒素的SPE-A、SPE-B、SPE-C,金黄色链球菌毒休克综合征毒素、链球菌有丝分裂外毒素、链球菌超抗原、病毒蛋白以及其氨基酸序列有70%以上的相同性的自然和人为的变异体。更优选的,选自金黄色葡萄球菌肠毒素家族的SEA。
在该方面的还有一个优选例中,超抗原是SEA蛋白;配体选自表皮生长因子和血管内皮细胞生长因子。
在该方面的一个优选例中,融合蛋白含有(a)超抗原;(b)配体;(c)可操纵性连接超抗原和配体的接头。更优选的,超抗原是SEA蛋白;配体选自GRP、GHRH、GnRH、α-MSH、或PRL;所述接头具有SEQ ID NO:11的核苷酸序列。更优选的,该接头编码SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在该方面的一个优选例中,融合蛋白具有SEQ ID NO:1、3、5、7或9的核苷酸序列编码的氨基酸序列。优选融合蛋白具有SEQ ID NO:2、4、6、8或10的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面,提供了一种重组载体,含有编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的还有一个方面提供了一种宿主细胞,含有上述重组载体。
在本发明的另一个方面,提供了一种生产上述融合蛋白的方法,包括步骤:培养上述宿主细胞,收集表达的上述融合蛋白。
在该方面的一个优选例中,还包括纯化收集的融合蛋白的步骤。
在本发明的还有一个方面,提供了上述融合蛋白用于制备治疗癌症或免疫疾病的药物的用途。
为了有效地开发针对癌症的特异性药物,本发明利用超抗原和激素的各自特性,构建一种新型激素-超抗原融合蛋白质,促进癌细胞生长或与癌细胞表面受体相对应的激素可以将融合蛋白质定位到癌细胞上,而超抗原则在癌细胞周围引起抗癌的免疫反应,即超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(Superantigen-dependent-cellular-cytotoxicity,SDCC)。利用此方法就可以将这种类型的融合蛋白质特异地定位到癌细胞并在癌细胞周围引起抗癌的细胞毒免疫反应。
本发明选择了一个崭新的战略,将超抗原连接到激素或短肽上,这样产生了新型的细激素-超抗原融合蛋白质,作为一类模型,本发明使用生长激素释放激素、促性腺激素释放激素、促黑激素和催乳激素分别与超抗原SEA来构建这种新型的融合蛋白质。而选择另一个与癌有关的促胃液素释放肽作为构建融合蛋白质的一部分,表明了像激素那样的小分子多肽也能够起到癌细胞定位的作用。
在此虽然只选择超抗原SEA,当然超抗原SEB和SEC以及其它超抗原也能够说明本发明的思想。抗原SEA或其它超抗原的作用是激发机体内的免疫反应。
同样,作为实验材料的4种激素以及一个短肽分子只是利用它们癌细胞的定位作用,采用与癌细胞紧密相关的其它激素和短肽分子也能够说明本发明的思想。
考虑到本发明的融合蛋白质可以由各种类型的激素与超抗原构建,所以采用了一个通用的蛋白质纯化方法,即按照同样的方法来纯化各种融合蛋白质。此方法是利用6个组氨酸作为纯化用的Tag,质粒pET-40b(Novagen公司)含有这个6His-Tag。
采用与癌紧密有关的激素作为癌细胞定向的载体,是因为癌细胞通常大量表达这些激素的受体。而正常细胞膜上的这些受体的表达量没有或很少,所以激素也可以起着癌细胞的特异性定位作用。利用激素能认识癌细胞的特性,把超抗原SEA分别连接到GRP、GHRH、GnRH、α-MSH、或PRL激素上,就能使得SEA集中在癌细胞的周围,特异地激发免疫反应,产生极其强大的针对癌细胞的细胞毒作用。单独使用超抗原SEA会产生全身用药的副作用,而采用融合蛋白质就会使得只在癌组织周围集中由SEA所诱导的大量T杀伤细胞。
超抗原SEA与T细胞激活产生增殖和产生细胞毒作用呈剂量依赖关系,其范围在每只小鼠0.1μg~100μg,最大效应出现在注射后24小时,96小时内消失,SDCC最大效应浓度为每只小鼠1μg,效应高峰在第48小时,96小时内消失(G.Hedlund,et al,Cancer Immunol.Immunother.,36,89-93,1993)。
所以融合蛋白质可以发挥类似于抗体-SEA的作用,而采用这个方法能够节约药物开发成本,例如小鼠抗体人源化和大规模动物细胞表达生产。所以超抗原SEA的药物就能大大地降低药物生产和病人医疗成本,同样含有超抗原SEA的本发明的融合蛋白质也可以大大地降低使用剂量。
GRP-SEA、GHRH-SEA、GnRH-SEA、α-MSH-SEA和PRL-SEA仅仅是用来说明本发明的材料,而本发明的思想范围可以拓展,例如可以采用各种类型的激素和超抗原以及它们的变异体,对融合蛋白质的结构进行改造,这些变异体可以完善其生物学功能以及减少其可能产生的副作用。例如SEA在第227位置的氨基酸改造(J.Hansson,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,2489-2494,1997)或其它位置上的改造后的变异体(E.Erlandsson,et al,J.Mol.Biol.,333,893-905,2003)可以大大地降低副作用。
融合蛋白质可以是GRP-SEA、GHRH-SEA、GnRH-SEA、α-MSH-SEA和PRL-SEA形式,也可以是SEA-GRP、SEA-GHRH、SEA-GnRH、SEA-α-MSH和SEA-PRL形式,在空间上两种蛋白质是独立的,所以两种形式都可以使得细胞因子和超抗原独立地发挥作用。
连接这两种蛋白质的接头的氨基酸组分和长度则可以是各种形式,过短的接头会造成细胞因子和超抗原因过分接近而产生空间阻碍,合适的接头对于充分发挥细胞因子和超抗原的作用是至关重要的。
以上的各种融合蛋白质基因可以转入动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、细菌等生物体在内的重组工程化宿主细胞,表达方式可以是分泌和不分泌等各种形式。无细胞体外翻译系统也可以用来进行融合蛋白质的生产。
当然融合蛋白质也可以通过化学交联反应等化学反应手段分别将激素和超抗原的多肽片段进行连接,例如共价键连接,从而构建成融合蛋白质。
对于融合蛋白质可以进行化学修饰、缺损融合蛋白质的一部分多肽片段以及将其它多肽连接在这些蛋白质上等一系列的改造。
本发明阐述的是一种新的抗癌方法,即把激素和超抗原构建成融合蛋白质,由激素将超抗原定位到癌细胞上,从而在癌细胞周围发生抗癌的细胞毒免疫反应。
从更大的范围来看,激素与其癌细胞表面上过度表达的受体实际上是一种配体(Ligand)和受体之间相互作用的关系,利用这种配体和受体的亲和力,将超抗原定位到肿瘤组织。除了激素多肽外,还包括细胞因子,例如表皮生长因子EGF家族、血管内皮细胞生长因子VEGF家族、碱性成纤维细胞生长因子bFGF及FGF家族、转化生长因子TGF-α、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-13、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、肝素结合EGF样生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子、胎盘生长因子、干细胞因子、白细胞介素-8、Heregulin、erbB配体、各种趋化因子,以及其它有与癌细胞过度表达受体相对应的多肽分子即配体也可用于癌细胞的特异性定位。这样的物质有Ephrin家族、血管生成素,Ang、血小板生成素TPO和凝血因子VII、尿激酶型纤溶酶原激活物uPA、生长抑素SST、去唾液酸糖蛋白ASGP、低密度脂蛋白LDL和转铁蛋白Tf等,许多肿瘤组织都过量表达这些物质的受体,从而这些蛋白等多肽分子配体就可以像激素那样与超抗原相连接形成融合蛋白质,将超抗原定位到肿瘤组织。
除了上面所说的与癌细胞上的受体对应的配体外,从噬菌体展示(phagedisplay)等方法筛选到的与癌细胞上的受体有亲和力并有拮抗作用的人工筛选多肽以及其它能够直接与癌细胞表面相互作用的多肽分子都可以和超抗原形成融合蛋白质。
细胞因子例如EGF和VEGF等也可以起到激素类似的作用,即与超抗原构建融合蛋白质,EGF和VEGF能将超抗原定位到癌细胞周围。在通常情况下,与有些激素比较,细胞因子的分子量较大,EGF有51个氨基酸,VEGF超过100个氨基酸。而GRP、GHRH、GnRH、α-MSH和PRL分别是27、44、10、13和199个氨基酸,在此只是PRL分子量较大,在通常情况下激素的上游调控激素例如GnRH等都是小分子的多肽。另外细胞因子常含有二硫键,需要蛋白质复性操作,而此处所选的激素不含二硫键。所以激素和超抗原的融合蛋白的生产成本要比细胞因子和超抗原的融合蛋白低,操作更简便。激素和超抗原的融合蛋白更能针对特定器官的肿瘤例如卵巢癌、乳腺癌、子宫癌和前列腺癌等。
本发明采用pET-40b质粒(Novagen公司,美国),它含有一个与目标蛋白共表达的参与二硫键复性DsbC蛋白,这个体系有利于外源基因所表达的产物保持生物活性。这个质粒供外源基因插入的地方含有多个限制性内切酶位点,可以很方便地插入超抗原和激素,从而形成各种融合蛋白质。对于10个氨基酸短肽的激素,只用引物就可以将编码这个激素的核酸序列导入质粒。
融合蛋白质不但可以起着和抗体相似的特异性抗癌作用,而且由超抗原所激发的T细胞杀伤效果要大于抗体,使用剂量却远远低于抗体药物的用量,这样就可以大大地降低生产成本。
作为药物形式应用的以上各种类型的融合蛋白质可应用于抗癌和免疫疾病等医学的临床方面,它们和防腐剂、乳化剂、脂质体、分散剂、安定化剂等一起制成各种注射、口服、敷贴以及手术处理等药物的给药形式。
除了融合蛋白质本身可以作为药物外,编码融合蛋白质的核苷酸片段或载体还可以作为基因治疗形式来应用。例如将这些核苷酸片段注射动物体内并被转入细胞,从而表达融合蛋白质。
附图说明
图1表示用pET-40b质粒构建各种融合蛋白质基因及其表达。
图2和图3表示了5种融合蛋白抑制肿瘤细胞的实验。
具体实施方式
以下实施例是为了更清楚的说明本发明,而不是为了特别限制。
实施例1、合成超抗原SEA基因
根据早已发表的SEA基因序列论文,它含有699个碱基,进行人工全合成(Takara公司,日本),还加上一个编码多肽接头碱基序列SEQ ID NO:11,它在SEA的上游,在这个合成的核酸序列的起始部位有SalI和HindIII限制性内切酶位点,它的末端有NotI和XhoI限制性内切酶位点。用限制性内切酶处理,就可以将这个DNA片段插入pET-40b质粒。反应条件是,HindIII在M缓冲液37℃和5个小时,然后再进行NotI处理,条件是H缓冲液37℃和5个小时,在这个反应缓冲液里再加入牛血清白蛋白和和Triton试剂。将限制性内切酶处理后的片段进行纯化以去除HindIII和NotI,加入同样经过HindIII和XhoI处理过的pET-40b质粒,再加入DNA连接酶进行16℃连接反应。最后将这个含有SEA基因及接头的pET-40b质粒转入大肠杆菌JM109,这样就得到了带有SEA基因的pET-40b质粒,可作为构建融合蛋白质基因的材料。
实施例2、制备生长激素释放激素GHRH和超抗原SEA融合蛋白基因
根据生长激素释放激素GHRH的GenBank信息(ACCESSION,NM_021081)人工全合成一个编码44个氨基酸成熟多肽的核酸序列(Takara公司,日本),并且在它的两端增添限制性内切酶位点,上游是BamHI和EcoRI位点,下游是SalI和HindIII位点。在此可以同时进行EcoRI和SalI处理,反应条件是H缓冲液37℃和5个小时。然后将这个片段与经过EcoRI和SalI处理过的实施例1中所得到的带有SEA基因的pET-40b质粒混合,加入DNA连接酶进行16℃连接反应。最后将其转入大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落并提取质粒,这样就得到了包含GHRH和SEA融合蛋白基因的质粒。
实施例3、制备促性腺激素释放激素GnRH和超抗原SEA融合蛋白基因
由于促性腺激素释放激素GnRH只是一个10氨基酸的多肽,可以直接合成编码此多肽的碱基序列的引物。
1、包含促性腺激素释放激素GnRH序列的正向引物,
5’-CGCGGATCCGAATTCG CAGCACTGGTCCTATGGACTGCGCCCTGGAGTCGACAAGCTTGGCGGAGGTGGCTCCGGC(SEQ ID NO:13),下线表注的是GnRH序列,上游含有BamHI和EcoRI位点,下游含有SalI和HindIII位点。
2、含有NotI和XhoI限制性内酶切点的SEA基因反向引物,
5’-CCGCTCGAGTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’(SEQ ID NO:14)。
利用这两个引物,对实施例1含有SEA基因的质粒进行PCR反应,PCR反应的循环条件:95℃30秒→55℃30秒→72℃100秒,一共是30个循环反应,最后是72℃10分钟。将所得片段进行EcoRI和XhoI处理,插入不含外源基因的pET-40b质粒,这样就得到了包含GnRH和SEA融合蛋白基因的质粒。
实施例4、制备促黑激素α-MSH和超抗原SEA融合蛋白基因
促黑激素α-MSH也是一个短肽,由13个氨基酸组成。它也可引物方法来合成此多肽的碱基序列。
1、包含限制性内切酶和促黑激素α-MSH序列的正向引物,
5’-CGCGGATCCGAATTCG TCCTACTCCATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCGGTGGTCGACAAGCTTGGCGGAGGTGGCTCCGGC(SEQ ID NO:15),下线表注的是α-MSH序列,上游含有BamHI和EcoRI位点,下游含有SalI和HindIII位点。
2、含有NotI和XhoI限制性内酶切点的SEA基因反向引物,
5’-CCGCTCGAGTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’(SEQ ID NO:14)。
利用这两个引物,对实施例1含有SEA基因的质粒进行PCR反应,PCR反应的循环条件:95℃30秒→55℃30秒→72℃100秒,一共是30个循环反应,最后是72℃10分钟。将所得片段进行EcoRI和XhoI处理,插入不含外源基因的pET-40b质粒,这样就得到了包含α-MSH和SEA融合蛋白基因的质粒。
实施例5、制备催乳激素PRL和超抗原SEA融合蛋白基因
根据催乳激素PRL的GenBank信息(ACCESSION,NP_000939)人工全合成一个编码199个氨基酸成熟多肽的核酸序列(Takara公司,日本),并且在它的两端增添限制性内切酶位点,上游是BamHI和EcoRI位点,下游是SalI和HindIII位点。在此可以同时进行BamHI和SalI处理,反应条件是H缓冲液37℃和5个小时。然后将这个片段与经过BamHI和SalI处理过的实施例1中所得到的带有SEA基因的pET-40b质粒混合,加入DNA连接酶进行16℃连接反应。最后将其转入大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落并提取质粒,这样就得到了包含PRL和SEA融合蛋白基因的质粒。
实施例6、促胃液素释放肽GRP和超抗原SEA融合蛋白基因
促胃液素释放肽GRP由27个氨基酸组成(E.R.Spindel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,5699-5703,1984),在此人工全合成一个编码这个多肽的核酸序列(Takara公司,日本),并且在它的两端增添限制性内切酶位点,上游是BamHI和EcoRI位点,下游是SalI和HindIII位点。在此可以同时进行BamHI和SalI处理,反应条件是H缓冲液37℃和5个小时。然后将这个片段与经过BamHI和SalI处理过的实施例1中所得到的带有SEA基因的pET-40b质粒混合,加入DNA连接酶进行16℃连接反应。最后将其转入大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落并提取质粒,这样就得到了包含PRL和SEA融合蛋白基因的质粒。
实施例7、各种融合蛋白基因的测序鉴定
利用美国Novagen公司的引物pET upstream primer(Cat.No.69214-3)和T7terminator primer(Cat.No.69337-3)对于携带融合蛋白基因的pET-40b质粒进行DNA序列测定。
序列表中的SEQ ID NO:1是生长激素释放激素(GHRH)-接头-超抗原-(SEA)融合蛋白质基因的序列,SEQ ID NO:2是SEQ ID NO:1的氨基酸序列。从第1位氨基酸到第44位氨基酸的多肽是GHRH,从第45位氨基酸到第63位氨基酸的多肽是接头,从第64位氨基酸到第296位氨基酸的多肽是SEA。
序列表中的SEQ ID NO:3是促性腺激素释放激素(GnRH)-接头-超抗原-(SEA)融合蛋白质基因的序列,SEQ ID NO:4是SEQ ID NO:3的氨基酸序列。从第1位氨基酸到第10位氨基酸的多肽是GnRH,从第11位氨基酸到第29位氨基酸的多肽是接头,从第30位氨基酸到第262位氨基酸的多肽是SEA。
序列表中的SEQ ID NO:5是促黑激素(α-MSH)-接头-超抗原-(SEA)融合蛋白质基因的序列,SEQ ID NO:6是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。从第1位氨基酸到第13位氨基酸的多肽是α-MSH,从第14位氨基酸到第32位氨基酸的多肽是接头,从第33位氨基酸到第265位氨基酸的多肽是SEA。
序列表中的SEQ ID NO:7是催乳激素(PRL)-接头-超抗原-(SEA)融合蛋白质基因的序列,SEQ ID NO:8是SEQ ID NO:7的氨基酸序列。从第1位氨基酸到第199位氨基酸的多肽是PRL,从第200位氨基酸到第218位氨基酸的多肽是接头,从第219位氨基酸到第451位氨基酸的多肽是SEA。
序列表中的SEQ ID NO:9是促胃液素释放肽(GRP)-接头-超抗原-(SEA)融合蛋白质基因的序列,SEQ ID NO:10是SEQ ID NO:9的氨基酸序列。从第1位氨基酸到第27位氨基酸的多肽是GRP,从第28位氨基酸到第46位氨基酸的多肽是接头,从第47位氨基酸到第279位氨基酸的多肽是SEA。
实施例8、分离纯化各种融合蛋白质
由于pET-40b质粒含有一个前导的DsbC蛋白,下游的融合蛋白质将被输送到大肠杆菌细胞间质,所以可用渗透压方法取得融合蛋白粗抽提液。由于表达各种融合蛋白的质粒系统是相同的,所以可采用相同的方法分离纯化所需蛋白质。
首先把表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),进行前培养,然后加入IPTG进行诱导,收集少量菌体,加入0.5ml缓冲液(0.5M蔗糖,pH8.0)并混合,冰上静置10分钟,再加入0.75ml 5倍稀释的缓冲液,冰上静置30分钟,然后离心,得到上清液。
由于融合蛋白与DsbC蛋白共表达即它与DsbC连在一起的,所以用蛋白酶Enterokinase(Novagen公司,美国)处理,从而将DsbC除去。
纯化方法采用美国Novagen公司系统,加入等量Binding Buffer到上清液,然后上样到His Bind Column,先用Wash Buffer洗,然后用Elute Buffer将融合蛋白洗脱下来,再对20mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行透析,这样就得到了纯化的融合蛋白。
实施例9、融合蛋白质体外抑制肿瘤细胞生长
先将健康人外周血单个核细胞PBMC和人乳腺癌细胞株MCF-7、人前列腺癌细胞株DU145、人黑色素瘤细胞株NEL-M1和人非小细胞肺癌细胞株A549的浓度调整至大约2×104-4×104细胞/ml,将肿瘤细胞稀释5倍并接种于96孔培养板,然后再加入没有稀释的PBMC,这样PBMC与肿瘤细胞Hep2的效靶比为5∶1,这样含有两种细胞的96孔培养板制做两份。最后分别加入经过除菌过滤的GnRH-SEA、PRL-SEA、GHRH-SEA、α-MSH-SEA和GRP-SEA融合蛋白,使终浓度分别为0.00,0.05,0.50,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00μg/ml。将96孔培养板放入CO2培养箱,37℃培养48小时。
另外在含有肿瘤细胞株的96孔培养板中分别只加入GnRH-SEA、PRL-SEA、GHRH-SEA、α-MSH-SEA和GRP-SEA融合蛋白作为对照实验。
在效靶比5∶1的情况下,各种融合蛋白的浓度达到3μg/ml时就显示出对于肿瘤细胞的最大抑制率,图2表示了各种融合蛋白抑制肿瘤细胞的效果,这个结果说明了GnRH-SEA、PRL-SEA、GHRH-SEA、α-MSH-SEA和GRP-SEA融合蛋白可以激活免疫细胞。
而在单独加入PBMC、或各种融合蛋白的情况下,没有观察到肿瘤细胞被抑制的现象。
                           序列表
<110>孙嘉琳
<120>癌靶向超抗原融合蛋白质及其生产方法
<150>
<151>
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>888
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(888)
<223>融合蛋白的编码序列
<400>1
tatgcagatg ccatcttcac caacagctac cggaaggtgc tgggccagct gtccgcccgc     60
aagctgctcc aggacatcat gagcaggcag cagggagaga gcaaccaaga gcgaggagca    120
agggcacggc ttgtcgacaa gcttggcgga ggtggctccg gcggaggtgg ctctggcggt    180
ggcggatcga gcgagaaaag cgaagaaata aatgaaaaag atttgcgaaa aaagtctgaa    240
ttgcagggaa cagctttagg caatcttaaa caaatctatt attacaatga aaaagctaaa    300
actgaaaata aagagagtca cgatcaattt ttacagcata ctatattgtt taaaggcttt    360
tttacagatc attcgtggta taacgattta ttagtagatt ttgattcaaa ggatattgtt    420
gataaatata aagggaaaaa agtagacttg tatggtgctt attatggtta tcaatgtgcg    480
ggtggtacac caaacaaaac agcttgtatg tatggtggtg taacgttaca tgataataat    540
cgattgaccg aagagaaaaa agtgccgatc aatttatggc tagacggtaa acaaaataca    600
gtacctttgg aaacggttaa aacgaataag aaaaatgtaa ctgttcagga gttggatctt    660
caagcaagac gttatttaca ggaaaaatat aatttatata actctgatgt ttttgatggg    720
aaggttcaga ggggattaat cgtgtttcat acttctacag aaccttcggt taattacgat    780
ttatttggtg ctcaaggaca gtattcaaat acactattaa gaatatatag agataataaa    840
acgattaact ctgaaaacat gcatattgat atatatttat atacaagt                 888
<210>2
<211>296
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(296)
<223>融合蛋白
<400>2
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
            20                  25                  30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu Val Asp Lys Leu
        35                  40                  45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
    50                  55                  60
Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu
65                  70                  75                  80
Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln
            100                 105                 110
His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn
        115                 120                 125
Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys
    130                 135                 140
Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu
                165                 170                 175
His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu
            180                 185                 190
Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr
        195                 200                 205
Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg
    210                 215                 220
Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly
225                 230                 235                 240
Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser
                245                 250                 255
Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu
            260                 265                 270
Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His
        275                 280                 285
Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser
    290                 295
<210>3
<211>786
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(786)
<223>融合蛋白的编码序列
<400>3
cagcactggt cctatggact gcgccctgga gtcgacaagc ttggcggagg tggctccggc     60
ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgagc gagaaaagcg aagaaataaa tgaaaaagat    120
ttgcgaaaaa agtctgaatt gcagggaaca gctttaggca atcttaaaca aatctattat    180
tacaatgaaa aagctaaaac tgaaaataaa gagagtcacg atcaattttt acagcatact    240
atattgttta aaggcttttt tacagatcat tcgtggtata acgatttatt agtagatttt    300
gattcaaagg atattgttga taaatataaa gggaaaaaag tagacttgta tggtgcttat    360
tatggttatc aatgtgcggg tggtacacca aacaaaacag cttgtatgta tggtggtgta    420
acgttacatg ataataatcg attgaccgaa gagaaaaaag tgccgatcaa tttatggcta    480
gacggtaaac aaaatacagt acctttggaa acggttaaaa cgaataagaa aaatgtaact    540
gttcaggagt tggatcttca agcaagacgt tatttacagg aaaaatataa tttatataac    600
tctgatgttt ttgatgggaa ggttcagagg ggattaatcg tgtttcatac ttctacagaa    660
ccttcggtta attacgattt atttggtgct caaggacagt attcaaatac actattaaga    720
atatatagag ataataaaac gattaactct gaaaacatgc atattgatat atatttatat    780
acaagt                                                               786
<210>4
<211>262
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(262)
<223>融合蛋白
<400>4
Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Val Asp Lys Leu Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Lys
            20                  25                  30
Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln
        35                  40                  45
Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys
    50                  55                  60
Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr
65                  70                  75                  80
Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys
            100                 105                 110
Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly
        115                 120                 125
Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp
    130                 135                 140
Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu
145                 150                 155                 160
Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys
                165                 170                 175
Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu
            180                 185                 190
Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val
        195                 200                 205
Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn
    210                 215                 220
Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg
225                 230                 235                 240
Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp
                245                 250                 255
Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser
            260
<210>5
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(795)
<223>融合蛋白的编码序列
<400>5
tcctactcca tggagcactt ccgctggggc aagccggtgg tcgacaagct tggcggaggt     60
ggctccggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcgagcg agaaaagcga agaaataaat    120
gaaaaagatt tgcgaaaaaa gtctgaattg cagggaacag ctttaggcaa tcttaaacaa    180
atctattatt acaatgaaaa agctaaaact gaaaataaag agagtcacga tcaattttta    240
cagcatacta tattgtttaa aggctttttt acagatcatt cgtggtataa cgatttatta    300
gtagattttg attcaaagga tattgttgat aaatataaag ggaaaaaagt agacttgtat    360
ggtgcttatt atggttatca atgtgcgggt ggtacaccaa acaaaacagc ttgtatgtat    420
ggtggtgtaa cgttacatga taataatcga ttgaccgaag agaaaaaagt gccgatcaat    480
ttatggctag acggtaaaca aaatacagta cctttggaaa cggttaaaac gaataagaaa    540
aatgtaactg ttcaggagtt ggatcttcaa gcaagacgtt atttacagga aaaatataat    600
ttatataact ctgatgtttt tgatgggaag gttcagaggg gattaatcgt gtttcatact    660
tctacagaac cttcggttaa ttacgattta tttggtgctcaag gacagta ttcaaataca    720
ctattaagaa tatatagaga taataaaacg attaactctg aaaacatgca tattgatata    780
tatttatata caagt                                                     795
<210>6
<211>265
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(265)
<223>融合蛋白
<400>6
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Val Asp Lys
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser
        35                  40                  45
Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr
    50                  55                  60
Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu
65                  70                  75                  80
Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr
                85                  90                  95
Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr
            100                 105                 110
Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys
        115                 120                 125
Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr
    130                 135                 140
Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn
145                 150                 155                 160
Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys
                165                 170                 175
Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg
            180                 185                 190
Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp
        195                 200                 205
Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro
    210                 215                 220
Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr
225                 230                 235                 240
Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met
                245                 250                 255
His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser
            260                 265
<210>7
<211>1353
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1353)
<223>融合蛋白的编码序列
<400>7
ttgcccatct gtcccggcgg ggctgcccga tgccaggtga cccttcgaga cctgtttgac     60
cgcgccgtcg tcctgtccca ctacatccat aacctctcct cagaaatgtt cagcgaattc    120
gataaacggt atacccatgg ccgggggttc attaccaagg ccatcaacag ctgccacact    180
tcttcccttg ccacccccga agacaaggag caagcccaac agatgaatca aaaagacttt    240
ctgagcctga tagtcagcat attgcgatcc tggaatgagc ctctgtatca tctggtcacg    300
gaagtacgtg gtatgcaaga agccccggag gctatcctat ccaaagctgt agagattgag    360
gagcaaacca aacggcttct agagggcatg gagctgatag tcagccaggt tcatcctgaa    420
accaaagaaa atgagatcta ccctgtctgg tcgggacttc catccctgca gatggctgat    480
gaagagtctc gcctttctgc ttattataac ctgctccact gcctacgcag ggattcacat    540
aaaatcgaca attatctcaa gctcctgaag tgccgaatca tccacaacaa caactgcgtc    600
gacaagcttg gcggaggtgg ctccggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcgagcgag    660
aaaagcgaag aaataaatga aaaagatttg cgaaaaaagt ctgaattgca gggaacagct    720
ttaggcaatc ttaaacaaat ctattattac aatgaaaaag ctaaaactga aaataaagag    780
agtcacgatc aatttttaca gcatactata ttgtttaaag gcttttttac agatcattcg    840
tggtataacg atttattagt agattttgat tcaaaggata ttgttgataa atataaaggg    900
aaaaaagtag acttgtatgg tgcttattat ggttatcaat gtgcgggtgg tacaccaaac    960
aaaacagctt gtatgtatgg tggtgtaacg ttacatgata ataatcgatt gaccgaagag    1020
aaaaaagtgc cgatcaattt atggctagac ggtaaacaaa atacagtacc tttggaaacg    1080
gttaaaacga ataagaaaaa tgtaactgtt caggagttgg atcttcaagc aagacgttat    1140
ttacaggaaa aatataattt atataactct gatgtttttg atgggaaggt tcagagggga    1200
ttaatcgtgt ttcatacttc tacagaacct tcggttaatt acgatttatt tggtgctcaa    1260
ggacagtatt caaatacact attaagaata tatagagata ataaaacgat taactctgaa    1320
aacatgcata ttgatatata tttatataca agt                                 1353
<210>8
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(451)
<223>融合蛋白
<400>8
Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg
1               5                   10                  15
Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu
            20                  25                  30
Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg
        35                  40                  45
Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala
    50                  55                  60
Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe
65                  70                  75                  80
Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr
                85                  90                  95
His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile
            100                 105                 110
Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu
        115                 120                 125
Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn
    130                 135                 140
Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp
145                 150                 155                 160
Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg
                165                 170                 175
Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg
            180                 185                 190
Ile Ile His Asn Asn Asn Cys Val Asp Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser
        195                 200                 205
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Lys Ser Glu Glu
    210                 215                 220
Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala
225                 230                 235                 240
Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr
                245                 250                 255
Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile Leu Phe
            260                 265                 270
Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp
        275                 280                 285
Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp
    290                 295                 300
Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn
305                 310                 315                 320
Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg
                325                 330                 335
Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys
            340                 345                 350
Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val
        355                 360                 365
Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys
    370                 375                 380
Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly
385                 390                 395                 400
Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu
                405                 410                 415
Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg
            420                 425                 430
Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp Ile Tyr Leu
        435                 440                 445
Tyr Thr Ser
    450
<210>9
<211>837
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(837)
<223>融合蛋白的编码序列
<400>9
gtcccgctgc ctgcgggcgg agggaccgtg ctgaccaaga tgtacccgcg cggcaaccac     60
tgggcggtgg ggcacttaat ggtcgacaag cttggcggag gtggctccgg cggaggtggc    120
tctggcggtg gcggatcgag cgagaaaagc gaagaaataa atgaaaaaga tttgcgaaaa    180
aagtctgaat tgcagggaac agctttaggc aatcttaaac aaatctatta ttacaatgaa    240
aaagctaaaa ctgaaaataa agagagtcac gatcaatttt tacagcatac tatattgttt    300
aaaggctttt ttacagatca ttcgtggtat aacgatttat tagtagattt tgattcaaag    360
gatattgttg ataaatataa agggaaaaaa gtagacttgt atggtgctta ttatggttat    420
caatgtgcgg gtggtacacc aaacaaaaca gcttgtatgt atggtggtgt aacgttacat    480
gataataatc gattgaccga agagaaaaaa gtgccgatca atttatggct agacggtaaa    540
caaaatacag tacctttgga aacggttaaa acgaataaga aaaatgtaac tgttcaggag    600
ttggatcttc aagcaagacg ttatttacag gaaaaatata atttatataa ctctgatgtt    660
tttgatggga aggttcagag gggattaatc gtgtttcata cttctacaga accttcggtt    720
aattacgatt tatttggtgc tcaaggacag tattcaaata cactattaag aatatataga    780
gataataaaa cgattaactc tgaaaacatg catattgata tatatttata tacaagt       837
<210>10
<211>279
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(279)
<223>融合蛋白
<400>10
Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro
1               5                   10                  15
Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Val Asp Lys Leu Gly
            20                  25                  30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu
        35                  40                  45
Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu
65                  70                  75                  80
Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His
                85                  90                  95
Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp
            100                 105                 110
Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly
        115                 120                 125
Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly
    130                 135                 140
Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His
145                 150                 155                 160
Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp
                165                 170                 175
Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn
            180                 185                 190
Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr
        195                 200                 205
Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys
    210                 215                 220
Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu
                245                 250                 255
Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile
            260                 265                 270
Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser
        275
<210>11
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(57)
<223>人工序列
<400>11
gtcgacaagc ttggcggagg tggctccggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcg    57
<210>12
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(19)
<223>连接肽
<400>12
Val Asp Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser
<210>13
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(76)
<223>引物
<400>13
cgcggatccg aattcgcagc actggtccta tggactgcgc cctggagtcg acaagcttgg    60
cggaggtggc tccggc                                                    76
<210>14
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(48)
<223>引物
<400>14
ccgctcgagt gcggccgcac ttgtatataa atatatatca atatgcat                 48
<210>15
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(85)
<223>引物
<400>15
cgcggatccg aattcgtcct actccatgga gcacttccgc tggggcaagc cggtggtcga    60
caagcttggc ggaggtggct ccggc                                          85

Claims (12)

1、一种融合蛋白,其特征在于,该融合蛋白含有:
a)促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相对应的配体、与癌细胞受体有亲和力及有拮抗作用的人工筛选多肽或直接与癌细胞表面相互作用的多肽分子;
b)能引起抗癌的免疫反应的超抗原。
2、根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相对应的配体选自:促胃液素释放肽、生长激素释放激素、促性腺激素释放激素、促黑激素、促胃液素释放肽、催乳激素、催乳激素释放激素、生长激素、促卵泡激素、胎盘泌乳激素、绒毛膜促性腺激素、促肾上腺皮质激素释放激素、表皮生长因子EGF家族、血管内皮细胞生长因子VEGF家族、碱性成纤维细胞生长因子bFGF及FGF家族、转化生长因子TGF-α、白细胞介素-4、白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-13、肝素结合EGF样生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子、胎盘生长因子、干细胞因子、白细胞介素-8、Ephrin家族、Heregulin、erbB配体、趋化因子、血管生成素、血小板生成素、凝血因子VII、尿激酶型纤溶酶原激活物、生长抑素、去唾液酸糖蛋白、低密度脂蛋白和转铁蛋白以及其它与癌症或免疫疾病有关联的配体,及其自然变异体和人为的变异体,以及能与癌细胞表面受体相互作用的人工多肽分子。
3、根据权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于,该自然变异体和人为的变异体的氨基酸序列与所述配体有70%以上的相同性。
4、根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的能起抗癌的免疫反应的超抗原选自:金黄色葡萄球菌肠毒素、链球菌毒素、金黄色链球菌毒休克综合征毒素、链球菌有丝分裂外毒素、链球菌超抗原、病毒蛋白及其自然和人为的变异体。
5、根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述金黄色葡萄球菌肠毒素选自SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SER、SET,所述链球菌毒素选自SPE-A、SPE-B、SPE-C、SPE-F、SPE-G、SPE-H、SPE-I、SPE-J、SPE-L、SPE-M。
6、根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相对应的配体选自促胃液素释放肽、生长激素释放激素、促性腺激素释放激素、促黑激素和催乳激素。
7、根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的能起抗癌的免疫反应的超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素家族的SEA。
8、根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述超抗原是SEA蛋白;所述配体选自促胃液素释放肽、生长激素释放激素、促性腺激素释放激素、促黑激素和催乳激素。
9、一种重组载体,其特征在于含有编码权利要求1所述的融合蛋白的核苷酸序列。
10、一种宿主细胞,其特征在于,该宿主细胞含有权利要求9所述的重组载体。
11、一种生产权利要求1所述的融合蛋白的方法,其特征在于,培养权利要求10所述的宿主细胞,收集表达的权利要求1所述的融合蛋白。
12、权利要求1所述的融合蛋白的用途,其特征在于,用于制备治疗癌症或免疫疾病的药物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102114239A (zh) * 2010-12-14 2011-07-06 孙嘉琳 细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用
WO2013075553A1 (zh) * 2011-11-25 2013-05-30 Sun Jialin 癌靶向超抗原融合蛋白、其制备方法和用途

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