CN1502632A

CN1502632A - 新型TNFR-Fc融合蛋白

Info

Publication number: CN1502632A
Application number: CNA021532907A
Authority: CN
Inventors: 刘昌闾; 王继武; 王琳; 杨琳; 孙扬
Original assignee: GUANGZHOU LUYANG BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU LUYANG BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2002-11-26
Filing date: 2002-11-26
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2022-11-26
Also published as: CN1246337C

Abstract

本发明公开了重组TNFR－Fc融合蛋白，编码该重组融合蛋白的DNA以及该融合蛋白在治疗与TNF相关的疾病中的应用。

Description

新型TNFR-Fc融合蛋白

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体地说，本发明涉及新的TNFR-Fc融合蛋白，利用基因工程技术生产该融合蛋白的方法以及含有该融合蛋白的药物组合物。本发明还涉及利用该TNFR-Fc融合蛋白预防或治疗与TNF相关的疾病的方法。

背景技术

类风湿性关节炎是一种以关节病变为主的慢性全身自身免疫性疾病。主要临床表现为小关节滑膜所致的关节肿痛，继而软骨破坏、关节间隙变窄，晚期因严重骨质破坏、吸收导致关节僵直、畸形、功能障碍，它反复发作，致残率较高，预后不良，目前还没有很好的根治方法。(Emery P.等(2001年6月)，Rheumatology(Oxford)40(6)：99-702)在我类风湿性关节炎的患病率为0.24％到0.5％，由于人口老化，国外有关专家预计今后的20年中类风湿性关节炎患者将增加20％。它给患者造成极大的痛苦，严重影响了患者本人及其家人的生活质量。

类风湿性关节炎的传统治疗药物主要有非甾体抗炎药(NSAIDs)、减轻症状的抗风湿药(DMARDs)和糖皮质激素三大种类，传统药物由于不良反应明显，可能出现胃肠道溃疡、出血、穿孔，甚至肾脏毒性，临床使用受到了限制。(Mandell BF.(2001年5月)，Cleve Clin J Med，68(5)：425-32)。

类风湿性关节炎的诱因尚在研究之中，可能包括感染、自身免疫及遗传等因素。患者的关节滑膜转化成一种富含血管的组织，名为血管翳。血管翳的扩张以及炎症细胞(如单核球、巨噬细胞等)的引入和激活导致周围关节软骨和骨的不断损伤。这种对人体不利的非正常发炎反应与免疫系统中某些细胞生长因子的失衡有密切的关系。(Yamanishi Y和Firestein GS(2001年5月)，Rheum Dis Clin North Am，27(2)：355-71)。

TNF(肿瘤坏死因子)是这类细胞生长因子中的重要一员。TNF在健康人的血液中检测不到，而在类风湿性关节炎患者的血液和关节滑液中浓度显著升高，它主要由关节附近的细胞产生。大量的研究结果表明，过多的TNF可以导致类风湿性关节炎：过量表达TNF的转基因小鼠即患有类风湿性关节炎。(Joe B等(1999年12月)，Curr Rheumatol Rep，1(2)：139-48；Probert L等(1996年4月)，J Leukoc Biol，59(4)：518-25)TNF不仅参与滑膜炎症反应，同时以多种机制诱发关节结构的破坏：(1)刺激关节周围细胞制造降解软骨的胶原酶及有害的过氧化物；(2)抑制骨的生成并促进骨的重吸收；(3)调节与关节损伤有关的其它细胞生长因子的水平。所以抑制TNF的活性成为治疗类风湿性关节炎最关键的环节之一。(Eigler A等(1997年10月)，Immunol Today，18(10)：487-92)。

TNFR-Fc是TNFR(肿瘤坏死因子受体)与人免疫球蛋白IgG的Fc片段组成的融合蛋白。(Murray KM和Dahl SL.(1997年11月)，AnnPharmacother，31(11)：1335-8)TNFR可以分为两型(Dembic，Z.等(1990)，Cytokine，2：231-237，；Smith，C.A.等(1990)，Science，248：1019-1023，)：I型TNFR是55kD到60kD的跨膜糖蛋白，前体有455个氨基酸残基，切除29个氨基酸的信号肽后，成熟膜蛋白长426个氨基酸。分为胞膜外区、跨膜区、胞浆区，胞膜外区有3个N-糖基化位点，跨膜区较短，而胞浆区有3个蛋白激酶C作用位点、1个蛋白酪氨酸激酶作用位点，I型TNFR又称为TNFR55、P55、P60或TNFRb，CD编号为CD120a；TNFRII是75kD到80kD的跨膜糖蛋白，前体长461个氨基酸，N端为22个氨基酸的信号肽，成熟蛋白长439个氨基酸，胞膜外区有2个N-糖基化位点，在靠近跨膜区的连接区还有一个富含丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸的STP区，是潜在的O-糖基化位点，跨膜区较短，胞浆区有1个蛋白激酶C作用位点，TNFRII又称为TNFR75、P75、P80、TNFRa，CD编号为CD120b。

TNFRI与TNFRII在胞膜外区有28％的同源性，在胞浆区没有同源性。TNFRII在其羧基端的78个氨基酸残基可以结合胞浆信号蛋白，在信号转导中发挥重要作用。TNFRI和TNFRII分布十分广泛，几乎存在于所有有核细胞表面。它们都可以从细胞表面脱落形成可溶性TNF受体，即sTNFRI与sTNFRII。由于这些可溶性的TNFR可与TNF结合，所以又被称为TNF结合蛋白，两种受体中以II型分布更为广泛，与肿瘤坏死因子的结合力更强。一般认为，可溶性TNFR可以结合TNF，从而抑制TNF的活性，可以作为TNF的拮抗剂。

TNFR-Fc在TNFR的基础上通过分子克隆技术将sTNFR基因和人免疫球蛋白的Fc基因连接到一起，由于TNFR-Fc可以通过Fc形成二聚体结构，比非聚体的sTNFR更加稳定。(Murray KM和Dahl SL.(1997年11月)，Ann Pharmaeother，31(11)：1335-8)。

TNFR-Fc通过竞争性地与血中TNF结合，阻断它和细胞表面TNFR的结合，从而减少滑膜细胞的增生，抑制软骨细胞、纤维母细胞等释放基质金属蛋白酶(MMP)，抑制滑膜细胞、内皮细胞、巨噬细胞释放前列腺素，阻止白细胞向炎症部位转移和聚集，同时也通过网络作用使IL-1、IL-6、IL-8相应地减少，因此有抗炎和减缓类风湿关节炎病情恶化发展的作用。(Partsch G等(1997年3月)，J Rheumatol，24(3)：518-23)。

TNFR-Fc不仅有TNF的载体功能，而且有TNF生物活性拮抗功能。另外，TNFR-Fc有比sTNFR更高的亲和力，可以用来治疗TNF相关疾病，比如：类风湿关节炎、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病，以及系统性红斑狼疮、肿瘤、创伤、慢性感染等其它疾病。(Murray KM和Dahl SL.(1997年11月)，Ann Pharmacother，31(11)：1335-8；Garrison L等(1999年11月)，Ann Rheum Dis，58 Suppl 1：I65-9)。

但现有的TNFR-Fc融合蛋白产品的不足在于其包含了一段蛋白酶酶切序列，从而影响其生物活性和稳定性，难以发挥其生物活性，从而不能有效地预防和治疗与TNF相关的疾病。

TNFRII可以与TNF结合(Smith，C.A.等(1990)，Science，248：1019-1023，；Dembic，Z.等(1990)，Cytokine 2：231-237，)。TNFRII和TNFRI的可溶性部分都存在于体液中(Lantz，M.等(1990)，J.Clin.Invest.，86：1396.；Engelmann，H.等(1990)，J.Biol.Chem.265：1531.；Khono，T.等(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8331.)，通过与TNF结合来调节它的生物活性(Aderka，D.等(1992)，J.Exp.Med.175：323.；Brakebusch，C.等(1994)，J.Biol.Chem.269：32488.)。

TNFRII脱落形成可溶性受体的机制还不是很清楚。但是有一点已经非常明确，即TNFRII形成可溶性受体时断开的部位在其N端紧靠跨膜区域的部位，序列见SEQ ID NO.1。而且，通过剔除和变异研究还发现第207到第216位(从其成熟蛋白的第一位氨基酸开始，即TNFRII前体的第23位氨基酸开始记数，序列见SEQ ID NO.2后)氨基酸尤其是位于第211位的脯氨酸对脱落十分重要(Herman，C.等(1998)，The Journal ofImmunology，160：2478-2487)。因此很可能断开反应是由一种羧肽酶组织蛋白酶D执行的，而这种非金属蛋白酶是有一定的蛋白水解活性的(Coyne，C.P.等(1999)，Shock，11(1)：19-28)。

本申请的发明人在经过多年努力的基础上，经过独特设计开发出新型TNFR-Fc融合蛋白，该融合蛋白在维持现有TNFR-Fc融合蛋白生物活性的同时，不仅降低了其分子量，而且具有比包含TNFRII胞外全长221个氨基酸的现有产品具有更高的与TNF的亲和力和稳定性。这一特点有可能使新型TNFR-Fc成为疗效更好的生物工程药物。从而完成了本发明。

发明简述

按照本发明的第一个方面，提供了新型TNFR-Fc融合蛋白。

本发明涉及的新型TNFR-Fc是截短的TNFRII的胞外部分与人免疫球蛋白IgG的Fc片段组成的融合蛋白。

本文描述的这种新型蛋白包含了TNFRII的功能部位，即胞外不含171-221氨基酸的部分，从而去掉了对肽酶消化十分关键的序列。因此，这种由截短的TNFRII和截短的人IgG的Fc片段组成的融合蛋白在理论和实践上都比现有的TNFR-Fc融合蛋白产品更稳定。

按照本发明的第二个方面，提供了编码新型TNFR-Fc融合蛋白的核酸构建体。

按照本发明的第三个方面，提供了利用基因工程方法生产新型TNFR-Fc融合蛋白的方法。

按照本发明的第四个方面，提供了含有新型TNFR-Fc融合蛋白的药物组合物。

按照本发明的第五个方面，提供了新型TNFR-Fc融合蛋白在预防和/或治疗与TNF相关的疾病中的应用。

附图简述

图1显示了新型TNFR-Fc融合蛋白的Western杂交结果。

图2显示了新型TNFR-Fc融合蛋白和对照蛋白受体配体结合实验结果。

图3显示了新型TNFR-Fc融合蛋白和对照蛋白在培养基中的蛋白浓度比较实验结果。

图4显示了对照蛋白和新型TNFR-Fc融合蛋白的细胞活性对比结果(分别见图4A和图4B)。该细胞活性实验中对照蛋白和新型蛋白的起始蛋白浓度均为10μg/ml，并按3倍比进行系列稀释。采用如下回归方程式：Y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D，其中X是蛋白稀释度，Y是OD值，对于对照蛋白A、B、C和D的值分别是0.8648、-1.5280、0.0055和0.2598，而对于新型蛋白A、B、C和D的值分别是0.8306、-0.9492、0.0017和0.2568。图4A对照蛋白的中点稀释度为4.74，ED50为54.49ng/ml；图4B新型蛋白的中点稀释度为5.79，ED50为17.30ng/ml。因此，新型蛋白比活性(对照蛋白ED50：新型蛋白ED50)为3.16。

图5显示了TNFR-Fc融合蛋白和对照蛋白的稳定性对比结果。

图5A为还原性SDS-PAGE蛋白电泳结果对比。从左至右依次为对照蛋白孵放前；对照蛋白37℃孵放28天；对照蛋白37℃孵放57天；BIORAD公司BROAD RANGE MARKER；新型TNFR-Fc融合蛋白孵放前；新型蛋白37℃孵放57天。

图5B显示了对照蛋白和新型TNFR-Fc融合蛋白37℃孵放57天后的细胞活性对比结果(分别见图5B-1和图5B-2)。该细胞活性实验中对照蛋白和新型蛋白的起始蛋白浓度均为100μg/ml，并按3倍比进行系列稀释。采用如下回归方程式：Y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D，其中X是蛋白稀释度，Y是OD值。对于对照蛋白A、B、C和D的值分别是1.3157、-0.9359、0.0052和0.0847，而对于新型蛋白A、B、C和D的值分别是1.7098、-0.5721、0.0007和-0.1453。图5B-1对照蛋白的中点稀释度为4.74，ED50为524.46ng/ml；图5B-2新型蛋白的中点稀释度为6.62，ED50为69.09ng/ml。因此，新型蛋白比活性(对照蛋白ED50：新型蛋白ED50)为7.59。

发明详述

本发明涉及新型TNFR-Fc重组融合蛋白以及该融合蛋白的衍生物或功能等同物，其特征在于该融合蛋白中肿瘤坏死因子受体II胞外蛋白部分(sTNFRII)与SEQ ID NO.4中所示的氨基酸序列相比在其C端缺失了部分氨基酸序列和/或该融合蛋白中的人免疫球蛋白IgG的Fc片段部分(Fc)与SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列相比在其N端缺失了部分氨基酸序列。

在一具体实施方案中所述的TNFR-Fc融合蛋白中TNFR部分具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

在另一实施方案中所述的TNFR-Fc融合蛋白中Fc部分具有SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列。

在本发明最优选的实施方案中TNFR-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

按照本发明的另一方面，提供了生产重组TNFR-Fc融合蛋白的方法，该方法包括下列步骤：

a.获得编码新型TNFR-Fc融合蛋白的基因序列；

b.将步骤(a)获得的基因序列插入到合适的载体中，得到相应的核酸构建体；

c.用步骤(b)获得的核酸构建体转染适宜的宿主细胞；

d.在适宜的培养条件下，培养步骤(c)的转染细胞，并从中分离出表达的TNFR-Fc融合蛋白。

以人白细胞的cDNA为模板，通过PCR扩增获得截短的sTNFRII胞外部分基因序列，两端酶切位点为EcoRI，BamHI。

上游及下游引物序列见SEQ ID NO.11及12。

以人脾细胞的cDNA为模板，通过PCR扩增获得截短的IgG Fc基因序列，两端位点为BamHI，HindIII。

上游及下游引物序列见SEQ ID NO.13及14。

以获得的截短sTNFR序列和截短IgG Fc序列为模板，以第一步的5’端引物和第二步的3’端引物为引物进行PCR扩增，得到全长的新型TNFR-Fc基因序列。

PCR产物用Qiagen纯化柱纯化后，用EcoRI和HindIII酶切，克隆到质粒载体pcDNA3(-)中。

用T7引物、BGH引物和内部测序引物，经自动测序仪测定核苷酸序列，证实PCR产物已经克隆到载体中。

将克隆后的表达载体分别转染到HEK293细胞和CHO K1细胞中，转染试剂为Lipofectin，并用800mg/L的G418筛选。两周后，选择活性最好的工程细胞株用于大规模培养。

当细胞密度在培养瓶中达到一定水平时，将有血清培养基弃去，用无菌生理盐水洗两次后，加入无蛋白培养基。每天收获一次。收获的培养基首先用0.45um的滤膜做澄清过滤，再用截留分子量为30KD的超滤器进行超滤浓缩，原有体积浓缩10倍后准备上层析柱纯化。将MEP填料清洗、装柱，用PBS缓冲液洗柱，上样，目的蛋白在柱内的停留时间不少于10分钟，穿流液检查无目的蛋白后弃去。上样完成后的层析柱用PBS缓冲液洗10个柱体积，准备洗脱。洗脱液为pH4的100mM柠檬酸缓冲液，收集280nm的蛋白峰即为目的蛋白。

本发明也提供了含有上述任一融合蛋白及其可作药用的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，根据需要，该药物组合物中还可加入其它活性成分。同时药物稀释剂、载体和/或赋形剂可以根据选择的给药途径从制药领域中常用的那些方案中进行选择。

本发明药物组合物中融合蛋白的具体剂量水平取决于多种因素，例如治疗对象的种类，患者的年龄和性别，所治疗的具体疾病及其严重程度，以及给药的途径和方法。根据所应用的具体情况，本领域普通技术人员能够很容易地确定药物组合物中活性成分的有效剂量。

本发明的药物组合物可用于预防或治疗由TNF介导的疾病，例如恶病质，类风湿性关节炎，糖尿病，多发性硬化，肺纤维化和硅肺，脑型疟，以及同种移植物和异种移植物抗宿主排斥反应疾病。

下面通过实施例更进一步地描述本发明。如果在实施例中没有其它的说明，所有制备和操作重组DNA的方法都按照在Sambrook等，分子克隆-实验室手册，第二版(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Second Edition)，冷泉港实验室出版社，纽约(1989)一书和在Ausubel等(1994)现代分子生物学技术，现代技术(Current Protocols in MolecularBiology，Current Protocols)，美国的第一卷和第二卷中所述的标准方法进行。PCR技术方法可在M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White编辑的“PCR技术：方法与应用指南”(“PCR protocols：a guide to methodsand applications”)(Academic Press，Inc.，1990)一书中找到。

在实施例、权利要求和叙述中所涉及的序列如下：

1.TNFRII断开形成可溶性受体的部位的序列(SEQ ID NO：1)

2.对TNFRII的断开重要的序列(SEQ ID NO：2)

3.TNFRII胞外部分的核苷酸序列及氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)；

4.全长Fc核苷酸序列及氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6)；

5.截短的TNFRII的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)；

6.截短的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)；

7.截短的TNFR-Fc的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列(分别是SEQID NO：9和SEQ ID NO：10)；

8.TNF-RII引物1的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)；

9.TNF-RII引物2的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)；

10.Fc引物1的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)；

11.Fc引物2的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。

实施例

实施例1.新型TNFR-Fc的克隆与表达

以人白细胞的cDNA为模板，通过PCR扩增获得截短的sTNFRII基因序列，两端酶切位点为EcoRI，BamHI。

以获得的截短sTNFRII序列和截短人IgG Fc序列为模板，以第一步的5’端引物和第二步的3’端引物为引物进行PCR扩增，得到全长的新型TNFR-Fc基因序列。

用抗TNFRII和抗人IgG抗体做Western杂交，确定表达产物，表达后的单体融合蛋白分子量约为55kDa(图1)。

实施例2.新型TNFR-Fc的亲和力测定

(1)受体配体结合比较实验

新型TNFR-Fc蛋白和对照蛋白(未截短的TNFR-Fc)溶于TBST缓冲液中，加入蛋白A Sepherose小珠和125I-TNFβ，再加入不同浓度的未标记的TNFβ，在室温震荡1小时，离心2分钟，使小珠和TNFR-Fc的结合物被沉淀，并用伽玛计数仪计数。

计数结果用GraghPad Prism软件分析，分别计算出的EC50为新型TNFR-Fc蛋白：0.35nM，对照蛋白：0.54nM，结果显示两种蛋白与TNFβ有非常接近的亲和力。(图2)

(2)在稳定表达细胞系的培养基中蛋白浓度比较实验

新型TNFR-Fc蛋白和对照蛋白(未截短的TNFR-Fc)的表达细胞在无血清的OPTI-MEM培养基中培养两天，然后用TBST缓冲液稀释到不同浓度，分别加入蛋白A Sepherose小珠和125I-TNFβ，在室温震荡1小时，离心2分钟，使小珠和TNFR-Fc的结合物被沉淀，并用伽玛计数仪计数。

计数结果用GraghPad Prism软件分析，分别计算出新型TNFR-Fc蛋白和对照蛋白的EC50，结果显示新型TNFR-Fc蛋白与TNFβ的亲和力比对照蛋白与TNFβ的结合活性高3到4倍。(图3)

(3)提纯蛋白的细胞活性对比实验

从稳定表达细胞系的无蛋白培养基收获液中提纯得到目的融合蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，与对照蛋白同时进行细胞活性实验。

原理为TNF会使测活细胞L929凋亡，而TNFR可与TNF结合，降低甚至消除TNF的杀伤细胞的能力，这种结合与TNFR-Fc在体内产生的生物效应相似。

测试结果用MTS染色法，在490nm处读数，数据结果用BIOASSAY-1软件分析，分别计算出新型TNFR-Fc蛋白和对照蛋白的细胞活性，结果显示，同样的蛋白浓度，新型TNFR-Fc蛋白的细胞活性是对照蛋白的3.16倍(图4A和4B)。

实施例3.新型TNFR-Fc的稳定性测定

将处于PBS缓冲液里的新型TNFR-Fc和对照蛋白用0.22um的滤膜除菌过滤，分装于5毫升胶塞玻璃瓶内，放置于37℃孵箱内。新型TNFR-Fc在57天做还原性SDS-PAGE蛋白电泳和细胞活性试验。对照蛋白除57天外在28天增加一个测试点

(1)电泳结果比较

蛋白电泳每孔上样10ug，用银染法染色。结果显示新型TNFR-Fc的稳定性明显好于对照蛋白。(图5A)

(2)细胞活性比较

取孵放57天的样品做细胞活性试验，结果显示，在37℃放置57天后，新型TNFR-Fc蛋白的细胞活性是对照蛋白的7.59倍。(图5B-1和5B-2)

本领域技术人员可以理解，可以对本申请中所描述的实施方案进行修改而不超出本发明的概念。本领域技术人员还应当理解，本发明并非局限于具体公开的实施方案，而是包括落在本发明实质和范围内的对实施方案做的各种修改。

序列表

<110>广州绿阳生物工程有限责任公司

<120>新型TNFR-Fc融合蛋白

<130>gzallP001

<160>14

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>51

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr

1 5 10 15

Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser

20 25 30

Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser

35 40 45

Thr Gly Asp

50

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>2

Leu Pro Met Gly Pro Set Pro Pro Ala Glu

1 5 10

<210>3

<211>771

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(771)

<223>

<400>3

atg gcg ccc gtc gcc gtc tgg gcc gcg ctg gcc gtc gga ctg gag ctc 48

Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu

1 5 10 15

tgg gct gcg gcg cac gcc ttg ccc gcc cag gtg gca ttt aca ccc tac 96

Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr

20 25 30

gcc ccg gag ccc ggg agc aca tgc cgg ctc aga gaa tac tat gac cag 144

Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln

35 40 45

aca gct cag atg tgc tgc agc aaa tgc tcg ccg ggc caa cat gca aaa 192

Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys

50 55 60

gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg tgt gac tcc tgt gag gac 240

Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp

65 70 75 80

agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt ccc gag tgc ttg agc tgt 288

Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys

85 90 95

ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa act caa gcc tgc act cgg 336

Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg

100 105 110

gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc ggc tgg tac tgc gcg ctg 384

Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu

115 120 125

agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc aag tgc cgc 432

Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg

130 135 140

ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg 480

Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val

145 150 155 160

tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc aac acg act tca tcc acg 528

Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr

165 170 175

gat att tgc agg ccc cac cag atc tgt aac gtg gtg gcc atc cct ggg 576

Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly

180 185 190

aat gca agc atg gat gca gtc tgc acg tcc acg tcc ccc acc cgg agt 624

Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser

195 200 205

atg gcc cca ggg gca gta cac tta ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc 672

Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser

210 215 220

caa cac acg cag cca act cca gaa ccc agc act gct cca agc acc tcc 720

Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser

225 230 235 240

ttc ctg ctc cca atg ggc ccc agc ccc cca gct gaa ggg agc act ggc 768

Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly

245 250 255

gac 771

Asp

<210>4

<211>257

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu

1 5 10 15

Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr

20 25 30

Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg

100 105 110

Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu

115 120 125

Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg

130 135 140

Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val

145 150 155 160

Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr

165 170 175

Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly

180 185 190

Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser

195 200 205

Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser

210 215 220

Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser

225 230 235 240

Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly

245 250 255

Asp

<210>5

<211>699

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(693)

<223>

<400>5

gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca 48

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc 96

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg 144

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg 192

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag 240

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag 288

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc 336

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc 384

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc 432

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc 480

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac 528

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

aag acc acg cot ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac 576

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 624

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag 672

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaatga 699

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210>6

<211>231

<212>PRT

<213>人

<400>6

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg ValVal Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210>7

<211>206

<212>PRT

<213>人

<400>7

Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu

1 5 10 15

Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr

20 25 30

Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln

35 40 45

Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys

50 55 60

Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys

85 90 95

Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg

100 105 110

Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu

115 120 125

Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg

130 135 140

Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val

145 150 155 160

Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr

165 170 175

Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly

180 185 190

Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr

195 200 205

<210>8

<211>225

<212>PRT

<213>人

<400>8

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

35 40 45

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

50 55 60

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

85 90 95

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

100 105 110

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

115 120 125

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

145 150 155 160

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

165 170 175

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

180 185 190

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

195 200 205

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215 220

Lys

225

<210>9

<211>1335

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(1311)

<223>

<400>9

gaattcgaca cc atg gcg ccc gtc gcc gtc tgg gcc gcg ctg gcc gtc gga 51

Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly

1 5 10

ctg gag ctc tgg gct gcg gcg cac gcc ttg ccc gcc cag gtg gca ttt 99

Leu Glu Leu Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe

15 20 25

aca ccc tac gcc ccg gag ccc ggg agc aca tgc cgg ctc aga gaa tac 147

Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr

30 35 40 45

tat gac cag aca gct cag atg tgc tgc agc aaa tgc tcg ccg ggc caa 195

Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln

50 55 60

cat gca aaa gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg tgt gac tcc 243

His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser

65 70 75

tgt gag gac agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt ccc gag tgc 291

Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys

80 85 90

ttg agc tgt ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa act caa gcc 339

Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala

95 100 105

tgc act cgg gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc ggc tgg tac 387

Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr

110 115 120 125

tgc gcg ctg agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc 435

Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg

130 135 140

aag tgc cgc ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act gaa aca tca 483

Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser

145 150 155

gac gtg gtg tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc aac acg act 531

Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr

160 165 170

tca tcc acg gat att tgc agg ccc cac cag atc tgt aac gtg gtg gcc 579

Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala

175 180 185

atc cct ggg aat gca agc atg gat gca gtc tgc acg tcc acg tcc ccc 627

Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro

190 195 200 205

acc gga tcc act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg 675

Thr Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

210 215 220

ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 723

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

225 230 235

atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 771

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

240 245 250

cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 819

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

255 260 265

gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 867

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

270 275 280 285

tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 915

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

290 295 300

ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 963

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

305 310 315

atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 1011

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

320 325 330

gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc 1059

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

335 340 345

agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 1107

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

350 355 360 365

gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 1155

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

370 375 380

ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 1203

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

385 390 395

gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1251

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

400 405 410

atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 1299

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

415 420 425

tct ccg ggt aaa tgagtgcgac ggccggcaaa gctt 1335

Ser Pro Gly Lys

430

<210>10

<211>433

<212>PRT

<213>人

<400>10

Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu

1 5 10 15

Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr

20 25 30

Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln

35 40 45

Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys

50 55 60

Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys

85 90 95

Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg

100 105 110

Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu

115 120 125

Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg

130 135 140

Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val

145 150 155 160

Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr

165 170 175

Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly

180 185 190

Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Gly Ser

195 200 205

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

210 215 220

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

225 230 235 240

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

245 250 255

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

260 265 270

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

275 280 285

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

290 295 300

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

305 310 315 320

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

325 330 335

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

340 345 350

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

355 360 365

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

370 375 380

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

385 390 395 400

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

405 410 415

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

420 425 430

Lys

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>11

gcgaattcga caccatggcg cccgtcgccg tct 33

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>12

cgggatccgg tgggggacgt ggacgt 26

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>13

gcggatccac tcacacatgc ccaccgtg 28

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>14

cgaagctttg ccggccgtcg cactca 26

Claims

1.TNFR-Fc融合蛋白，其特征在于该融合蛋白中肿瘤坏死因子受体蛋白部分(TNFR)与SEQ ID NO.4中所示的氨基酸序列相比在其C端缺失了部分氨基酸序列和/或该融合蛋白中的免疫球蛋白IgG的Fc片段部分(Fc)与SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列相比在其N端缺失了部分氨基酸序列；以及该融合蛋白的衍生物或功能等同物。

2.权利要求1所述的TNFR-Fc融合蛋白，其中TNFR部分具有SEQID NO.7所示的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的TNFR-Fc融合蛋白，其中Fc部分具有SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列。

4.权利要求1所述的TNFR-Fc融合蛋白，它具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

5.一种核酸构建体，其特征在于它含有编码权利要求1-4中任一项所述的TNFR-Fc融合蛋白的核苷酸序列。

6.权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于它含有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

7.生产权利要求1-4中任一项所述的TNFR-Fc融合蛋白的方法，该方法包括下列步骤：

a.获得编码TNFR-Fc融合蛋白的基因序列；

c.将步骤(b)获得的核酸构建体，转染适宜的宿主细胞；

8.一种药物组合物，它含有作为活性成分的如权利要求1-4中任一项所述的TNFR-Fc融合蛋白以及含有可作药用的稀释剂、载体或赋形剂。

9.权利要求1-4中任一项的TNFR-Fc融合蛋白在制备用于预防和治疗与TNF相关的疾病的药物中的用途。

10.权利要求9所述的用途，它用于预防或治疗类风湿性关节炎疾病。