CN102911958A - 编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其应用。本发明通过密码子优化筛选，得到如SEQ ID NO.1所示的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因。该基因在CHO细胞中表达量高，且表达出来的蛋白与TNFR的亲和力高。将该基因转入CHO细胞，得到表达重组人TNFR-Fc融合蛋白的细胞。本发明使用一次性反应器发酵转有该基因的CHO细胞，操作简单，得到的蛋白量较使用传统发酵罐高；特别是在添加补料培养基后，可延长细胞生长时间，提高表达水平，降低生产成本，获得高纯度的目的蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白，特别涉及一种编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其应用。
背景技术
人肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种活化的单核/巨噬细胞产生的细胞因子，并具有多种生物学效应。TNF-α能够诱导肿瘤细胞坏死或凋亡，且同时是介导炎症反应的主要细胞因子。研究发现，TNF-α在类风湿关节炎病人的血清中的含量远超过正常人的水平，而其可能的致病机理也被慢慢发现。在关节腔中的TNF含量升高，会产生两方面的作用：一方面TNF-α与关节滑膜细胞的受体结合，造成该细胞直接损伤，另一方面，TNF-α可以召集免疫效应细胞聚集至此，分泌更多的细胞因子，产生更强更持久的自身免疫反应。这两方面共同作用，从而造成了类风湿关节炎患者关节部位肿胀和疼痛。
细胞表面存在两种不同的TNFR，即分子量分别为55KD的TNFRI（CD120a）和75KD的TNFRII（CD120b）。人TNF-α与TNFR的亲和力较高，与TNFRI和TNFRII的亲和常数分别为1.23±0.23nM和0.36±0.13nM。这两种TNFR的膜外区均可脱落，仍然保留结合TNF-α的活性。将受体的膜外区与抗体的Fc段连接，形成的融合蛋白则既可与TNF-α结合，又增加了稳定性，而且通过Fc段可形成二聚体，比天然出现的单体受体对TNF-α有更大的亲和力。
重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（TNFR-Fc）是一种由美国FDA批准的，可用于治疗如类风湿性关节炎等自身免疫疾病的蛋白药物。Etanercept（EnbrelTM）是已经上市的商品化的TNFR/Fc融合蛋白，也是抗TNF最有效的药物之一，而生物技术药物中销售额最高的产品正是Amgen公司生产的Enbrel。国内中国中信国建所生产的TNFR-Fc融合蛋白已经获批生产上市，商品名为益赛普，用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎的骨和关节损伤。但是，价格仍相对高昂，因此仍需获得成本较低的生产方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因。
本发明的另一目的在于提供所述的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白基因的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因，核苷酸序列如下所示：
ATGGCCCCCGTGGCCGTGTGGGCTGCCCTGGCCGTGGGACTGGAACTGTGGGCTGCTGCCCACGCCCTGCCCGCCCAGGTGGCCTTCACCCCCTACGCCCCCGAGCCAGGCAGCACCTGCAGGCTGAGAGAGTACTACGACCAGACCGCCCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCTCTCCAGGCCAGCATGCCAAGGTGTTCTGCACCAAGACCAGCGACACCGTGTGCGACAGCTGCGAGGACAGCACCTACACCCAGCTGTGGAACTGGGTGCCCGAGTGCCTGAGCTGTGGCAGCAGGTGCTCTAGCGACCAGGTCGAGACCCAGGCCTGCACCAGAGAGCAGAACAGGATCTGCACCTGCAGACCCGGCTGGTACTGCGCCCTGAGCAAGCAGGAAGGCTGCAGGCTCTGCGCCCCACTGAGGAAGTGCAGGCCCGGCTTCGGCGTGGCCAGACCCGGCACCGAGACCTCCGACGTGGTGTGCAAGCCCTGCGCCCCAGGCACCTTCAGCAACACCACCTCCAGCACCGACATCTGCAGGCCCCACCAGATCTGCAACGTGGTGGCTATCCCCGGCAATGCCAGCATGGACGCCGTGTGCACCAGCACCTCCCCCACCAGAAGCATGGCCCCAGGCGCCGTGCACCTGCCCCAGCCCGTGAGCACCAGGTCCCAGCACACCCAGCCCACCCCAGAGCCTAGCACCGCCCCCTCTACCAGCTTCCTGCTGCCCATGGGCCCCAGCCCTCCAGCCGAGGGCAGCACCGGCGACGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCTCTCGAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGATGA；
所述的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因的应用，是将其重组于CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统上，在CHO细胞中进行表达；
一种重组载体pIRESneo3-TNFR-Fc，通过如下方法制备得到：
（1）通过基因合成，得到如SEQ ID NO.1所示的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因；
（2）使用引物F1和引物R1对步骤（1）得到的基因进行PCR扩增，得到含有AgeI和BamHI酶切位点的基因序列；
引物F 1：5’-TTCTACCGGTATGGCCCCCGTGGCCGTGT-3’；
引物R 1：5’-CGCGGATCCTCATCACTTGCCGGGGGACAGGCT-3’；
（3）用AgeI酶和BamHI酶分别双酶切步骤（2）得到的含有AgeI和BamHI酶切位点的基因序列和载体pIRESneo3；再将双酶切后得到的基因序列和载体pIRESneo3连接，得到重组载体pIRESneo3-TNFR-Fc；
步骤（1）中所述的基因合成为通过基因合成公司进行合成；
步骤（2）中所述的PCR扩增的条件优选为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1分钟，34个循环；72℃延伸5分钟；
一种转TNFR-Fc基因的CHO细胞，为将上述重组载体pIRESneo3-TNFR-Fc转染到CHO细胞得到；
所述的转TNFR-Fc基因的CHO细胞的发酵方法，包含如下步骤：
（1）将转TNFR-Fc基因的CHO细胞接种到含3.5～4.5mM谷氨酰胺、0.08～0.12mM次黄嘌呤和0.015～0.017mM胸腺嘧啶的proCHO5培养基中，首先使用50ml旋转管Tubespin进行培养，proCHO5培养基的体积为9～11ml、细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/ml、培养温度为36～38℃、转速为170～200rmp，培养至对数生长期；
（2）接着将步骤（1）中处于对数生长期的细胞用Schott-Duran摇瓶逐级放大；
（3）将逐级放大后的细胞转接到55L一次性生物反应袋进行培养，培养体积为25～35L；最初调节转速70～90rpm/min，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.9～7.1；在第3天调整温度为30～32℃，当细胞密度达到4×106～6×106个/ml，增大转速至120rpm/min；当细胞密度达到7×106～9×106个/ml，增大转速至150rpm/min；溶解氧始终保持为35～45%，葡萄糖浓度始终保持为1～3g/L；
（4）当细胞活力降为40%以下时，放出发酵液，结束发酵；
步骤（3）优选为：将逐级放大后的细胞转接到55L一次性生物反应袋进行培养，培养体积为25～35L；最初调节转速70～90rpm/min，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.9～7.1；在第3天调整温度为30～32℃，当细胞密度达到4×106～6×106个/ml，增大转速至120rpm/min；当细胞密度达到7×106～9×106个/ml，增大转速至150rpm/min；溶解氧始终保持为35～45%，葡萄糖浓度始终保持为1～3g/L；在培养过程中添加补料培养基1～3L，补料培养基的配方如下：无水氯化钙100～130mg/L、L-亮氨酸55～70mg/L、亚油酸0.03～0.05mg/L、五水硫酸铜0.0013mg/L、L-赖氨酸盐酸盐87～94mg/L、硫辛酸0.1～0.15mg/L、九水硝酸铁0.03mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚红7～9mg/L、七水硫酸亚铁0.4～0.45mg/L、L-苯丙氨酸32.0～37.2mg/L、1,4-丁二胺二盐酸盐0.075～0.085mg/L、氯化钾300～350mg/L、L-丝氨酸23～30mg/L、丙酮酸钠45～55mg/L、氯化镁25～30mg/L、L-苏氨酸50～60mg/L、维生素H 0.0035mg/L、无水硫酸镁42～47mg/L、L-丙氨酸3.8～4.5mg/L、D-泛酸钙2～3mg/L、氯化钠6920～7000mg/L、L-天门冬酰胺7～8.5mg/L、氯化胆碱8.5～9.5mg/L、无水磷酸二氢钠50～60mg/L、L-天门冬氨酸6～7mg/L、叶酸2.5～3.5mg/L、磷酸氢二钠62～70mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐15～20mg/L、肌醇10～13mg/L、七水硫酸锌0.4～0.6mg/L、L-谷氨酸7～8mg/L、烟酰胺1.5～3mg/L、L-精氨酸盐酸盐140～155mg/L、L-脯氨酸16～18mg/L、盐酸吡哆醛1.5～2.5mg/L、L-胱氨酸盐酸盐25～35mg/L、L-色氨酸8～10mg/L、盐酸吡哆醇0.025～0.033mg/L、L-谷氨酰胺350～380mg/L、L-酪氨酸34～42mg/L、核黄素0.2～0.25mg/L、甘氨酸17～20mg/L、L-缬氨酸45～55mg/L、盐酸硫胺2～2.5mg/L、L-组氨酸盐酸盐28～35mg/L、D-葡萄糖3100～3200mg/L、胸苷0.3～0.4mg/L、L-异亮氨酸50～60mg/L、次黄嘌呤1.8～2.5mg/L、维生素B12 0.5～0.8mg/L；
所述的补料培养基优选为在培养过程中第4、7、9天添加，每次添加1L；
步骤（2）中所述的逐级放大的步骤优选为：依次使用容积为250ml、500ml、1000ml、5000ml的Schott-Duran摇瓶进行培养，proCHO5培养基的体积为Schott-Duran摇瓶容积的1/5～1/4ml、细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/ml、培养温度为36～38℃、转速为170～200rmp；每一级培养至对数生长期就转接到。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明通过密码子优化，得到本发明所提供的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因。将该编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因重组于CHO细胞表达系统中，在CHO细胞表达得到的重组人TNFR-Fc融合蛋白亲和力高。
（2）本发明所提供了转TNFR-Fc基因的CHO细胞的发酵方法，使用一次性反应器，操作简单，得到的蛋白量较使用传统发酵罐高。
（3）特别是在添加补料培养基后，可延长细胞生长时间，提高表达水平，降低生产成本，获得高纯度的目的蛋白。
附图说明
图1是转TNFR-Fc基因的CHO细胞的发酵过程细胞密度图。
图2是TNFR-Fc融合蛋白及Enbrel与人TNFα的结合活性检测图。
图3是TNFR/Fc融合蛋白及标准品Enbrel对人TNFα介导细胞毒性的中和作用的检测图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明根据CHO哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，已知TNFR-FC蛋白的氨基酸序列，设计了4个新的编码TNFR-FC蛋白的基因序列如下：
序列1：
ATGGCCCCCGTGGCCGTGTGGGCTGCCCTGGCCGTGGGACTGGAACTG TGGGCTGCTGCCCACGCCCTCCCGGCCCAGGTCGCCTTCACCCCGTACGCCCCGGAGCCAGGCTCCACCTGCAGGCTCAGAGAGTACTACGACCAGACCGCCCAGATGTGCTGCTCCAAGTGCTCTCCAGGCCAGCATGCCAAGGTCTTCTGCACCAAGACCTCGGACACCGTCTGCGACTCGTGCGAGGACTCGACCTACACCCAGCTCTGGAACTGGGTCCCGGAGTGCCTCTCGTGTGGCTCGAGGTGCTCTTCGGACCAGGTGGAGACCCAGGCCTGCACCAGAGAGCAGAACAGGATCTGCACCTGCAGACCGGGCTGGTACTGCGCCCTCTCGAAGCAGGAAGGCTGCAGGCTGTGCGCCCCACTCAGGAAGTGCAGGCCGGGCTTCGGCGTCGCCAGACCGGGCACCGAGACCTCCGACGTCGTCTGCAAGCCCTGCGCCCCAGGCACCTTCTCGAACACCACCTCGTCCACCGACATCTGCAGGCCCCACCAGATCTGCAACGTCGTCGCTATCCCGGGCAATGCCTCGATGGACGCCGTCTGCACCTCGACCTCGCCGACCAGATCGATGGCCCCAGGCGCCGTCCACCTGCCGCAGCCGGTCTCCACCAGGTCGCAGCACACCCAGCCCACCCCAGAGCCTAGCACCGCCCCCTCTACCAGCTTCCTGCTGCCCATGGGCCCCAGCCCTCCAGCCGAGGGCAGCACCGGCGACGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCTCTCGAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGATGA；
序列2：
ATGGCCCCCGTGGCCGTGTGGGCTGCCCTGGCCGTGGGACTGGAACTG TGGGCTGCTGCCCACGCCCTGCCCGCCCAGGTGGCCTTCACCCCCTACGCCCCCGAGCCAGGCAGCACCTGCAGGCTGAGAGAGTACTACGACCAGACCGCCCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCTCTCCAGGCCAGCATGCCAAGGTGTTCTGCACCAAGACCAGCGACACCGTGTGCGACAGCTGCGAGGACAGCACCTACACCCAGCTGTGGAACTGGGTGCCCGAGTGCCTGAGCTGTGGCAGCAGGTGCTCTAGCGACCAGGTCGAGACCCAGGCCTGCACCAGAGAGCAGAACAGGATCTGCACCTGCAGACCCGGCTGGTACTGCGCCCTGAGCAAGCAGGAAGGCTGCAGGCTCTGCGCCCCACTGAGGAAGTGCAGGCCCGGCTTCGGCGTGGCCAGACCCGGCACCGAGACCTCCGACGTGGTGTGCAAGCCCTGCGCCCCAGGCACCTTCAGCAACACCACCTCCAGCACCGACATCTGCAGGCCCCACCAGATCTGCAACGTGGTGGCTATCCCCGGCAATGCCAGCATGGACGCCGTGTGCACCAGCACCTCCCCCACCAGAAGCATGGCCCCAGGCGCCGTGCACCTGCCCCAGCCCGTGAGCACCAGGTCCCAGCACACCCAGCCCACCCCAGAGCCTAGCACCGCCCCCTCTACCAGCTTCCTGCTGCCCATGGGCCCCAGCCCTCCAGCCGAGGGCAGCACCGGCGACGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCTCTCGAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGATGA；
序列3：
ATGGCCCCCGTGGCCGTGTGGGCTGCCCTGGCCGTGGGACTGGAACTG TGGGCTGCTGCCCACGCCCTGCCGGCCCAGGTGGCCTTCACCCCGTACGCCCCGGAGCCAGGCAGCACCTGCAGGCTCAGAGAGTACTACGACCAGACCGCCCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCTCTCCAGGCCAGCATGCCAAGGTCTTCTGCACCAAGACCTCGGACACCGTCTGCGACTCGTGCGAGGACAGCACCTACACCCAGCTCTGGAACTGGGTCCCCGAGTGCCTCAGCTGTGGCAGCAGGTGCTCTAGCGACCAGGTCGAGACCCAGGCCTGCACCAGAGAGCAGAACAGGATCTGCACCTGCAGACCCGGCTGGTACTGCGCCCTCTCGAAGCAGGAAGGCTGCAGGCTCTGCGCCCCACTCAGGAAGTGCAGGCCCGGCTTCGGCGTCGCCAGACCGGGCACCGAGACCTCCGACGTCGTCTGCAAGCCCTGCGCCCCAGGCACCTTCTCGAACACCACCTCCTCCACCGACATCTGCAGGCCGCACCAGATCTGCAACGTCGTCGCTATCCCCGGCAATGCCAGCATGGACGCCGTCTGCACCTCGACCTCGCCGACCAGATCGATGGCCCCAGGCGCCGTGCACCTGCCCCAGCCCGTCAGCACCAGGTCCCAGCACACCCAGCCCACCCCAGAGCCTAGCACCGCCCCCTCTACCAGCTTCCTGCTGCCCATGGGCCCCAGCCCTCCAGCCGAGGGCAGCACCGGCGACGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCTCTCGAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGATGA；
序列4：
ATGGCCCCCGTGGCCGTGTGGGCTGCCCTGGCCGTGGGACTGGAACTG TGGGCTGCTGCCCACGCCCTCCCCGCCCAGGTCGCCTTCACCCCCTACGCCCCGGAGCCAGGCTCCACCTGCAGGCTGAGAGAGTACTACGACCAGACCGCCACGATGTGCTGCTCCAAGTGCTCTCCAGGCCAGCATGCCAAGGTGTTCTGCACCAAGACCTCGGACACCGTGTGCGACTCGTGCGAGGACTCGACCTACACCCAGCTGTGGAACTGGGTCCCGGAGTGCCTGTCGTGTGGCAGCAGGTGCTCTAGCGACCAGGTGGAGACCCAGGCCTGCACCAGAGAGCAGAACAGGATCTGCACCTGCAGACCGGGCTGGTACTGCGCCCTGTCGAAGCAGGAAGGCTGCAGGCTCTGCGCCCCACTCAGGAAGTGCAGGCCGGGCTTCGGCGTCGCCAGACCCGGCACCGAGACCTCGGACGTGGTGTGCAAGCCCTGCGCCCCAGGCACCTTCTCGAACACCACCTCGTCCACCGACATCTGCAGGCCCCACCAGATCTGCAACGTGGTGGCTATCCCGGGCAATGCCTCGATGGACGCCGTGTGCACCTCGACCTCCCCCACCAGATCGATGGCCCCAGGCGCCGTGCACCTGCCGCAGCCGGTGTCCACCAGGTCGCAGCACACCCAGCCCACCCCAGAGCCTAGCACCGCCCCCTCTACCAGCTTCCTGCTGCCCATGGGCCCCAGCCCTCCAGCCGAGGGCAGCACCGGCGACGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCTCTCGAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGATGA；
其中每个正链1～66位核苷酸片段为该序列的信号肽，其第一个ATG是加入的起始密码子。
上述4条序列由DNA2.0（Menlo Park,CA,USA）合成。使用引物F1（5’-TTCTACCGGTATGGCCCCCGTGGCCGTGT-3’）和引物R1（5’-CGCGGATCCTCATCACTTGCCGGGGGACAGGCT-3’）分别对以上4个基因进行PCR扩增，将AgeI酶切位点引入基因序列的5’端，将BamHI酶切位点引入基因序列的3’端。
PCR的反应体系为：TakaRa LA Taq 0.5μl、2×GC buffer I 25μl、dNTP混合液（各2.5mM）8μl，模板DNA 100ng、20μM引物F1 1μl、20μM引物R1 1μl，用ddH2O补足50μl。
PCR的反应条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1分钟，34个循环；72℃延伸5分钟。
使用PCR清洁试剂盒对得到的PCR产物分别纯化。纯化后的PCR产物使用AgeI酶（NEB公司）和BamHI酶（NEB公司）进行双酶切。同时也使用AgeI酶（NEB公司）和BamHI酶（NEB公司）双酶切载体pIRESneo3（Clontech公司）。
酶切体系如下：AgeI酶0.5μl、BamHI 0.5μl、10倍buffer 410μl、PCR产物或载体pIRESneo3 500ng、用ddH2O补至100μl。
37℃酶切5小时。酶切后通过质量体积比0.8%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收酶切后的PCR产物和载体pIRESneo。
通过T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和载体pIRESneo3，按说明书标准体系进行配制，16℃连接过夜。再将连接得到的产物，按照《分子克隆》中的方法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（宝生物工程（大连）有限公司），通过在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行筛选，每个平板取10个白色菌斑接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中进行扩增，用质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒DNA，测序。根据测序结果，各确认1个序列完全正确的克隆，分别记作pIRESneo3-TNFR-Fc-1、pIRESneo3-TNFR-Fc-2、pIRESneo3-TNFR-Fc-3和pIRESneo3-TNFR-Fc-4。
实施例2
融合基因在中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞，中国科学院上海生科院细胞资源中心）中的转染与表达。
将克隆pIRESneo3-TNFR-Fc-1、pIRESneo3-TNFR-Fc-2、pIRESneo3-TNFR-Fc-3和pIRESneo3-TNFR-Fc-4分别接种于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，用μltrapure Plasmid Purification Kit（QIAGEN）抽提质粒DNA。
用脂质体法转染CHO细胞，转染试剂盒购自Invitrogen公司。转染时分别取上述纯化的pIRESneo3-TNFR-Fc-1、pIRESneo3-TNFR-Fc-2、pIRESneo3-TNFR-Fc-3和pIRESneo3-TNFR-Fc-4质粒100μg作为DNA样品对CHO细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。
转染后的CHO细胞经连续3个月的嘌呤霉素（PM），其浓度从0.05μM到10μM，每两周增加一次浓度，每次PM的用量约为前一次的2倍，具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行，培养基为ProCHO5(LONZA公司)。于37℃，5%CO2培养箱中培养。然后按照常规极度稀释法进行单克隆化。应用夹心ELISA方法分别检测其融合蛋白的表达量，总共得到pIRESneo3-TNFR-Fc-1克隆72个、pIRESneo3-TNFR-Fc-2克隆85个、pIRESneo3-TNFR-Fc-3克隆69个、pIRESneo3-TNFR-Fc-4克隆93个。
将各个克隆置于Tubespin中旋转震荡培养，培养基为ProCHO5，培养体积为10ml，培养温度为37℃，转速为180rpm。采用ELISA法对上述部分克隆TNFR-Fc的表达量进行测定，具体数据如表1。
表1不同重组基因克隆株蛋白表达量比较
以上数据表明，经CHO偏爱密码子优化的序列2重组TNFR-Fc-2基因显著提高了融合蛋白TNFR-Fc的表达水平。这在融合蛋白大规模生产中具有重要的经济意义。因此，重组TNFR-Fc-2基因的克隆株第25号被选作为生产细胞株。
ELISA具体过程如下：
（1）用包被液（pH9.6、0.1M的碳酸盐缓冲液）稀释羊抗人IgG-Fc包被抗体至1μg/ml，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃过夜；
（2）扣干包被液，用PBST（PH7.4、0.1M的Tris盐缓冲液+吐温20，吐温20的终浓度为体积百分比0.05%）以300μl/孔加至96孔酶标板内，洗板1次，每次3min。
（3）用质量体积百分比2%的BSA（800mg BSA+40ml PBST）封闭液，以300μl/孔加至板内，室温放置1小时。
（4）扣干封闭液，将封闭好的96孔酶标板用PBST以300μl/孔洗板3次，每次3min。将稀释好的标准品（Enbrel标准品，Amgen公司）和待测样品均以100μl/孔加至板内，37度放置1小时。
（5）用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。用含1%BSA二抗稀释液（400mg BSA+40ml PBST）将碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG稀释为1μg/ml，以100μl/孔加至板内，37度放置1小时。
（6）用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。用配制的对硝基苯磷酸二钠显色液，以200μl/孔加至板内，37度避光放置15min。
（7）用3M NaOH以100μl/孔加至板内终止反应。在405nm波长下读取OD值。
通过标准品做标准曲线，计算样品中TNFR-Fc的含量。检测时每个样品做3个复孔，取平均值。
实施例3
55L一次性生物反应器中发酵培养
（1）取所构建筛选得到的重组CHO细胞株（重组TNFR-Fc-2基因的克隆株第25号），以约5×105个/ml接种于含4mM谷氨酰胺、0.1mM次黄嘌呤和0.016mM胸腺嘧啶的proCHO5培养基中，采用50ml Tubespin进行，培养体积为10ml，培养温度37℃，转速为180rpm。在细胞传代扩增过程中，逐级放大培养，经过250ml、500ml、1000ml、5000ml摇瓶的细胞扩增，当细胞密度达到4×106个/ml时，转移采用55L一次性生物反应袋进行批次培养，培养体积为32L。发酵生长中，根据重组CHO细胞生长规律，按照常规方法培养，最初调节转速90rpm/min，温度保持在37℃，空气流量调节在10L/h，pH值控制在6.9～7.1，溶解氧一直保持在40%。在第3天调整温度为31℃，并每24小时后取样检测细胞密度。在细胞密度达到5×106个/ml左右后，继续增大转速至120rpm/min，始终保持溶解氧在40%，维持一定的生长速率。待细胞密度达到8×106个/ml左右后，继续增大转速至150rpm/min，并维持溶解氧在40%。在培养过程中第4、7、9天添加补料培养基，每次添加1L。补料培养基的配方如下：无水氯化钙110mg/L、L-亮氨酸60mg/L、亚油酸0.04mg/L、五水硫酸铜0.0013mg/L、L-赖氨酸盐酸盐90mg/L、硫辛酸0.12mg/L、九水硝酸铁0.03mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚红8mg/L、七水硫酸亚铁0.43mg/L、L-苯丙氨酸34.6mg/L、1,4-丁二胺二盐酸盐0.08mg/L、氯化钾325mg/L、L-丝氨酸26.5mg/L、丙酮酸钠50mg/L、氯化镁27.5mg/L、L-苏氨酸55mg/L、维生素H 0.0035mg/L、无水硫酸镁44.5mg/L、L-丙氨酸4.15mg/L、D-泛酸钙2.5mg/L、氯化钠6960mg/L、L-天门冬酰胺7.75mg/L、氯化胆碱9mg/L、无水磷酸二氢钠55mg/L、L-天门冬氨酸6.5mg/L、叶酸3mg/L、磷酸氢二钠66mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐17.5mg/L、I-肌醇11.5mg/L、七水硫酸锌0.5mg/L、L-谷氨酸7.5mg/L、烟酰胺2.25mg/L、L-精氨酸盐酸盐147.5mg/L、L-脯氨酸17mg/L、盐酸吡哆醛2mg/L、L-胱氨酸盐酸盐30mg/L、L-色氨酸9mg/L、盐酸吡哆醇0.029mg/L、L-谷氨酰胺365mg/L、L-酪氨酸38mg/L、核黄素0.225mg/L、甘氨酸18.5mg/L、L-缬氨酸50mg/L、盐酸硫胺2.25mg/L、L-组氨酸盐酸盐31.5mg/L、D-葡萄糖3150mg/L、胸苷0.35mg/L、L-异亮氨酸55mg/L、次黄嘌呤2.15mg/L、维生素B120.65mg/L。
在55L发酵罐培养全过程中，每天取样测定细胞密度（通过血球计数板检测）、活力（台盼蓝染色）和葡萄糖的浓度，根据所测葡萄糖的浓度来添加葡萄糖，使发酵液中葡萄糖浓度为1～3g/L。当细胞活力降为40%以下时，放出发酵液，结束发酵。
（2）设置批次培养，其与步骤（1）的区别在于不添加补料。
将步骤（1）得到的发酵液和步骤（2）得到的发酵液，通过实施例2提供的ELISA法检测发酵液上清中的蛋白量。结果如表2和图1所示。
表2补料培养与批次培养条件下培养时间与表达量比较
结果表明，与批次培养相比，添加补料培养基后细胞周期延长了5天，由14天延长为19天；同时在添加补料培养基后，在培养第9天时，细胞最高密度达到9.2×106个/ml，而批次培养在培养第6天时，细胞最高密度仅为7.5×106个/ml；在添加补料培养基后融合蛋白的表达量提高了810mg/L，由940mg/L提高到了1750ml/L。因此本发明所构建的表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞在旋转振荡培养方式下，在添加补料培养基后，有着极好的蛋白表达量。其在用于蛋白大规模生产中具有极大优势。
实施例4
TNFR-Fc融合蛋白与人TNFα结合活性的检测及相对亲和力的测定
将实施例3中补料培养（即步骤（1））获得的发酵液，经0.45μm滤膜过滤，上样于MabSelect Sure亲和层析柱（GE XK16/20，25ml）进行亲和层析。亲和层析平衡缓冲液为：20mM、pH7.2的PB+0.15M NaCl；洗脱缓冲液为：100mM、pH3.2的NaAc溶液，5ml/min流速。收集洗脱峰，进行10%SDS-PAGE，经扫描分析纯度大于99%。同时经SE-HPLC进行纯度测定，使用TSK gel G3000SWXL（7.8mm×300mm）凝胶色谱柱，流速为0.5ml/min，流动相为：20mM乙腈，0.5M氯化钠，pH7.2。测定结果显示纯度大于95%。
将纯化后的TNFR-Fc融合蛋白与标准品Enbrel通过间接ELISA方法检测其与人TNFα的结合活性，并测定其相对亲和力。具体方法如下：
（1）用包被液（pH9.6、0.1M的碳酸盐缓冲液）稀释TNFα蛋白（北京义翘神州生物技术有限公司）至200ng/ml，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃过夜。
（2）扣干包被液，用PBST（PH7.4、0.1M的Tris盐缓冲液+吐温20，吐温20的终浓度为体积百分比0.05%）以300μl/孔加至96孔酶标板内，洗板1次，每次3min。
（3）用质量体积百分比2%的BSA（800mg BSA+40ml PBST）封闭液，以300μl/孔加至板内，室温放置1小时。
（4）将待测样品（TNFR-Fc融合蛋白和标准品Enbrel）分别稀释为10个不同浓度梯度（5000ng/ml，1250ng/ml，416.67ng/ml，138.89ng/ml，46.30ng/ml，15.43ng/ml，5.14ng/ml，1.71ng/ml，0.57ng/ml和0.19ng/ml）。每孔加入100ul各种稀释度的样品，每个稀释度做3个复孔，空白对照孔只加入样品稀释液。
（5）在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。
（6）用PBST将1mg/ml的山羊抗人IgG（Fc）/HRP二抗稀释为1μg/ml，每孔加入100μl稀释后的抗体。
（7）在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。
（8）TMB显色液按100μl/孔上样，在37℃条件下避光孵育15分钟，可见显色。用2M硫酸以100μl/孔加至板内终止反应。在450nm波长下读取OD值。
检测结果如图2所示，表明本发明中的TNFR-Fc融合蛋白可以与人TNFα特异性结合。同时与标准品Enbrel进行比较分析发现，TNFR-Fc融合蛋白的EC50为11.92ng/ml，Enbrel的EC50为13.05ng/ml，两者无显著差异。
实施例5
TNFR-Fc融合蛋白对人TNFα中和活性研究
将实施例4纯化后得到的TNFR-Fc融合蛋白与标准品Enbrel通过以下方法检测其对人TNFα的中和活性。
（1）取对数生长期的L929成纤维细胞（中国科学院上海生科院细胞资源中心），用0.5ml胰酶常规消化使细胞充分分散，并用细胞培养液稀释至2.0×105个/ml。
（2）取96孔板，将细胞以20000个/孔接种于96孔板（100μl每孔），5%CO2培养箱中37℃培养24小时。
（3）用1～2μg/ml放线菌素D和0.001μg/ml TNFα标准品（北京义翘神州生物技术有限公司产品）的细胞培养液将待测样品稀释至10μg/ml、1.0μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml和0.00001μg/ml。
（4）每孔加入100μl各种稀释度的样品，每个稀释度3个复孔。阴性对照只加入含1～2μg/ml放线菌素D的细胞培养液。阳性对照中加入高剂量的TNFα（2μg/ml）。
（5）5%CO2培养箱中37℃培养24小时或者更长。培养时间根据阳性对照孔中的细胞全部死亡确定。
（6）用MTT染色后在570nm波长读取OD值。
检测结果如图3所示，表明本发明中的TNFR-Fc融合蛋白对人TNFα介导的细胞毒性具有中和作用。与标准品Enbrel进行比较分析发现，TNFR-Fc融合蛋白的EC50为8.75ng/ml，而标准品Enbrel的中和活性为10.03ng/ml。这说明，本发明中优化条件后所获得的融合蛋白的中和能力，即亲和力，与标准品Enbrel之间无显著差异。
实施例6
TNFR-Fc融合蛋白在大鼠体内的药代动力学研究
（1）取672只SD大鼠（购买于广州中医药大学实验动物中心），随机分为6组，将实施例4中纯化后的TNFR-Fc融合蛋白与标准品Enbrel分别按照0.5、3、18mg/kg皮下注射给药。
（2）于给药后1、2、4、8、12、24、28、32、36、48、72、96、120、144h等14个时间点心脏采血，每个时间点8只动物（4雌、4雄）。
（3）将采集的血液样本以1500rpm/min转速离心5min，分取血清，用ELISA酶标法（实施例2中所提供的ELISA方法）测定血清中TNFR-Fc的含量，计算不同时间的血药浓度。
（4）应用药代动力学与分析软件对血药浓度（c）与时间（t）数据进行c-t曲线拟合，并计算出有关的药物动力学参数。
表3 TNFR/Fc融合蛋白及Enbrel在大鼠中药代动力学参数比较
通过酶标法测定不同时间TNFR-Fc血药浓度，对药物浓度-时间数据进行分析处理，其拟合曲线符合单室模型非血管给药的特征。0.5、3、18mg/kg三种剂量的主要结果参数如表3中所示。在同等剂量下，TNFR-Fc比Enbrel有更显著更高的代谢周期，其体内半衰期比Enbrel高27.84%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因的应用，其特征在于：是将其重组于CHO细胞表达系统上，在CHO细胞中进行表达。
3.一种重组载体pIRESneo3-TNFR-Fc，其特征在于通过如下方法制备得到：
（1）通过基因合成，得到如SEQ ID NO.1所示的编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因；
（2）使用引物F1和引物R1对步骤（1）得到的基因进行PCR扩增，得到含有AgeI和BamHI酶切位点的基因序列；
引物F1：5’-TTCTACCGGTATGGCCCCCGTGGCCGTGT-3’；
引物R1：5’-CGCGGATCCTCATCACTTGCCGGGGGACAGGCT-3’；
（3）用AgeI酶和BamHI酶分别双酶切步骤（2）得到的含有AgeI和BamHI酶切位点的基因序列和载体pIRESneo3；再将双酶切后得到的基因序列和载体pIRESneo3连接，得到重组载体pIRESneo3-TNFR-Fc。
4.根据权利要求3所述的重组载体pIRESneo3-TNFR-Fc，其特征在于：步骤（2）中所述的PCR扩增的条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1分钟，34个循环；72℃延伸5分钟。
5.一种转TNFR-Fc基因的CHO细胞，其特征在于：为将权利要求3或4所述的重组载体pIRESneo3-TNFR-Fc转染到CHO细胞得到。
6.权利要求5所述的转TNFR-Fc基因的CHO细胞的发酵方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）将转TNFR-Fc基因的CHO细胞接种到含3.5～4.5mM谷氨酰胺、0.08～0.12mM次黄嘌呤和0.015～0.017mM胸腺嘧啶的proCHO5培养基中，首先使用50ml旋转管Tubespin进行培养，proCHO5培养基的体积为9～11ml、细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/ml、培养温度为36～38℃、转速为170～200rmp，培养至对数生长期；
（2）接着将步骤（1）中处于对数生长期的细胞用Schott-Duran摇瓶逐级放大；
（3）将逐级放大后的细胞转接到55L一次性生物反应袋进行培养，培养体积为25～35L；最初调节转速70～90rpm/min，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.9～7.1；在第3天调整温度为30～32℃，当细胞密度达到4×106～6×106个/ml，增大转速至120rpm/min；当细胞密度达到7×106～9×106个/ml，增大转速至150rpm/min；溶解氧始终保持为35～45%，葡萄糖浓度始终保持为1～3g/L；
（4）当细胞活力降为40%以下时，放出发酵液，结束发酵。
7.根据权利要求6所述的转TNFR-Fc基因的CHO细胞的发酵方法，其特征在于：
步骤（3）为：将逐级放大后的细胞转接到55L一次性生物反应袋进行培养，培养体积为25～35L；最初调节转速70～90rpm/min，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.9～7.1；在第3天调整温度为30～32℃，当细胞密度达到4×106～6×106个/ml，增大转速至120rpm/min；当细胞密度达到7×106～9×106个/ml，增大转速至150rpm/min；溶解氧始终保持为35～45%，葡萄糖浓度始终保持为1～3g/L；在培养过程中添加补料培养基1～3L，补料培养基的配方如下：无水氯化钙100～130mg/L、L-亮氨酸55～70mg/L、亚油酸0.03～0.05mg/L、五水硫酸铜0.0013mg/L、L-赖氨酸盐酸盐87～94mg/L、硫辛酸0.1～0.15mg/L、九水硝酸铁0.03mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚红7～9mg/L、七水硫酸亚铁0.4～0.45mg/L、L-苯丙氨酸32.0～37.2mg/L、1,4-丁二胺二盐酸盐0.075～0.085mg/L、氯化钾300～350mg/L、L-丝氨酸23～30mg/L、丙酮酸钠45～55mg/L、氯化镁25～30mg/L、L-苏氨酸50～60mg/L、维生素H 0.0035mg/L、无水硫酸镁42～47mg/L、L-丙氨酸3.8～4.5mg/L、D-泛酸钙2～3mg/L、氯化钠6920～7000mg/L、L-天门冬酰胺7～8.5mg/L、氯化胆碱8.5～9.5mg/L、无水磷酸二氢钠50～60mg/L、L-天门冬氨酸6～7mg/L、叶酸2.5～3.5mg/L、磷酸氢二钠62～70mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐15～20mg/L、肌醇10～13mg/L、七水硫酸锌0.4～0.6mg/L、L-谷氨酸7～8mg/L、烟酰胺1.5～3mg/L、L-精氨酸盐酸盐140～155mg/L、L-脯氨酸16～18mg/L、盐酸吡哆醛1.5～2.5mg/L、L-胱氨酸盐酸盐25～35mg/L、L-色氨酸8～10mg/L、盐酸吡哆醇0.025～0.033mg/L、L-谷氨酰胺350～380mg/L、L-酪氨酸34～42mg/L、核黄素0.2～0.25mg/L、甘氨酸17～20mg/L、L-缬氨酸45～55mg/L、盐酸硫胺2～2.5mg/L、L-组氨酸盐酸盐28～35mg/L、D-葡萄糖3100～3200mg/L、胸苷0.3～0.4mg/L、L-异亮氨酸50～60mg/L、次黄嘌呤1.8～2.5mg/L、维生素B120.5～0.8mg/L。
8.根据权利要求7所述的转TNFR-Fc基因的CHO细胞的发酵方法，其特征在于：所述的补料培养基为在培养过程中第4、7、9天添加，每次添加1L。
9.根据权利要求6～8任一项所述的转TNFR-Fc基因的CHO细胞的发酵方法，其特征在于：步骤（2）中所述的逐级放大的步骤为：依次使用容积为250ml、500ml、1000ml、5000ml的Schott-Duran摇瓶进行培养，proCHO5培养基的体积为Schott-Duran摇瓶容积的1/5～1/4ml、细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/ml、培养温度为36～38℃、转速为170～200rmp；每一级培养至对数生长期就进行转接。
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