CN103361355A - 编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因及其应用。该基因包含如SEQ ID NO.1所示的编码轻链的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的编码重链的核苷酸序列。分别在前述两个序列上设计信号肽、起始密码子和终止密码子；将设计好的序列分别克隆至真核表达载体中，共同转染CHO细胞，得到表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞，再对该CHO细胞进行发酵。本发明由于对密码子进行优化，转基因后的CHO细胞表达重组人rhHER2-mAb的表达量高；且本发明提供的发酵方法，特别是在添加补料培养基后，延长细胞生长时间，提高表达水平，降低生产成本，获得高纯度的目的蛋白。

Description

编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种编码单克隆抗体的基因，特别涉及一种编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因及其应用。

背景技术

rhHER2-mAb是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2（HER2）的细胞外部位。此抗体属IgGl型，含人的框架区，及能与HER-2结合的鼠抗-p185HER2抗体的互补决定区。

HER2原癌基因或C-erbB2编码一个单一的受体样跨膜蛋白，分子量185kDa，其结构上与表皮生长因子受体相关。在原发性乳腺癌患者中观察到有25%～30%的患者HER2过度表达。HER2基因扩增的结果是这些肿瘤细胞表面HER2蛋白表达增加，导致HER2受体活化。研究表明，HER2过度表达的肿瘤患者较无过度表达的无病生存期短。HER2的过度表达可通过以下方法诊断：对肿瘤组织块以免疫组化为基础的评价法，组织或血浆样品的ELISA法或荧光原位杂交法（FISH）。

抗HER2人源化单克隆抗体（rhHER2-mAb）又称曲妥珠单抗（国际非专利药品名称：Trastuzumab），在中国的商品名为：赫赛汀（大陆及港澳地区）、贺癌平（台湾地区），由瑞士罗氏Roche药厂生产，是第一个针对HER2/neu基因扩增的人源化单克隆抗体，能够特异性识别并作用于HER2的细胞外部位，使其通过吞噬作用离开细胞膜进入核体内，抑制其介导的信号转导，从而达到治疗肿瘤的作用。曲妥珠单抗在体外以及动物实验中均显示其可以抑制HER2过度表达的肿瘤细胞的增殖。另外，曲妥珠单抗还是抗体依赖的细胞介导的细胞毒反应（ADCC）的潜在介质。在体外研究中，已经证明了曲妥珠单抗介导的ADCC在HER2过度表达的癌细胞中比HER2非过度表达的癌细胞中优先产生。

Herceptin于1998年在美国批准上市，2002年在我国上市，在临床试验和后续应用中均取得了确切的疗效。在化疗辅助治疗的年代，乳腺癌的治愈率仅为43.4%，靶向药物赫赛汀的临床应用，使早期HER2阳性的乳腺癌患者的治愈率提升到80%左右。但是，价格仍相对高昂，因此仍需获得成本较低的生产方法。目前，人们发现，抗体的表达量与编码基因的偏好性、表达方法有一定的相关性。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因。

本发明的另一目的在于提供所述的编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体基因的应用。

本发明的目的是通过下述技术方案实现：一种编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因，包含编码轻链的核苷酸序列和编码重链的核苷酸序列；编码轻链的核苷酸序列如下所示：

GACATCCAGATGACGCAGTCGCCGTCCTCATTGAGCGCATCCGTGGGAGACAGAGTCACTATTACATGCCGGGCATCCCAAGACGTAAACACGGCCGTCGCCTGGTACCAACAGAAGCCCGGAAAAGCGCCCAAACTGTTGATCTACTCCGCCTCATTTCTGTACAGCGGGGTACCCTCGAGGTTCAGCGGCTCGAGGAGCGGGACGGATTTCACGTTGACAATTTCGTCACTTCAGCCGGAAGATTTTGCGACATACTATTGCCAGCAACACTATACCACACCCCCGACGTTTGGCCAGGGGACCAAAGTCGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCGTCAGTATTCATCTTCCCGCCGTCCGATGAGCAACTCAAGAGCGGAACCGCATCAGTCGTATGCTTGCTCAATAACTTCTATCCGCGAGAGGCGAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGTAATAGCCAGGAATCAGTCACGGAGCAGGATTCAAAGGATTCGACCTATTCCCTCTCGTCGACATTGACGCTGTCGAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTGTACGCTTGTGAAGTGACACACCAGGGCCTTTCATCCCCGGTGACAAAGTCGTTCAATCGCGGGGAGTGT；

编码重链的核苷酸序列如下所示：

GAGGTGCAGCTTGTCGAATCCGGGGGAGGGCTCGTCCAACCCGGAGGATCACTGCGCCTTTCATGCGCAGCCTCGGGTTTCAATATCAAGGACACGTATATCCATTGGGTGCGGCAGGCGCCAGGAAAAGGTTTGGAGTGGGTCGCGAGGATCTACCCCACCAATGGGTACACACGATACGCCGATTCGGTCAAGGGGCGGTTCACAATCTCGGCGGACACGTCGAAAAACACTGCGTACTTGCAGATGAATAGCCTCCGCGCAGAAGATACTGCGGTGTATTACTGCTCCCGCTGGGGAGGTGATGGCTTCTATGCGATGGACTATTGGGGACAAGGAACACTTGTAACGGTCAGCTCGGCCAGCACCAAGGGGCCGTCCGTGTTTCCCCTCGCCCCCTCGTCGAAGTCAACTAGCGGCGGAACAGCCGCCCTTGGTTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTCACGGTGTCATGGAACTCGGGAGCATTGACTTCGGGTGTGCATACATTTCCCGCAGTGCTCCAGTCATCAGGACTGTATAGCCTCTCGTCCGTCGTAACGGTCCCGTCATCGTCGCTCGGGACCCAGACATACATTTGCAATGTCAACCACAAACCTTCGAATACAAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGTGACAAGACGCACACATGTCCTCCATGCCCTGCGCCTGAGTTGCTGGGAGGGCCGAGCGTGTTCCTCTTTCCTCCCAAGCCGAAGGACACACTGATGATTTCGAGGACGCCTGAGGTAACTTGCGTGGTAGTAGATGTGTCCCATGAGGACCCCGAAGTAAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGTGTGGAGGTCCACAATGCCAAAACCAAACCGCGCGAAGAGCAATACAACAGCACATATCGGGTGGTGAGCGTGCTCACCGTCTTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAAGAGTACAAATGTAAAGTATCAAACAAAGCGCTCCCCGCACCCATTGAAAAGACTATCTCAAAGGCTAAGGGACAGCCCAGAGAGCCACAAGTCTACACGCTCCCGCCCTCGAGAGATGAGTTGACGAAGAATCAGGTCAGCCTTACGTGCCTCGTCAAAGGGTTTTACCCATCCGACATTGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGACAGCCAGAGAACAACTACAAGACTACACCGCCTGTGCTGGACTCGGATGGTTCGTTCTTCCTCTACTCGAAATTGACTGTGGACAAATCCCGCTGGCAGCAGGGAAATGTGTTCTCGTGTAGCGTAATGCATGAAGCGTTGCACAATCACTATACCCAGAAATCGCTCTCCCTTTCGCCTGGC；

所述的编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因的应用，是将上述编码轻链的核苷酸序列和上述编码重链的核苷酸序列分别克隆到CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统上，再共同转染CHO细胞，发酵，诱导表达；

所述的CHO细胞表达系统优选为真核表达载体

和真核表达载体

更优选为将上述编码轻链的核苷酸序列克隆至真核表达载体将上述编码重链的核苷酸序列克隆至真核表达载体

一种表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞，为含有上述编码轻链的核苷酸序列和上述编码重链的核苷酸序列的细胞；

所述的表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞，优选通过如下步骤得到：

（1）分别在上述编码轻链的核苷酸序列和上述编码重链的核苷酸序列的5’端设计上信号肽和起始密码子，再分别在3’端设计上终止密码子，具体如下所示：

设计有信号肽（粗体带横线部分）、起始密码子和终止密码子的编码重链的核苷酸序列，命名为PH-H1序列：

ATGGAGTTCTGGTTGTCATGGGTCTTTCTGGTAGCTATTCTTAAGGGAGTACAG TGTGAGGTGCAGCTTGTCGAATCCGGGGGAGGGCTCGTCCAACCCGGAGGATCACTGCGCCTTTCATGCGCAGCCTCGGGTTTCAATATCAAGGACACGTATATCCATTGGGTGCGGCAGGCGCCAGGAAAAGGTTTGGAGTGGGTCGCGAGGATCTACCCCACCAATGGGTACACACGATACGCCGATTCGGTCAAGGGGCGGTTCACAATCTCGGCGGACACGTCGAAAAACACTGCGTACTTGCAGATGAATAGCCTCCGCGCAGAAGATACTGCGGTGTATTACTGCTCCCGCTGGGGAGGTGATGGCTTCTATGCGATGGACTATTGGGGACAAGGAACACTTGTAACGGTCAGCTCGGCCAGCACCAAGGGGCCGTCCGTGTTTCCCCTCGCCCCCTCGTCGAAGTCAACTAGCGGCGGAACAGCCGCCCTTGGTTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTCACGGTGTCATGGAACTCGGGAGCATTGACTTCGGGTGTGCATACATTTCCCGCAGTGCTCCAGTCATCAGGACTGTATAGCCTCTCGTCCGTCGTAACGGTCCCGTCATCGTCGCTCGGGACCCAGACATACATTTGCAATGTCAACCACAAACCTTCGAATACAAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGTGACAAGACGCACACATGTCCTCCATGCCCTGCGCCTGAGTTGCTGGGAGGGCCGAGCGTGTTCCTCTTTCCTCCCAAGCCGAAGGACACACTGATGATTTCGAGGACGCCTGAGGTAACTTGCGTGGTAGTAGATGTGTCCCATGAGGACCCCGAAGTAAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGTGTGGAGGTCCACAATGCCAAAACCAAACCGCGCGAAGAGCAATACAACAGCACATATCGGGTGGTGAGCGTGCTCACCGTCTTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAAGAGTACAAATGTAAAGTATCAAACAAAGCGCTCCCCGCACCCATTGAAAAGACTATCTCAAAGGCTAAGGGACAGCCCAGAGAGCCACAAGTCTACACGCTCCCGCCCTCGAGAGATGAGTTGACGAAGAATCAGGTCAGCCTTACGTGCCTCGTCAAAGGGTTTTACCCATCCGACATTGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGACAGCCAGAGAACAACTACAAGACTACACCGCCTGTGCTGGACTCGGATGGTTCGTTCTTCCTCTACTCGAAATTGACTGTGGACAAATCCCGCTGGCAGCAGGGAAATGTGTTCTCGTGTAGCGTAATGCATGAAGCGTTGCACAATCACTATACCCAGAAATCGCTCTCCCTTTCGCCTGGCTAATGA；

设计有信号肽（粗体带横线部分）、起始密码子和终止密码子的编码轻链的核苷酸序列，命名为PH-L1序列：

ATGGATATGCGAGTACCCGCACAACTTCTTGGGCTTTTGCTTCTGTGGTTGAGG GGAGCTAGATGTGACATCCAGATGACGCAGTCGCCGTCCTCATTGAGCGCATCCGTGGGAGACAGAGTCACTATTACATGCCGGGCATCCCAAGACGTAAACACGGCCGTCGCCTGGTACCAACAGAAGCCCGGAAAAGCGCCCAAACTGTTGATCTACTCCGCCTCATTTCTGTACAGCGGGGTACCCTCGAGGTTCAGCGGCTCGAGGAGCGGGACGGATTTCACGTTGACAATTTCGTCACTTCAGCCGGAAGATTTTGCGACATACTATTGCCAGCAACACTATACCACACCCCCGACGTTTGGCCAGGGGACCAAAGTCGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCGTCAGTATTCATCTTCCCGCCGTCCGATGAGCAACTCAAGAGCGGAACCGCATCAGTCGTATGCTTGCTCAATAACTTCTATCCGCGAGAGGCGAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGTAATAGCCAGGAATCAGTCACGGAGCAGGATTCAAAGGATTCGACCTATTCCCTCTCGTCGACATTGACGCTGTCGAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTGTACGCTTGTGAAGTGACACACCAGGGCCTTTCATCCCCGGTGACAAAGTCGTTCAATCGCGGGGAGTGTTAATGA；

（2）通过基因合成，得到如步骤（1）所示的PH-H1序列和PH-L1序列；

（3）以PH-H1序列和PH-L1序列为模板，使用PCR后能在得到的产物3'端添加A碱基的酶，通过如下引物分别PCR扩增得到带有突出A碱基的PH-H1序列的PCR产物和带有突出A碱基的PH-L1序列的PCR产物；

重链引物F1：5'-ATGGAGTTCTGGTTGTCATGGG-3'；

重链引物R1：5'-TCATTAGCCAGGCGAAAGGGAGAGC-3'；

轻链引物F2：5'-ATGGATATGCGAGTACCCGCACAAC-3'；

轻链引物R2：5'-TCATTAACACTCCCCGCGATTGAACG-3'；

（4）将带有突出A碱基的PH-H1序列的PCR产物与载体

连接，得到pOptiVEC-Prot-PH-H1重组载体；将带突出A碱基的PH-L1序列的PCR产物与载体

连接，得到pcDNA3.3-Prot-PH-L1重组载体；

（5）将pcDNA3.3-Prot-PH-L1和pOptiVEC-Prot-PH-H1共同转染至CHO细胞，得到表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞；

步骤（2）中所述的基因合成为通过基因合成公司进行合成；

步骤（3）中所述的PCR后能在得到的产物3'端添加A碱基的酶优选为LA Taq酶；

步骤（3）中所述的PCR扩增的条件如下：

①当模板为PH-H1序列，PCR扩增的条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1.5分钟，34个循环；72℃延伸5分钟；

②当模板为PH-L1序列，PCR扩增的条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1分钟，34个循环；72℃延伸5分钟；

步骤（4）中所述的载体

和所述的

载体均为线性化且突出末端为T的载体，从而其能与3'带有突出A碱基的PCR产物进行连接；连接后的产物转入大肠杆菌，复制，筛选，得到阳性克隆，抽提，得到重组载体；

一种发酵表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞的方法，包含如下步骤：

I、将表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞接种到生长培养基中培养至对数生长期，培养条件如下：温度为36～38℃、转速为170～200rmp，体积分数为5～8%CO₂；

II、接着将步骤I中处于对数生长期的细胞使用生长培养基进行逐级放大；

III、将逐级放大后的细胞转接到5L搅拌式发酵罐中进行培养，培养体积为1.5～2.5L生长培养基；第1天和第2天调节转速70～90rpm/min，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.9～7.1；在第3天调整温度为30～32℃，当细胞密度达到4×10⁶～6×10⁶个/ml，增大转速至120rpm/min；当细胞密度达到7×10⁶～9×10⁶个/ml，增大转速至150rpm/min；溶解氧始终保持为35～45%，葡萄糖浓度始终保持为1～3g/L；

IV、当细胞活力降为40%以下时，放出发酵液，结束发酵。

步骤I中所述的生长培养基为含3.5～4.5mM谷氨酰胺的proCHO5培养基或是含3.5～4.5mM谷氨酰胺、0.08～0.12mM次黄嘌呤和0.015～0.017mM胸腺嘧啶的proCHO5培养基；

步骤I中所述的培养优选为使用50ml Tubespin旋转振荡培养；

步骤II中所述的逐级放大的步骤优选为：依次使用容积为500ml、1000ml的Schott-Duran摇瓶进行培养，加入生长培养基的体积为Schott-Duran摇瓶容积的1/5～1/4、细胞接种后最终浓度为4×10⁵～6×10⁵个/ml、培养温度为36～38℃、转速为170～200rmp；每一级培养至对数生长期就进行转接；

步骤III优选为：将逐级放大后的细胞转接到5L搅拌式发酵罐，培养体积为1.5～2.5L；第1天和第2天调节转速70～90rpm/min，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.9～7.1；在第3天调整温度为30～32℃，当细胞密度达到4×10⁶～6×10⁶个/ml，增大转速至120rpm/min；当细胞密度达到7×10⁶～9×10⁶个/ml，增大转速至150rpm/min；溶解氧始终保持为35～45%，葡萄糖浓度始终保持为1～3g/L；在培养过程中添加补料培养基0.6～1L，补料培养基的配方如下：无水氯化钙100～130mg/L、L-亮氨酸55～70mg/L、亚油酸0.03～0.05mg/L、五水硫酸铜0.0013mg/L、L-赖氨酸盐酸盐87～94mg/L、硫辛酸0.1～0.15mg/L、九水硝酸铁、0.03mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚红7～9mg/L、七水硫酸亚铁0.4～0.45mg/L、L-苯丙氨酸32.0～37.2mg/L、1,4-丁二胺二盐酸盐0.075～0.085mg/L、氯化钾300～350mg/L、L-丝氨酸23～30mg/L、丙酮酸钠45～55mg/L、氯化镁25～30mg/L、L-苏氨酸50～60mg/L、维生素H0.0035mg/L、无水硫酸镁42～47mg/L、L-丙氨酸3.8～4.5mg/L、D-泛酸钙2～3mg/L、氯化钠6920～7000mg/L、L-天门冬酰胺7～8.5mg/L、氯化胆碱8.5～9.5mg/L、无水磷酸二氢钠50～60mg/L、L-天门冬氨酸6～7mg/L、叶酸2.5～3.5mg/L、磷酸氢二钠62～70mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐15～20mg/L、肌醇10～13mg/L、七水硫酸锌0.4～0.6、L-谷氨酸7～8mg/L、烟酰胺1.5～3mg/L、L-精氨酸盐酸盐140～155mg/L、L-脯氨酸16～18mg/L、盐酸吡哆醛1.5～2.5mg/L、L-胱氨酸盐酸盐25～35mg/L、L-色氨酸8～10mg/L、盐酸吡哆醇0.025～0.033mg/L、L-谷氨酰胺350～380mg/L、L-酪氨酸34～42mg/L、核黄素0.2～0.25mg/L、甘氨酸17～20mg/L、L-缬氨酸45～55mg/L、盐酸硫胺2～2.5mg/L、L-组氨酸盐酸盐28～35mg/L、D-葡萄糖3100～3200mg/L、L-异亮氨酸50～60mg/L、维生素B120.5～0.8mg/L；

所述的补料培养基优选为在培养过程中第3、6、9天添加，每次按1.5L生长培养基加入200ml补料培养基的量添加补料培养基；

所述的5L搅拌式发酵罐优选为型号为Sartorius D21000466-FE01的发酵罐。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明通过密码子优化，得到本发明所提供的编码重组人rhHER2-mAb的核苷酸序列。将该编码重组人rhHER2-mAb的基因重组于CHO细胞表达系统中，在CHO细胞表达得到的重组人rhHER2-mAb的表达量高。

（2）本发明所提供了转rhHER2-mAb基因的CHO细胞的发酵方法，特别是在添加补料培养基后，可延长细胞生长时间，提高表达水平，降低生产成本，获得高纯度的目的蛋白。

附图说明

图1是转重组基因获得的CHO-protH-H1L1细胞的发酵过程细胞周期图。

图2是转重组基因获得的CHO-protH-H1L1细胞的发酵过程细胞密度图。

图3是转重组基因获得的CHO-protH-H1L1细胞的发酵过程rhHER2-mAb表达量图。

图4是rhHER2-mAb及Herceptin标准品对SK-BR-3亲和力检测图。

图5是rhHER2-mAb及Herceptin标准品对BT-474亲和力检测图。

图6是重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的体内抗肿瘤药活性检测图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

已知的Herceptin蛋白的重链和轻链的氨基酸序列（国家发明专利200580031905.4图16A,16B公开）如下：

重链的氨基酸序列如下所示，共449个氨基酸：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；

轻链的氨基酸序列如下所示，共214个氨基酸：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

本发明根据CHO哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，对上述氨基酸序列分别进行优化，设计了2条新的编码Herceptin蛋白重链的基因和2条新的编码Herceptin蛋白轻链的基因，另外在5'端设计上起始密码子ATG、信号肽（粗体划横线部分）以及在3'端设计上终止密码子TAATGA，具体序列如下：

优化好的编码Herceptin的重链的序列1（PH-H1）：

ATGGAGTTCTGGTTGTCATGGGTCTTTCTGGTAGCTATTCTTAAGGGAGTACA GTGTGAGGTGCAGCTTGTCGAATCCGGGGGAGGGCTCGTCCAACCCGGAGGATCACTGCGCCTTTCATGCGCAGCCTCGGGTTTCAATATCAAGGACACGTATATCCATTGGGTGCGGCAGGCGCCAGGAAAAGGTTTGGAGTGGGTCGCGAGGATCTACCCCACCAATGGGTACACACGATACGCCGATTCGGTCAAGGGGCGGTTCACAATCTCGGCGGACACGTCGAAAAACACTGCGTACTTGCAGATGAATAGCCTCCGCGCAGAAGATACTGCGGTGTATTACTGCTCCCGCTGGGGAGGTGATGGCTTCTATGCGATGGACTATTGGGGACAAGGAACACTTGTAACGGTCAGCTCGGCCAGCACCAAGGGGCCGTCCGTGTTTCCCCTCGCCCCCTCGTCGAAGTCAACTAGCGGCGGAACAGCCGCCCTTGGTTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTCACGGTGTCATGGAACTCGGGAGCATTGACTTCGGGTGTGCATACATTTCCCGCAGTGCTCCAGTCATCAGGACTGTATAGCCTCTCGTCCGTCGTAACGGTCCCGTCATCGTCGCTCGGGACCCAGACATACATTTGCAATGTCAACCACAAACCTTCGAATACAAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGTGACAAGACGCACACATGTCCTCCATGCCCTGCGCCTGAGTTGCTGGGAGGGCCGAGCGTGTTCCTCTTTCCTCCCAAGCCGAAGGACACACTGATGATTTCGAGGACGCCTGAGGTAACTTGCGTGGTAGTAGATGTGTCCCATGAGGACCCCGAAGTAAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGTGTGGAGGTCCACAATGCCAAAACCAAACCGCGCGAAGAGCAATACAACAGCACATATCGGGTGGTGAGCGTGCTCACCGTCTTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAAGAGTACAAATGTAAAGTATCAAACAAAGCGCTCCCCGCACCCATTGAAAAGACTATCTCAAAGGCTAAGGGACAGCCCAGAGAGCCACAAGTCTACACGCTCCCGCCCTCGAGAGATGAGTTGACGAAGAATCAGGTCAGCCTTACGTGCCTCGTCAAAGGGTTTTACCCATCCGACATTGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGACAGCCAGAGAACAACTACAAGACTACACCGCCTGTGCTGGACTCGGATGGTTCGTTCTTCCTCTACTCGAAATTGACTGTGGACAAATCCCGCTGGCAGCAGGGAAATGTGTTCTCGTGTAGCGTAATGCATGAAGCGTTGCACAATCACTATACCCAGAAATCGCTCTCCCTTTCGCCTGGCTAATGA。

优化好的编码Herceptin的重链的序列2（PH-H2）：

ATGGAGTTCTGGTTGTCATGGGTCTTTCTGGTAGCTATTCTTAAGGGAGTACA GTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCAGGAGGATCACTGAGGCTGTCCTGCGCCGCTAGCGGTTTCAACATCAAGGACACCTACATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCACGCATCTATCCAACTAATGGGTACACCAGATATGCCGACTCTGTGAAGGGTCGGTTTACCATTTCTGCTGATACAAGTAAAAACACTGCCTACCTGCAGATGAATTCACTGCGAGCCGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCAGTCGTTGGGGGGGTGACGGATTCTACGCTATGGATTATTGGGGGCAGGGTACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCATCAACAAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCACTGGCCCCCTCTAGTAAAAGCACCTCTGGCGGAACAGCAGCCCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCAGTCACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCCCTGACATCCGGAGTCCATACTTTTCCTGCTGTGCTGCAATCATCCGGCCTGTACAGCCTGAGCTCTGTGGTCACTGTCCCAAGTTCATCCCTGGGAACTCAGACCTATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCATCCAATACCAAAGTCGACAAGAAAGTGGAACCCAAGAGCTGTGATAAAACACATACTTGCCCACCTTGTCCTGCACCAGAGCTGCTGGGAGGTCCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCTAAAGACACCCTGATGATTTCTCGAACTCCAGAAGTCACCTGCGTGGTCGTGGACGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTCGAGGTGCATAATGCTAAGACAAAACCAAGAGAGGAACAGTACAACAGCACTTATCGCGTCGTGTCTGTCCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATATAAGTGCAAAGTGAGCAATAAGGCTCTGCCCGCACCTATCGAGAAAACAATTTCTAAGGCTAAAGGCCAGCCTAGGGAACCACAGGTGTACACTCTGCCTCCATCTCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGTCTGACATGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCTCCGATATCGCAGTGGAGTGGGAAAGCAATGGACAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGGAGTTTCTTTCTGTATAGTAAGCTGACCGTGGATAAATCACGGTGGCAGCAGGGTAATGTCTTTAGTTGTTCAGTGATGCATGAGGCACTGCACAATCACTATACCCAGAAATCGCTCTCCCTTTCGCCTGGCTAATGA。

未经优化的编码Herceptin的重链的序列（PH-HC）：

ATGGAGTTCTGGTTGTCATGGGTCTTTCTGGTAGCTATTCTTAAGGGAGTACAGTG TGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATACCTATATTCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCGCGCATTTATCCGACCAACGGCTATACCCGCTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCGCGGATACCAGCAAAAACACCGCGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCAGCCGCTGGGGCGGCGATGGCTTTTATGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCGAGCACCAAAGGCCCGAGCGTGTTTCCGCTGGCGCCGAGCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGCACCGCGGCGCTGGGCTGCCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCGCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTTCCGGCGGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAACGTGAACCATAAACCGAGCAACACCAAAGTGGATAAAAAAGTGGAACCGAAAAGCTGCGATAAAACCCATACCTGCCCGCCGTGCCCGGCGCCGGAACTGCTGGGCGGCCCGAGCGTGTTTCTGTTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTAGCCGCACCCCGGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCGGAAGTGAAATTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAAGTGCATAACGCGAAAACCAAACCGCGCGAAGAACAGTATAACAGCACCTATCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAATATAAATGCAAAGTGAGCAACAAAGCGCTGCCGGCGCCGATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCGAAAGGCCAGCCGCGCGAACCGCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGCGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATATTGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAAACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGAAATCGCTCTCCCTTTCGCCTGGCTAATGA。

优化好的编码Herceptin的轻链的序列1（PH-L1）：

ATGGATATGCGAGTACCCGCACAACTTCTTGGGCTTTTGCTTCTGTGGTTGAG GGGAGCTAGATGTGACATCCAGATGACGCAGTCGCCGTCCTCATTGAGCGCATCCGTGGGAGACAGAGTCACTATTACATGCCGGGCATCCCAAGACGTAAACACGGCCGTCGCCTGGTACCAACAGAAGCCCGGAAAAGCGCCCAAACTGTTGATCTACTCCGCCTCATTTCTGTACAGCGGGGTACCCTCGAGGTTCAGCGGCTCGAGGAGCGGGACGGATTTCACGTTGACAATTTCGTCACTTCAGCCGGAAGATTTTGCGACATACTATTGCCAGCAACACTATACCACACCCCCGACGTTTGGCCAGGGGACCAAAGTCGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCGTCAGTATTCATCTTCCCGCCGTCCGATGAGCAACTCAAGAGCGGAACCGCATCAGTCGTATGCTTGCTCAATAACTTCTATCCGCGAGAGGCGAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGTAATAGCCAGGAATCAGTCACGGAGCAGGATTCAAAGGATTCGACCTATTCCCTCTCGTCGACATTGACGCTGTCGAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTGTACGCTTGTGAAGTGACACACCAGGGCCTTTCATCCCCGGTGACAAAGTCGTTCAATCGCGGGGAGTGTTAATGA；

优化好的编码Herceptin的轻链的序列2（PH-L2）：

ATGGATATGCGAGTACCCGCACAACTTCTTGGGCTTTTGCTTCTGTGGTTGAG GGGAGCTAGATGTGACATTCAGATGACCCAGTCCCCATCCAGCCTGAGCGCATCTGTGGGCGACAGAGTCACTATCACTTGCAGGGCCAGCCAGGATGTGAACACCGCAGTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCAAAGCTCCAAAGCTGCTGATCTACAGTGCATCATTCCTGTATTCAGGAGTGCCCTCCAGGTTTTCCGGGAGCCGGTCTGGTACCGACTTCACACTGACTATCTCTAGTCTGCAGCCTGAGGATTTTGCCACATACTATTGCCAGCAGCACTATACCACACCCCCTACTTTCGGCCAGGGAACCAAAGTGGAGATCAAGCGGACTGTCGCCGCTCCATCCGTGTTCATCTTTCCACCCTCCGACGAACAGCTGAAGAGCGGGACAGCTTCTGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTTTACCCCAGGGAGGCAAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGAATTGCAGAGTGGAAATTCACAGGAGTCCGTGACAGAACAGGACAGCAAAGATTCTACTTATAGTCTGTCATCCACCCTGACACTGTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAAGTCTATGCTTGTGAAGTGACCGACCAGGGGCTGTCCAGTCCGGTGACAAAGTCGTTCAATCGCGGGGAGTGTTAATGA。

未经优化的编码Herceptin的轻链的序列（PH-LC）：

ATGGATATGCGAGTACCCGCACAACTTCTTGGGCTTTTGCTTCTGTGGTTGAG GGGAGCTAGATGTGATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGGATGTGAACACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATAGCGCGAGCTTTCTGTATAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCCGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGCATTATACCACCCCGCCGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGCACCGTGGCGGCGCCGAGCGTGTTTATTTTTCCGCCGAGCGATGAACAGCTGAAAAGCGGCACCGCGAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTTTATCCGCGCGAAGCGAAAGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCGCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAACAGGATAGCAAAGATAGCACCTATAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCGGATTATGAAAAACATAAAGTGTATGCGTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTGACAAAGTCGTTCAATCGCGGGGAGTGTTAATGA。

其中每个轻链1～66位核苷酸片段为该序列的信号肽，其第一个ATG是加入的起始密码子。每个重链1～57位核苷酸片段为该序列的信号肽，其第一个ATG是加入的起始密码子。

实施例2

将实施例1中编码rhHER2-mAb重链和轻链的核酸序列送去DNA2.0（Menlo Park，CA，USA）进行基因合成，得到编码的重组人rhHER2-mAb的重链和轻链的核酸序列，并测序。将编码重组人rhHER2-mAb的重链（PH-H1，PH-H2及PH-HC）使用引物F1（5'-ATGGAGTTCTGGTTGTCATGGG-3'）和引物R1（5'-TCATTAGCCAGGCGAAAGGGAGAGC-3'），轻链（PH-L1，PH-L2及PH-LC）使用引物F2（5'-ATGGATATGCGAGTACCCGCACAAC-3'）和引物R2（5'-TCATTAACACTCCCCGCGATTGAACG-3'）对以上6个基因进行PCR扩增，得到带有突出A碱基的基因序列。其中编码轻链的核苷酸序列的PCR扩增的条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1分钟，34个循环；72℃延伸5分钟；反应体系为：模板DNA100ng、TakaRaLA Taq0.5μl、10×PCR Buffer5μl、50mM dNTP0.5μl、20μM引物F11μl、20μM引物R11μl，用ddH₂O补足50μl。编码重链的核苷酸序列的PCR扩增的条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1.5分钟，34个循环；72℃延伸5分钟，反应体系为：模板DNA100ng、TakaRaLA Taq0.5μl、10×P CR Buffer5μl、50mM dNTP0.5μl、20μM引物F11μl、20μM引物R11μl，用ddH₂O补足50μl。对产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用QIAgen凝胶回收试剂盒（QIAGEN，目录号28704）回收目的片段。

重链的PCR产物（PH-H1，PH-H2及PH-HC）及载体

按照Cloning Kit（Invitrogen货号12744-017）提供方法进行连接。编码轻链的PCR产物（PH-L1，PH-L2及PH-LC）及载体

按照

Cloning Kit（Invitrogen货号K8300-01）提供方法进行连接。将连接后的pCDNA3.3-Prot-PH-LC，pOptiVEC-Prot-PH-HC，pCDNA3.3-Prot-PH-L1，pOptiVEC-Prot-PH-H1，pCDNA3.3-Prot-PH-L2，pOptiVEC-Prot-PH-H2转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（宝生物工程（大连）有限公司）中。将转化细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取质粒克隆至液体LB培养基中培养，260rpm摇菌14小时，由无内毒素的质粒试剂盒（QIAGEN，Cat.no.12381）抽提质粒。获得的编码轻链的质粒pCDNA3.3-Prot-PH-LC，pCDNA3.3-Prot-PH-L1，pCDNA3.3-Prot-PH-L2通过

Cloning Kit提供的如下引物CMV forward（5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’）及TK polyA reverse（5′-CTTCCGTGTTTCAGTTAGC-3′）进行PCR鉴定阳性克隆。获得的编码重链的质粒pOptiVEC-Prot-PH-HC，pOptiVEC-Prot-PH-H1，pOptiVEC-Prot-PH-H2通过

Cloning Kit提供的如下引物CMV forward（5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’）和EMCV IRES reverse（5’-CCTTATTCCAAGCGGCTTCG-3’）进行PCR鉴定阳性克隆。将鉴定的含有pCDNA3.3-Prot-PH-LC，pOptiVEC-Prot-PH-HC，pCDNA3.3-Prot-PH-L1，pOptiVEC-Prot-PH-H1，pCDNA3.3-Prot-PH-L2，pOptiVEC-Prot-PH-H26种质粒的阳性克隆按照体积比1%的比例转接至在250ml LB（含100μg/ml氨苄青霉素）液体培养基中放大培养。质粒克隆由无内毒素的质粒试剂盒（QIAGEN，Cat.no.12381）纯化，再由华大基因公司进行的DNA测序。根据测序结果，分别确认插入片段的序列与设计的完全一致。

实施例3

融合基因在CHO细胞（OptiCHO^TMProtein Express Kit For transfection of CHO DG44Cellsand development of stable cell lines for protein production.货号为A10999-01）中的转染与表达。

取分别转有实施例2构建的重组质粒pCDNA3.3-Prot-PH-LC、pOptiVEC-Prot-PH-HC、pCDNA3.3-Prot-PH-L1、pOptiVEC-Prot-PH-H1、pCDNA3.3-Prot-PH-L2及pOptiVEC-Prot-PH-H2的大肠杆菌（Escherichia coli.）DH5α，分别接种于500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，260rpm振荡培养16小时。用Ultrapure Plasmid PurificationKit（QIAGEN）抽提质粒。

经过优化的重链和轻链以以下5种组合用脂质体法转染CHO细胞

①pCDNA3.3-Prot-PH-LC，pOptiVEC-Prot-PH-HC各100μg；

②pCDNA3.3-Prot-PH-L1，pOptiVEC-Prot-PH-H1各100μg；

③pCDNA3.3-Prot-PH-L1，pOptiVEC-Prot-PH-H2各100μg；

④pCDNA3.3-Prot-PH-L2，pOptiVEC-Prot-PH-H1各100μg；

⑤pCDNA3.3-Prot-PH-L2，pOptiVEC-Prot-PH-H2各100μg。

转染试剂盒是购自Invitrogen公司的FreeStyle^TMMAX Reagent（Invitrogen，货号16447-100）。转染时分别取上述纯化的质粒按照上述组合对CHO细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。将组合1转染获得的细胞库命名为CHO-protH-HCLC，将组合2转染获得的细胞库命名为CHO-protH-H1L1，将组合3转染获得的细胞库命名为CHO-protH-H2L1，将组合4转染获得的细胞库命名为CHO-protH-H1L2，将组合5转染获得的细胞库命名为CHO-protH-H2L2。转染后的CHO细胞经连续3个月的G418及MTX（氨甲喋呤）筛选，其G418浓度为500ng/ml，其MTX浓度梯度为50nM、200nM、500nM、1000nM和1500nM，从50nM开始每两周增加一次浓度，具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行，培养基为LONZA公司12-766Q无蛋白无L-谷氨酰胺的ProCHO5培养基，添加4mM的L-谷氨酰胺；于37℃，5%CO₂培养箱中培养。然后按照有限稀释法进行单克隆化（即将细胞稀释至96孔板，每孔0.5～1个克隆）。总共得到不同载体组合获得的表达目的抗体蛋白的CHO细胞克隆245个。将获得的各个单克隆细胞株以0.5×10⁶个细胞/ml CHO细胞接种于Tubespin-50中旋转振荡培养，培养基为ProCHO5，培养体积为10ml，培养温度为37℃，转速为180rpm，培养72h。

取培养72h的细胞培养上清100μl，3000rpm离心5min收集上清，将上清应用夹心ELISA方法分别检测其融合蛋白的表达量，

夹心ELISA方法具体过程如下：

（1）用包被液（pH9.6、0.1M的碳酸盐缓冲液）稀释羊抗人IgG-Fc（购自美国KPl公司，货号01-10-20）至1μg/ml用于包被抗体，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃过夜。

（2）扣干包被液，用PBST（pH7.4，0.1M的磷酸盐缓冲液+吐温20，吐温20的终浓度为体积百分比0.05%）以300μl/孔加至96孔酶标板内，洗板1次，每次3min。

（3）用质量体积比2%的牛血清白蛋白（BSA）封闭液（为800mg BSA+40ml PBST），以300μl/孔加至板内，室温放置1小时。

（4）扣干封闭液，将封闭好的96孔酶标板用PBST以300μl/孔洗板3次，每次3min。

（5）将稀释好的标准品（Herceptin标准品购自Roche公司，批号：B3416B01）和待测样品用含质量体积比1%BSA的PBST稀释10000倍，均以100μl/孔加至板内，37℃放置1小时。

（6）用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。用含质量体积比1%BSA的二抗稀释液（400mg BSA+40ml PBST）将碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG（Abcam货号：6859）稀释为1μg/ml，以100μl/孔加至板内，37℃放置1小时。

（7）用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。用配制成1.5mg/ml的对硝基苯磷酸二钠显色液（sigma71768-5G），以200μl/孔加至板内，37℃避光放置15min。

（8）用3M NaOH以100μl/孔加至板内终止反应。在405nm波长下读取OD值。

通过标准品做标准曲线，计算样品中rhHER2-mAb的含量。检测时每个样品做3个复孔，取平均值。

采用夹心ELISA法对上述部分克隆rhHER2-mAb的表达量进行测定，具体数据如表1所示。

表1不同重组基因克隆株蛋白表达量比较

以上数据表明，与原始基因序列转染筛选获得CHO-protH-HCLC细胞相比，经CHO偏爱密码子优化的序列重组转染筛选获得CHO-protH-H1L1细胞显著提高了融合蛋白rhHER2-mAb的表达水平，提高的幅度达2倍以上。这在抗体大规模生产中具有重要的经济意义。因此，重组CHO-protH-H1L1细胞库产生的63个克隆又通过ELISA检测表达量结果及细胞生长情况选择蛋白表达量高并且生长状况好的单克隆细胞株19号作为大规模生产的候选细胞株。

实施例4

5L搅拌式生物反应器中补料发酵培养

补料培养基配方：无水氯化钙110mg/L、L-亮氨酸60mg/L、亚油酸0.04mg/L、五水硫酸铜0.0013mg/L、L-赖氨酸盐酸盐90mg/L、硫辛酸0.12mg/L、九水硝酸铁0.03mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚红8mg/L、七水硫酸亚铁0.43mg/L、L-苯丙氨酸34.6mg/L、1,4-丁二胺二盐酸盐0.08mg/L、氯化钾325mg/L、L-丝氨酸26.5mg/L、丙酮酸钠50mg/L、氯化镁27.5mg/L、L-苏氨酸55mg/L、维生素H0.0035mg/L、无水硫酸镁44.5mg/L、L-丙氨酸4.15mg/L、D-泛酸钙2.5mg/L、氯化钠6960mg/L、L-天门冬酰胺7.75mg/L、氯化胆碱9mg/L、无水磷酸二氢钠55mg/L、L-天门冬氨酸6.5mg/L、叶酸3mg/L、磷酸氢二钠66mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐17.5mg/L、I-肌醇11.5mg/L、七水硫酸锌0.5mg/L、L-谷氨酸7.5mg/L、烟酰胺2.25mg/L、L-精氨酸盐酸盐147.5mg/L、L-脯氨酸17mg/L、盐酸吡哆醛2mg/L、L-胱氨酸盐酸盐30mg/L、L-色氨酸9mg/L、盐酸吡哆醇0.029mg/L、L-谷氨酰胺365mg/L、L-酪氨酸38mg/L、核黄素0.225mg/L、甘氨酸18.5mg/L、L-缬氨酸50mg/L、盐酸硫胺2.25mg/L、L-组氨酸盐酸盐31.5mg/L、D-葡萄糖3150mg/L、L-异亮氨酸55mg/L、维生素B120.65mg/L。

取所构建筛选得到的重组CHO-protH-H1L1基因的CHO细胞，以约5×10⁵个/ml接种于含4mM谷氨酰胺的proCHO5培养基中，采用50ml Tubespin进行，培养体积为10ml，培养温度37℃，转速为180rpm。在细胞传代扩增过程中，逐级放大培养，经过500ml、1000ml的Schott-Duran摇瓶（含4mM谷氨酰胺的proCHO5培养基为摇瓶体积的1/5）的细胞扩增，当细胞密度达到4×10⁶个/ml时，转移采用5L搅拌式生物反应器中发酵培养（SartoriusD21000466-FE01）进行发酵培养，培养体积为1.5L。在发酵生长中，根据重组CHO细胞生长规律，按照常规方法培养，前48h调节转速90rpm/min，温度保持在37℃，空气流量调节在10L/h，pH值控制在6.9～7.1，溶解氧一直保持在40%。在第3天调整温度为31℃，一罐在整个培养过程中在第3天，第6天，第9天，分别加入补料培养基200mL并每24小时后取样检测细胞密度。在细胞密度达到5×10⁶个/ml后，增大转速至120rpm/min，始终保持溶解氧在40%，维持一定的生长速率。待细胞密度达到8×10⁶个/ml后，继续增大转速至150rpm/min，并维持溶解氧在40%。4℃，3000rpm离心细胞上清8min。

在5L搅拌式生物反应器中发酵培养，每天取样用血球计数板计数法测定细胞密度，用台盼蓝染色法测定细胞活力，用上海荣盛生物有限公司的葡萄糖检测试剂盒（货号361500）检测葡萄糖的浓度，根据所测葡萄糖的浓度来添加葡萄糖，使发酵液中葡萄糖浓度为1～3g/L。用实施例3中的夹心ELISA方法检测蛋白表达量。

结果表明，添加补料培养基后细胞周期可达20天（见图1，图2）；同时在添加补料培养基后，在培养第9天时，细胞最高密度达到8.6×10⁶个/ml，在添加补料培养基后rhHER2-mAb抗体的可达1015mg/L（见图3）。因此本发明所构建的表达rhHER2-mAb抗体的重组CHO细胞在旋转振荡培养方式下，在添加补料培养基后，有着极好的蛋白表达量，可达1.015g/L（见图3）。其在用于蛋白大规模生产中具有极大优势。

实施例5：重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的细胞表面亲和力检测

用ELISA检测重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞（中科院上海细胞库）和人乳腺导管瘤细胞株BT-474细胞（中科院上海细胞库）的细胞表面亲和力。分别用RPMI1640培养基+体积百分比10%的FBS培养SK-BR-3细胞和BT-474细胞备用。

（1）在细胞的对数生长期时用胰酶消化，重悬于新鲜RPMI1640培养基（含胎牛血清FBS，FBS的终浓度为体积百分比10%），调整SK-BR-3细胞的密度至1×10⁶个细胞/ml，BT-474细胞的密度至2×10⁶个细胞/ml，吹打均匀后加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。

（2）37℃，5%CO₂，饱和湿度的条件下培养24h使细胞完全贴壁。

（3）小心移走培养液，用RPMI1640培养基（含体积百分比10%的FBS）稀释纯化后的重组rhHER2-mAb和Herceptin标准品，按不同的浓度梯度分别加入细胞中，50μl/well，37℃孵育1h。

（4）小心移走抗体，PBS（pH7.4、0.1M）溶液洗板3次，300μl/孔，3min/次。

（5）加入固定液（体积百分比0.25%的戊二醛），200μl/孔，室温孵育25min。

（6）倒掉固定液，PBS溶液洗板3次，300μl/孔，3min/次。

（7）加入按体积比1:1000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG（Abcam，6859），100μl/孔，37℃孵育1h。

（8）倒掉抗体，PBS洗板5次，300μl/well，3min/次。

（9）加入1.5mg/ml的对硝基苯磷酸二钠显色液（sigma71768-5G），100μl/孔，37℃避光孵育15min。

（10）加入终止液（3M NaOH），100μl/孔，用酶标仪在405nm的波长下测量OD值。做出亲和力曲线，计算待测样品和Herceptin标准品的细胞表面亲和力。每个样品稀释梯度做3个复孔，取平均值。

检测结果表明，该融合蛋白可以与SK-BR-3细胞和BT-474细胞的细胞表面HER2受体特异性结合，同时检测Herceptin标准品作为对照，测定两者的细胞表面亲和力。经ELISA检测分析，对SK-BR-3细胞，rhHER2-mAb融合蛋白的解离常数为3.0±0.2nM，Herceptin标准品的解离常数为3.3±0.2nM（图4）；对BT-474细胞，rhHER2-mAb融合蛋白的解离常数为3.1±0.2nM，Herceptin标准品的解离常数为2.3±0.3nM（图5），实验结果证明了两者在细胞表面亲和力方面的相似性。

实施例6：重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的细胞外亲和力检测

用ELISA检测重组rhHER2-mAb对HER2蛋白的细胞外亲和力。

（1）稀释HER2蛋白（北京义翘神州生物技术有限公司)至浓度为2.5μg/ml，包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜。

（2）倒掉包被液，PBST洗板1次，300μl/孔，3min/次。

（3）分别加入稀释后的待测样品及Herceptin标准品，100μl/孔，37℃孵育1h。

（4）倒掉抗体，PBST洗板3次，300μl/孔，3min/次。

（5）加入按体积比1:1000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，100μl/孔，37℃孵育1h。

（6）倒掉二抗，PBST洗板5次，300μl/孔，3min/次。

（7）加入显色液，100μl/孔，37℃避光孵育15min。

（8）加入终止液，100μl/孔，用酶标仪在405nm的波长下测量OD值。

通过OD值做出S型曲线，计算待测样品和Herceptin标准品的解离常数。每个样品稀释梯度做3个复孔，取平均值。

结果表明，该融合蛋白可以与HER2蛋白特异性结合，同时检测Herceptin标准品作为对照，测定两者的细胞外亲和力。经ELISA检测分析，rhHER2-mAb融合蛋白的解离常数为0.16±0.01nM，Herceptin标准品的解离常数为0.19±0.01nM，实验结果证明了两者在细胞外亲和力方面的相似性。

实施例7：重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的体内抗肿瘤药效学研究

(1)BT-474乳腺癌移植瘤模型建立：

接种前1天在裸鼠（广东省医学实验动物中心）颈部皮下埋植0.72mg17β-雌二醇缓释片。然后将处于对数生长期的BT-474细胞经胰酶消化，以无血清1640培养液洗涤，调整活细胞浓度为1×10⁷个细胞/mL，与matrigel胶按体积比1∶1混匀后，放于冰盒中携至动物房，接种于裸鼠乳垫，建立肿瘤模型，观察肿瘤生长状况，并绘制生长曲线。

(2)肿瘤体积测量与给药处理：

肿瘤细胞接种后，每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径（L）和短径（W），肿瘤体积（TV）的计算公式为：TV=0.5×L×W²。计算每组裸鼠的移植瘤体积平均值和标准方差。为考察制备的裸鼠移植瘤模型对抗Her2抗体处理的反应，肿瘤长至200mm³时，将荷瘤裸鼠随机分为2组，每组7只，分别按下述方法给药处理：rhHER2-mAb治疗组，给予rhHER2-mAb剂量10mg/kg；PBS对照组，给予PBS；各组均采用腹腔注射给药，每3天给药1次，连续给药30天，实验结束时称量各组裸鼠所荷肿瘤质量。

结果见图6，乳垫接种BT-474细胞后，裸鼠于10天后全部长出体积大于200mm³的肿瘤，且形状较整齐。连续治疗30天后，PBS对照组肿瘤进行性生长，给药组rhHER2-mAb10mg/kg显示出较好的抑瘤作用，治疗期间肿瘤生长停滞，治疗终点瘤体直径与PBS治疗组相比具有统计学差别(P<0.05)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因，其特征在于包含编码轻链的核苷酸序列和编码重链的核苷酸序列：编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因的应用，其特征在于：是将如SEQ ID NO.1所示的编码轻链的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的编码重链的核苷酸序列分别克隆到CHO细胞表达系统上，再共同转染CHO细胞，发酵，诱导表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体；所述的CHO细胞表达系统为真核表达载体

和真核表达载体

3.一种表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞，其特征在于：含有权利要求1所述的编码轻链的核苷酸序列和编码重链的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞，其特征在于通过如下步骤得到：

（1）分别在如SEQ ID NO.1所示的编码轻链的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的编码重链的核苷酸序列的5’端设计上信号肽和起始密码子，再分别在3’端设计上终止密码子，具体如下所示：

设计有信号肽、起始密码子和终止密码子的编码重链的核苷酸序列，命名为PH-H1序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

设计有信号肽、起始密码子和终止密码子的编码轻链的核苷酸序列，命名为PH-L1序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

（2）通过基因合成，得到如步骤（1）所示的PH-H1序列和PH-L1序列；

（3）以PH-H1序列和PH-L1序列为模板，使用PCR后能在得到的产物3'端添加A碱基的酶，通过如下引物分别PCR扩增得到带有突出A碱基的PH-H1序列的PCR产物和带有突出A碱基的PH-L1序列的PCR产物；

重链引物F1：5'-ATGGAGTTCTGGTTGTCATGGG-3'；

重链引物R1：5'-TCATTAGCCAGGCGAAAGGGAGAGC-3'；

轻链引物F2：5'-ATGGATATGCGAGTACCCGCACAAC-3'；

轻链引物R2：5'-TCATTAACACTCCCCGCGATTGAACG-3'；

（4）将带有突出A碱基的PH-H1序列的PCR产物与载体

连接，得到pOptiVEC-Prot-PH-H1重组载体；将带突出A碱基的PH-L1序列的PCR产物与载体

连接，得到pcDNA3.3-Prot-PH-L1重组载体；

（5）将pcDNA3.3-Prot-PH-L1和pOptiVEC-Prot-PH-H1共同转染至CHO细胞，得到表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞。

5.根据权利要求4所述的表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞，其特征在于：

步骤（3）中所述的PCR后能在得到的产物3'端添加A碱基的酶为LA Taq酶；

步骤（3）中所述的PCR扩增的条件如下：

①当模板为PH-HC序列，PCR扩增的条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1.5分钟，34个循环；72℃延伸5分钟；

②当模板为PH-LC序列，PCR扩增的条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1分钟，34个循环；72℃延伸5分钟。

6.一种发酵表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞的方法，其特征在于包含如下步骤：

I、将表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞接种到生长培养基中培养至对数生长期，培养条件如下：温度为36～38℃、转速为170～200rmp，体积分数为5～8%CO₂；

II、接着将步骤I中处于对数生长期的细胞使用生长培养基进行逐级放大；

III、将逐级放大后的细胞转接到5L搅拌式发酵罐中进行培养，培养体积为1.5～2.5L生长培养基；第1天和第2天调节转速70～90rpm/min，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.9～7.1；在第3天调整温度为30～32℃，当细胞密度达到4×10⁶～6×10⁶个/ml，增大转速至120rpm/min；当细胞密度达到7×10⁶～9×10⁶个/ml，增大转速至150rpm/min；溶解氧始终保持为35～45%，葡萄糖浓度始终保持为1～3g/L；

IV、当细胞活力降为40%以下时，放出发酵液，结束发酵；

步骤I中所述的生长培养基为含3.5～4.5mM谷氨酰胺的proCHO5培养基或是含3.5～4.5mM谷氨酰胺、0.08～0.12mM次黄嘌呤和0.015～0.017mM胸腺嘧啶的proCHO5培养基。

7.根据权利要求6所述的发酵表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞的方法，其特征在于：

步骤II中所述的逐级放大的步骤为：依次使用容积为500ml、1000ml的Schott-Duran摇瓶进行培养，加入生长培养基的体积为Schott-Duran摇瓶容积的1/5～1/4、细胞接种后最终浓度为4×10⁵～6×10⁵个/ml、培养温度为36～38℃、转速为170～200rmp；每一级培养至对数生长期就进行转接。

8.根据权利要求6所述的发酵表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞的方法，其特征在于：

步骤III中细胞培养的培养过程中添加补料培养基0.6～1L；所述的补料培养基的配方如下：无水氯化钙100～130mg/L、L-亮氨酸55～70mg/L、亚油酸0.03～0.05mg/L、五水硫酸铜0.0013mg/L、L-赖氨酸盐酸盐87～94mg/L、硫辛酸0.1～0.15mg/L、九水硝酸铁、0.03mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚红7～9mg/L、七水硫酸亚铁0.4～0.45mg/L、L-苯丙氨酸32.0～37.2mg/L、1,4-丁二胺二盐酸盐0.075～0.085mg/L、氯化钾300～350mg/L、L-丝氨酸23～30mg/L、丙酮酸钠45～55mg/L、氯化镁25～30mg/L、L-苏氨酸50～60mg/L、维生素H0.0035mg/L、无水硫酸镁42～47mg/L、L-丙氨酸3.8～4.5mg/L、D-泛酸钙2～3mg/L、氯化钠6920～7000mg/L、L-天门冬酰胺7～8.5mg/L、氯化胆碱8.5～9.5mg/L、无水磷酸二氢钠50～60mg/L、L-天门冬氨酸6～7mg/L、叶酸2.5～3.5mg/L、磷酸氢二钠62～70mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐15～20mg/L、肌醇10～13mg/L、七水硫酸锌0.4～0.6、L-谷氨酸7～8mg/L、烟酰胺1.5～3mg/L、L-精氨酸盐酸盐140～155mg/L、L-脯氨酸16～18mg/L、盐酸吡哆醛1.5～2.5mg/L、L-胱氨酸盐酸盐25～35mg/L、L-色氨酸8～10mg/L、盐酸吡哆醇0.025～0.033mg/L、L-谷氨酰胺350～380mg/L、L-酪氨酸34～42mg/L、核黄素0.2～0.25mg/L、甘氨酸17～20mg/L、L-缬氨酸45～55mg/L、盐酸硫胺2～2.5mg/L、L-组氨酸盐酸盐28～35mg/L、D-葡萄糖3100～3200mg/L、L-异亮氨酸50～60mg/L、维生素B120.5～0.8mg/L。

9.根据权利要求8所述的发酵表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞的方法，其特征在于：所述的补料培养基为在培养过程中第3、6、9天添加，每次按1.5L生长培养基加入200ml补料培养基的量添加补料培养基。

10.根据权利要求6所述的发酵表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞的方法，其特征在于：

步骤I中所述的培养为使用50ml Tubespin旋转振荡培养；

步骤III中所述的5L搅拌式发酵罐为Sartorius D21000466-FE01发酵罐。

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