CN105229027A - Nme抑制剂以及应用nme抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了蛋白质的NME家族的抑制剂。

Description

NME抑制剂以及应用NME抑制剂的方法
技术领域
本申请涉及蛋白质的NME家族的抑制剂。本申请还涉及使用抑制剂的方法。
背景技术
近年来，为细胞毒性剂的抗癌药物已被‘智能’药物所替代或增强，其中上述‘智能’药物靶向直接或间接地促进癌细胞生长的特定分子。理想地，相比于在健康细胞中，靶向分子被更多表达在癌细胞中。甚至更优选的将是这样的药物，其靶向几乎完全表达在癌细胞或癌性组织中并且不表达在健康成人组织中的的分子。在这种情况下，靶分子可以有效地被禁止而没有显著伤害患者的健康组织。
本发明人先前报道了他们的发现，NME蛋白是MUC1*生长因子受体的配体以及这些配体-受体对介导干细胞和癌细胞的生长(Mahantaetal,2008,Hikitaetal,2008,Smaggheetal,2013)。在此之前，NM23-H1和NM23-H2(NME1和NME2)已被暗示为在分化中具有作用，然而，文献充满矛盾的报告(Lombardietal,1995)。主要地，NM23已被确定为抑制因子，其防止白血病细胞达到终末分化，其是疾病的标志(Okabe-Kado,J.,etal.1985,Okabe-Kado,J.,etal.1992,Okabe-Kado,J.,etal.1995)。然而，在发明人的公开内容(NM23-H1和H-2是MUC1*生长因子受体的配体，经由配体诱导的MUC1*的胞外域的二聚化，其促进干细胞和癌细胞生长)之前，不知道NM23如何涉及分化，或更重要的是，它必须是二聚体，或二聚化它的靶受体，以具有活性。本发明人表明，二聚体NM23结合于并二聚化在癌细胞和干细胞上的MUC1*，以及分别促进癌症生长和存活或生长和多能性。NM23四聚体或六聚体并不结合于MUC1*受体的PSMGFR区并具有与二聚体相反的功能。六聚体NM23诱导干细胞的分化。
类似地，许多研究人员尝试开发靶向MUC1的药物。然而，直到本发明人发现，正是所谓的MUC1*的切割形式，其具有主要由PSMGFR序列构成的胞外域，充当生长因子受体并由配体诱导的二聚化所激活，才知道MUC1如何相关与癌症(如果真会发生的话)。事实上，基本上开发抗癌疗法的所有其他尝试针对靶向胞外域的串联重复的MUC1，本发明人表明，其流出和释放自细胞表面。直到那时，传统观点是，MUC1被切割，但包含串联重复的切割部分下来并结合于仍然附着于细胞表面的跨膜片段，从而形成异二聚体(Ligtenbergetal,1990,BaruchAetal.(1999)。本发明人表明，是不真实的，因为利用仅识别切割形式，MUC1*，的抗体，或仅结合于流出区(串联重复或‘核心’)的抗体进行的癌性组织的双染实验揭示了，染色切割形式的抗体并不与结合于串联重复的抗体共定位。
事实上，癌性组织的大多数膜染色对于具有完整串联重复域的MUC1呈阴性或最小阳性，但对于修剪MUC1*形式则是高度阳性的。这些实验表明，当MUC1被切割时，庞大的胞外域释放自细胞表面(Mahanta,etal,2008)。
除抗癌药物之外，在开发抗癌疫苗方面已经有许多失败的尝试。问题在于，机体的免疫系统将产生针对“自我”的抗体，其将破坏在健康组织上以及在任何未来癌性组织上的靶。已进行多次尝试来开发靶向MUC1的抗癌疫苗。然而，在每个失败的尝试中，被靶向的MUC1分子的部分是‘核心’，还被称为串联重复域，本发明人先前表明，其来自癌细胞的表面(KroemerGetal,2013)。
发明内容
在一个方面，本发明涉及这样的抗体，其优先识别癌细胞但并不识别健康细胞，其中MUC1被修剪成生长因子受体形式。
在另一个方面，本发明涉及靶向NME蛋白的抗体。
在本发明的另一个方面，抗体靶向NME蛋白，其优先表达在早期生命中并在小得多的程度上表达在成年生活中。优选地，这些NME蛋白以高水平存在于干细胞中但不存在于成体细胞中。
在本发明的另一个方面，抗体靶向NME蛋白，其优先表达在胚胎发育的非常早期阶段中或表达在初始态干细胞中，但不表达或以较低水平表达在成体组织中。
在本发明的另一个方面，产生靶向NME1的抗体。
在本发明的另一个方面，产生靶向NME6的抗体。
在本发明的另一个方面，产生靶向NME1或NME6的抗体，其中它们抑制二聚化。
在本发明的另一个方面，产生靶向NME7的抗体。
在本发明的一个方面，产生的识别NME蛋白的抗体还抑制它的二聚化。在本发明的另一个方面，产生的识别NME蛋白的抗体抑制它与MUC1的相互作用。在本发明的又一方面，产生的识别NME蛋白的抗体抑制它与MUC1*的相互作用或它与PSMGFR肽的相互作用。
在本发明的又一方面，产生抗体，其结合于MUC1*并抑制它与NME蛋白的相互作用。在一个方面，它们抑制在MUC1*和NME7之间的相互作用，但不抑制在MUC1*和NME1之间的相互作用。
在本发明的一个方面，在患者外部产生抗体，例如，在动物中，在细胞中，或人工产生抗体，其中包括利用噬菌体展示或结合测定。在本发明的另一个方面，在患者中产生抗体，其中单独或组合给予靶向蛋白的部分，其中可以添加佐剂，供用作疫苗。
在一个方面，本发明涉及抑制NME家族成员蛋白的功能的药剂。上述剂可以是抗体，如Fab，单价、二价的，或IgM，双特异性的，人或人源化的。或，上述剂可以是小分子。在一个方面，可以寻求被抑制的NME家族成员蛋白的功能可以是NME家族成员蛋白的以下能力：促进干细胞增殖和/或抑制分化；促进癌细胞增殖和/或抑制分化；结合于MUC1*；结合于DNA；充当转录因子；由细胞分泌；或形成二聚体。尤其是，NME家族成员可以优选是NME7或NME7-AB。
上述剂可以是抑制NME7或NME7AB的致瘤活性的抗体。优选地，NME家族成员可以是具有25至33kDa之间的分子量的NME7的变体。可替换地，NME家族成员可以是NME6或NME1。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予患者有效量的抑制NME家族成员蛋白的致瘤活性的药剂。NME家族成员蛋白可以优选是NME7、NME6、或NME1。在一种实施方式中。上述剂可以抑制NME7活性，但不抑制NME1活性。在另一种实施方式中，上述剂可以抑制在NME7和MUC1*之间的结合。或，上述剂可以抑制在NME7和它的同源核酸结合位点之间的结合。在又一种实施方式中，上述剂可以是抗体。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予患者有效量的NME1，作为六聚体。NME1多肽可以是偏好六聚体状态的突变体或变体。
在又一个方面，本发明涉及用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予患者有效量的NME6，作为单体。在一种实施方式中，NME6可以是偏好单体状态的突变体或变体。
在再一个方面，本发明涉及用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予患者有效量的NME1，作为单体。NME1可以是偏好单体状态的突变体或变体。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予患者有效量的肽或肽模拟物，其抑制NME家族成员与它的同源受体的相互作用。在一种实施方式中，同源受体可以是MUC1。在另一种实施方式中，肽可以源自MUC1、PSMGFR、N-10PSMGFR、N-15PSMGFR、或N-20PSMGFR的MUC1*部分。
在另一个方面，本发明涉及用于分类癌症或分层患有或怀疑患有癌症的患者的方法，包括以下步骤：(i)分析患者样品中干细胞或祖细胞基因或基因产物的存在；以及(ii)对共享干细胞或祖细胞基因或基因产物的类似表达或表达水平有患者进行分组。
上述方法可以进一步包括步骤(iii)：用抑制那些干细胞或祖细胞基因或基因产物的药剂来治疗患者。可替换地，上述方法可以包括以下步骤：(iii)分析干细胞或祖细胞基因或基因产物以评估癌症的严重程度，其中是早期干细胞或祖细胞状态的特征的基因或基因产物的表达或较高表达表明更具攻击性癌症，以及是晚期祖细胞状态的特征的基因或基因产物的表达或较高表达则表明较少攻击性癌症；(iv)设计相应与治疗如在步骤(iii)中确定的患有更具或较少攻击性癌症的患者的疗法；以及(v)用按照在步骤(iv)中设计的疗法来治疗患者。在这样的方法中，患者样品可以是血液、体液、或活检。以及基因或基因产物可以是NME家族蛋白。在一种实施方式中，指示早期干细胞状态的基因或基因产物可以是NME7或NME6。
在另一个方面，本发明涉及一种药剂，其抑制NME家族成员蛋白和MUC1跨膜蛋白(其胞外域缺乏串联重复域)的相互作用，其中，相比于它结合于MUC1跨膜蛋白(其胞外域缺乏在成年健康细胞上存在的串联重复域)，上述剂以更高亲和力结合于在癌细胞上的MUC1*。在一种实施方式中，上述剂可以包括但不限于抗体、天然产物、合成化学品或核酸。在一种实施方式中，NME家族成员蛋白可以是NME7、NME6或细菌NME。
在另一个方面，本发明涉及抑制NME家族成员蛋白和MUC1跨膜蛋白(其胞外域缺乏在细胞中的串联重复域)的相互作用的方法，上述方法包括使细胞接触一种药剂，相比于它结合于MUC1跨膜蛋白(其胞外域缺乏在成年健康细胞上的串联重复域)，上述剂以更高亲和力结合于在癌细胞上的MUC1*。在一种实施方式中，上述剂可以包括但不限于抗体、天然产物、合成化学品或核酸。在一种实施方式中，NME家族成员蛋白可以是NME7、NME6或细菌NME。
在另一个方面，本发明涉及用于确定一种药剂的方法，上述剂抑制NME家族成员蛋白和MUC1跨膜蛋白(其胞外域缺乏串联重复域)的相互作用，其步骤可以包括确定上述剂对在癌细胞上存在的MUC1*的亲和力，确定上述剂对在干细胞或祖细胞上存在的MUC1*的亲和力，以及选择一种药剂，相比于它结合于在干细胞或祖细胞上存在的MUC1*的能力，其更好地结合于在癌细胞上存在的MUC1*，从而确定上述剂。在一种实施方式中，上述剂可以包括但不限于抗体、天然产物、合成化学品或核酸。在另一种实施方式中，干细胞或祖细胞可以是胚胎干细胞、iPS细胞、脐带血细胞、骨髓细胞或造血祖细胞。在一种实施方式中，NME家族成员蛋白可以是NME7、NME6或细菌NME。
在另一个方面，本发明涉及转基因哺乳动物，其在生殖细胞和体细胞中表达人NME蛋白，其中生殖细胞和体细胞包含核酸，其编码引入所述哺乳动物的人NME。因此，人NME重组表达在转基因哺乳动物中。当然，转基因哺乳动物可能不是人。在转基因哺乳动物中，可以优选地可诱导地表达NME蛋白。NME蛋白可以优选是NME7或NME7-AB。
在又一个方面，本发明涉及用于产生哺乳动物的方法，上述哺乳动物以更加紧密地近似于人的响应的方式响应癌症，其中哺乳动物是其中表达人NME蛋白的哺乳动物。癌症可能是自发产生的或移植自培养的细胞或人类。在一种实施方式中，NME蛋白可以是NME1二聚体或NME7单体。在另一个方面，哺乳动物可以是转基因的，其中哺乳动物可以在生殖细胞和体细胞中表达人MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞和体细胞包含引入所述哺乳动物的重组人MUC1或MUC1*或NME蛋白基因序列。优选地，可诱导地表达NME蛋白。仍然优选地，NME蛋白可以是NME7或NME7-AB。
在另一个方面，本发明涉及用于增加在哺乳动物中人肿瘤的植活的方法，包括，在将细胞注入测试哺乳动物之前，混合人肿瘤细胞和NME1二聚体或NME7单体。
在又一个方面，本发明涉及用于产生抗体的方法，包括将NME家族蛋白或其肽片段注入哺乳动物并收获抗体或产生抗体的细胞。优选地，NME家族蛋白可以是NME7或NME7-AB或NME1。优选地，肽片段可以选自SEQIDNO:88-140，更优选88-133，更优选88-121。
在另一个方面，本发明涉及用于产生或选择抗体或抗体样分子的方法，上述抗体或抗体样分子特异性地结合于NME家族蛋白或其肽片段，上述方法包括：(i)借助于NME家族蛋白或肽片段来筛选抗体库或抗体片段或表位的库；(ii)测定与NME家族蛋白或其肽片段的结合；以及(iii)确定特异性地结合的抗体或抗体样分子。上述方法可以进一步包括设计确定的抗体或抗体样分子，用于利用在本领域中众所周知的方法来给予患者以治疗或预防癌症。NME家族蛋白可以是NME7或NME7-AB或NME1。优选地，肽片段可以选自SEQIDNO:88-140，更优选88-133，更优选88-121。
在又一个方面，本发明涉及用于预防癌症的方法，其中通过用NME家族蛋白或其肽片段对人进行接种。在一种实施方式中，肽片段可以包括其序列存在于NME家族蛋白中的一种或多种肽，其可选地与载体、佐剂混合或附着于免疫原性剂。NME家族蛋白可以是NME1、NME6、NME7或NME7-AB。优选地，肽片段可以选自SEQIDNO:88-140，更优选88-133，更优选88-121。在一种优选实施方式中，肽序列不是人NME-H1蛋白的片段。
附图说明
依据下文给出的详细描述、以及附图，将更全面地理解本发明，其是仅通过说明的方式来给出。因而并不限制本发明，以及其中：
图1是测得的作为二价或单价抗体浓度的函数的癌细胞生长的曲线图，其示出，正是MUC1*受体的二聚化刺激生长。通过添加二价(Ab)抗MUC1*刺激MUC1阳性乳癌细胞ZR-75-30的生长，而通过添加单价Fab抑制MUC1阳性乳癌细胞ZR-75-30的生长。二价抗体的添加产生特征钟形生长曲线，其指示生长因子受体二聚化。MUC1阴性HEK293细胞的生长并不受到二价或单价Fab抗MUC1*的影响。当过量添加二价抗体时，一个二价抗体结合于每个受体，而不是一个二价抗体使每两个受体二聚化，因而抑制生长。
图2是在用媒介物(媒介物，vehicle)或MN-E6抗MUC1*抗体的Fab进行治疗以后，植入nu/nu雌性小鼠的T47D乳癌细胞的肿瘤容积测量结果的曲线图。发现，在减小肿瘤体积方面，抗MUC1*E6抗体的效力是统计上显著的，具有0.0001的p值。
图3A-图3D.Western印迹(蛋白质印记)凝胶的照片，其示出在以下细胞裂解液中NME1或NME7的表达：1)BGO1V人胚胎干细胞，其在NM23-H1二聚体中、在涂有MUC1*抗体表面(MN-C3mab)的表面上培养；2)BGO1V人胚胎干细胞，按照标准协议，其在bFGF中、在一层小鼠饲养细胞(MEF)上培养；3)T47D乳癌细胞，通过标准方法在RPMI培养基中培养；以及4)重组人NM23-H1野生型，“wt”(A,B)。底行(C,D)示出“拉下”(“pull-down”)测定或免疫沉淀测定的结果，其中用珠来分别孵育细胞裂解液，其中将抗体加入MUC1胞质尾区，“Ab-5”。通过SDS-PAGE来分离通过结合于MUC1*肽所捕获的物质，然后用相对于每种相应的NM23蛋白的抗体加以印迹。用NME6进行同样的实验，但数据未示出。
图4A-图4E示出Western印迹的照片，其中探测(probe)来自T47D乳癌细胞、BGO1V和HES-3人ES细胞以及人SC101-A1iPS细胞的细胞裂解液中NME1、NME6或NME7的存在。在所有细胞系中的NME1跑出(ranwith)～17kDa的表观分子量(A)。在所有细胞系中，除HES-3细胞系(在FGF中培养的)以外，可以检测NME7～33kDa物质以及42kDa物质(C,E)。当利用超级信号(SuperSignal)来增强可视化时，在除HES-3细胞系以外的所有细胞系中检测到与NME6特异性抗体反应的物质。
图5A-图5C示出人胚胎干(ES)细胞(A)和诱导多能干(iPS)细胞(B,C)的Western印迹的照片组，其探测NME7的存在。Western印迹显示在细胞裂解液中存在三种形式的NME7。一种具有以下表观分子量：～42kDa(全长)，～33kDa(NME7-AB域，其缺乏N端DH域)以及小～25kDa物质。然而，仅较低分子量物质是在条件培养基中(B)。
图6A-图6C.(A)是NME7-AB的尺寸排阻色谱纯化的洗脱曲线；(B)是来自NME7-AB峰值级分的非还原SDS-PAGE凝胶；(C)是纯化的NME7-AB的尺寸排阻色谱的洗脱曲线。
图7A-图7C示出纳米颗粒结合测定的照片，其中MUC1*胞外域肽被固定在SAM涂覆的纳米颗粒上，并添加NME蛋白(游离在溶液中)。从粉红色到蓝色的颜色变化表明，游离在溶液中的蛋白质可以同时结合于在两个不同纳米颗粒上的两个肽。
图8示出来自ELISA夹心测定的HRP信号的曲线图，其示出NME7-AB使MUC1*胞外域肽二聚化。
图9A-图9D是接种后第1天在重组NME7-AB或重组NM23(NME1)纯化二聚体中培养的人iPS干细胞的放大照片。
图10A-图10D是接种后第3天在重组NME7-AB或重组NM23(NME1)纯化二聚体中培养的人iPS干细胞的放大照片。
图11A-图11D示出免疫细胞化学实验的照片，其示出，在NME7-AB中培养10代或更多代的人HES-3干细胞对于多能性标志物NANOG(A)、OCT3/4(B)、Tra1-81(C)和SSEA4(D)呈阳性。
图12A-图12C是用抗体染色的HES-3胚胎干细胞的照片，其中上述抗体识别在组蛋白3上的三甲基化的赖氨酸27，如果细胞已从初始态进展到始发态(primed)，其中相对于两个X的活性染色体(XaXa)，一个X染色体被失活(XaXi)，则其形成浓缩点。A)首先在FGF培养基中、在MEF饲养细胞上培养细胞(XaXi)，B)然后在NME7中生长10代(XaXa)，C)然后回到FGF-MEF中，经4代(XaXi)。
图13A-图13G是没有用任何东西(行A)、用Taxol(紫杉醇)(行B)或抗NME7抗体(行C-行E)处理的MUC1*阳性癌细胞的照片；曲线图示出在48小时时响应于处理的细胞计数(F)，并且斑点印迹用来估算在癌细胞抑制实验中使用的抗体浓度(G)。
图14A-图14K示出使用抗NME7抗体来抑制癌细胞生长的实验的48小时结果。示出在以下条件下培养的细胞的照片：单独培养基(A)、紫杉醇(B)、或在指定浓度下的抗NME7(C-J)；利用钙黄绿素am获得的细胞数目的曲线图(K)。
图15A-图15K示出使用抗NME7抗体来抑制癌细胞生长的实验的96小时结果。示出在以下条件下培养的细胞的照片：单独培养基(A)、紫杉醇(B)、或在指定浓度下的抗NME7(C-J)；利用钙黄绿素am获得的细胞数目的曲线图(K)。曲线图和照片示出在低至纳摩尔范围内的浓度下抗NME7抗体抑制癌细胞生长。
图16示出天然的非变性凝胶，其显示NM23-WT与重组NM23-S120G的三种不同制剂的多聚化状态。
图17A-图17G.(A)示出NM23-WT、NM23-S120G-混合的、NM23-S120G-六聚体和NM23-S120G-二聚体的非还原凝胶的照片，其示出野生型蛋白和S120G突变体的三种不同制剂的多聚化状态。图17B示出结合于MUC1*胞外域肽(PSMGFR)(其附着于SPR芯片表面)的不同的NM23多聚体的表面等离子体共振(SPR)测量结果。图17C示出纳米颗粒实验的照片，其示出仅NM23二聚体结合于同源受体MUC1*。MUC1*胞外域肽被固定在金纳米颗粒上。图17D-图17G示出不同的NM23-H1多聚体，其针对它们支持多能性干细胞生长的能力进行测试。
图18是动画，其示出NME7、NME1二聚体和NME1六聚体的表达的时机(timing)以及它们的相关的癌症/干细胞因子的表达水平，其来自本文描述的实验的分析。
图19A-图19I示出ELISA测定的结果的曲线图，其中示出人NME6结合于MUC1*胞外域的PSMGFR肽。通过FPLC将重组NME6-wt分离为单体或多聚体，然后通过ELISA来测定结合于PSMGFR肽的表面的能力(A)。按照CMC(临界胶束浓度)的级分，通过在SDS中的稀释，来解离NME6多聚体，然后通过ELISA来测定结合于PSMGFR肽的表面的能力(B)。通过模拟NME1S120G突变，其偏好二聚体形成并且是在NME6中的S139G(通过序列对比)，来产生被设计成偏好二聚化的NME6突变体。制备第二突变体，其中通过突变残基以致在上述关键区域中人NME6被转化以看起来像海绵NME6，其已被报道作为二聚体存在。表达和纯化这些重组突变体，然后针对结合于PSMGFR肽的表面的能力进行测定(C)。D-I是聚丙烯酰胺凝胶的照片，其证明各种重组人NME6蛋白的表达。D)NME6wt被表达。E)带有S139G突变的NME6被表达，其对应于在NME1中的S120G突变。F)人NME6，带有突变S139A、V142D、和V143A，以模拟海绵NME6，其被报告为二聚体。G,H)单链人NME6，其具有通过(GSSS)3接头连接的2个域。I)利用针对MUC1的C端的抗体进行的拉下测定。在凝胶上分离结合于MUC1的蛋白质，然后借助于相对于NME6的抗体进行探测。凝胶表明，在T47D乳癌细胞中，BGo1v和HES-3人胚胎干细胞、人iPS细胞均表达结合于MUC1的NME6。
图20A-图20D示出Western印迹的照片，其中对于NME7(A,B)或NME1(C,D)的存在探测来自T47D乳癌细胞、BGO1V和HES-3人ES细胞以及人SC101-A1iPS细胞的细胞裂解液(A,C)或细胞核部分(B,D)。
图21是在MUC1阳性T47D乳癌细胞、MUC1阳性DU145前列腺癌细胞和MUC1阴性PC3前列腺癌细胞中NME1、NME6、NME7和MUC1的实时PCR测量结果的图。测量结果是相对于18S核糖体RNA并且归一化到T47D细胞的测量结果。两种MUC1阳性癌细胞系均具有较高的NME7。MUC1阴性细胞系没有可检测的NME1、NME7或MUC1，但具有NME6的非常高的表达。
图22是Western印迹的照片，其中对于NME7的存在探测干细胞裂解液(奇数泳道)或细胞条件培养基(偶数泳道)。如下培养iPS(诱导多能干)细胞：在FGF中、在MEF上(泳道1,2)，在NM23-H1二聚体中、在抗MUC1*抗体(C3)表面上(泳道3,4)，或在NME7中、在抗MUC1*抗体(C3)表面上(泳道5-8)。如下培养HES-3(人胚胎干)细胞：在FGF中、在MEF上(泳道9,10)，在NM23-H1二聚体中、在抗MUC1*抗体(C3)表面上(泳道11,12)，或在NME7中、在抗MUC1*抗体(C3)表面上(泳道13,14)。还探测小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞(泳道15,16)。Western印迹表明，细胞裂解液包含分子量为～42kDa的NME7物质，其对应于全长蛋白质。然而，分泌的物质跑出～33kDa的表观MW，其对应于缺乏N端前导序列的NME7物质。
图23A-图23B是示于图22的同样Western印迹的照片，其然后被剥离并探测是否存在组氨酸标签的物质，其将识别重组NM23-H1，～17kDa和NME7-AB33kDa，其中培养在泳道3-8和11-14中的干细胞。产生的最小染色表明，在图22中检测到的主要NME7物质是由干细胞生产和加工的天然NME7。
图24A-图24B示出利用小鼠单克隆抗体(A)或仅识别N端DM10序列的另一种单克隆抗体(B)、针对NME7的存在探测的各种细胞裂解液和相应的条件培养基的Western印迹的照片。在来自细胞的条件培养基的样品中，缺少DM10特异性抗体与～33kDaNME7物质的结合表明，NME7的分泌形式缺乏大多数(如果不是所有)的N端DM10前导序列。
图25A-图25B.(A)示出来自细菌盐单胞菌藻593(HalomonasSp.593)的NME的聚丙烯酰胺凝胶，其在大肠杆菌中表达并表达为可溶性蛋白和天然二聚体。(B)示出，在ELISA测定中，来自盐单胞菌藻593的NME结合于MUC1*胞外域的PSMGFR肽。
图26示出来自细菌牙龈卟啉单胞菌W83(PorphyromonasgingivalisW83)的NME的聚丙烯酰胺凝胶。
图27A-图27C.(A)示出盐单胞菌藻593细菌NME与人NME-H1的序列对比。(B)示出盐单胞菌藻593细菌NME与人NME7-A域的序列对比。(C)示出盐单胞菌藻953细菌NME与人NME7-B域的序列对比。
图28A-图28D是在10X放大(A,C)或20X(B,D)下，在来自盐单胞菌藻593的细菌NME培养的人胚胎干细胞的照片。
图29是在包含人NME7-AB、人NME1二聚体或来自盐单胞菌藻593的细菌NME的无血清培养基中培养人成纤维细胞以后，测量干/癌细胞标志物OCT4的表达的RT-PCR数据的图形。
图30是在人NME7-AB、人NME1或来自盐单胞菌藻593(’HSP593’)的细菌NME的存在下已经培养的成纤维细胞中干/癌基因OCT4和NANOG的表达水平的RT-PCR测量结果的图。在一些情况下，添加rho激酶抑制剂‘ROCi’以制备附着于表面的非贴壁细胞(那些变成干/癌症样的细胞)。
图31示出在包含二聚体形式的人NME1的无血清培养基中培养18天以后人成纤维细胞的放大4倍的照片。
图32示出在包含二聚体形式的人NME1的无血清培养基中培养18天以后人成纤维细胞的放大20倍的照片。
图33示出在包含来自盐单胞菌藻593的细菌NME的无血清培养基中培养18天以后人成纤维细胞的放大4倍的照片。
图34示出在包含来自盐单胞菌藻593的细菌NME的无血清培养基中培养18天以后人成纤维细胞的放大20倍的照片。
图35示出在包含人NME7-AB的无血清培养基培养18天以后人成纤维细胞的放大4倍的照片。
图36示出在包含人NME7-AB的无血清培养基中培养18天以后人成纤维细胞的放大20倍的照片。
图37示出在没有NME蛋白的标准培养基中培养18天以后人成纤维细胞的放大4倍的照片。
图38示出在没有NME蛋白的标准培养基中培养18天以后人成纤维细胞的放大20倍的照片。
图39是相比于晚期始发态干细胞，在最早期初始态人干细胞中转录因子BRD4和辅因子JMJD6的表达水平的RT-PCR测量结果的图形。
图40是染色质重排因子的表达水平的RT-PCR测量结果的图形，当成纤维细胞回复到诱导多能性状态时，上述染色质重排因子受到抑制，同时其他则在初始态干细胞中以及在一些癌细胞中受到抑制。在已经在人NME7-AB、人NME1或来自盐单胞菌藻593(’HSP593’)的细菌NME的存在下加以培养的成纤维细胞中测量染色质重排基因Brd4、JMJD6、Mbd3和CHD4的表达水平。在一些情况下，添加rho激酶抑制剂‘ROCi’以制备附着于表面的非贴壁细胞(那些变成干/癌症样的细胞)。
图41是在已经在人NME7-AB、人NME1或来自盐单胞菌藻593(’HSP593’)的细菌NME的存在下培养的成纤维细胞中干/癌基因的表达水平的RT-PCR测量结果的复合图形。在一些情况下，添加rho激酶抑制剂‘ROCi’以制备附着于表面的非贴壁细胞(那些变成干/癌症样的细胞)。
图42是在已经在人NME7-AB、人NME1或来自盐单胞菌藻593(’HSP593’)的细菌NME的存在下培养的成纤维细胞中干/癌基因的表达水平的RT-PCR测量结果的复合图形，其中Y轴被压缩以更好地示出具有较小变化的基因的差异。在一些情况下，添加rho激酶抑制剂‘ROCi’以制备附着于表面的非贴壁细胞(那些变成干/癌症样的细胞)。
图43是针对在传统培养基或包含NME7的培养基中培养以后的T47D癌细胞，干细胞标志物和癌症干细胞标志物的基因表达的RT-PCR测量结果的图形，其中，与那些仍然粘附的细胞分开地分析变成非粘附的细胞(漂浮体，floater)。
图44是针对T47D癌细胞的干细胞标志物SOX2和癌症干细胞标志物CXCR4的基因表达的RT-PCR测量结果的图形。在传统培养基或包含NME1二聚体或NME7(NME7-AB)的培养基中培养细胞。分开分析的细胞类型是漂浮细胞、细胞加上Rho激酶抑制剂(+Ri)，其使得所有细胞附着，或在除去漂浮体以后细胞仍然粘附的，其是在不存在rho激酶抑制剂(-Ri)的情况下。
图45是针对T47D乳癌细胞，各种干细胞和假定癌症干细胞标志物的基因表达的RT-PCR测量结果的图形。在传统培养基或包含NME1二聚体(“NM23”)或NME7(NME7-AB)的培养基中培养细胞。分开分析的细胞类型是漂浮细胞、细胞加上Rho激酶抑制剂(+Ri)，其使得所有细胞附着，或在除去漂浮体以后仍然粘附的细胞，其是在不存在rho激酶抑制剂(-Ri)的情况下。
图46是针对DU145前列腺癌细胞，各种干细胞和假定癌症干细胞标志物的基因表达的RT-PCR测量结果的图形。在传统培养基或包含NME1二聚体(“NM23”)或NME7(NME7-AB)的培养基中培养细胞。没有使用Rho激酶抑制剂，这是因为到第2代时，细胞仍然粘附的。
图47是针对DU145前列腺癌细胞，各种干细胞和假定癌症干细胞标志物的基因表达的RT-PCR测量结果的图形。在传统培养基或包含NME1二聚体(“NM23”)或NME7(NME7-AB)的培养基中培养细胞。没有使用Rho激酶抑制剂，这是因为到第2代时，细胞仍然粘附的。
图48是在T47D乳癌细胞中、在最小无血清基础培养基(其中仅添加的因子是‘2i’抑制剂(GSK3-β和MEK抑制剂)或人重组NME7-AB)中培养以后，报道的‘癌症干细胞’或‘肿瘤起始细胞’标志物CDH1(E-钙黏蛋白)、CXCR4、NANOG、OCT4和SOX2、以及MUC1的表达水平的RT-PCR测量结果的图形。加以分析的细胞是那些开始非锚定依赖性地(anchorage-independently)生长的‘漂浮体’的细胞。
图49是在T47D乳癌细胞中、在最小无血清基础培养基(其中仅添加的因子是‘2i’抑制剂(GSK3-β和MEK抑制剂)或人重组NME7-AB)中培养以后，转录因子BRD4和辅因子JMJD6(据报道分别会抑制NME7和诱导NME1)、以及染色质重排因子MBD3和CHD4(据报道会阻滞干细胞多能性的诱导)的表达水平的RT-PCR测量结果的图形。
图50是NME7和来自本文描述的实验的分析的相关因子的相互作用图的动画。
图51是随时间测得的肿瘤体积的曲线图。利用标准方法来植入T47D乳癌细胞(虚线)，或其中细胞50/50vol/vol与NME7-AB混合并在10天以后，用NME7-AB每日注射这些小鼠。
图52示出在培养的癌细胞(T47D)、在FGF、NM23-H1二聚体或NME7中培养的人胚胎干细胞(HES)中，测量对于MMP14、MMP16和ADAM17(其可以将MUC1-全长切割为MUC1*)的RNA的表达的定量PCR测定的图形。
图53是在生长在FGF中的HES-3人胚胎干细胞、生长在人NME7-AB中的HES-3细胞、生长在NME1二聚体中的HES-3细胞、体外T47D乳癌细胞、植入动物的T47D乳癌细胞、体外DU145前列腺癌细胞、植入动物的DU145细胞、和植入动物的1500乳癌细胞中切割酶MMP14、MMP16和ADAM17的表达水平的RT-PCR测量结果的图形，均归一化到在FGF中在MEF上生长的HES-3细胞。
图54是在体外T47D乳癌细胞、生长在FGF中的HES-3人胚胎干细胞、生长在人NME7-AB中的HES-3细胞、生长在NME1二聚体中的HES-3细胞中，切割酶MMP14、MMP16和ADAM17和表达水平的RT-PCR测量结果的图形，均归一化到体外T47D乳癌细胞。
图55是在用媒介物或MN-E6抗MUC1*抗体的Fab治疗60天以后，植入NOD/SCID雄性小鼠的DU145激素难治性前列腺癌细胞的肿瘤容积测量结果的曲线图。从第60天至第70天，交换治疗组。发现，在减小肿瘤体积方面，抗MUC1*E6抗体的效力是统计上显著的，具有0.0001的p值。
图56是在用媒介物或MN-E6抗MUC1*抗体的Fab治疗60天以后，在植入NOD/SCID雄性小鼠的、切除自DU145激素难治性前列腺癌细胞的肿瘤中，切割酶MMP14和MMP16的表达水平的RT-PCR测量结果的图形。虽然阻滞MUC1*生长因子受体的治疗降低了两种切割酶的表达，但仅MMP14是统计上显著的。
图57A-图57B.(A)是在用媒介物或MN-E6抗MUC1*抗体的Fab治疗60天以后Western印迹的照片，其探测在植入NOD/SCID雄性小鼠的、切除自DU145激素难治性前列腺癌细胞的肿瘤中的MUC1*。照片表明，在抗MUC1*Fab治疗的小鼠中，存在较少的MUC1*，即在治疗组中较少的MUC1切割。(B)是在用媒介物或MN-E6抗MUC1*抗体的Fab治疗60天以后，在植入NOD/SCID雄性小鼠的、切除自DU145激素难治性前列腺癌细胞的肿瘤中，微RNA-145的表达水平的RT-PCR测量结果的图形。该图形表明，平均而言，相比于对照组，在治疗组中，miR-145(其向干细胞发进行分化的信号)增加。
图58A-图58D示出FACS实验和结果，其中用干细胞特异性抗MUC1*单克隆抗体或癌细胞特异性单克隆抗体来探测活的癌细胞。(A)MN-C2单克隆抗体，其的选择是基于对N-10肽的结合偏好，显示强烈结合于活的T47D乳癌细胞并且是癌细胞特异性的。(B)MN-C3单克隆抗体，其的选择是基于对C-10肽的结合偏好，显示不结合于活的T47D乳癌细胞并且是干细胞特异性的。C)癌细胞特异性MN-C2结合于DU145前列腺癌细胞。D)干细胞特异性MN-C3并不结合于DU145前列腺癌细胞。E)另一FACS实验的曲线图示出癌细胞特异性单克隆抗体MN-C2和MN-E6结合于DU145前列腺癌细胞，而干细胞特异性MN-C3则没有。
图59A-图59D示出FACS实验的结果，其中用干细胞特异性抗MUC1*单克隆抗体或癌细胞特异性单克隆抗体来探测干细胞或癌细胞。干细胞特异性MN-C3单克隆抗体显示强烈结合于BGO1v人胚胎干细胞(A)，但显示不结合于T47D乳癌细胞(B)，或结合于DU145前列腺癌细胞(C)。另一FACS实验的图形显示，干细胞特异性MN-C3单克隆抗体显示强烈结合于干细胞但并不结合于T47D乳癌细胞、1500乳癌细胞系、DU145前列腺癌细胞、或MUC1阴性PC3前列腺癌细胞(D)。
图60A-图60E示出在普通培养基中培养的DU145前列腺癌细胞的照片，其中向普通培养基添加：没有东西(A)，干细胞特异性MN-C3的Fab(B)，干细胞特异性MN-C8的Fab(C)，癌细胞特异性MN-C2的Fab(D)，或癌细胞特异性MN-E6的Fab(E)。如果抗体识别MUC1*(因为它出现在癌细胞上)，则抗体的Fab将阻止MUC1*的二聚化并诱导细胞死亡。如在照片中可以看到的，干细胞特异性抗体的Fab对癌细胞生长没有影响，而癌细胞特异性抗体的Fab则有效地杀死癌细胞。
图61是在人NME1和人NME7-A或-B域之间的序列对比。
图62列出来自人NME7的免疫原性肽，其具有与NME1的低序列同一性。列出的肽序列被识别为是免疫原性肽，从而产生靶向人NME7但并不靶向人NME1的抗体。选择这样的序列，其缺乏与人NME1的序列同源性，并且可用作NME7特异性肽来产生抑制NME7的抗体，从而用来治疗或预防癌症。
图63列出来自人NME7的免疫原性肽，其对于结构完整性或对于结合于MUC1*可能是重要的。优选这样的二价和双特异性抗体，其中每个可变区结合于NME7的不同的肽部分。可以通过使用不止一种的肽来产生对于两者均具有特异性的抗体，从而产生上述肽。上述肽可用作NME7特异性肽来产生抑制NME7的抗体，从而用来治疗或预防癌症。
图64列出来自人NME1的免疫原性肽，其对于结构完整性或对于结合于MUC1*可能是重要的。列出的肽序列是来自人NME1并且其选择是基于它们与人NME7的高同源性以及它们与能够模拟它的功能的其他细菌NME蛋白的同源性。尤其是，肽50至53具有与人NME7-A或-B以及与HSP593的高同源性。
具体实施方式
定义
如在本文中所使用的，“MUC1*”胞外域主要由PSMGFR序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:6))来定义。由于MUC1切割的确切位点取决于剪掉它的酶，以及切割酶取决于细胞类型、组织类型或细胞进化的时间而变化，所以在N端处MUC1*胞外域的确切序列可能会变化。
如在本文中所使用的，术语“PSMGFR”是用于MUC1生长因子受体的基本序列的首字母缩写词，如阐述为GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:6)。在这方面，如在“N-10PSMGFR”、“N-15PSMGFR”、或“N-20PSMGFR”中的“N-数字”是指在PSMGFR的N-末端处已被删除的氨基酸残基的数目。同样如在“C-10PSMGFR”、“C-15PSMGFR”、或“C-20PSMGFR”中的“C-数字”是指在PSMGFR的C-末端处已被删除的氨基酸残基的数目。
如在本文中所使用的，“MUC1*的胞外域”是指缺乏串联重复域的MUC1蛋白的细胞外部分。在大多数情况下，MUC1*是切割产物，其中MUC1*部分由缺乏串联重复的短胞外域、跨膜结构域和胞质尾区构成。MUC1的切割的精确位置是未知的，也许是因为看起来它可能被不止一种的酶所切割。MUC1*的胞外域将包括大部分的PSMGFR序列，但可以具有另外10-20个N末端氨基酸。
如在本文中所使用的，“NME家族蛋白”或“NME家族成员蛋白”，编号1-10，是组合在一起的蛋白质，因为它们均具有至少一个NDPK(核苷酸二磷酸激酶)域。在一些情况下，就能够催化ATP到ADP的转化而言，NDPK域不是功能性的。NME蛋白以前被称为NM23蛋白，编号H1、H2等。在本文中，术语NM23和NME是可以互换的。在本文中，术语NME1、NME2、NME6和NME7用来指天然蛋白以及NME变体。在一些情况下，这些变体是更加可溶的，在大肠杆菌中更好地表达，或是比天然序列蛋白更加可溶的。例如，如在本说明书中使用的NME7可以指天然蛋白或变体，如NME7-AB，其具有优越的商业应用性，这是因为变化允许在大肠杆菌中高产率表达可溶的、适当折叠的蛋白。如本文所提到的“NME1”与“NM23-H1”是可以互换的。还意在，本发明并不限于NME蛋白的确切序列。在整个申请中，可互换使用突变NME1-S120G，还被称为NM23-S120G。S120G突变体和P96S突变体是优选的，这是由于它们偏好二聚体形成，但可以在本文中称为NM23二聚体或NME1二聚体。
如本文所提到的NME7意指分子量为约42kDa的原生NME7，分子量为25至33kDa的切割形式，缺乏DM10前导序列的变体，NME7-AB或重组NME7蛋白，或其变体，其序列可以被改变以允许有效表达或增加产率、溶解度或其他特性，其使得NME7更有效或商业上更可行的。
本发明公开了这样的抗体和抗体变体，其调节涉及MUC1*的途径，其中一组抗体优先结合于MUC1*(当它存在于干细胞上时)但并不识别在癌细胞上的MUC1*，以及另一组抗体优先结合于MUC1*(当它存在于癌细胞上时)但并不识别在干细胞上的MUC1*。本发明进一步公开了用于确定属于这些类别的其他抗体的方法。本发明进一步公开了用于使用第一组抗体，以下称为“干细胞抗体”，的方法，用于体外和体内刺激干细胞生长。本发明还公开了用于使用第二组抗体，以下称为“癌细胞抗体”，的方法，用于抑制体外和体内癌细胞生长。
在本申请中，癌症特异性抗体MIN-C2(在本文中以及在从其中本申请要求优先权的申请中还称作“C2”)或MIN-E6(在本文中以及在从其中本申请要求优先权的申请中还称作“E6”)是在结构上和序列上和在本申请人的其他申请中相同的抗体(如在本申请中提及的)。这些抗体和它们的CDR序列的描述可以见2009年10月6日提交的WO2010/042562(PCT/US2009/059754)。尤其是，见其中的图11至16。
同样，干细胞特异性抗体2D6C3(在本文中以及在从其中本申请要求优先权的申请中还称作“C3”)或MN-C3或2D6C8(在本文中以及在从其中本申请要求优先权的申请中还称作“C8”)或MN-C8是在结构上和序列上和在本申请人的其他申请中相同的抗体(如在本申请中提及的)。这些抗体和它们的CDR序列的描述可以见2012年3月19日提交的WO2012/126013(PCT/US2012/059754)。尤其是，见其中的图13至18。
如在本文中所使用的，“有效量的用来抑制NME家族成员蛋白的药剂”是指有效量的药剂，其阻碍在NME家族成员蛋白和它的同源受体如MUC1或MUC1*之间的活化相互作用。
如在本文中所使用的，“高同源性”被认为是在指定的重叠区域中在任何两个多肽之间至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或97％同一性。
如在本文中所使用的，“低同源性”被认为在指定的重叠区域中在任何两个多肽之间低于25％、20％、15％、10％、或5％同一性。
如在本文中所使用的，关于被称为“小分子”的药剂，它可以是合成化学品或基于化学的分子，其具有50Da至2000Da的分子量，更优选150Da至1000Da，仍然更优选200Da至750Da。
如在本文中所使用的，关于被称为“天然产物”的药剂，它可以是化学分子或生物分子，只要上述分子存在于自然界。
如在本文中所使用的，“2i抑制剂”是指MAP激酶信号途径的GSK3-β和MEK的小分子抑制剂。在研究文章(SilvaJetal2008)中创造的名称2i，然而在本文中“2i”是指GSK3-β或MEK的任何抑制剂，因为存在许多小分子或生物剂，如果它们抑制这些靶，则具有对多能性或肿瘤发生相同的影响。
如在本文中所使用的，FGF、FGF-2或bFGF是指成纤维细胞生长因子。
如在本文中所使用的，“Rho相关激酶抑制剂”可以是小分子、肽或蛋白质(RathN,etal,2012)。Rho激酶抑制剂在这里和其他地方被缩写为ROCi或ROCKi、或Ri。特异性rho激酶抑制剂的使用意在是示例性的并且可用于替代任何其他rho激酶抑制剂。
如在本文中所使用的，术语“癌症干细胞”或“肿瘤起始细胞”是指这样的癌细胞，其表达一定水平的已连接于更具转移状态或更具攻击性癌症的基因。术语“癌症干细胞”或“肿瘤起始细胞”还可以指这样的癌细胞，当移植到动物中时，为产生肿瘤，需要其少得多的细胞。癌症干细胞和肿瘤起始细胞往往耐化疗药物。
如在本文中所使用的，术语“干/癌症”、“癌症样”、“干细胞样”是指这样的状态，其中细腻获得干细胞或癌细胞的特性，共享干细胞、癌细胞或癌症干细胞的基因表达模式的重要元件。干细胞样细胞可以是经受诱导至较不成熟状态的体细胞，如多能性基因的增加的表达。干细胞样细胞还指这样的细胞，其已经受一定的去分化或处于亚稳态，据此它们可能改变它们的终未分化。癌症样细胞可以是癌细胞，其尚未充分表征但呈现癌细胞的形态和特征，如能够非贴壁依赖性地生长或能够在动物中产生肿瘤。
如在本文中所使用的，术语“抗体样”是指这样的分子，其可以被设计以致它包含抗体的部分但不是将天然存在于自然界中的抗体。实例包括但不限于CAR(嵌合抗原受体)T细胞技术和技术。CAR技术使用融合于T细胞的一部分的抗体表位，以致机体的免疫系统被引导到攻击特定靶蛋白或细胞。技术包括“抗体样”库，其是合成人Fab的集合，然后针对与来自靶蛋白的肽表位的结合来对其进行筛选。然后可以将选择的Fab区设计进入支架或构架，以致它们类似于抗体。
序列列表自由文本
关于不同于a、g、c、t的核苷酸符号的使用，它们遵循在WIPOStandardST.25,Appendix2,Table1中阐述的惯例，其中k表示t或g；n表示a、c、t或g；m表示a或c；r表示a或g；s表示c或g；w表示a或t；以及y表示c或t。
ASANL(SEQIDNO:1)描述了全长MUC1受体(黏蛋白1前体，Genbank登录号：P15941)。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQIDNO:2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTA(SEQIDNO:3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTG(SEQIDNO:4)
SEQIDNO:2、3和4描述了N-末端MUC-1信号序列，其用于将MUC1受体和截短亚型引导到细胞膜表面。在C-末端处可以不存在多达3个氨基酸残基，如由在SEQIDNO:2、3和4中的变体所表明的。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQIDNO:5)描述了截短MUC1受体亚型，其具有在它的N端处的nat-PSMGFR并且包括全长MUC1受体的跨膜和胞质序列。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:6)描述了MUC1生长因子受体的原生基本序列(nat-PSMGFR–“PSMGFR”的实例)：
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:7)描述了MUC1生长因子受体的原生基本序列(nat-PSMGFR–“PSMGFR”的实例)，其具有在SEQIDNO:6的N端处的单个氨基酸缺失)。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:8)描述了MUC1生长因子受体的原生基本序列的“SPY”功能变体，其具有增强的稳定性(var-PSMGFR–“PSMGFR”的实例)。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:9)描述了MUC1生长因子受体的原生基本序列的“SPY”功能变体，其具有增强的稳定性(var-PSMGFR–“PSMGFR”的实例)，具有在SEQIDNO:8的C端处的单个氨基酸缺失)。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQIDNO:10)描述了MUC1胞质域核苷酸序列。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQIDNO:11)描述了MUC1胞质域氨基酸序列。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(SEQIDNO:12)描述了NME7核苷酸序列(NME7：GENBANKACCESSIONAB209049)。
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQIDNO:13)描述了NME7氨基酸序列(NME7：GENBANKACCESSIONAB209049)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQIDNO:14)描述了NM23-H1核苷酸序列(NM23-H1：GENBANKACCESSIONAF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQIDNO:15)NM23-H1描述了氨基酸序列(NM23-H1：GENBANKACCESSIONAF487339)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQIDNO:16)描述了NM23-H1S120G突变体核苷酸序列(NM23-H1：GENBANKACCESSIONAF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQIDNO:17)描述了NM23-H1S120G突变体氨基酸序列(NM23-H1：GENBANKACCESSIONAF487339)。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQIDNO:18)描述了NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2：GENBANKACCESSIONAK313448)。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE(SEQIDNO:19)描述了NM23-H2氨基酸序列(NM23-H2：GENBANKACCESSIONAK313448)。
用于大肠杆菌表达优化的人NM23-H7-2序列：
(DNA)
atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQIDNO:20)
(氨基酸)
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:21)
人NME7-A：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQIDNO:22)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQIDNO:23)
人NME7-A1：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQIDNO:24)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQIDNO:25)
人NME7-A2：
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQIDNO:26)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQIDNO:27)
人NME7-A3：
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQIDNO:28)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQIDNO:29)
人NME7-B：
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQIDNO:30)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:31)
人NME7-B1：
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQIDNO:32)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN—(SEQIDNO:33)
人NME7-B2：
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQIDNO:34)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:35)
人NME7-B3：
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQIDNO:36)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--(SEQIDNO:37)
人NME7-AB：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQIDNO:38)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--(SEQIDNO:39)
人NME7-AB1：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQIDNO:40)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:41)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-A序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQIDNO:42)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQIDNO:43)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-A1序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQIDNO:44)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQIDNO:45)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-A2序列：
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQIDNO:46)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQIDNO:47)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-A3序列：
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQIDNO:48)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQIDNO:49)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-B序列：
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQIDNO:50)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:51)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-B1序列：
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQIDNO:52)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:53)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-B2序列：
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQIDNO:54)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:55)
人NME7-B3序列用于大肠杆菌表达优化的：
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQIDNO:56)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:57)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-AB序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQIDNO:58)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:59)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-AB1序列：
(DNA)
Atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQIDNO:60)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:61)
小鼠NME6
(DNA)
Atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag(SEQIDNO:62)
(氨基酸)
MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWKLEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARYIAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHYSPEEGIHCAAETGGHKQPNKT-(SEQIDNO:63)
人NME6：
(DNA)
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQIDNO:64)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQIDNO:65)
人NME61：
(DNA)
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQIDNO:66)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQIDNO:67)
人NME62：
(DNA)
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQIDNO:68)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQIDNO:69)
人NME63：
(DNA)
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQIDNO:70)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQIDNO:71)
用于大肠杆菌表达优化的人NME6序列：
(DNA)
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQIDNO:72)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQIDNO:73)
用于大肠杆菌表达优化的人NME61序列：
(DNA)
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQIDNO:74)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQIDNO:75)
用于大肠杆菌表达优化的人NME62序列：
(DNA)
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQIDNO:76)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQIDNO:77)
用于大肠杆菌表达优化的人NME63序列：
(DNA)
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQIDNO:78)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQIDNO:79)
OriGene-NME7-1全长
(DNA)
gacgttgtatacgactcctatagggcggccgggaattcgtcgactggatccggtaccgaggagatctgccgccgcgatcgccatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttctctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataatacgcgtacgcggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggcagcaaatgatatcctggattacaaggatgacgacgataaggtttaa(SEQIDNO:80)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTRTRRLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDKV(SEQIDNO:81)
AbnovaNME7-1全长
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQIDNO:82)
Abnova部分NME7-B
(氨基酸)
DRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKIL(SEQIDNO:83)
组氨酸标签
(ctcgag)caccaccaccaccaccactga(SEQIDNO:84)
链霉II标签
(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(SEQIDNO:85)
N-10肽：
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:86)
C-10肽
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQIDNO:87)
源自人NME7的免疫肽：
LALIKPDA(SEQIDNO:88)
MMMLSRKEALDFHVDHQS(SEQIDNO:89)
ALDFHVDHQS(SEQIDNO:90)
EILRDDAICEWKRL(SEQIDNO:91)
FNELIQFITTGP(SEQIDNO:92)
RDDAICEW(SEQIDNO:93)
SGVARTDASESIRALFGTDGIRNAA(SEQIDNO:94)
ELFFPSSGG(SEQIDNO:95)
KFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMA(SEQIDNO:96)
LMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVT(SEQIDNO:97)
EFYEVYKGVVTEYHD(SEQIDNO:98)
EIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNA(SEQIDNO:99)
YSGPCVAM(SEQIDNO:100)
FREFCGP(SEQIDNO:101)
VHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQIDNO:102)
IQNAVHCTD(SEQIDNO:103)
TDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQIDNO:104)
PEDGLLEVQYFFK(SEQIDNO:105)
EIINKAGFTITK(SEQIDNO:106)
MLSRKEALDFHVDHQS(SEQIDNO:107)
NELIQFITT(SEQIDNO:108)
EILRDDAICEWKRL(SEQIDNO:109)
SGVARTDASESIRALFGTDGI(SEQIDNO:110)
SGVARTDASES(SEQIDNO:111)
ALFGTDGI(SEQIDNO:112)
NCTCCIVKPHAVSE(SEQIDNO:113)
LGKILMAIRDA(SEQIDNO:114)
EISAMQMFNMDRVNVE(SEQIDNO:115)
EVYKGVVT(SEQIDNO:116)
EYHDMVTE(SEQIDNO:117)
EFCGPADPEIARHLR(SEQIDNO:118)
AIFGKTKIQNAV(SEQIDNO:119)
LPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQIDNO:120)
GPDSFASAAREMELFFP(SEQIDNO:121)
源自人NME7的免疫肽
ICEWKRL(SEQIDNO:122)
LGKILMAIRDA(SEQIDNO:123)
HAVSEGLLGK(SEQIDNO:124)
VTEMYSGP(SEQIDNO:125)
NATKTFREF(SEQIDNO:126)
AIRDAGFEI(SEQIDNO:127)
AICEWKRLLGPAN(SEQIDNO:128)
DHQSRPFF(SEQIDNO:129)
AICEWKRLLGPAN(SEQIDNO:130)
VDHQSRPF(SEQIDNO:131)
PDSFAS(SEQIDNO:132)
KAGEIIEIINKAGFTITK(SEQIDNO:133)
源自人NME1的免疫肽
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(SEQIDNO:134)
VDLKDRPF(SEQIDNO:135)
HGSDSVESAEKEIGLWF(SEQIDNO:136)
ERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(SEQIDNO:137)
VDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLN(SEQIDNO:138)
NIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELV(SEQIDNO:139)
KPDGVQRGLVGEII(SEQIDNO:140)
NME抑制
申请人先前发现，关键生长因子受体，MUC1*，和它的活化配体，NM23-H1(还被称为NME1)(二聚体形式)，介导大多数实体肿瘤癌症的生长。我们随后发现，这种相同的生长因子/生长因子受体对还介导多能性干细胞的生长。MUC1*，跨膜蛋白，MUC1，的选择性剪接变体或酶促切割形式，表达在所有多能性人干细胞上(Hikitaetal,2008)以及表达在大多数实体肿瘤癌症上(Mahantaetal,2008)。当干细胞分化时，MUC1的切割减弱并且MUC1回复到它的全长静止形式。在干细胞和癌细胞上，MUC1*充当生长因子受体。配体诱导的MUC1*的二聚化促进癌细胞生长，存活，并且可能使得癌细胞耐化疗药物(Fessleretal,2009)。配体诱导的MUC1*的胞外域的二聚化的抑制极大地体外(图1)和体内(图2)抑制癌细胞生长。在干细胞中，配体诱导的MUC1*的二聚化刺激生长和存活，同时抑制分化。干细胞和癌细胞均分泌NM23-H1。在二聚物形式中，NM23-H1二聚化MUC1*的胞外域以使得干细胞可以增殖以及抑制它们的分化。二聚体形式的NME1不仅促进干细胞的生长和多能性，而且诱导人干细胞回复到早期最多能状态，称作“初始态”状态(NicholsJ,SmithA(2009)；Hannaetal,2010；AmitM,etal,2000；LudwigTE,etal2006；XuC,etal,2005；XuRH,etal,2005；Smaggheetal2013)。迄今为止，这是仅有的自然因子，其已表明，当它们存在于极早期胚胎的内细胞团中时，会维持人干细胞处于初始态。
在这里，我们报道以下发现，以前被认为是对于干细胞具有特异性的其他分子还表达在癌细胞中。在胚胎发育期间表达但两次错误地表达在癌细胞中的生长因子和生长因子受体构成极好的治疗靶，因为去能它们将不会对患者具有显著负面影响。因此，将是对现有技术状态的很大的改进的是，确定这样的干细胞生长因子和受体，其在胚胎发育中、在胚胎干(ES)细胞中或在诱导多能干(iPS)细胞中是活性的但在癌细胞中被错误地再活化，以及开发治疗剂，其去能它们或引起它们的表达被抑制。
申请人最近还发现，表达在人干细胞中的许多基因和基因产物还表达在人癌症中。例如MUC1*，跨膜蛋白的选择性剪接变体或酶促切割形式，MUC1*，被表达在所有多能性人干细胞上和在大多数实体肿瘤癌症上。当干细胞分化时，MUC1的切割停止并且MUC1回复到它的全长静止形式。在干细胞和癌细胞上，MUC1*充当生长因子受体。MUC1*的二聚化促进干细胞和癌细胞生长；它抑制干细胞的分化并引起癌细胞回复到较少分化状态。干细胞和癌细胞均分泌二聚物形式的NM23-H1，并二聚化MUC1*的胞外域以使得干细胞增殖并抑制它们的分化。
我们已发现，活性地表达在干细胞中的NME家族成员在癌细胞中被错误地上调。除NM23-H1之外，其他NME家族蛋白作为生长因子和转录因子，其促进干细胞和癌细胞生长并抑制它们的分化。当它是二聚体时，NME1促进干细胞生长和多能性。NME1二聚体还介导MUC1阳性癌细胞的生长和去分化。当干细胞的密度增加以及越来越多的NME1分泌自干细胞时，NME1形成六聚体，其实际上诱导分化，因而停止多能性干细胞生长。已知的是，癌细胞可以表现为比正常成体细胞更少分化的。事实上，癌细胞形态上似乎已经去分化的程度相关于癌症进攻性程度。因此，用六聚体形式的NME1，其将诱导癌细胞的分化并限制它们的自我复制的能力，来治疗患有癌症的患者、或具有发展癌症的风险的患者，是有效的治疗途径。
除NME1之外，NME6和NME7被表达在早期干细胞中和在癌细胞中。对各种各样的人干细胞和癌细胞系进行Western印迹分析，其表明，干细胞和癌细胞均表达和分泌NME1、NME6和NME7。在一项这样的实验中，人胚胎干细胞(BGO1v)和人MUC1*阳性乳癌细胞(T47D)，其中探测细胞裂解液中NME1(NM23-H1)、NME6(数据未示出)、或NME7的存在。图3A和3B示出，在干细胞和癌细胞的裂解液中容易检测到NME1和NME7。以图4D所示的更为敏感的测定来检测NME6，～22kDa。利用结合于MUC1的胞质域的抗体，对干细胞和癌细胞进行拉下测定。图3C和3D的Western表明，NME1和NME7均结合于MUC1，因为它存在于干细胞和癌细胞中。虽然在干细胞和癌细胞中均产生NME7，但我们发现，在细胞内，它存在为全长蛋白质～42kDa。然而，在它被分泌以前，NME7必须被切割。分泌形式似乎是缺乏它的前导序列DM10并具有～33kDa的表观分子量。图5是人胚胎干(ES)细胞(A)和诱导多能干(iPS)细胞(B,C)的Western印迹的一组照片，其中探测NME7的存在。Western印迹表明在细胞裂解液中存在三种形式的NME7。一种具有～42kDa(全长)的表观分子量，～33kDa(NME7-AB域，其缺乏N端DH域)和小～25kDa物质。然而，在条件培养基中仅分泌较低分子量物质(C)。
我们制作了用于人NME7的表达的若干构建体。很好表达在大肠杆菌中的这些构建体的一种以可溶形式作为单体被分泌并大致作为NME1二聚体，其用于促进干细胞生长、多能性和分化的抑制。在此构建体中，从序列省去前导序列“DM10”。这产生这样的物质，其和蛋白质的分泌形式具有大约相同的分子量，33kDa。上述蛋白质被制成组氨酸标签蛋白并首先经NTA-Ni柱，然后通过FPLC加以纯化(大于98％纯度)。我们称这种形式的NME7为NME7-AB。它并不意味着，本发明限于NME7蛋白的确切特性。产生的NME7-AB蛋白可以简单地是天然蛋白质的为它的干/癌症促进功能所需要的最小部分。我们已经证明，NME7-AB以基本上相同于天然加工的NME7的方式发挥作用，如在本文包括的实验和实施例中所证明的。然而，NME7的自然发生的切割位点可能不同于我们开始NME7-ABN端的地方。NME7的抑制剂可作用于在N端处包含DM10的天然蛋白，或可以用来抑制NME7切割成分泌形式。图6A-C示出在通过镍柱纯化以后NME7-AB的FPLC痕迹(A)，未经纯化的蛋白质的SDS-PAGE凝胶(B)，和最终产物的FPLC痕迹(C)。进行纳米颗粒测定，其显示，NME7作为单体可以同时结合于MUC1*胞外域的两个PSMGFR肽(SEQIDNO:6)。组氨酸标签PSMGFR肽被固定在NTA-SAM涂覆的纳米颗粒上。将重组NME7-AB(表达缺乏DM10N端前导序列)，通过FPLC和天然凝胶，其已被证实是单体的，加入纳米颗粒。NME7的添加引起金纳米颗粒溶液从粉红色变成蓝色，其表明，NME7同时结合于在两个分开的纳米颗粒上的两个肽，其引起颗粒被紧密拉在一起，因而诱导特有的颜色变化(图7)。进行另一项ELISA实验，其表明NME7单体二聚化两个MUC1*胞外域肽。将第一PSMGFR肽耦合至BSA并固定在多孔板上。添加重组NME7-AB。在适当的洗涤步骤以后，添加用生物素修饰的第二PSMGFR肽。然后添加标记的链霉亲和素，其清楚地表明，NME7单体可以同时结合两个MUC1*胞外域肽(图8)。这些结果表明，NME7，经由它的两个NDPK域，结合于并二聚化在干细胞和癌细胞上的MUC1*。
NME7大致和NME1二聚体同样地起作用。如同NME1二聚体，NME7完全支持人干细胞生长。在最小无血清基础培养基中培养一组人干细胞(胚胎‘ES’和诱导多能性‘iPS’)，其中添加NME1二聚体或NME7-AB作为仅有的生长因子或细胞因子。比在传统的含FGF培养基中的生长更快生长的干细胞并不自发分化，并且回复到初始态，如由具有两个活性X染色体所证明的。图9和图10示出在NME1二聚体或NME7-AB中培养的人HES-3胚胎干细胞分别在第1天和第3天的照片。如可以清楚地看到的，干细胞似乎正等效地生长，而没有分化的迹象。注意，初始态干细胞并不生长成集落而是生长成单层，当达到汇合时，其变成片层。图11示出免疫细胞化学(ICC)实验的照片，其证实了，在NME7-AB中培养超过10代的干细胞对于标准多能性标志物是染色阳性的。图12示出ICC实验的照片，其证实，在NME7-AB中培养的干细胞是处于初始态。在FGF中用小鼠饲养细胞来培养小组的细胞(A)(正如标准做法)。染色抗体产生红点，此处它结合于在组蛋白3上的凝聚三甲基化赖氨酸27(H3K27me)，其表明一个X染色体是无效的(XaXi)以及干细胞已进展到“始发态”状态。小组的细胞(B)是和在(A)照片上所示的相同的细胞，不同之处在于，它们在NME7-AB中被培养10代。如在插图中可以看到的，H3K27me抗体产生“云”染色模式，表明两个X染色体均是活性的(XaXa)，其显示，细胞已回复到初始态。因此，我们已经证明，NME7完全支持干细胞生长和多能性并且还使它们恢复到初始态或基态，相比于晚期始发态，其是较不成熟状态。
我们接着试图确定NME7是否也是驱动癌细胞生长的活性生长因子。如果是这样的话，那么通过阻滞NME7与MUC1*胞外域的相互作用的治疗剂，可以在患者中抑制或防止癌症生长。将相对于NME7A和B域生长的兔多克隆抗体加入T47D，MUC1*阳性乳癌细胞，然后测量细胞生长。即使在非常低的纳摩尔浓度下,抗NME7也抑制癌细胞的生长(图13-15)。在一种优选实施方式中，用于癌症治疗的治疗剂是结合于NME7的NDPKA域的抗体。在一种更优选的实施方式中，治疗剂是结合于NME7的NDPKB域的抗体。在一种仍然更优选的实施方式中，治疗剂是这样的抗体，其结合在NME7的A或B域中的序列，其不存在于NME1中。在一种仍然更优选的实施方式中，治疗剂是抑制在NME7和MUC1*之间的相互作用的抗体。在一种最优选的实施方式中，治疗剂是抑制NME7的功能的抗体，其中所述功能是癌性生长或回复到癌症样状态的促进。
回想一下，NME配体充当生长因子人一种方式是通过结合于和二聚化MUC1*的胞外域。NME家族蛋白具有一个或多个NDPK域。这些NDPK域具有催化功能，其独立于，并且不需要它们的作为生长因子和转录因子的功能。经由它们的NDPK域，NME家族蛋白结合于MUC1*的胞外域。
在正常的胚胎发育过程中在不同的时间表达不同的NME家族蛋白。NME7是最原生的NME家族蛋白，其调节干细胞生长并在体内仅在非常早期的胚胎发育中表达。NME7是单～42kDa的蛋白质，其具有两个NDPK域，A和B加上N端前导序列，称为DM10域。ELISA测定表明，NME7结合于并且二聚化MUC1*跨膜受体。因为NME7具有2个NDPK域，所以它是假二聚体，其总是能够二聚化MUC1*受体。
相比之下，NME1大致是NME7的一半分子量(～17kDa)并仅具有一个NDPK域。NME1作为生长因子，仅当它是二聚体时，其促进生长并抑制分化。在较高浓度下，NME1可能形成六聚体。相对于二除体，NME1六聚体诱导分化。因此，NME1，其在胚胎发育中稍后表达，能够关闭自己，因而限制自我复制，而NME7则不能。在可测量的浓度下，野生型(wt)NME1主要存在为六聚体。突变NME1蛋白质，如形成稳定的二聚体群体的S120G，已分离自癌症，因而连续激活MUC1*受体。我们制备了重组NME1-wt、和S120G突变体。通过变化重折叠协议，我们能够稳定基本上为100％六聚体或100％二聚体的群体。此外，我们分离了NME1-S120G的群体，其是二聚体、四聚体和六聚体的混合物。图16示出在天然凝胶上的这些不同的多聚体。图17(A)示出在SPR实验中使用的NME1蛋白的凝胶，(B)其中MUC1*胞外域的PSMGFR肽被固定在芯片上以及不同的NME1蛋白流过表面。结果表明，NME1的二聚体形式是结合于MUC1*胞外域的形式。小组(C)示出纳米颗粒实验，其中PSMGFR肽附着于NTA-Ni-SAM涂覆的纳米颗粒并将重组NME1二聚体或六聚体加入纳米颗粒。如果发生相互作用，金纳米颗粒变为蓝色，以及如果没有发生相互作用，则金纳米颗粒保持粉红色。如可以看到的，仅二聚体结合于在纳米颗粒上的MUC1*肽并且二聚化在两个不同纳米颗粒中的两个肽，基本上交联颗粒。当加入溶液时，MN-C2抗MUC1*抗体的Fab会破坏在NME1二聚体和MUC1*PSMGFR肽之间的相互作用。小组(D)示出在NME1二聚体(NM23)、六聚体、或二聚体加上游离PSMGFR肽(以竞争性地抑制上述相互作用)中培养的人干细胞的照片。如在照片中可以看到的，仅NME1二聚体促进多能性干细胞生长。在自然界中，当干细胞的浓度达到临界质量以及它们的NME1的分泌达到在其下它们形成六聚体的浓度时，分化被诱导。图18是动画，其描述由本文描述的实验支持的机制，借此，NME7和NME1起作用以促进多能性，其中NME1调节本身。
在非常早期的胚胎发育中还表达NME6。在一些物质如海绵中，NME6据报道是二聚体。在它可以激活生长和抑制分化以前，必须以足够高的水平来表达NME6以致它可以形成二聚体。因此，相比于NME7，它是在晚期被表达。NME6还结合于MUC1*胞外域的PSMGFR肽。在拉下测定中，表明，NME6结合于在癌细胞中和在干细胞中的MUC1*。我们制备了重组NME6，作为野生型蛋白，或具有单点突变S139G，其模拟引起NME1偏好二聚体形成的S120G突变。此外，制备了另一种NME6变体，以致在此敏感区域中，人NME6将看起来像海绵NME6，其据报道存在为二聚体。这些突变是S139A加上V142D和V143A。图19A、B、和C中所示的ELISA测定表明，NME6结合于MUC1*胞外域的PSMGFR肽。在部分A中，NME6-wt被纯化为单体或被纯化为高分子量多聚体。ELISA测定，其中表面涂有PSMGFRMUC1*肽，显示NME6单体与MUC1*肽的优先结合。在部分B中，通过在SDS中的稀释来解离NME6多聚体。ELISA表明，当多聚体被解离时，与MUC1*肽的结合会增加。该图显示，NME6-wt和偏好二聚体形成的两个变体结合于MUC1*肽。图19D-H的凝胶显示以下项的表达：NME6-wt(D)；NME6，其具有S139G突变，其对应于突变S120G，其在人NME1中增加二聚体形成(E)；NME6，带有三个突变，其使得人形式模拟海绵形式，其被报道是二聚体(F)；以及连接两个NME6蛋白的单链蛋白(G,H)。小组I显示，在使用相对于MUC1的胞质尾区的抗体的拉下测定中，表明，NME6结合于在癌细胞中和在干细胞中的MUC1。因此，有效的抗癌剂将是破坏NME6二聚体与MUC1*胞外域肽的结合的抗体、小分子或其他剂。在一种优选实施方式中，用于癌症治疗的治疗剂是结合于NME6的NDPKA域的抗体。在一种更优选的实施方式中，治疗性抗体结合于在NME1中不存在的NME6的序列。
模拟胚泡的内质的胚胎干细胞的人干细胞，其是最早期干细胞，被称为“初始态”状态干细胞。直到最近，研究者不能体外维持或产生基因未修饰的初始态人干细胞。通过在NME1二聚体中或在NME7中并在不存在其他生长因子或细胞因子的情况下，尤其在不存在bFGF的情况下，培养细胞，我们最近成功产生处于初始态的基因未修饰的人干细胞。此外，我们发现，一旦它们暴露于bFGF，这些初始态干细胞就进展到更加成熟的“始发态”状态。为了证明NME7以非常高的水平表达在非常早期阶段干细胞中，我们对在NME1或NME7中培养的(初始态的)或在bFGF中培养的(始发态的)人干细胞进行Western印迹分析，然后探测NME7的存在。处于始发态的胚胎干细胞，其比处于初始态的干细胞更为分化的，仅表达微量的NME7。与之形成鲜明对比，处于早期“初始态”状态(还被称为“基”态)的干细胞表达高水平的NME7(图3B，比较泳道1(初始态的)与泳道2(始发态的)。在癌细胞中NME7的表达水平相当于它在早期干细胞中的表达水平(图3B，比较泳道3(癌细胞)与泳道1(初始态干细胞))。为此原因，可以治疗上禁止NME7和NME6而没有显著的副作用，这是因为它们的主要作用是在早期胚胎发育中而不是在成年生活中。
NME7是具有两个NDPK域的单分子，因此，在一个方面，充当NME1二聚体。NME7的结合配偶体的一种是MUC1*。我们的研究表明，NME7结合和二聚化MUC1*阳性细胞的胞外域以促进生长以及抑制人干细胞和癌细胞的分化。在癌细胞中，在条件培养基、细胞质和细胞核中，还检测到NME7，表明它充当分泌的生长因子以及还充当转录因子，其直接或间接地结合DNA。图20的Western印迹表明，NME1和NME7均存在于人癌细胞(T47D)、胚胎干细胞(BGO1v和HES-3)以及诱导多能干(iPS)细胞的细胞质和细胞核中。这些数据表明，NME1和NME7可能直接或间接地发挥作用以影响基因的转录。因此，在本发明的一个方面，通过添加可以是小分子的药剂来抑制NME1或NME7的功能，其抑制NME1或NME7与DNA的结合，以及抑制NME1或NME7的转录功能的药剂是抗癌剂，其可以给予患有癌症或具有发展癌症的风险的患者。
在不同的癌细胞中，NME蛋白可能被表达至不同水平。大多数癌症是MUC1*阳性的并显示NME1、NME6和NME7的高表达。DU145前列腺癌细胞具有比NME1或NME6更高的NME7表达。PC3前列腺癌细胞，其是MUC1*阴性的，没有可检测的NME1或NME7，但具有高表达的NME6(图21)。
NME7存在于不同的形式
NME7被表达为不同的物质。这些物质中的一些对于癌细胞具有特异性。全长NME7是42kDa并且是由两个不相同的NDPK域和DM10前导序列(在它的N端处)构成。在细胞质中可以发现全长NME7。？？？
仅在干细胞和癌细胞的条件培养基发现～33kDaNME7物质，其与由NDPKA和B域(但缺乏DM10前导序列)组成的物质相一致(图5和图22)。注意，这些发现是独立于为培养干细胞所添加的二聚体形式的重组NME1。图23显示，当剥离图22的凝胶并再探测在重组蛋白上组氨酸标签的存在时，没有检测到任何东西。这些结果主张，较小分子量NME7是分泌的生长因子形式。我们制备了由NDPKA和B域但没有DM10域组成的、分子量为～33kDa的NME7变体，我们称其为NME7-AB。这种重组NME7-AB能够完全支持多能性人干细胞在缺乏其他生长因子或细胞因子的无血清培养基中的生长。NME7-AB还完全支持MUC1*阳性癌细胞的生长。这些实验证明，NME7的分泌形式是生长因子形式，以及它是由NDPKA和B域构成并缺乏大多数或所有的DM10域，而且具有～33kDa的分子量。图24示出各种细胞裂解液的Western印迹的照片以及探测NME7的存在的相应的条件培养基，其中使用小鼠单克隆抗体(A)，或仅识别N端DM10序列的另一种单克隆抗体(B)。在来自细胞的条件培养基的样品中，DM10特异性抗体与～33kDaNME7物质的结合的缺乏表明，NME7的分泌形式缺乏大多数(如果不是所有的)N端DM10前导序列。
有时还存在另一种较小的～25kDaNME7物质。Western印迹表明从一开始就存在较低分子量～25kDa物质。这种～25kDaNME7是由NDPKA域构成并具有用于MUC1*的单一结合位点。切除～25kDa带并通过质谱法进行分析。质谱表明，～25kDa物质基本上由NDPKA域组成。
已被报道，NME7表达在其他人组织中(尽管以较低水平)。然而，我们已发现，正是NME7的分泌形式充当生长因子，以及虽然一些成体组织可以表达NME7，但关键方面是它是否被分泌。表达和分泌NME7的干细胞是那些干细胞，其处于比并不分泌NME7的干细胞更早，因而更为多能性状态，其是处于比并不表达或分泌NME7的干细胞？更早和更为多能性状态。表达和分泌NME7的癌细胞是那些癌细胞，其是比并不分泌NME7的癌细胞更少分化的和更具攻击性的。因此，NME7和分泌的NME7的测量水平可以用来预测肿瘤侵袭性，设计疗法，监测疗法的效力，以及分层用于临床试验的患者群体。因此，检测NME1、NME6或NME7的抗体可以用作诊断工具来检测癌症的发生或评估癌症的侵袭性，其中高水平的NME1、NME6或NME7关联与肿瘤侵袭性和不良后果。高水平的NME7和NME6尤其相关与肿瘤侵袭性，因此不良预后。可以用相对于NME1、NME6或NME7的抗体来探测的患者样品可以是体液的样品，包括血液、组织活检、针取活检等。
NME家族成员蛋白可以起作用来促进癌症
本发明人以前报道了，NME蛋白促进胚胎和iPS细胞的生长和多能性以及诱导细胞回复到干细胞样状态。由于现共享干细胞样状态和癌性状态的许多遗传特征，所以我们的结论是，NME家族成员蛋白也能够诱导癌性状态。在一种优选实施方式中，NME家族成员蛋白是NME1或NME蛋白，其具有与NME1大于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或97％的序列同一性，其中所述蛋白是二聚体。在一种更优选的实施方式中，NME家族成员蛋白是NME7或NME蛋白，其具有与NME7域A或B的至少一种大于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或97％的序列同一性并且能够二聚化MUC1*生长因子受体。
在这里，我们报告了，二聚体形式的NME1、二聚体形式的细菌NME1、NME7或NME7-AB能够：a)完全支持人ES或iPS生长和多能性，同时抑制分化；b)回复体细胞到更为干细胞样或癌症样状态；以及c)转化癌细胞到高度转移性癌症干细胞状态，还被称为肿瘤起始细胞。
我们制备了在盐单胞菌593(‘HSP593’)中和在牙龈卟啉单胞菌W83中发现的重组细菌NME蛋白，其具有与人NME1的高序列同源性并且已被报道以二聚体状态的形式存在(图25和图26)。HSP593很好表达在大肠杆菌中并且显著部分存在为二聚体，然后通过FPLC来纯化其群体并证实了二聚体群体(图25A)。进行直接结合实验，其表明，来自盐单胞菌593的细菌NME结合于MUC1*胞外域的PSMGFR肽(图25B)。在HSP593和人NME1或人NME7域A或B之间的序列对比表明，结合于MUC1*胞外域的细菌NME是40-41％相同于人NME1和人NME7-A，以及34％相同于NME7-B(图27A-C)。
进行另外的实验，其表明，具有与人NME1或NME7大于30％，或更优选40％的同一性的细菌NME的功能如同促进癌症和干细胞生长和存活的人NME。报道了，具有与人NME的这种高序列同一性的许多细菌NME涉及人癌症。因此我们试图检验以下想法：许多细菌在人中诱导癌症或使现有癌症更糟。在相对于人NME1和NME7的功能测定中测试细菌NME。在无血清最小基础培养基中培养人HES-3胚胎干细胞，其中含有HSP593、人NME1二聚体或人NME7-AB作为仅有的生长因子或细胞因子。正如人NME1和NME7完全支持人干细胞生长，来自HSP593的细菌NME也是如此(图28A-F，比较与图9和图10)。
人NME1二聚体或人NME7能够使体细胞回复到较不成熟状态，从而表达干细胞和癌细胞标志物。与人同系物一起来测试来自HSP593的细菌NME，以确定，通过能够回复体细胞到癌症样状态，它是否可以模拟它们的功能。在具有HSP593、人NME1二聚体或人NME7-AB作为仅有的生长因子或细胞因子的无血清最小基础培养基培养人成纤维细胞。RT-PCR测量结果表明，如同人NME，到第19天，细菌NME1HSP593回复体细胞到OCT4阳性期(图29)。回顾，干细胞和转移性癌细胞可能非贴壁依赖性地生长，我们重复上述实验，但这次将rho激酶抑制剂加入一组细胞以使得细胞附着于表面。当漂浮细胞被迫附着于表面时，RT-PCR表明，实际上存在干/癌症标志物OCT4的7倍增加以及干/癌症标志物Nanog的高达12倍增加(图30)。实验的照片表明，当在人或细菌NME中培养时，随着成纤维细胞回复以后的形态的巨大变化(图31-38)。回复体细胞到较不成熟状态的效率的相对次序是NME7>NME1二聚体>NME1细菌。转录因子BRD4和辅因子JMJD6据报道抑制NME7并向上调节NME1(LuiWithetal,2013)。我们发现，相比于它们表达在晚期始发态干细胞中，这些因子以更低水平表达在初始态干细胞中(图39)。此结果支持我们的假设，NME7是比NME1更早表达的干细胞生长因子，这是因为前者不能和NME1那样关闭自己或调节自我复制；作为二聚体，它激活干细胞生长，但当细胞分泌更多并且它形成六聚体时，六聚体并不结合MUC1*并且分化被诱导。
最近报道，染色质重排因子MBD3和CHD4会阻滞多能性的诱导(RaisYetal,2013)。在人NME1或NME7或细菌NME1中生长的人成纤维细胞的RT-PCR测量结果表明，NME蛋白抑制多能性的所有四种(BRD4、JMJD6、MBD3和CHD4)阻滞剂(图40)。RT-PCR实验的复合曲线图表明，增加多能性基因和降低多能性阻滞剂的相对效力是NME7>NME1>HSP593NME。然而，来自HSP593的细菌NME明显地上调人NME7和NME1的表达(图41和图42)。因此，NME1二聚体、NME7和细菌NME1二聚体引起体细胞回复到较少成熟的癌症/干细胞样状态。
NME1和NME7具有的另一种功能是能够转化癌细胞到更为转移性癌症干细胞状态，还被称为肿瘤起始细胞。在具有人NME7-AB或人NME1二聚体(‘NM23’，在图中)作为仅有的生长因子或细胞因子的无血清最小基础培养基中培养一组癌细胞。在此培养基中数天以后，细胞开始浮起并离开表面并在溶液中继续生长。收集‘漂浮体’并通过PCR分开地加以分析。用rho激酶抑制剂(‘Ri，在图中’)来处理在其他孔中的细胞。定量PCR测量结果表明癌症干细胞标志物的增加，其中的一些过去被认为仅是干细胞标志物(MikiJetal2007,JeterCRetal2011,HongXetal2012FaberAetal2013,MukherjeeDetal2013,Herreros-VillanuevaMetal,2013,SefahKetal,2013；SuH-Tetal2013)。图44-47示出，用NME蛋白的培养回复癌细胞到高度转移性肿瘤起始细胞，其中‘转移受体’CXCR4被上调200倍以上，SOX2被上调200倍以上，E-钙黏蛋白(CDH1)、NANOG和MUC1被上调10倍。总而言之，癌细胞分泌NME7和NME1，其激活MUC1并上调许多癌症和癌症干细胞基因。我们观察到更温和但趋势性的癌症干细胞的标志物的增加以及甚至在为MUC1阴性的细胞中的转移(图47)。我们因此得出结论，NME7可能能够通过不同于MUC1*的途径而进入这些细胞，其中MUC1*仍然可以充当转录因子并影响这些基因的表达水平。NME1必须是二聚体以以这种方式来发挥作用，这是因为作为六聚体，它并不激活干细胞或癌症生长。然而，许多癌症突变NME1以致它阻止自我复制的形成，从而限制六聚体。不同于NME1，NME7总是活性的。
已报道(SilvaJetal,2008)，2i抑制剂，其是MAP激酶信号途径的GSK3-β和MEK的小分子抑制剂，可以回复小鼠始发态干细胞到初始态。我们想知道这些抑制剂是否也可以回复人癌细胞到癌症干细胞状态。在添加有2i抑制剂的无血清最小基础培养基中，或在添加有人重组NME7-AB，或添加有NME7-AB和and2i的相同基础培养基中，培养T47D乳癌细胞10天。图48所示的结果表明，通过2i、2i+NME7-AB、单独NME7-AB会大大上调癌症干细胞标志物E-钙黏蛋白(CDH1)、转移受体CXCR4以及干/癌症标志物OCT4、SOX2和NANOG。诱导癌症干细胞标志物的相对效力是NME7>NME7+2i>2i(图48)。当用2i或NME7-AB来处理癌细胞时，类似地下调多能性-阻滞染色质调节剂以及转录因子BRD4、JMJD6、MBD3和CHD4的表达(图49)。
因此，除去NME1二聚体(人或细菌)或NME7的任何以下功能：促进干细胞生长的能力、结合于MUC1*肽PSMGFR的能力、回复体细胞到较不成熟状态的能力、转化癌细胞到癌症干细胞状态的能力，的药剂是有效的抗癌剂并且可以给予患者来治疗或预防癌症。
为了支持NME抑制剂是有效的抗癌剂的想法，我们进行了实验并主张它可以扩展到结合于NME7、NME7-AB以及其他NME蛋白的许多其他抗体。在存在或不存在相对于人NME7生长的兔多克隆抗体的情况下，我们生长MUC1*阳性癌细胞。肿瘤细胞生长以浓度依赖性方式被大大降低并示于图13-15。多克隆抗NME7可能不是理想的抗癌剂，因为它是由兔产生的抗体的集合。对于治疗剂，将产生单克隆抗体并依据它们特异性地抑制癌细胞生长的能力来选择，以及理想地选择这样的单克隆抗体，其破坏NME7与MUC1*胞外域的结合。最后，将选择人或人源化抗体。
NME功能1：NME蛋白起作用以促进癌症的一种方式是通过结合于MUC1跨膜蛋白的修剪形式，在本文中被称为MUC1*，其主要由PSMGFR序列构成。MUC1*胞外域的二聚化会刺激干细胞和癌细胞的生长和去分化。
NME功能2：NME蛋白起作用以促进癌症、去分化、多能性、生长或存活的另一种方式是：它们可以被转运到细胞核，此处它们直接或间接地发挥作用以刺激或抑制其他基因。之前已经报道(Boyeretal,2005)，OCT4和SOX2结合于MUC1和它的切割酶MMP16的启动子部位。同样的研究报道了，SOX2和NANOG结合于NME7的启动子部位。基于我们的实验，我们得出结论：这些‘Yamanaka’多能性因子(TakahashiandYamanaka,2006)上调MUC1、它的切割酶MMP16和它的活化配体NME7。以前还报道了，BRD4抑制NME7，而它的辅因子JMJD6则上调NME1(Thompsonetal)，我们确定其是在胚胎发育中比NME7稍后表达的自调节干细胞生长因子。还有一些人最近报道，Mbd3或Chd4的siRNA抑制大大降低对iPS产生的抗性(RaisYetal2013etal.)。我们的证据是，存在相互反馈环，其中NME7抑制BRD4和JMJD6，同时还抑制多能性Mbd3和CHD4的抑制剂。我们注意到，相比于它们在晚期‘始发态’干细胞中的表达，在初始态人干细胞中，这些四种因子BRD4、JMJD6、Mbd3和CHD4被抑制。我们还注意到，2i抑制剂(Gsk3β和MEK的抑制剂)，其回复小鼠始发态干细胞到初始态，也下调同样的四种因子BRD4、JMJD6、Mbd3和CHD4。我们还已发现，NME7上调SOX2(>150X)、NANOG(～10X)、OCT4(～50X)、KLF4(4X)和MUC1(10X)。重要地，我们已经表明，NME7上调癌症干细胞标志物，包括CXCR4(～200X)和E-钙黏蛋白(CDH1)。综合起来，这些多行的证据指向以下结论：NME7是最原生的干细胞生长和多能性介质，并且在体细胞到癌性状态的转化以及转化癌细胞到更为转移性癌症干细胞中它是强大的因子。图50是NME7和干/癌症状态的相关调节子的相互作用图的动画，如由本文描述的实验所证明的。在能够转化体细胞到干/癌症样状态以及能够转化癌细胞到转移性癌症干细胞方面，二聚体形式的NME1的作用大致相同于NME7，尽管在稍小的程度上。类似地，具有与人NME1或NME7如盐单胞菌藻593的高同源性的细菌NME二聚体，如同NME1二聚体和NME7单体，能够完全支持人干细胞生长、多能性和存活、癌细胞生长和存活，回复体细胞到癌症/干细胞状态以及转化癌细胞到更为转移性癌症干细胞。
我们因此得出结论，去除支持人干细胞生长、多能性和存活、癌细胞生长和存活的NME蛋白的功能的药剂，能够回复体细胞到癌症/干细胞状态的药剂，以及能够转化癌细胞到更为转移性癌症干细胞的药剂，是用于抗癌疗法的理想的靶，其中治疗剂去能NME蛋白，阻滞它结合于MUC1*，阻滞它作为直接或间接转录因子的功能或阻滞它的功能(如上所述)。在一种优选实施方式中，阻滞NME蛋白的功能的药剂是抗体。在另一种优选实施方式中，上述剂阻滞NME1二聚体或二聚化的功能。在又一种更优选的实施方式中，上述述剂阻滞NME7的功能。阻滞这些NME蛋白的一种的功能的抗癌剂可以可替换地是核酸。例如，抑制NME的表达的核酸，如sh-或siRNA、反义核酸等。可替换地，上述剂可以间接抑制NME的表达。例如，BRD4的增加的表达将抑制NME7，因而作为抗癌剂。在另一种实施方式中，抑制靶向NME蛋白的功能的药剂是合成化学品如小分子，其直接作用于NME蛋白或抑制它的表达。分开地或组合地，这些剂是用于治疗或预防癌症的有效的抗癌剂。
在一种情况下，抑制靶向NME蛋白的药剂是抗体并且是抗癌剂，其被直接给予患者，用于治疗或预防癌症。在一种优选实施方式中，原发性癌症或它的后代是MUC1*阳性癌症。抗体可以是抗体本身或可以是工程抗体样分子。抗体或抗体样分子可以连接于细胞毒性实体或激活免疫应答的实体。例如，可以将抗NME抗体的部分设计成治疗性分子的一部分，如在CAR(嵌合抗原受体)T细胞技术(PorterDetal,2011)中所描述的。抗体可以是二价的、单价的、双特异性人源化的或部分人源化的。可以利用体外结合测定、噬菌体展示技术等，包括由TillerTetal,2013使用的那些技术，以及例如利用随机人抗体表位库如系统以及其他系统，来产生抗体或抗体样分子。
在本发明的另一个方面，抑制靶向NME蛋白的药剂是由患者产生的抗体，其中用靶向NME蛋白的部分来免疫患者，以致患者安装免疫应答，其包括抗NME抗体。进行这样的免疫，用于治疗或预防癌症，例如作为疫苗。
在另一个方面，本发明涉及识别肽序列，上述肽序列源自MUC1*、人NME1、细菌NME1和NME7，其将产生产生是抗癌剂的抗体。这些肽序列可以用于产生治疗性抗体以及用于疫苗、用于反义型疗法的核酸序列、用于识别致癌细菌的方法、诊断方法和药物筛选方法。在本发明的一个方面，可以用佐剂或融合于刺激免疫系统的其他肽来增强本文描述的序列的肽，然后用来在宿主动物或在人中产生抗癌抗体，作为疫苗，以免疫对抗癌症，其中通过诱导患者提高相对于靶向NME蛋白的抗体。在一种优选实施方式中，靶向NME蛋白是细菌NME，其具有与人NME1或NME7域A或B的30％或更大的序列同一性。在一种更优选的实施方式中，靶向NME蛋白是人NME1，其中抗体可以特异性地靶向具有突变的NME1，其使得它偏好二聚体形成如S120G突变、P69S突变或C-末端截短。在一种仍然更优选的实施方式中，靶向NME蛋白是NME7(SEQIDNO:13)，包括切割形式，基本上如阐述为NME7-AB(SEQIDNO:39)。
表达人NME7、人NME1或突变体(其偏好二聚化)或细菌NME的转基因小鼠将在药物发现中大量使用，用于体内生长癌细胞和用于测试免疫NME衍生肽作为抗癌疫苗的元件的效果。例如，鼠NME蛋白不同于人NME蛋白。使用单生长因子LIF来生长小鼠干细胞，而LIF不能支持人干细胞的生长。我们现在知道，癌细胞和干细胞的生长是通过类似的机制。因此，将人癌细胞植入小鼠带来除在小鼠中对人癌细胞的仅仅免疫应答之外的问题：小鼠并不产生人NME7或二聚体NME1，其是单独地促进癌症生长和它们转化到癌症干细胞的生长因子。
我们已发现，注射有人NME7的动物比未注射有人NME7的小鼠更容易发展癌症。例如，一些癌细胞非常难以在动物中植活。骑过对动物注射人NME7或NME7-AB，我们增加癌细胞的植活率数倍。对免疫受损小鼠植入T47D乳癌细胞，其50/50vol/vol混合与Matrigel或NME7-AB。在10天以后，对已接受NME7混合细胞的小鼠每天另外注射NME7-AB(图51)。另外注射有NME7-AB的组(虚线)具有以加速的速率生长的更大的肿瘤。当NME7-AB混合与癌细胞时(当植入时)以及当在植入以后每24或48小时注射小鼠时，导致植活率，降低的所需细胞的数目和更快的肿瘤生长速率。癌细胞与NME7的比率的范围或NME7的注射日程表预计会因小鼠品系和肿瘤类型改变。在这种方法的改进方法中，对于人NME7或NME7-AB为转基因的动物大大增加癌细胞的植活率，因而，减少为在动物中发展成肿瘤所需要的细胞的数目。这允许在表达人NME7或NME7-AB的动物中原发性患者癌细胞的生长。
在一个实施例中，将癌细胞植入动物并给予动物NME7或NME7-AB。在一种优选实施方式中，动物是表达人NME7-AB的转基因动物。在一种优选实施方式中，癌细胞是来自患者的原代细胞。以这种方式，动物，其可以是小鼠，提供NME生长因子，其引起患者癌细胞回复到较少成熟的、更具转移状态。在一种实施方式中，对宿主动物注射候选药物或化合物并评估效力以预测患者对用候选药物或化合物的治疗的反应。在另一种情况下，将正被给予患者或正考虑用于患者的治疗的第一线治疗或药物给予带有患者的癌细胞(其正被回复到较不成熟状态)的动物。第一线治疗可能影响癌细胞采用哪些突变来逃避第一线治疗。然后可以从宿主动物除去得到的癌细胞并分析或表征以确定响应于某些治疗可能发生的突变。可替换地，癌细胞可以保留在宿主动物中，然后用其他治疗剂来治疗宿主动物以确定哪些剂抑制或杀死抗性细胞或癌症干细胞。
我们的实验已经表明，在鼠NME蛋白和人NME蛋白之间的差异是为何在小鼠中人癌细胞的植活是如此低效的主要原因。在癌细胞植入时，对小鼠注射重组人NME7大大增加了肿瘤植活率和肿瘤生长速率。因此，表达人NME7或更优选人NME7-AB的转基因小鼠将大大增加肿瘤植活率，从而使得可以在用于药物发现、剂量测试的小鼠模型中植活患者细胞，或确定响应于药物治疗患者的癌细胞可能如何演变或突变。将是有利的是，在诱导型启动子上具有人NME7，例如以避免在动物的发育过程中NME7表达的潜在问题。可替换地，可以在NME7、NME1二聚体或细菌NME(其模拟人NME)中培养癌细胞，包括患者细胞，以致将细胞转化成癌症干细胞，其需要少至50-200个细胞以在动物中引发肿瘤。然后将体外或体内测试这些细胞，包括在带有NME7、NME1二聚体、细菌NME或单链NME1假二聚体的转基因动物中。
表达人NME，尤其是NME7-AB，的转基因动物还将可用于评估哪些免疫肽可以安全地用于产生相对于NME蛋白(包括NME1、细菌NME和NME7)的抗体。例如，可以用阐述在图62-64中的免疫肽(肽编号1-53)的一种或多种来免疫对于人NME1、NME7、或NME7-AB为转基因的小鼠。分析对照组小鼠以确保产生抗NME抗体。然后将人肿瘤细胞植入转基因小鼠，其中诱导人NME蛋白在宿主动物中的表达(如果使用诱导型启动子)。然后，相比于对照小鼠或其中未启用诱导型NME启动子的小鼠，通过比较移植入转基因小鼠的细胞的肿瘤植活、肿瘤生长速率和肿瘤引发潜力，来评估免疫肽的效力和潜在毒性。除确定总骨髓数、循环血细胞的数目和类型以及对骨髓细胞的再生的响应时间(响应于用对于骨髓细胞具有细胞毒性的药剂进行的治疗)之外，还通过检查器官如心脏、肝脏等来评估毒性。源自在图62-64中(肽编号1-53)所列肽的免疫肽，其显著降低肿瘤植活、肿瘤生长速率、或肿瘤引发潜力并具有可容忍的副作用，被选择为免疫肽，用于在患者外部产生抗体或在人中作为抗癌治疗、预防或疫苗。
因此，通过使用将人基因引入动物的许多方法的任何一种方法，来产生小鼠或其他哺乳动物，其将自发形成肿瘤，或更加如同人一样响应待测试药物或其将更好地允许人肿瘤植活。这样的方法常被称为敲入、敲除、CRISPR、TALEN等。本发明设想使用来使哺乳动物表达人NME7或NME7-AB的任何方法。NME7或NME7-AB可以是可诱导的，因为用于控制转基因的表达的许多方法的一种在本领域中是已知的。可替换地，通过另一种基因(其可以由哺乳动物天然表达)的表达，可以控制NME7表达或定时表达。例如，可以期望，NME7或NME7变体被表达在一定组织如心脏中。然后用于NME7的基因可操作地连接于在心脏中表达的蛋白质如MHC的表达。在这种情况下，当表达MHC基因产物时和情况下，启用NME7的表达。类似地，人们可能希望，在前列腺中启用人NME6或NME7的表达以致通过例如前列腺特异性蛋白的表达来控制其表达的位置和定时。类似地，通过在乳腺组织中表达的基因，可以控制在非人哺乳动物中人NME6或NME7的表达。例如，在转基因小鼠中，人NME6或人NME7表达自催乳素启动子、或类似基因。
作为抗癌剂的NME蛋白的抑制剂
用将作为抗癌剂的抑制剂来靶向哪些NME蛋白可以取决于癌症类型。例如，将用抗体或其他剂，其靶向细菌NME蛋白并抑制其二聚化的能力、其结合于MUC1*的能力或其促进癌症生长或转化癌细胞到癌症干细胞的能力，来治疗这样的肿瘤，其表明包藏与人NME1或NME7-A或-B域或细菌NME(其显示会模拟人NME1二聚体或NME7-AB的功能)具有高序列同源性的细菌NME。可替换地，在一些癌细胞中，偏好二聚化的NME蛋白可能被错误地重新激活或突变，以致它们抵抗六聚体形式的形成。还有其他癌症可以错误地重新激活NME7或切割形式NME7-AB的表达。因此，识别NME1、细菌NME(其模拟NME1二聚体)和/或NME7-AB的治疗性抗体可以用于癌症的预防或治疗。可替换地，进行诊断测定以确定何种NME抑制剂可有效用于癌症或癌症的子集。
结合于NME7并抑制它的致瘤潜能的抗体是有效的抗癌剂并且可以被给予患者以治疗或预防癌症。抑制NME7或NME7-AB的致瘤潜能的抗体是那些抗体，其抑制NME7结合于它的同源结合配偶体的能力，在一种情况下其是MUC1*受体的PSMGFR部分。在另一种情况下，NME7可以通过进入细胞，易位到细胞核和作为直接或间接转录因子，开启基因，其促进肿瘤发生，如CXCR4、SOX2、MUC1、E-钙黏蛋白、OCT4，来发挥作用。NME7或NME7-AB下调BRD4、JMJD6、MBD3和CHD4，所有这些都导致细胞的增加的致瘤潜能。因此，用于癌症的治疗或预防的抗体是那些抗体，当体外或体内测试时其抑制NME7结合于MUC1*或抑制NME7或它的辅因子结合于CXCR4、SOX2、MUC1、E-钙黏蛋白、OCT4、BRD4、JMJD6、MBD3或CHD4的核酸启动子部位。可以将这些抗体给予患有癌症或具有发展癌症的风险的患者。如在本领域中众所周知的，可以利用整个NME1、NME6或NME7蛋白来产生抗体和抗体样分子。可替换地，可以使用肽或蛋白质的部分。仍然在其他方法中，连同载体分子或佐剂一起，将肽注入宿主动物以诱导免疫反应。抗体可以以标准方式收获自动物，包括产生自产生抗体的细胞(收获自动物)的单克隆抗体，其然后可以被人源化。本发明还设想，在筛选测定中，使用NME1、NME6或NME7蛋白、或其序列源自它们的肽。在一个这样的实施例中，可以筛选抗体库以确定它们结合于NME1、NME6或NME7的能力，其中结合于靶向NME蛋白的抗体用来治疗或预防癌症。另外，上述库不需要由抗体本身组成。可以针对结合于NME蛋白的部分来筛选抗体表位或片段的库，以确定用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的人的治疗性抗体。在图62-64中列出的免疫原性肽的一种或多种非常适用于在宿主动物中产生抗体或适用于确定和选择抗体表位，其可以以后被设计进入用于给予患者的抗体样分子。在另一种实施方式中，将其序列源自NME1、NME6或优选NME7的肽直接给予人，以致受体产生免疫反应，包括抗体生产，作为癌症疫苗。在图62-64中列出的肽(SEQIDNO.88-140)的一种或多种优选用于抗体产生或选择，其中用于在宿主动物中抗体产生，供用作疫苗，用作诱饵来筛选合成肽或抗体表位的亩如系统，其中通过抑制NME7的功能或标志它用于降解，所述抗体将抑制癌症。在另一个方面，本发明涉及NME家族蛋白的肽片段，以及利用这些肽来产生或选择结合于和抑制NME7的抗癌抗体或抗体表位，其选自SEQIDNO:88-140，更优选88-133，更优选88-121。
NME7可以是用于治疗或预防癌症的理想的治疗靶，这是因为它的主要作用似乎是在非常早期的胚胎发育中并且并不以显著水平表达在成体组织中。因此，去能NME7的药剂预期可预防或大大地抑制癌症，同时对健康成体组织具有轻微的(如果有的话)不利影响。我们的研究表明，癌细胞和初始态干细胞分泌NME7，其可以充当它们的仅需要的生长因子。此外，我们发现，通过使它们接触NME1二聚体、细菌NME二聚体、或NME7，为转移性癌细胞的癌细胞的群体，还被称为癌症干细胞或肿瘤起始细胞，被优先扩展，其中NME7产生最大数量的癌症干细胞。因此，去能NME蛋白的药剂是极好的抗癌治疗剂，特别可用于癌症干细胞或肿瘤起始细胞的抑制或预防。在一种优选实施方式中，由治疗剂靶向的NME蛋白是NME1(人或细菌)，其中治疗剂抑制二聚化，抑制结合于MUC1*，或抑制它上调多能性基因或癌症干细胞基因如CXCR4的能力。在一种更优选的实施方式中，由治疗剂靶向的NME蛋白是NME7，其中治疗剂抑制NME7的表达，抑制NME7结合于MUC1*，抑制DM10域的切割，或抑制它上调多能性基因或癌症干细胞基因如CXCR4的能力。
因此，用来抑制癌细胞的生长和去分化的靶向治疗剂是去能NME7功能的药剂。为了治疗癌症，治疗剂将去能的NME7功能包括但不限于：1)结合于MUC1*胞外域的能力；2)结合于DNA的能力；3)促进干细胞增殖的能力；4)抑制分化的能力；5)充当转录因子的能力；以及6)被细胞分泌的能力。
如上文列出的去能NME7功能的药剂包括但不限于：抗体、化学实体、小分子、微RNA、反义核酸、抑制性RNA、RNAi、siRNA。在一种情况下，治疗剂是抗体，其可以是单价、二价、双特异性、多克隆、单克隆抗体，或可以是抗体样，因为它们含有模拟抗体的可变域的区。在另一种情况下，治疗剂是化学实体如小分子。引起NME7的抑制的药剂如RNAi或siRNA也被设想为抗癌治疗剂。在一种优选实施方式中，这些制剂阻滞NME7与MUC1*的胞外域的相互作用。
在另一种方法中，当BRD4抑制NME7时，将上调BRD4的药剂给予患者，用于癌症的治疗或预防。
免疫NME肽以产生治疗性抗体
到目前为止，关于NME蛋白和它们的功能，尤其是新识别的NME蛋白如NME7，很少是已知。直到最近，NME1被认为是六聚体。已经发表了NME1和NME2作为六聚体的晶体结构(WebbPAetal,1995；MinKetal,2002)，但关于NME二聚体或NME7可能如何折叠，提供的信息很少。然而，基于已公布的NME1的六聚体结构，在人NME1、人NME7和细菌NME(其可以模拟人NME1和NME7功能，尤其是盐单胞菌593)之间的序列对比，我们确定了来自人NME1、人NME7和盐单胞菌593的某些肽序列，其被预测会产生用于治疗应用(用于治疗或预防癌症)的抗体(如本文先前所描述的)。
图61是在人NME1和人NME7-A或-B域之间的序列对比。图27是在人NME1和来自盐单胞菌藻593的细菌NME之间以及在人NME7-A或-B域和来自盐单胞菌藻593(‘HSP593’)的细菌NME之间的序列对比。
在图62中列出的肽1至34(具有SEQIDNO:88-121)是来自人NME7的肽，其被选用的原因在于它们与人NME1的低同源性。选择NME7肽35至46(SEQIDNO:122-133)(图63)，这是因为，关于NME7的区，它们是有点独特的序列，对于蛋白质的完整性或对于它们结合于MUC1*肽的能力，其似乎是结构上重要的。预期两组NME7序列会产生结合于NME7的抗体，而第二组NME7肽可能起作用以去能NME7或它结合于MUC1*肽的能力。预期这些肽会产生将识别NME7或还可以识别人NME1或细菌NME的抗体，因而可以用于治疗或预防癌症。
在图64中列出的肽47至53(SEQIDNO:134-140)是人NME1序列，其被选用是由于它们与人NME7和细菌HSP593NME的高序列同源性，因此被推断为对于结构或结合于MUC1*是重要的。预期这些肽会产生可以识别NME1、NME7或细菌NME的抗体，因而可以用于治疗或预防癌症。
与人NME1具有低同源性但与人NME7-A或NME7-B具有高同源性的肽序列列于图62，肽1至34(SEQIDNO:88-121)应产生偏好结合于人NME7的抗体，其在成体组织中应具有有限(如果有的话)的作用，除在癌性组织中以外，在这种情况下，期望抑制其活性。
在图63中列出的肽35至46(SEQIDNO:122-133)是来自NME7的肽序列，其中基于序列同源性、公布的NME1六聚体的晶体结构和以下认识：C-末端截短偏好二聚化并且并不抑制结合于MUC1*或上述蛋白质在干细胞和癌症生长中的功能，它们对于结构完整性或结合于MUC1*似乎是重要的。在图64中列出的肽47至53(SEQIDNO:134-140)是来自NME1的肽序列，其中基于序列同源性、公布的NME1六聚体的晶体结构和以下认识：C-末端截短偏好二聚化并且并不抑制结合于MUC1*或上述蛋白质在干细胞和癌症生长中的功能，它们对于结构完整性或结合于MUC1*似乎是重要的。产生自包含这些序列的肽或肽模拟物的抗体将产生这样的抗体，其用来给予患者来治疗或预防癌症。含有这些序列的肽或肽模拟物将在宿主中产生抗体，因而构成抗癌疫苗，其可以被给予患者来治疗或预防癌症，
诊断测定
在本发明的又一方面，描述了诊断测定，其可以确定在患者癌症中、或在具有发展癌症的风险的患者中的主要NME是否是NME1、细菌NME或NME7全长或切割成NME7-AB形成。上述诊断测定涉及标准测定如IHC、ICC、FISH、RNA-Seq和其他检测或测序技术，但不同于标准癌症诊断测试，将进行上述测定以确定NME1、NME7或细菌NME的存在量是否大于在对照组中测得的存在量。基于由患者的癌症或由困扰许多患者的癌症的子集表达的NME蛋白的类型的上述确定，可以选择将特异性地抑制或去能在患者或患者组中存在的NME蛋白的抗NME抗体或其他NME能力丧失剂并给予患者。类似地，采用诊断测定来确定患者的NME蛋白中否带有使蛋白质有利于二聚化的突变并且如果是这样的话，则将去能上述特定突变NME的药剂给予患者以用于癌症的治疗或预防。
可以进一步筛选去能靶向NME蛋白或它的同源受体MUC1*的功能的抗体，以确定那些抗体，其优先靶向癌细胞并且并不靶向干细胞或祖细胞或在小得多的程度上靶向干细胞或祖细胞。通过各种各样的切割酶，将MUC1切割成MUC1*形式，其中哪些酶切割MUC1可以是由于组织类型或细胞或生物体发育的时序。例如，MMP14以比在乳癌细胞上表达的水平更高的水平表达在干细胞中(图52)。相反地，MMP14和ADAM17，还有MUC1切割酶表达在DU145前列腺癌细胞上，3倍和5倍高于它们表达在人干细胞；在T47D乳癌细胞中，MMP16和ADAM17是2倍高于它们在干细胞中(图53和54)。确实，当用抗MUC1*抗体MN-E6的Fab来治疗植入有DU145前列腺癌细胞的小鼠时，肿瘤生长受到很大抑制(图55)，MMP14和ADAM17的表达被降低(图56)，MUC1切割被减少以及发出分化信号的微RNA-145的表达被增加(图57A,B)。因此，MUC1*可以在其远端发生变化，N端达10或更多个氨基酸。MUC1的C端是在细胞内以及它的N端是在细胞外。我们的实验表明，NME1二聚体结合于PSMGFR肽的N-10变体。也就是说，省略PSMGFR肽的最初10个氨基酸，其对应于MUC1*胞外域的大部分，并不影响NME1二聚体结合于MUC1*肽的能力。优先结合于N-10肽(SEQIDNO:86)的抗体优先结合于MUC1*(当它存在于癌细胞上时)。相反地，优先结合于C-10肽(SEQIDNO:87)的抗体优先结合于干细胞和骨髓细胞而不是癌细胞(图58-60)。因此，靶向MUC1*用于癌症的治疗或预防的抗体可以通过用PSMGFR肽、N-10肽或C-10肽进行免疫来产生。可替换地，可以通过选择那些抗体或抗体样分子，其结合于MUC1*(当它出现在癌细胞上时，相对于它如何出现在干细胞和祖细胞上)，来确定用于治疗或预防癌症的治疗性抗体或抗体样分子。在一种优选实施方式中，抗体偏好结合于N-10肽。在又一种更优选的实施方式中，针对它结合于癌细胞但不结合于干细胞或祖细胞的能力来选择治疗性抗体。在一个实施例中，通过ELISA或类似的直接结合测定，针对它们结合于PSMGFR肽、N-10肽或C-10肽的能力来首先选择抗体，然后证实能够结合于许多不同类型的MUC1*阳性癌细胞，其中一种抗体可以比结合乳癌细胞更好地结合前列腺癌细胞，反之亦然，以支持在不同的组织类型上不同切割位点的假设。然后，将杂交瘤上清液涂布在多孔板上并在它们之上接种干细胞。因为人干细胞是未粘附的，所以涂有结合于干细胞(或祖细胞)的抗体的孔引起干细胞附着，而并不引起干细胞附着的抗体被选择为用于治疗或预防癌症的优选的抗MUC1*抗体。
因此，在另一个方面，本发明涉及用于分类癌症或分层患者(患有或怀疑患有癌症)的方法，包括以下步骤：(i)分析患者样品中干细胞或祖细胞基因或基因产物的存在；以及(ii)分组共享干细胞或祖细胞基因或基因产物的类似表达或表达水平的患者。以这种方式，然后可以用抑制那些干细胞或祖细胞基因或基因产物的药剂来治疗患者。
在另一种情况下，测量干细胞或祖细胞基因或基因产物的表达水平以评估癌症的严重程度，其中为早期干细胞或祖细胞状态的特征的基因或基因产物的表达或较高表达表明更具攻击性癌症，以及为晚期祖细胞状态的特征的基因或基因产物的表达或较高表达表明较少攻击性癌症。于是这种确定将允许医生设计疗法，其相应与治疗患有更具或较少攻击性癌症的患者。
可以借助于血液样品、体液、或活检来完成用于分类癌症或分层癌症的这些方法。其高表达水平将表明非常侵袭性癌症的基因或基因产物将包括NME1、更优选NME6以及仍然更优选NME7。
本发明的范围并不限于本文描述的具体实施方式。确实，对于本领域中的技术人员来说，依据前面的描述和附图，除本文描述的之外，本发明的各种改进将变得显而易见。这样的改进旨在属于所附权利要求的范围。以下实施例是用来说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1-最小无血清培养基(“MM”)(500ml)的成分
400mlDME/F12/GlutaMAXI(Invitrogen#10565-018)
100mlKnockoutSerumReplacement(KO-SR,Invitrogen#10828-028)
5ml100xMEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen#11140-050)
0.9ml(0.1mM)β-巯基乙醇(55mM原液，Invitrogen#21985-023)
实施例2–对于NME1、NME6和NME7的存在探测癌症和干细胞
在此系列实验中，我们检测了在干细胞和癌细胞中NME6和NME7的表达。此外，我们识别MUC1*作为NME7靶标。我们首先对细胞裂解物进行蛋白印迹测定法(Westernblotassays)来确定NME1、NME6和NME7的存在或缺失。在图3A中，将在NME1二聚体中、在涂覆有抗MUC1*抗体的表面上培养的BGO1v人胚胎干细胞的裂解物(泳道1)，或在bFGF中、在MEF上培养的BGO1V人胚胎干细胞裂解物(泳道2)或T47D人乳癌细胞裂解物(泳道3)或NME1-野生型(wt)作为阳性对照，通过SDS-PAGE分离，然后用抗NME1特异性抗体探测。结果表明，无论是在NME1二聚体或是bFGF中培养的人ES细胞中，以及T47D癌细胞中，NME1均强烈表达。通过SDS-PAGE来分离同样的细胞裂解液，然后用抗NME6特异性抗体(抗NME6，来自Abnova)加以探测。没有检测到NME6(数据未示出)，然而，后来在更浓缩的样品中检测到(见图4)。
在图3B中，通过SDS-PAGE分离相同的细胞裂解物，然后用抗NME7特异性抗体(nm23-H7B9，来自SantaCruzBiotechnology,Inc)探测。结果表明，NME7在NME1二聚体中、在抗-MUC1*抗体表面上培养的人ES细胞中强烈表达，在bFGF中、在MEF上培养的相同ES细胞中微弱表达(泳道2)，并在乳癌细胞中强烈表达(泳道3)。加入NME1的泳道4是空白的，这表明NME7抗体与NME1没有交叉反应。在NME1二聚体中培养的干细胞(我们已经表明表达标志物意味着相比于在bFGF中培养的细胞，它们处于更初始态的状态)中，NME7有更大的表达量的事实表明，相比于其在始发态态细胞中的表达量，NME7在初始态细胞中具有更高水平的表达。
为测定NME7在作为生长因子的同时是否将MUC1*作为其靶受体起作用，我们进行了拉下实验。在这些实验中，合成的MUC1*胞外结构域肽(His-标记的PSMGFR序列)固定在NTA-Ni磁珠上。用BGO1v人胚胎干细胞裂解物孵育这些磁珠，该BGO1v人胚胎干细胞在NME1二聚体中、在涂覆有抗MUC1*抗体的表面上培养(泳道1)，或在bFGF中、在MEF上培养(泳道2)或在T47D人乳癌细胞裂解物(泳道3)上培养。漂洗磁珠并且通过加入咪唑释放捕获的蛋白。通过SDS-PAGE分离蛋白并且随后使用抗-NME1抗体(图3C)、抗NME6抗体(数据未示出)或NME7抗体(图3D)探测。结果表明NME7结合至MUC1*胞外结构域肽。这意味着在干细胞和癌细胞中，NME7经由它的两个NDPK结构域的其部分，通过使MUC1*胞外结构域二聚化而激活多能性通路。
实施例3-蛋白结构(构建体，construct)的产生
产生重组NME7–首先制作构建体以制作可以有效表达并具有可溶形式的重组NME7。第一种方式是制备将编码原生NME7(-1)或选择性剪接变体NME7(-2)的构建体，其具有N端缺失。在一些情况下，构建体携带组氨酸标签或链球菌标签以有助于纯化。NME7-1在大肠杆菌中较差表达而NME7-2根本不在大肠杆菌中表达。然而，制备了新的构建体。其中靶向序列被删除以及NME7基本上包括NDPKA和B域，其具有31kDa的计算分子量。这种新的NME7-AB很好地表达在大肠杆菌中并存在为可溶性蛋白。其中表达单NDPK域的构建体，NME-A，并不表达在大肠杆菌中。首先经NTA-Ni柱来纯化NME7-AB，然后通过尺寸排阻色谱(FPLC)并经Sephadex200柱来进一步纯化。然后测试纯化的NME7-AB蛋白促进多能性和抑制干细胞的分化的能力。
实施例4-人重组NME7-AB的功能测试
测试重组NME7维持多能性和抑制分化的能力。产生和纯化NME7的可溶性变体，NME7-AB。按照制造商的指示，在4ng/mlbFGF中，在一层小鼠成纤维细胞饲养细胞上生长人干细胞(iPS商品目录号SC101a-1，SystemBiosciences)四代。然后将这些源干细胞接种到6孔细胞培养板(VitaTM，ThermoFisher)中，其已涂有12.5ug/孔的单克隆抗MUC1*抗体，MN-C3。以300,000个细胞/孔的密度接种细胞。基础培养基是最小干细胞培养基，由以下组成：400mlDME/F12/GlutaMAXI(Invitrogen#10565-018)、100ml敲除血清替代物(KnockoutSerumReplacement)(KO-SR,Invitrogen#10828-028)、5ml100xMEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen#11140-050)和0.9ml(0.1mM)β-巯基乙醇(55mM原液，Invitrogen#21985-023)。基础培养基可以是任何培养基。在一种优选实施方式中，基础培养基不含其他生长因子和细胞因子。向基础培养基添加8nM的NME7-AB或8nM的NM23-H1，其被重折叠和纯化为稳定的二聚体。每48小时变更培养基，以及由于加速生长，在接种后的第3天必须收获和传代。图9和图10示出在NM23-H1二聚体中的生长与在NME7单体中的生长的逐日比较。NME7和NM23-H1(NME1)二聚体均多能性地生长并且甚至当100％汇合时也没有分化。如在照片中可以看到的，NME7细胞比在NM23-H1二聚体中生长的细胞更快地生长。在第一次收获时的细胞计数证实。在NME7中的培养比在NM23-H1二聚体中的培养产生1.4倍更多的细胞。典型的多能性标志物的ICC染色证实，NME7-AB完全支持人干细胞生长、多能性并且抵抗分化(图11)。
实施例5-产生NME6和NME7的变体
设计和产生了以下新的NME6和NME7变体：
用于大肠杆菌表达优化的人NM23-H7-2序列：
(DNA)
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(氨基酸)
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:21)
人NME7-A：
(DNA)
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(氨基酸)
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人NME7-A1：
(DNA)
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(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQIDNO:25)
人NME7-A2：
(DNA)
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(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQIDNO:27)
人NME7-A3：
(DNA)
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(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQIDNO:29)
人NME7-B：
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQIDNO:30)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:31)
人NME7-B1：
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQIDNO:32)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN—(SEQIDNO:33)
人NME7-B2：
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQIDNO:34)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:35)
人NME7-B3：
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQIDNO:36)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--(SEQIDNO:37)
人NME7-AB：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQIDNO:38)
(氨基酸)
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人NME7-AB1：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQIDNO:40)
(氨基酸)
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用于大肠杆菌表达优化的人NME7-A序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQIDNO:42)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQIDNO:43)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-A1序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQIDNO:44)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQIDNO:45)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-A2序列：
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQIDNO:46)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQIDNO:47)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-A3序列：
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQIDNO:48)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQIDNO:49)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-B序列：
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQIDNO:50)
(氨基酸)
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用于大肠杆菌表达优化的人NME7-B1序列：
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQIDNO:52)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:53)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-B2序列：
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQIDNO:54)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:55)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-B3序列：
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQIDNO:56)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:57)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-AB序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQIDNO:58)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:59)
用于大肠杆菌表达优化的人NME7-AB1序列：
(DNA)
Atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQIDNO:60)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQIDNO:61)
小鼠NME6
(DNA)
Atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag(SEQIDNO:62)
(氨基酸)
MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWKLEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARYIAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHYSPEEGIHCAAETGGHKQPNKT-(SEQIDNO:63)
人NME6：
(DNA)
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQIDNO:64)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQIDNO:65)
人NME61：
(DNA)
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQIDNO:66)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQIDNO:67)
人NME62：
(DNA)
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQIDNO:68)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQIDNO:69)
人NME63：
(DNA)
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQIDNO:70)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQIDNO:71)
用于大肠杆菌表达优化的人NME6序列：
(DNA)
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQIDNO:72)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQIDNO:73)
用于大肠杆菌表达优化的人NME61序列：
(DNA)
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQIDNO:74)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQIDNO:75)
用于大肠杆菌表达优化的人NME62序列：
(DNA)
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQIDNO:76)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQIDNO:77)
用于大肠杆菌表达优化的人NME63序列：
(DNA)
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQIDNO:78)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQIDNO:79)
可以借助于任何亲和标签来表达NME6和NME7以及新的变体，但是用以下标签来表达：
组氨酸标签
(ctcgag)caccaccaccaccaccactga(SEQIDNO:84)
链霉II标签
(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(SEQIDNO:85)
实施例6-用于大肠杆菌表达优化的人NME7-1序列
NME7wt-cDNA，密码子优化以用于在大肠杆菌中表达，由Genscript(NJ)根据我们的请求产生。使用下列引物由聚合酶链反应(PCR)扩增NME7-1：
正向5’-atcgatcatatgaatcactccgaacgc-3’(SEQIDNO:141)
反向5’-agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg-3’(SEQIDNO:142)
随后将该片段纯化，酶切(NdeI，XhoI)并且克隆在表达载体pET21b的NdeI和XhoI限制性位点之间。
实施例7-用于大肠杆菌表达优化的人NME7-2序列
使用下列引物由聚合酶链反应(PCR)扩增NME7-2：
正向5’-atcgatcatatgcatgacgttaaaaatcac-3’(SEQIDNO:143)
反向5’-agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg-3’(SEQIDNO:144)
随后将该片段纯化，酶切(NdeI，XhoI)并且克隆在表达载体pET21b的NdeI和XhoI限制性位点之间。
实施例8-用于大肠杆菌表达优化的人NME7-A序列
使用下列引物由聚合酶链反应(PCR)扩增NME7-A：
正向5’-atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg-3’(SEQIDNO:145)
反向5’-actgcctcgaggaaaaacagttccatttcacgagctgccgatg-3’(SEQIDNO:146)
随后将该片段纯化，酶切(NdeI，XhoI)并且克隆在表达载体pET21b的NdeI和XhoI限制性位点之间。
实施例9-用于大肠杆菌表达优化的人NME7-AB序列
使用下列引物由聚合酶链反应(PCR)扩增NME7-AB：
正向5’-atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg-3’(SEQIDNO:147)
反向5’-agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg-3’(SEQIDNO:148)
随后将该片段纯化，酶切(NdeI，XhoI)并且在表达载体pET21b的NdeI和XhoI限制性位点之间克隆。所示蛋白表达有C-TermHis标签。
使用下列引物由聚合酶链反应(PCR)扩增NME7-AB：
正向5’-atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg-3’(SEQIDNO:149)
反向5’-agagcaccggtattatccagaattttgaaaaagtattg-3’(SEQIDNO:150)
随后将该片段纯化，酶切(NdeI，AgeI)并且克隆在表达载体pET21b的NdeI和AgeI限制性位点之间，其中由Age1替换XhoI，接着是链霉亲和素标签II和上述His标签之前的两个终止密码子。上述蛋白表达有C-Term链霉亲和素标签II。
实施例10-用于大肠杆菌表达优化的人NME6序列:
使用下列引物由聚合酶链反应(PCR)扩增NME6：
正向5’-atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg-3’(SEQIDNO:151)
反向5’-actgcctcgagtgccggacccagaccacccgtgc-3’(SEQIDNO:152)
随后将该片段纯化，酶切(NdeI，XhoI)并且克隆在表达载体pET21b的NdeI和XhoI限制性位点之间。蛋白表达有C-TermHis标签。
使用下列引物由聚合酶链反应(PCR)扩增NME6：
正向5’-atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg-3’(SEQIDNO:153)
反向5’-actgcaccggttgccggacccagaccacccgtgcg-3’(SEQIDNO:154)
随后将该片段纯化，酶切(NdeI，AgeI)并且克隆在表达载体pET21b的NdeI和AgeI限制性位点之间，其中由Age1替换XhoI，随后是链霉标签II和上述His标签之前的两个终止密码子。并且蛋白表达有C-Term链霉亲和素标签II(C-TermStrepTagII)。
实施例11-产生重组NME7-AB
LB肉汤培养基(Luria-Bertani肉汤培养基)中接种1/10过夜培养物，并在37℃培养直到OD600值达到～0.5。在该点，使用0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，GoldBiotechnology)诱导重组蛋白表达并且5h后培养停止。经离心(6000rpm，40℃10min)收集细胞，之后用运行缓冲液重悬细胞沉淀：PBSpH值为7.4，360mMNaCl和80mM咪唑。然后加入溶菌酶(1mg/mL，Sigma)，MgCl2(0.5mM)和DNA酶(0.5ug/mL，Sigma)。细胞悬浮液在37℃转台(275rpm)上孵育30min，并在冰上超声5min。通过离心(20000rpm离心30min，40℃)除去不溶的细胞碎片。然后将澄清的裂解液施加至用运行缓冲液(runningbuffer)平衡的Ni-NTA柱(Qiagen)。该柱用4CV运行缓冲液清洗，然后用补充有30mM咪唑的4CV的运行缓冲液清洗，再使用补充有70mM咪唑运行缓冲液(6CV)从柱中洗脱蛋白质，随后使用补充有490mM咪唑的运行缓冲液(4CV)进行二次洗脱。NME7-AB通过尺寸排阻色谱法(Superdex200)“FPLC”进行进一步纯化。
实施例12-产生重组NME6
LB肉汤培养基(Luria-Bertani肉汤培养基)中接种1/10过夜培养物，并在37℃培养直到OD600值达到～0.5。在该点，使用0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，GoldBiotechnology)诱导重组蛋白表达并且5h后培养停止。经离心(6000rpm，40℃10min)收集细胞，之后用运行缓冲液(电泳缓冲液，runningbuffer)重悬细胞沉淀：PBSpH值为7.4，360mMNaCl和80mM咪唑。随后加入溶菌酶(1mg/mL，Sigma)，MgCl2(0.5mM)和DNA酶(0.5ug/mL，Sigma)。细胞悬浮液在37℃转台(275rpm)上孵育30min，并在冰上超声5min。通过离心(20000rpm30min，40℃)除去不溶的细胞碎片。然后将澄清的裂解液施加至用运行缓冲液平衡的Ni-NTA柱(Qiagen)。在使用补充有420mM咪唑运行缓冲液(6CV)从柱中洗脱蛋白质之前，清洗该柱(8CV)。通过尺寸排阻色谱法(Superdex200)“FPLC”进行进一步纯化NME6。
实施例13-初始态和始发态基因的定量PCR分析
标准方法用来进行RT-PCR。如下列出使用的引物：使用试剂(Invitrogen)分离RNA并且用RandomHexamers(Invitrogren)使用SuperScriptII(Invitrogen)进行逆转录cDNA，随后使用AppliedBiosystems的基因表达分析(OCT4P/NHs00999634_gH，Nanog的P/NHs02387400_gl，KLF2P/NHs00360439_gl，KLF4的P/NHs00358836_ml，Foxa2的P/NHs00232764_ml，OTX2P/NHs00222238_ml，LHX2P/NHs00180351_ml，XISTP/NHs01079824_ml和GAPDHP/N4310884E)，在AppliedBiosystems7500实时仪上测定基因：FOXA2，XIST，KLF2，KLF4，NANOG和OCT4。每个样品一式3份进行。基因表达归一化(标准化)至GAPDH。数据表示为相对于对照的倍数变化。
实施例14-MUC1拉下试验表明NME1、NME6和NME7结合至MNC1物种蛋白。
在一组细胞上进行使用对MUC1*细胞质尾区(Ab-5)抗体的拉下试验。通过SDS-PAGE分离通过MUC1抗体拉下(pulldown)的蛋白，然后使用蛋白质印迹技术利用特异于NME1、NME6和NME7的抗体探测。MUC1*阳性乳癌细胞系T47D细胞(ATCC)、人胚胎干细胞系BGO1v(LifeTechnologies)、人类ES细胞(HES-3,BioTimeInc.)和人类iPS细胞(SC101A-1,SystemBiosciencesInc.)T47D癌细胞根据ATCC方案在RPMI-1640(ATCC)加10％FBS(VWR)中生长。所有干细胞在具有8nMNM23-RS(重组NME1S120G二聚体)的最小干细胞培养基“MM”中培养。干细胞在用12.5μg/mL的抗-MUC1*C3mab涂覆的塑料制品上生长。在冰上，用200μL的RIPA缓冲液溶解细胞10min。在通过离心法去除细胞碎片之后，将上清液用于免疫共沉淀试验中。使用识别MUC1细胞质尾区并且连接至免疫磁珠蛋白G(DynabeadsproteinG)(LifeTechnologies)的Ab-5抗体(抗-MUC-1Ab-5，ThermoScientific)拉下MUC1*。珠用RIPA缓冲液洗涤两次并且再悬浮在还原缓冲液中。将上清液样品进行还原SDS-PAGE，随后将蛋白转移到PVDF膜。随后用以下各项探测膜：A)抗-NM23-H1(NME1)抗体(C-20,SantaCruzBiotechnology)；B)抗-NME6(Abnova)；或C)抗NM23-H7抗体(B-9,SantaCruzBiotechnology)；D)使用超强信号(Supersignal)(Pierce)增强NME6的染色；以及E)使用超强信号增强NME7的染色。在用它们各自的连接至HRP的二抗孵育之后，通过化学发光检测蛋白。照片示出了天然的NME1、NME6和NME7存在于MUC1*阳性乳癌细胞、人类ES细胞和人类iPS细胞中，并且它们结合至MUC1*。注意到存在于HES-3沉淀中的细胞数目少于存在于其他样品中的数目。
实施例15-重组NM23(S120G突变体H1二聚体)、NME7-AB、以及天然NME7结合至MUC1*胞外结构域肽并且能够诱导受体二聚化。
根据Thompsonetal.(ACSAppl.Mater.Interfaces,2011,3(8),pp2979-2987)，用NTA-SAM表面涂覆30.0nm直径的金纳米颗粒。然后，将NTA-SAM涂覆的金纳米颗粒用等体积的180μMNiSO4活化，在室温下孵育10min，洗涤，并且再悬浮在10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中。然后，在0.5μM的最终浓度下将金纳米颗粒用PSMGFRN-10肽(QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAHHHHHH)(SEQIDNO:155)负载，并且在室温下孵育10min。在指示浓度下将从大肠杆菌表达并且纯化的重组NME7-AB蛋白游离地加入至溶液中。当颗粒固定的蛋白彼此结合，或同时结合至两种不同颗粒上的两种不同的肽时，颗粒溶液颜色从粉红色/红色变化至紫色/蓝色。由于结合至单肽将不会诱导两种或多种颗粒达到彼此靠近，如果游离地加入至溶液中的蛋白引起颗粒聚集，则存在强有力的证据表明游离蛋白使同源肽二聚。
图7(A)示出了NTA-Ni-SAM涂覆的负载有PSMGFRN-10肽的纳米颗粒。将NME7-AB在指示浓度下游离地加入至溶液中。来自颗粒聚集的从粉红色到紫色/蓝色的溶液颜色变化表明颗粒上的MUC1*肽和溶液中游离的NME7之间的结合。该结果表明溶液中的NME7具有针对MUC1*肽的两个结合位点。抗-MUC1*抗体的Fab完全抑制结合，表明颗粒聚集是由于MUC1*肽和NME7的特异性相互作用。(B)示出了在较宽的浓度范围内游离地加入至溶液中的NME7-AB。观察到了表明NME7可以同时结合至两种肽的颗粒聚集。(C)示出了加入至溶液中的所有蛋白，NME7-AB几乎立即变为紫色。NM23-RS(H1二聚体)也开始几乎立即变化为紫色。包含天然NME7的T47D乳癌细胞系溶解产物也显著地变为紫色。
实施例16-如通过在具有标明的X染色体失活(这是始发态的特点)的细胞核中缺少浓缩的(condensed)组蛋白-3所证明的，在NME1二聚体或NME7中培养的人类ES和iPS细胞处于初始态状态。
在最小培养基(MinimalMedia，“MM”)加NME1二聚体(NM23-RS)或NME7(NME7-AB构建体)中培养人类ES(HES-3干细胞，BioTimeInc)和iPS(SC101A-Ipsc,SystemBiosciences)细胞8-10代。将细胞接种到已经用12.5μg/mL的结合至MUC1*受体的PSMGFR序列的远端部分的抗-MUC1*单克隆抗体(MN-C3)涂覆的VitaTM板(ThermoFisher)上。周期性地贯穿10代，通过免疫细胞化学(ICC)试验测定干细胞的样品并且在共聚焦显微镜(ZeissLSM510共聚焦显微镜)上分析以确定组蛋白-3的细胞定位。如果组蛋白-3在细胞核中浓缩(以单点出现)，那么X染色体的拷贝已经失活并且细胞不再处于纯基态(puregroundstate)或初始态。如果干细胞已经从始发态(通过在FGF中培养，所有商业可获得的干细胞已经被驱动至始发态)回复至初始态状态，那么组蛋白-3将被视为“云”，如斑点状散布的或不可检测。图12示出了根据标准方案，除它们已经在FGF中在MEF上生长之外，来自相同来源的对照细胞，均示出了在细胞核中浓缩的组蛋白-3(H3K27me3)，证实它们均100％处于始发态状态而不是处于初始态状态。相反地，在NME7中培养10代的相同来源的细胞大部分为不具有浓缩的组蛋白-3的干细胞，表明它们是前X失活并且处于真正的初始态状态。图12所示的插图是分离的为100％初始态的许多克隆之一。
实施例17-检测胚胎干细胞和iPS细胞中的NME7
将人类ES细胞(BGO1v和HES-3)以及iPS细胞(SC101-A1)在基于NME的培养基中培养，其中细胞接种在抗-MUC1*抗体的层上。为了识别NME7物种，收获并且用补充有蛋白酶抑制剂(Pierce)的RIPA缓冲液(Pierce)溶解细胞。细胞溶解产物(20μL)通过12％SDS-PAGE还原凝胶上的电泳分离并且转移到PVDF膜(GEHealthcare)。印迹用包含3％的牛奶的PBS-T封闭，然后在4℃下用一抗(抗NM23-H7克隆B-9，SantaCruzBiotechnology)孵育过夜。在用PBS-T洗涤之后，膜用辣根过氧化物酶(HRP)-结合的二抗(山羊抗小鼠，Pierce)在室温下孵育1h。用Immun-Star化学发光试剂盒(Bio-Rad)检测信号。Western印迹示出了NME7以～40kDa物质以及可以是可变剪接同种型或翻译后修饰如切割的～25-33kDa的较小分子量NME7物质存在。
实施例18-检测iPS条件培养基中的NME7
通过12％SDS-PAGE还原凝胶上的电泳分离iPS条件培养基(conditionedmedia)(20μL)并且转移到PVDF膜(GEHealthcare)。印迹用包含3％的牛奶的PBS-T封闭，然后在4℃下用一抗(抗NM23-H7克隆B-9，SantaCruzBiotechnology)孵育过夜。在用PBS-T洗涤之后，膜用辣根过氧化物酶(HRP)-结合的二抗(山羊抗小鼠，Pierce)在室温下孵育1h。用Immun-Star化学发光试剂盒(Bio-Rad)检测信号。Western印迹示出了具有约30kDa的分子量的分泌的NME7物质。注意到：重组NME7-AB具有33kDa的分子量并且如此能够同时结合至两个MUC1*肽并且还完全支持多能性干细胞生长，诱导多能性并且抑制分化。～25-30kDa的NME7物质可以是可变剪接同种型(alternativespliceisoform)或翻译后修饰如切割，其可以使得能够从细胞分泌。
实施例19-NME7免疫沉淀和通过质谱分析
使用NME7特异性抗体(NM23H7B9,SantaCruz)，在一组MUC1*阳性细胞上进行拉下试验。根据标准方案(T47D)培养乳癌细胞(T47D)以及人类ES(BGO1v和HES-3)和iPS(SC101-A1)细胞或在抗-MUC1*抗体表面上、在基于NME的培养基中培养。用补充有蛋白酶抑制剂(Pierce)的RIPA缓冲液(Pierce)溶解细胞。用在4℃下孵育2h的10μg的重组NME7-AB补充细胞溶解产物。然后，NME7在4℃下用连接至磁珠蛋白G(Lifetechnologies)的抗NM23-H7(B-9,SantaCruzBiotechnology)免疫沉淀过夜。珠用PBS洗涤两次并且通过12％SDS-PAGE还原凝胶上的电泳分离免疫沉淀蛋白。通过银染(Pierce)检测蛋白。与NME7共免疫沉淀的来自T47D样品和BGO1v细胞的蛋白的～23kDa带被切除并且通过质谱分析(TaplinMassSpectrometryFacility,HarvardMedicalSchool)。质谱分析表明被切除的蛋白条带均包含如以下示出的来自NME7NDPKA结构域的序列。通过质谱识别NME7的A结构域中的下划线序列。
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRAL FGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQIDNO:156)
没有使用质谱分析与NME7免疫沉淀的较高分子量(～30kDa)的蛋白条带并且可以相应于可以是切割产物的内源性NME7蛋白或可变剪接同种型或可替换地可以是添加至细胞溶解产物的NME7-AB～33kDa。
实施例20-表明NME7-AB同时结合至两个MUC1*胞外结构域肽的ELISA试验
使用Imject马来酰亚胺活化的BSA试剂盒(ThermoFisher)，将带有C-端半光氨酸(PSMGFR-Cys)的PSMGFR肽共价结合至BSA。在0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6中，将PSMGFR-Cys连接的BSA稀释成10μg/mL，并且将50μL加入至96孔板的每一孔中。在4℃下过夜孵育之后，用PBS-T将板洗涤两次并且加入3％的BSA溶液以封闭孔上的剩余结合位点。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤两次并且以不同的浓度加入稀释在PBS-T+1％BSA中的NME7。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤3x次并且以1/500稀释率加入稀释在PBS-T+1％BSA中的抗-NM23-H7(B-9,SantaCruzBiotechnology)。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤3x次并且以1/3333的稀释率加入稀释在PBS-T+1％BSA中的山羊抗小鼠-HRP。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤3x次并且使用ABTS溶液(Pierce)在415nm下测定NME7的结合。
ELISAMUC1*二聚：使用针对NME7结合的方案并且以11.6μg/mL使用NME7。
在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤3x次并且以不同的浓度加入稀释在PBS-T+1％BSA中的His标记的PSMGFR肽(PSMGFR-His)或生物素化的PSMGFR肽(PSMGFR-生物素)。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤3x次并且以1/5000的浓度加入稀释在PBS-T+1％BSA中的抗His标签-HRP(Abcam)或链霉亲和素-HRP(Pierce)。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤3x次并且使用ABTS溶液(Pierce)在415nm下测定PSMGFR肽与已经结合至另一个PSMGFR肽(通过抗-His抗体或通过链霉亲和素可能没有信号)连接BSA的NME7的结合。
实施例21-NME6克隆、表达和纯化
由Genscript,NJ对于我们的要求合成了用于大肠杆菌表达的密码子优化的WTNME6cDNA。然后，使用以下引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增WTNME6cDNA：5'-atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg-3'(SEQIDNO:157)和5'-actgcctcgagtgccggacccagaccacccgtgc-3'(SEQIDNO:158)。在用NdeI和XhoI限制性酶(NewEnglishBiolabs)消化之后，将纯化的片段克隆到用相同限制性酶消化的pET21b载体(Novagen)中。
实施例22-NME6蛋白表达/纯化
LB肉汤培养基(Luria-Bertani肉汤培养基)用1/10的过夜培养基接种并且在37℃下培养直至OD600达到～0.5。在该点，用0.4mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,GoldBiotechnology)诱导重组蛋白表达并且在5h之后停止培养。在通过离心法(在4℃下以6000rpm离心10min)收获细胞之后，用运行缓冲液：PBSpH7.4、360mMNaCl、10mM咪唑和8M尿素再悬浮细胞沉淀物。在37℃下在转台(275rpm)上孵育细胞悬浮液30min并且在冰上超声处理5min。通过离心(在4℃下以20000rpm离心30min)除去不溶的细胞碎片。然后，将澄清的溶解产物施加到用运行缓冲液平衡的Ni-NTA柱(Qiagen)。用4CV的运行缓冲液洗涤柱，然后，4CV的用30mM的咪唑补充运行缓冲液，再用由420mM咪唑补充的运行缓冲液(8CV)从柱洗脱蛋白。然后，通过透析将蛋白复性。
实施例23-复性方案
1.对100mMTrispH8.0、4M尿素、0.2mM咪唑、0.4ML-精氨酸、1mMEDTA和5％的甘油透析过夜。
2.对100mMTrispH8.0、2M尿素、0.2mM咪唑、0.4ML-精氨酸、1mMEDTA和5％的甘油透析24h。
3.对100mMTrispH8.0、1M尿素、0.2mM咪唑、0.4ML-精氨酸、1mMEDTA和5％的甘油透析24h。
4.对100mMTrispH8.0、0.2mM咪唑、0.4ML-精氨酸、1mMEDTA和5％的甘油透析8h。
5.对25mMTrispH8.0、0.2mM咪唑、0.1ML-精氨酸、1mMEDTA和5％的甘油透析过夜。
6.对PBSpH7.4、0.2mM咪唑、1mMEDTA和5％的甘油透析3x3h。
7.对PBSpH7.4、0.2mM咪唑、1mMEDTA和5％的甘油透析过夜。
8.在4℃下离心复性的蛋白(18,500rpm)30min并且收集上清液用于进一步纯化。通过尺寸排阻色谱法(Superdex200)进一步纯化蛋白。
通过引用将本文中引用的所有参考文献的全部内容合并于此。
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本领域技术人员只需使用常规试验就将会意识到或能够确定本文中具体描述的本发明的具体实施方式的许多等同物。这些等同物旨在包含在权利要求的范围内。

Claims (72)

1.一种抑制NME家族成员蛋白的功能的药剂。
2.根据权利要求1所述的药剂，其中，所述药剂是抗体。
3.根据权利要求2所述的药剂，其中，所述抗体是Fab、单价的、二价的、或IgM、双特异性人的或人源化的。
4.根据权利要求1所述的药剂，其中，所述药剂是小分子。
5.根据权利要求1所述的药剂，其中，受到抑制的所述NME家族成员蛋白的功能是以下能力：促进干细胞增殖和/或抑制分化；促进癌细胞增殖和/或抑制分化；结合于MUC1*；结合于DNA；作为转录因子；由细胞所分泌；或形成二聚体。
6.根据权利要求1所述的药剂，其中，所述NME家族成员是NME7或NME7-AB。
7.根据权利要求6所述的药剂，其中所述药剂是抑制NME7或NME7AB的致瘤活性的抗体。
8.根据权利要求6所述的药剂，其中，所述NME家族成员是具有25至33kDa之间的分子量的NME7的变体。
9.根据权利要求1所述的药剂，其中，所述NME家族成员是NME6。
10.根据权利要求1所述的药剂，其中，所述NME家族成员是NME1。
11.一种用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予所述患者有效量的抑制NME家族成员蛋白的致瘤活性的药剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述NME家族成员蛋白是NME7、NME6、或NME1。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，所述药剂抑制NME7而非NME1。
14.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，所述药剂抑制在NME7和MUC1*之间的结合。
15.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，所述药剂抑制在NME7和同源核酸结合位点之间的结合。
16.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，所述药剂是抗体。
17.一种用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予所述患者有效量的作为六聚体的NME1。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述NME1是偏好六聚体状态的突变体或变体。
19.一种用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予所述患者有效量的作为单体的NME6。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述NME6是偏好单体状态的突变体或变体。
21.一种用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予所述患者有效量的作为单体的NME1。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述NME1是偏好单体状态的突变体或变体。
23.一种用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予所述患者有效量的肽或肽模拟物，所述肽或肽模拟物抑制NME家族成员与它的同源受体的相互作用。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述同源受体是MUC1。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中，所述肽衍生自MUC1、PSMGFR、N-10PSMGFR、N-15PSMGFR、N-20PSMGFR的MUC1*部分。
26.一种用于分类癌症或分层患有或怀疑患有癌症的患者的方法，包括以下步骤：
(i)对于干细胞或祖细胞基因或基因产物的存在分析患者样品；以及
(ii)对共享干细胞或祖细胞基因或基因产物的类似表达或表达水平的患者进行分组。
27.根据权利要求26所述的方法，进一步包括：
(iii)用抑制那些干细胞或祖细胞基因或基因产物的药剂来治疗所述患者。
28.根据权利要求26所述的方法，进一步包括：
(iii)分析所述干细胞或祖细胞基因或基因产物以评估所述癌症的严重程度，其中是早期干细胞或祖细胞状态的特征的基因或基因产物的表达或较高表达表明更具攻击性的癌症，并且是晚期祖细胞状态的特征的基因或基因产物的表达或较高表达表明较少攻击性的癌症；
(iv)设计与治疗患有如在步骤(iii)中确定的更具或较少攻击性的癌症的患者相应的疗法；以及
(v)用按照在步骤(iv)中设计的疗法来治疗患者。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述患者样品是血液、体液、或活检。
30.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述基因或基因产物是NME家族蛋白。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，指示早期干细胞状态的所述基因或基因产物是NME7。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，指示早期干细胞状态的所述基因或基因产物是NME6。
33.一种抑制NME家族成员蛋白和其胞外域缺乏串联重复域的MUC1跨膜蛋白的相互作用的药剂，其中，相比于所述药剂与其胞外域缺乏在成人中健康细胞上存在的串联重复域的所述MUC1跨膜蛋白的结合，所述药剂以更高亲和力结合于在癌细胞上的MUC1*。
34.根据权利要求33所述的药剂，其中，所述药剂是抗体。
35.根据权利要求33所述的药剂，其中，所述药剂是天然产物。
36.根据权利要求33所述的药剂，其中，所述药剂是合成化学品。
37.根据权利要求33所述的药剂，其中，所述药剂是核酸。
38.一种用于抑制在细胞中NME家族成员蛋白和其胞外域缺乏串联重复域的MUC1跨膜蛋白的相互作用的方法，包括使所述细胞接触一种药剂，其中，相比于所述药剂与其胞外域缺乏在成人中健康细胞上的串联重复域的MUC1跨膜蛋白的结合，所述药剂以更高亲和力结合于在癌细胞上的MUC1*。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述药剂是抗体。
40.根据权利要求38所述的方法，其中，所述药剂是天然产物。
41.根据权利要求38所述的方法，其中，所述药剂是合成化学品。
42.根据权利要求38所述的方法，其中，所述药剂是核酸。
43.一种用于识别权利要求33的药剂的方法，包括
确定所述药剂对于在癌细胞上存在的MUC1*的亲和力，
确定所述药剂对在干细胞或祖细胞上存在的MUC1*的亲和力，以及
选择一种药剂，相比于所述药剂与在干细胞或祖细胞上存在的MUC1*结合的能力，所述药剂更好地结合于在癌细胞上存在的MUC1*，因而识别所述药剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述药剂是抗体。
45.根据权利要求43所述的方法，其中，所述药剂是天然产物。
46.根据权利要求43所述的方法，其中，所述药剂是合成化学品。
47.根据权利要求43所述的方法，其中，所述药剂是核酸。
48.根据权利要求43所述的方法，其中，所述干细胞或祖细胞是胚胎干细胞、iPS细胞、脐带血细胞、骨髓细胞或造血祖细胞。
49.根据权利要求33-37中任一项所述的药剂，其中，所述NME家族成员蛋白是NME7、NME6或细菌NME。
50.根据权利要求38-48中任一项所述的方法，其中，所述NME家族成员蛋白是NME7、NME6或细菌NME。
51.一种在生殖细胞和体细胞中表达人NME蛋白的转基因哺乳动物，其中，所述生殖细胞和体细胞包含核酸，所述核酸编码引入所述哺乳动物的人NME。
52.根据权利要求51所述的转基因哺乳动物，其中，可诱导地表达所述NME蛋白。
53.根据权利要求51所述的转基因哺乳动物，其中，所述NME蛋白是NME7或NME7-AB。
54.一种用于产生哺乳动物的方法，所述哺乳动物以更加紧密地近似于人的响应的方式响应癌症，其中所述哺乳动物是其中表达人NME蛋白的哺乳动物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述癌症是自发产生的或移植自培养的细胞或移植自人类。
56.根据权利要求54所述的方法，其中，所述NME蛋白是NME1二聚体或NME7单体。
57.根据权利要求54所述的方法，其中，所述哺乳动物是转基因的，其中所述哺乳动物在生殖细胞和体细胞中表达人MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中所述生殖细胞和体细胞包含引入所述哺乳动物的重组人MUC1或MUC1*或NME蛋白基因序列。
58.根据权利要求54所述的方法，其中，可诱导地表达所述NME蛋白。
59.根据权利要求54所述的方法，其中，所述NME蛋白是NME7或NME7-AB。
60.一种用于在哺乳动物中增加人肿瘤的植活的方法，包括在将细胞注入测试哺乳动物之前使所述人肿瘤细胞和NME1二聚体或NME7单体混合。
61.一种用于产生抗体的方法，包括将NME家族蛋白或一种或多种其肽片段注射至哺乳动物中并收获所述抗体或产生抗体的细胞。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NME7或NME7-AB。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述肽片段选自SEQIDNO:88-140，更优选88-133，更优选88-121。
64.一种用于产生或选择抗体或抗体样分子的方法，所述抗体或抗体样分子特异性地结合于NME家族蛋白或其肽片段，包括：
(i)借助于所述NME家族蛋白或肽片段来筛选抗体库或抗体片段或表位的库；
(ii)测定与所述NME家族蛋白或其肽片段的结合；以及
(iii)识别特异性地结合的抗体或抗体样分子。
65.根据权利要求64所述的方法，进一步包括配制所述识别的抗体或抗体样分子用于给予患者以治疗或预防癌症。
66.根据权利要求64所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NME7或NME7-AB。
67.根据权利要求66所述的方法，其中，所述肽片段选自SEQIDNO:88-140，更优选88-133，更优选88-121。
68.一种通过用NME家族蛋白或其一种或多种肽片段接种人来预防癌症的方法。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，所述一种或多种肽片段包含其序列存在于NME家族蛋白中的一种或多种肽，所述肽可选地与载体、佐剂混合，或附着于免疫原性剂。
70.根据权利要求68所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NME1、NME6、NME7或NME7-AB。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，肽选自由具有如阐述为SEQIDNO:88-140，更优选88-133，更优选88-121的氨基酸序列的肽组成的组。
72.根据权利要求68所述的方法，其中，所述肽的序列不存在于人NME-H1中。
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