CN105582525B - Cirp在制备端粒酶结合剂或端粒酶活性调控剂方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人冷诱导RNA结合蛋白(cold‑inducible RNA binding protein,CIRP)在制备端粒酶结合剂或端粒酶活性调控剂方面的应用。CIRP直接作用于人端粒酶的RNA组分(TERC)并通过该RNA组分与端粒酶蛋白组分hTERT相互作用。CIRP参与调控端粒酶蛋白组分的表达并且参与端粒的长度调控。在肿瘤细胞中，下调CIRP的表达可降低端粒酶活性。因此，CIRP可用于制备干细胞全能性正向调控剂或维持剂。CIRP抑制剂也可用于制备端粒酶阳性肿瘤药物。

Description

CIRP在制备端粒酶结合剂或端粒酶活性调控剂方面的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种新的端粒酶调控剂，更具体地说，涉及CIRP在制备端粒酶结合剂或端粒酶活性调控剂方面的应用。

背景技术

端粒(Telomere)作为真核生物染色体末端的特殊结构，是由高度重复的序列(TTAGGG)及其相互作用蛋白所组成。作为线性染色体末端的这一特殊结构如果没有得到有效的保护则会被细胞内的信号蛋白识别为DNA损伤从而引起修复反应。这种修复将会导致细胞进入周期阻滞或者衰老的状态。为此，真核生物进化出了一套保护端粒的机制，在端粒上结合有起保护作用的蛋白质shelterin,shelterin由六个核心蛋白质组成(TRF1,TRF2,TPP1,POT1,RAP1,TIN2)可以使细胞区分正常的染色体末端和DNA损伤，从而避免引起细胞的修复反应，并且这些蛋白可维持端粒的稳定性。shelterin特异性的定位于端粒，并且在细胞的整个周期中均高表达，shelterin通过与其他结合的蛋白一起构成保护端粒的蛋白质作用网络，由此有科学家提出了Telomere Interactome的概念。在正常的人体细胞中，端粒由于DNA聚合酶的非完整复制过程而逐渐变短。大量的细胞培养实验已经证实，端粒在决定动植物寿命以及细胞衰老过程中起重要作用，长期培养的老化细胞端粒变短，染色体也会变得极不稳定。早代细胞端粒较长，随着年龄的增长变得越来越短，最终端粒的消失会导致染色体发生畸变，从而使细胞丧失增殖能力而进入衰老状态。揭示参与真核生物基因组稳定性调节的蛋白质复合体，特别是在维持端粒过程中的信号通路对于研究人类细胞的衰老过程具有十分重要的意义。

端粒酶是一种核糖核酸蛋白质复合物，由互补于端粒DNA的RNA亚基(humantelomerase RNA,hTR)和具有逆转录酶活性的端粒酶催化亚基(human telomerasereverse transcriptase,hTERT)及端粒酶相关蛋白(telomerase associated protein,TEP)组成，其中hTR和hTERT组成端粒酶的最基本核心结构。hTR在所有组织中均有高表达，而hTERT则限于大部分的肿瘤细胞如胃癌、肝癌、大肠癌以及干细胞、生殖细胞、活化的淋巴细胞中。大量证据表明hTERT是端粒酶活性调控的关键组分。

端粒酶的活性调节发生在细胞内多个水平，包括转录，翻译，翻译后修饰以及hTR和hTERT的修饰，转运以及在亚细胞的定位，端粒酶核蛋白组装，端粒酶核蛋白在端粒上的组装以及功能发挥等过程。研究和阐明端粒酶在肿瘤细胞中被激活而正常细胞被抑制的调控机制，不仅对于肿瘤的诊断和治疗具有极为重要的意义，而且对干细胞全能性的维持具有积极的意义。

然而，目前关于端粒酶活性调节方面的研究仍较有限。有效的端粒酶活性调节剂的研发，对于端粒酶阳性肿瘤的治疗和诊断以及干细胞的利用等，都具有重要的现实意义。

发明内容

本发明首次提供了CIRP在制备端粒酶结合剂或端粒酶活性调控剂方面的应用，提供了一种全新的端粒酶调节剂，对于多种与端粒酶活性相关的生物学应用具有重大的推动作用。

冷诱导RNA结合蛋白CIRP(cold-inducible RNA binding protein,CIRP)最早是1997年由Nishiyama等在小鼠睾丸中分离得到的。十多年来，国内外多位科学家以人和多种动物培养细胞(包括重组细胞)为主要研究对象，针对CIRP进行了广泛研究。并且揭示了CIRP基因的一些重要生物学功能。目前，科学家们已经证实CIRP不仅具有介导冷诱导的细胞生长抑制作用，而且可能参与人和动物的生殖发育、神经发育与调节、胚胎发育、肿瘤发生以及动物冬眠等生理学过程。然而，此前所有关于CIRP的研究并没有发现其对端粒酶活性具有重要的调控作用。

发明人首次发现并解析了冷诱导RNA结合蛋白CIRP在调控肿瘤细胞端粒长度中的功能。

CIRP在端粒酶阳性细胞中与端粒酶蛋白亚基hTERT共定位，并且定位于端粒，通过调控端粒酶活性维持端粒长度，从而调控细胞的生长与增殖，其蛋白水平与端粒长度呈正相关。

具体地，CIRP可与端粒酶相互作用，发明人通过实验发现这种作用是依赖于端粒酶的RNA亚基-hTERC，CIRP通过与TERC的结合而和端粒酶相互作用，CIRP同时也参与端粒酶蛋白亚基hTERT的RNA水平调节而调节端粒酶活性，进而参与端粒长度的调控，从而参与细胞生长与增殖的调控。

CIRP与端粒酶相互作用可能是通过端粒酶的核心RNA亚基hTERC直接作用的，并且与端粒酶蛋白亚基hTERT间接作用。

CIRP也定位于卡哈尔小体(端粒酶组装区域)上。

另外CIRP与端粒酶的蛋白亚基hTERT共定位于细胞，通过调控hTERT的表达而影响端粒酶活性以及端粒长度变化。实验发现当敲低CIRP的表达时，细胞端粒的长度显著变短。

因此，CIRP在端粒酶阳性细胞中有重要的端粒调控功能，可以针对其调控机制制备有效的细胞调控剂。

本发明首次提供了CIRP在制备端粒酶结合剂或端粒酶活性调控剂方面的应用。

优选地，CIRP可用于制备端粒长度维持剂。而CIRP抑制剂则可以作为端粒长度的负向调控剂。

除此，通过检测CIRP表达量，可以用于检测或预测端粒酶阳性细胞的生长情况。

作为一种可选的方案，CIRP可用于制备干细胞全能性/多能性正向调控剂或维持剂。

优选地，所述的干细胞为全能干细胞或多能干细胞。

已有研究表明，端粒酶缺失、端粒缩短或功能异常会降低多能性胚胎干细胞(ES细胞)在体内的发育和分化能力，端粒长度对ES/iPSC细胞等的发育潜能具有重要作用，端粒长度检测可以作为评价干细胞系多能性的一个重要指标。

而本发明首次发现了CIRP的正向调控可以调节端粒酶的活性、维持端粒长度，这对正向调控及维持干细胞的全能性/多能性具有重要的作用。由于CIRP的表达有利于端粒长度的维持，CIRP的表达量与干细胞的全能性/多能性具有一定的正相关关系，因此通过检测CIRP的表达量，可以用于评价干细胞的全能性/多能性。

作为另一种可选的方案，CIRP抑制剂可用于制备端粒酶阳性肿瘤药物，以利于个性化的有效治疗。

关于CIRP与肿瘤的关系方面，目前已有相关研究表明CIRP可能在肿瘤细胞的发生发展过程中发挥极为重要的功能。然而，对于不同的肿瘤细胞而言，CIRP所起的作用可能是不同的甚至是相反的。

Ana Artero-Castro等发现在原代细胞中CIRP可通过激活细胞外信号调节激酶-1/2帮助原代细胞绕过复制衰老，从而实现细胞永生化。而下调表达CIRP则会降低这些细胞的增殖能力。Yu Zeng等人研究CIRP功能时发现在前列腺癌细胞中冷诱导蛋白CIRP和RBM3是被上调表达的。当用siRNA下调表达CIRP和RBM3时，前列腺肿瘤细胞的存活降低并且对化学治疗的敏感性增强。这表明在肿瘤细胞中，冷诱导RNA结合蛋白CIRP发挥了重要的功能。另外还有研究表明CIRP的表达以及定位会受到温度条件的影响。当细胞在低温条件(32℃)或者UV照射以及低氧条件下，其表达量均会上升；在人和小鼠的细胞系中CIRP主要定位于细胞核中。CIRP在人精子细胞质中也可检测到高表达，Frederic等发现在结肠癌RKO细胞中伴随着紫外线照射进行从细胞核到细胞质转位。Lleonart ME等发现CIRP在33％的克隆性增生中和45％的乳腺癌患者中过表达的事实支持它参与了肿瘤的生长。

除此也有研究表明，CIRP除了作为致癌蛋白之外，也可能起到抗癌作用。Y Zeng等人的研究表明CIRP可减少前列腺细胞(LNCaP and PC-3)的增生，提示显示CIRP可能是治疗前列腺癌新的药物。

尽管已有研究表明CIRP参与了癌症的发生和发展，然而对于其机制尚不明确，使得癌症药物的利用缺乏针对性或个性化的治疗方案或干预手段。

本发明首次阐明了在肿瘤细胞中CIRP调节端粒酶蛋白亚基hTERT表达，正向调控端粒长度。

由于并非所有的癌细胞都是依靠端粒酶维持永生的，据现有研究表明，约85％的癌细胞依靠端粒酶来维持端粒长度和细胞永生；另10％的肿瘤细胞不依靠端粒酶来维持端粒长度，这些细胞具有无限分裂的能力，但检测不到端粒酶活性。因此，本发明的研究结果，可以使得敲低或抑制CIRP的肿瘤治疗手段具有进一步的针对性治疗方案，也即是说，在采用CIRP抑制剂用于治疗肿瘤时，应当先判断该肿瘤是否为端粒酶阳性肿瘤，例如，可以通过检测端粒酶活性来判断相应的个体情况，只有在排除掉端粒酶阴性肿瘤的情况下，才采用CIRP抑制剂作为治疗手段，以减少无效用药和治疗造成的时间拖延和药物滥用。

作为另一种可选的方案，CIRP可用于制备端粒酶hTERT调控剂/抑制剂。

由于hTERT亚基在端粒酶中扮演着重要的角色，在端粒及端粒酶的研究领域中，hTERT的功能是重要的研究对象。本发明提供了一种全新的hTERT调控剂，这为hTERT功能的研究提供了重要的研究手段。

上述的CIRP可以是CIRP蛋白、基因或与CIRP转录/表达相关的调控单元。优选地，为人CIRP。

附图说明

图1为内源CIRP蛋白在不同细胞中与端粒的共定位情况。

图2为内源CIRP在不同细胞中与卡哈尔小体的共定位情况。

图3为内源CIRP在不同细胞中与卡哈尔小体共定位实验的统计数据。

图4为内源CIRP在HTC75细胞中与端粒酶蛋白亚基hTERT共定位情况。

图5为内源CIRP在HTC75细胞中与端粒酶蛋白亚基hTERT共定位实验的统计数据。

图6为BiFC技术原理示意图以及CIRP与端粒酶蛋白亚基hTERT的BiFC实验流式结果。其中。

图7为CIRP与端粒酶蛋白亚基hTERT的体内免疫共沉淀实验结果(A)以及RNA酶处理之后的体内免疫共沉淀实验结果(B)。

图8为CIRP的蛋白序列以及突变体示意图。

图9为CIRP全长及突变体的免疫沉淀结合端粒酶活性实验结果。

图10为敲低内源CIRP表达结合端粒酶活性实验统计结果以及蛋白水平检测结果。

图11为敲低内源CIRP表达后检测端粒酶蛋白及RNA亚基表达水平实验结果。

图12为CIRP敲低细胞系中端粒长度的变化图，右侧为western blot检测CIRP敲低效率以及长度变化统计数据。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备；未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。

本发明为了研究冷诱导RNA结合蛋白CIRP对细胞的调控功能，具体实验设计如下：

S1.免疫荧光实验，检测内源CIRP在端粒上的定位情况；

S2.双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)实验以及免疫荧光实验，研究CIRP与端粒酶相互作用机制。进一步地，通过体外免疫沉淀实验验证CIRP与端粒酶的作用。

S3.免疫沉淀结合端粒酶活性实验，研究CIRP与端粒酶的相互作用以及相互作用的区域。

S4.敲低HTC75细胞中CIRP表达水平，研究CIRP与端粒长度变化的关系。

以下实验所用到的蛋白CIRP，是通过从哈佛医学院ORFeome数据库购买包含其序列的入门载体pDONR223，然后连接到含有不同标签(如SFB,HA,GST)的表达载体中，再通过大肠杆菌原核表达或者真核细胞中表达得到。

Hela细胞、HTC75细胞、293T细胞(人肾上皮细胞)，均购于上海中国科学院细胞库。

实施例1免疫荧光实验

1、实验材料

试剂：本实验所用兔多抗CIRP內源抗体(购于Abcam公司，产品货号ab94999)，使用时用3％牛血清蛋白(BSA)按1:500稀释；Coilin抗体(购于Abcam公司，产品货号ab11822)，使用时用3％BSA按1:2000稀释；HA抗体(购于sigma公司，产品货号H3663)，使用时用3％BSA按1:500稀释；二抗(羊抗鼠，购于LI-COR公司，产品货号926-68050，羊抗兔，购于LI-COR公司，产品货号926-32211)，使用时用3％BSA按1:10000稀释。

2、实验方法

S1.将细胞接种至预先加有盖玻片的培养皿中，待细胞生长至70-80％即可。抽掉培养液，用预冷的PBS清洗两次，去掉残余培养基。

S2.预透化：弃PBS，加透化液室温预透化5min。

S3.固定：弃透化液，加固定液冰上固定20min。弃固定液，PBS洗2次。

S4.透化：弃PBS，加透化液室温下透化30min。弃透化液，PBS洗3次，每次10min。

S5.封闭：封闭液室温封闭1h。

S6.一抗孵育：一抗用封闭液稀释，每个玻片加20μl抗体,4℃湿盒中孵育过夜。

S7.二抗孵育：用PBS洗三次，每次10min。二抗用封闭液稀释，室温孵育1h，避光操作。用PBS洗三次，每次10min。

S8.标记片子并且染核：取VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI和VECTASHIELD Mounting Medium按1：3的比例混匀。取3μl于载玻片上。将玻片附有细胞面倒扣于载玻片mounting medium上，避免气泡，室温干燥5min后用指甲油封玻片防止移动。避光4℃保存或直接置于荧光显微镜下观察。

3、实验结果

结果如图1-5所示。

图1显示了内源CIRP蛋白在不同细胞中与端粒的共定位情况。各蛋白荧光信号与图片上方标示蛋白相对应。两个Control分别为在两种肿瘤细胞系中单独孵育TRF2抗体和检测，无CIRP抗体，确定抗体的特异性结合，DAPI表示单独染细胞核的染料，Merge表示三种荧光信号合并之后得到的荧光信号。由结果可知，在CIRP与端粒蛋白TRF2共定位的情况下，我们可以在合并的图片看到CIRP与TRF2的荧光信号结合到一起，呈现第三种颜色，无共定位的蛋白则只显示一种已有的信号。因此可以看到在这两种细胞中CIRP蛋白的荧光信号都和TRF2蛋白的荧光信号有重叠，内源CIRP在不同肿瘤细胞系中均与端粒有部分共定位。

图2显示了内源CIRP在不同细胞中与卡哈尔小体的共定位情况。各蛋白荧光信号与图片上方标示蛋白相对应。Neg Ctrl是单独孵育Coilin抗体的对照组。Coilin是卡哈尔小体的标记蛋白，Merge表示前面两张图片的合并之后的结果。图3显示了内源CIRP在不同细胞中与卡哈尔小体共定位实验的统计数据。由结果可知，在肿瘤细胞系HTC75和HeLa细胞中，CIRP蛋白与卡哈尔小体的标记蛋白Coilin都有接近30％的共定位，为对照组没有共定位。免疫荧光实验证明内源CIRP与端粒酶组装区域卡哈尔小体(Cajal body)有部分共定位。

图4显示了内源CIRP在HTC75细胞中与端粒酶蛋白亚基TERT共定位情况，各蛋白荧光信号与图片上方标示蛋白相对应。Anti-HA表示抗体检测标签蛋白HA表达，而SecondaryAntibody表示免疫荧光使用二抗，不孵育一抗，hTERT-HA表示蛋白TERT连接HA标签蛋白标签共表达的蛋白，Anti-HA与Secondary Antibody作为阴性对照(Negative Control)。图5为内源CIRP在HTC75细胞中与端粒酶蛋白亚基hTERT共定位实验的统计数据。由结果可知，作为负对照实验组的Anti-HA没有共定位的荧光信号，而实验组的CIRP与端粒酶亚基hTERT则有约40％的共定位信号，由此可知，内源CIRP在肿瘤细胞HTC75细胞中与端粒酶蛋白亚基hTERT有部分共定位。

实施例2双分子突光互补实验(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)

1、实验方法

BiFC质粒构建：经LR反应将CIRP从pEntry入门载体克隆入含YFPn(黄色荧光蛋白1-155氨基酸)的逆转录病毒表达载体pBabe-CMV-DEST-YFPn–neo，将TPP1和hTERT克隆入含YFPc(黄色荧光蛋白156-239氨基酸)的逆转录病毒表达载体pBabe-CMV-DEST-YFPc–puro(贝勒医学院生化与分子生物学实验室惠赠)。以该病毒感染HTC75细胞并用抗生素G418筛选出稳定表达hTERT-YFPn的诱饵(Bait)细胞。然后用同样的方法备得到pBabe-CMV-YFPc-CIRP-puro病毒载体，以该病毒感染筛选出的稳定细胞系(Prey细胞),再通过嘌呤霉素(puro)筛选,最后使用流式细胞仪技术分析两者是否具有相互作用。

2、实验结果

实验结果如附图6所示。其中A为BiFC技术原理示意图，B为瞬转表达端粒酶蛋白亚基hTERT-CVN和CIRP-YFPcc以及TPP1-YFPcc的荧光检测结果，其中TPP1-YFPcc作为实验正对照，单转hTERT-CVN和CIRP-YFPcc作为负对照，C为BiFC实验统计结果示意图，D为流式细胞仪检测黄色荧光蛋白结果。TPP1是已知与hTERT相互作用的蛋白作为阳性对照，hTERT-CVN和CIRP-YFPcc作为阴性对照。双分子荧光互补技术实验中，分别表达连有YFP部分结构的CIRP和hTERT，两半YFP蛋白重新结合成会发荧光的完整的YFP蛋白，由结果可知，体内表达的CIRP与端粒酶蛋白亚基TERT在细胞内相互靠近才会有荧光信号可被检测到，而单转的hTERT-CVN和CIRP-YFPcc则没有荧光信号，从而证实了CIRP可以与端粒酶蛋白亚基hTERT相互作用。

实施例3免疫共沉淀实验

1、实验使用的抗体有FLAG抗体(购于sigma公司，产品货号F7425)，使用时用3％牛血清蛋白(BSA)按1:5000稀释；GST抗体(购于Abmart公司，产品货号M20007)，使用时用3％牛血清蛋白(BSA)按1:5000稀释；H3抗体(购于Cell signaling technology公司，产品货号9701S)，使用时用3％牛血清蛋白(BSA)按1:1000稀释。

2、体内免疫共沉淀实验

在293T细胞中共转染待验证相互作用的蛋白(CIRP和hTERT，TCAB1和hTERT)。所述TCAB1的cDNA全长是通过PCR方法从HTC75细胞中获得并连接到Invitrogen pEnter-D-TOPO入门载体，得到TCAB1pENTER载体，然后再利用Gateway技术进行LR反应连接到pDEST27目的载体(美国贝勒医学院生化与分子生物学实验室惠赠)；所述hTERT的cDNA全长是通过PCR方法从HTC75细胞中获得并连接到Invitrogen pEnter-D-TOPO入门载体，得到hTERT pENTER载体，然后再利用Gateway技术进行LR反应连接到pBabe-CMV-SFB-puro目的载体(美国贝勒医学院生化与分子生物学实验室惠赠)，得到hTERT-SFB载体质粒。通过GST pull down,然后western blot(使用FLAG抗体、GST抗体)检测结合下来的蛋白，或者通过Flag IP(Flag-Immunoprecipitation),然后western blot(使用FLAG抗体、GST抗体、和H3抗体)检测与hTERT的相互作用。

3、实验结果

结果如图7所示，其中A为CIRP与端粒酶蛋白亚基hTERT的体内免疫共沉淀实验结果，B为加RNA酶处理之后的体内免疫共沉淀实验结果。图A显示，体内CIRP可结合端粒酶蛋白亚基hTERT,其中TCAB1以及TPP1是已报道的端粒酶结合蛋白，为正对照组，GST是标签载体表达蛋白，作为实验负对照。GFP-SFB为绿色荧光蛋白连入SFB标签载体共表达蛋白，为实验负对照组。“+”为具有该蛋白实验组，“-”为不具有该蛋白实验组。抗体检测分别为Flag，GST标签抗体，H3为内参蛋白。图B显示，在免疫沉淀过程中加入RNA酶处理与不处理的对比；RNase A-表示不加RNA酶，RNase A+表示加入RNA酶处理。体内的免疫共沉淀实验证实了CIRP与端粒酶的相互作用是间接的，经过RNA酶处理之后的免疫沉淀看出CIRP与hTERT相互作用减弱，说明CIRP通过与RNA相互作用而结合端粒酶蛋白亚基。证明CIRP能够与端粒酶RNA亚基相互作用。

实施例4免疫沉淀相结合的端粒酶活性实验

1、实验方法

在293T细胞中瞬时转染带Flag标签的CIRP核苷酸序列全长及突变体的质粒，48小时后收集蛋白，经过Flag IP后，用3XFlag肽段洗脱beads上的蛋白。将洗脱下来的蛋白与体外端粒酶延伸的底物(底物是一段序列为SEQ ID NO.1:AATCCGTCGAGCAGAGTT的引物)孵育，然后通过实时荧光定量PCR技术检测结合下来的端粒酶活性。

2、实验结果

图8显示了CIRP的蛋白序列以及突变体示意图。

图9为CIRP全长及突变体的免疫沉淀结合端粒酶活性实验结果，A为CIRP及其突变体的免疫沉淀结果。其中TPP1是已知与端粒酶相结合的端粒蛋白，作为正对照组。RRM为CIRP结合RNA的结构域，ΔRRM为删除RNA结合的结构域，ΔRGG以及ΔSY均为CIRP功能域突变体；B为全细胞裂解液的端粒酶活性检测结果；C为免疫沉淀之后检测到的端粒酶活性结果。

结果显示，CIRP全长能够结合很强的端粒酶活性，而突变了RNA结合的基序RRM以及RGG或者单独的RMM基序则结合比较弱的端粒酶活性，说明CIRP是通过其N端以及C端的RNA结合基序与端粒酶相互作用的。

实施例5端粒酶活性检测

1、实验方法

在HTC75细胞中通过siRNA敲低内源CIRP蛋白。

siRNA序列分别为：

siRNA-CIRP-1:

正义链(SEQ ID NO.2):CAGCGGAGAACGAGGAGGAUGAGCA

反义链(SEQ ID NO.3):UGCUCAUCCUCCUCGUUCUCCGCUG

siRNA-CIRP-2:

正义链(SEQ ID NO.4):AAGGAGGGUGUGGAGUACCGGAUAA

反义链(SEQ ID NO.5):UUAUCCGGUACUCCACACCCUCCUU

siRNA-CIRP-3:

正义链(SEQ ID NO.6):CCUGGGAGUGGAAUCUCACCAUCAA

反义链(SEQ ID NO.7):UUGAUGGUGAGAUUCCACUCCCAGG

48h之后收集1×106细胞于离心管，6000rpm，5min，弃上清，用100μl LysisBuffer(97.3μl DEPC处理H₂O,1.7μl 1mg/ml PMSF and 1μl 500mMβ-ME)，冰上裂解30min。冻存于-80℃或者直接稀释后进行下一步PCR反应

按照以下表格配制TRAP反应体系：

Reagent	Volume
		DEPC Treated H2O	36.6μl
10X TRAP Reaction Buffer	5.0μl
		dNTP Mix	4.0μl(2.5mM final)
TS Primer(200ng/μl)	1.0μl
		Primer mix	1.0μl
rTaq Polymerase(5U/μl)	0.4μl(2units)
		RNase Inhibitor(2U/μl)	1.0μl(2units)
Diluted Lysate	1.0μl
		Total	50μl

冰上操作，混匀反应体系后进行PCR反应，反应完成后，样品中加入10μl 6×Loading Buffer，可短时存于4℃或直接用于跑胶检测，用UVP观察结果。

2、实验结果

实验结果如图10所示，A为检测端粒活性实验TRAP，B为相对端粒酶活性计算结果,C为检测CIRP蛋白表达水平实验。由于三条siRNA靶标的序列差别以及作用效率差异导致其下调表达目的蛋白CIRP存在一定差异，但均可影响端粒酶活性。敲低内源CIRP可降低体内端粒酶活性，证明CIRP可调控端粒酶活性。

实施例6实时荧光定量PCR实验

1、实验方法

使用TRIzol(Invitrogen,货号15596-026)法提取细胞总RNA，用DNase I(Invitrogen,货号18068015)处理样品，去除残余DNA，再用TAKARA PrimeScript^TM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录成cDNA。以SYBR Green(ABI,货号4309155)为染料，进行实时荧光定量PCR实验。设置PCR程序：第一步，95℃10分钟；第二步：95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。溶解曲线程序：第一步，95℃10分钟；第二步：95℃10秒，55℃10秒，每循环将55℃提升0.5℃，升至95℃后结束。

2、实验结果

实验结果如附图11，其显示了敲低内源CIRP表达后检测端粒酶蛋白及RNA亚基表达水平实验结果。由结果可知，敲低内源CIRP蛋白的表达可引起端粒酶的蛋白亚基hTERT的RNA减少，而端粒酶的RNA亚基hTERC则没有明显变化。证明CIRP特异性调节端粒酶蛋白组分的RNA水平。

实施例7通过shRNA蛋白敲低的方法研究CIRP对细胞的作用机制

1、本实施例中的稳定表达shRNA(shCIRP)的细胞系的筛选方法

首先合成含有shRNA正反序列的oligo引物：

shRNA-CIRP-1

FP(SEQ ID NO.8):GATC TTT GGAGGCTCCAGAGACTACTATAGCA TTCAAGAGATGCTATAGTAGTCTCTGGAGCCTCC TTTTTGG

RP(SEQ ID NO.9):AGCTT CCAAAAA GGAGGCTCCAGAGACTACTATAGCATCTCTTGAATGCTATAGTAGTCTCTGGAGCCTCCAAA

shRNA-CIRP-2

FP(SEQ ID NO.10)：GATCTTTGACAGATCTCTGAAGTGGTGGTTGTTTCAAGAGAACAACCACCACTTCAGAGATCTGTC TTTTTGG

RP(SEQ ID NO.11):AGCTT CCAAAAA GACAGATCTCTGAAGTGGTGGTTGTTCTCTTGAAACAACCACCACTTCAGAGATCTGTC AAA

通过梯度降温的方式将2条引物退火，将退火好的含有shRNA正反序列的双链DNA连接于pcl-MU6载体中，制备逆转录病毒。以病毒感染HTC75细胞或者U20S细胞，并用嘌呤霉素筛选出稳定表达shRNA的细胞系。

2、Southern blot实验

(1)实验方法

首先构建稳定表达shCIRP的HTC75细胞系，通过western检测shRNA的敲低效率，取不同代次的细胞，提取基因组DNA，使用限制性内切酶fca I和HinfI将其切碎到只剩下端粒区，跑0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，然后转移到尼龙膜(购自GE公司)上，紫外交联，然后变性、中和，与同位素P32标记的端粒探针杂交，然后用Typhoon扫描仪进行信号检测。

(2)实验结果

结果如图12所示，A为检测端粒长度实验Southern blot，B为检测蛋白表达水平实验Westernblot,C为端粒长度计算结果。实验结果显示，敲低HTC75细胞中CIRP的表达水平，导致端粒长度逐渐变短，说明CIRP能够正调控端粒长度。

Claims (9)

1.CIRP在制备端粒酶结合剂或端粒酶活性调控剂方面的应用。

2.CIRP在制备端粒长度维持剂方面的应用。

3.CIRP抑制剂在制备细胞端粒长度负向调控剂中的应用。

4.CIRP在制备端粒酶蛋白亚基hTERT调控剂方面的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的调控剂为抑制剂。

6.CIRP检测试剂在制备检测或预测端粒酶阳性细胞生长中的应用。

7.CIRP在制备端粒酶阳性细胞生长调控剂方面的应用。

8.CIRP在制备端粒酶阳性细胞衰老调控剂方面的应用。

9.如权利要求1-8任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述的CIRP为CIRP蛋白、基因。