WO2009090287A1 - Compuestos antitumorales basados en cirp - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con la identificación de la capacidad de la proteína CIRP, una proteína que se expresa por estrés térmico a bajas temperaturas y que juega un papel esencial en la supresión de la proliferación celular inducida por frío, de evitar la senescencia replicativa de células primarias. La invención describe el uso de CIRP para el tratamiento de enfermedades relacionadas con una senescencia celular indeseada así como con compuestos inhibidores de CIRP (oligonucleótidos antisentido, ribozimas y similares) para el tratamiento de enfermedades asociadas a una proliferación celular indeseada.

Description

COMPUESTOS ANTITUMORALES BASADOS EN CIRP

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La invención se encuadra dentro del campo de la proliferación celular y, más concretamente, en el campo de compuestos capaces de promover la proliferación celular o de impedir la entrada de una célula en senescencia replicativa así como en el campo de compuestos capaces de inhibir la proliferación celular indeseada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células somáticas en cultivo primario muestran una capacidad proliferativa muy limitada (Hayflick, L. and Moorhead, P. S. (1961) Exp. CeIl Res. 25, 585-621) que se manifiesta en que dichas células, tras un número limitado de ciclos de división, detienen de forma irreversible su crecimiento entrando en lo que se conoce como estado de senescencia replicativa.

La senescencia celular parece estar implicada en múltiples condiciones patológicas en las personas ancianas que podrían ser aliviadas mediante la extensión de la vida media de las células in situ. Ejemplos de tales condiciones incluyen la atrofia de la piel debido a la pérdida de la homeostasis de la matriz extracelular en los fibroblastos de la dermis, degeneración de la mácula ocasionada por la acumulación de liporascina y disminución de la expresión de un factor de supervivencia neuronal en células epiteliales de la retina y aterosclerosis causada por la pérdida de la capacidad proliferativa de células endoteliales y la sobre-expresión de factores hipertensivos y protrombóticos en dichas células.

El conseguir un aumento de la vida media celular puede tener también aplicaciones in vitro. Así, células diploides normales podrían ser utilizadas en lugar de líneas de células tumorales establecidas en estudios bioquímicos y patológicos sobre el crecimiento y la diferenciación. Células normales con una vida media aumentada podrían ser usadas para la producción de productos de utilidad terapéutica y poblaciones expandidas de células rejuvenecidas normales o modificadas genéticamente podrían ser utilizadas para terapia génica antologa o alogénica para. Por tanto, la habilidad de extender la vida media de las células mantenido su carácter diploide, las características de crecimiento y el patrón de expresión de células normales tiene importantes implicaciones para la investigación en biología, la industria farmacéutica y la medicina.

Por tanto, existe un interés en la identificación de compuestos que permitan inhibir la senescencia celular o promover la proliferación de células que en condiciones normales alcanzarían la senescencia replicativa.

Así, se han descrito toda una serie de métodos en los que la estimulación de la proliferación celular se consigue mediante la activación de la telomerasa. Por ejemplo, WO0031238 describe métodos para aumentar la capacidad proliferativa celular mediante el uso de una combinación de un compuesto que activa la telomerasa de forma reversible y de un compuesto que inactiva de forma reversible la ruta de Rb/INK4 o la ruta de p53; WO9935243 describe métodos para aumentar la capacidad proliferativa celular mediante la expresión ectópica de EST2, la subunidad catalítica de la telomerasa; WO06066247 describe métodos para aumentar la capacidad replicativa celular mediante el aumento de la actividad hTERT, WO05000245 describe la capacidad de glicósidos de astragenol de promover la proliferación celular mediante la activación de la actividad telomerasa; y WO0061617A describe composiciones con capacidad de promover la proliferación celular mediante el uso de proteínas de fusión formadas por la subunidad catalítica de la telomerasa y un péptido con capacidad de promover la translocación a través de membranas biológicas de los compuestos que se encuentren unidos a este (por ejemplo herpesvirus VP22 y TAT).

Otros métodos para promover la proliferación celular o para inhibir la senescencia replicativa no basados en promover directamente la actividad telomerasa incluyen el uso del factor de inhibición migratoria (MIF), según se describe en WO9942578, que es capaz de aumentar la capacidad proliferativa de una células ya que es capaz de evitar la parada del ciclo celular mediada por p53.

Otros métodos para impedir la entrada de las células en senescencia replicativa incluyen el uso de medios de cultivo específicos tales como los descritos en WO07115223 y en WO07107303, el uso de inhibidores de la proteína SIRTl tal y como se ha descrito en US2007160586, o mediante el aumento de la expresión intracelular de MOT-2, tal y como se ha descrito en US2003170783.

Por otro lado, en US6566399 se han descrito métodos para inhibir la senescencia replicativa de queratinocitos mediante el uso de composiciones que comprenden ácido retonoico incluyendo el ácido retinoico todo trans, el ácido 3,4-didehidroretinoico y el ácido 9-cis retinoico. Adicionalmente, en WO2004007720 se han descrito métodos para inhibir la capacidad proliferativa de células tumorales mediante el uso de inhibidores de la expresión y/o actividad de inhibidores de enzimas de la vía glicolítica.

El cribado genético funcional utilizando distribución retroviral de genotecas de ADNc de alta complejidad es valioso para investigar los genes nuevos implicados en las características fenotípicas del proceso oncogénico. Así, Hannon, GJ et al (Science, 1999; 283:1129-1130) han descrito un método para la identificación de genes capaces de promover la transformación celular usando genotecas de ADNc obtenidas de líneas celulares tumorales y que se introducen e una población de células con capacidad proliferativa limitada usando un sistema de integración mediado por retrovirus. Berns, K. et al. (Nature 2004, 428:431-437) han descrito un método para la identificación de genes requeridos para la parada celular mediada por p53 mediante el uso de librerías de ARNips.

En WO2004007720 se ha descrito un método para la identificación de polipéptidos con capacidad de promover proliferación celular basado en la transformación de células de cultivos primarios y que, por tanto, están destinadas a alcanzar senescencia replicativa tras un número limitado de ciclos de replicación, con una genoteca de ADNc obtenida a partir de ARN poliA⁺ derivado de embriones de 7 y 15 días, cabezas de embriones de día 15 y de cerebro y testículos de ratón adulto. Sin embargo, este método ha demostrado estar limitado puesto que únicamente ha permitido la identificación de proteínas de la vía glicolítica. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos alternativos de mayor sensibilidad para la identificación de proteínas con capacidad de promover la proliferación celular. La proteína CIRP (del inglés, cold-inducible RNA-binding protein) es una proteína que se expresa por estrés térmico a bajas temperaturas y consiste en un dominio N-terminal de unión al ARN y un dominio C-terminal rico en glicina. CIRP juega un papel esencial en la supresión de la proliferación celular inducida por frío. La proteína CIRP humana se encuentra localizada en el locus cromosómico 19pl3.3 (Nishiyama et al. (1997) J CeIl Biol, 137 (4):899-908).

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con CIRP, una variante tuncionalmente equivalente del mismo o un polinucleótido que codifica CIRP o una variante tuncionalmente equivalente para su uso en medicina.

En un aspecto, la invención se relaciona con CIRP, una variante tuncionalmente equivalente del mismo, un polinucleótido que codifica CIRP o una variante tuncionalmente equivalente del mismo para el tratamiento de una enfermedad relacionada con una senescencia celular indeseada.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un compuesto capaz de inhibir la expresión y/o la actividad de CIRP, con una composición farmacéutica que comprende dicho inhibidor, con el uso de dicho inhibidor en medicina y con el compuesto inhibidor para el tratamiento de enfermedades asociadas a una proliferación celular indeseada.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación de proteínas capaces de activar la proliferación celular o de prevenir la senescencia replicativa que comprende

(i) poner en contacto una célula de capacidad proliferativa limitada con una genoteca de ADNc de células troncales, (ii) seleccionar aquellas células en las que se observe proliferación celular o inhibición de la senescencia replicativa y (iii) caracterizar el miembro de la genoteca de las células seleccionadas en (ii)

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para activar la proliferación celular o para evitar la senescencia replicativa que comprende la introducción en una célula de CIRP, de una variante funcionalmente equivalente del mismo o de un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína CIRP o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación de compuestos capaces de bloquear la proliferación celular o de bloquear la evitación de la senescencia replicativa que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una célula en la que proteína CIRP se encuentra sobre- expresada con un compuesto candidato y (ii) identificar aquellos compuestos que bloquean la proliferación celular inducida por CIRP o que bloquean la evitación de la senescencia replicativa inducida por CIRP.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para el diagnóstico de cáncer en un sujeto o para determinar la predisposición de un sujeto a padecer cáncer, o para determinar el estadio o severidad de dicho cáncer en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicho cáncer, que comprende cuantificar los niveles de expresión del gen CIRP o de la proteína codificada por dicho gen o de cualquier variante funcionalmente equivalente de dicha proteína en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde un aumento de la expresión de CIRP o del nivel de expresión de la proteína codificada por dicho gen, o cualquier variante funcionalmente equivalente de dicha proteína CIRP, con respecto a la expresión de CIRP o del nivel de expresión de la proteína codificada por dicho gen, o cualquier variante funcionalmente equivalente de dicha proteína CIRP es indicativa de cáncer, o de mayor predisposición de dicho sujeto a padecer cáncer, o de mayor severidad del cáncer, o de la no respuesta a la terapia en relación con un control.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. CIRP evita Ia senescencia replicativa. Figura la. Curva de crecimiento de células madre embrionarias CGR8 frete a células de cáncer de pulmón (DV90) o MEFs primarios. Figura Ib. Representación esquemática del screening genético para el estudio del efecto de la sobreexpresión de genes inmortales en MEFs primarios. Figura Ic. Curva de crecimiento y morfología celular de células MEF en pase 4 (P4) tras la infección y selección de los genes indicados. Figura Id. Ensayo de formación de colonias tras la infección y selección de los genes indicados. Figura le. Tratamiento Cre de células infectadas CIRP WT y CIRP-del. Figura 2. Expresión de CIRP en varias líneas celulares.

Figura 2a. ARNm de CIRP. RT-PCR cuantitativa de células MEF infectadas con los genes indicados. Las líneas celulares CGR8 y ROSA 21 se muestran como controles positivos. Figura 2b. Western-blot de MEFs CIRP frente a MEFs-GFP. Figura 3. Proteínas de ciclo celular durante senescencia.

Figura 3a. MEFs que expresan CIRP no activan las proteínas pió y p21 tras la selección (P4) o en pases posteriores cuando las células GFP alcanzan senescencia (P6). Figura 3b. En MEFs-CIRP el estado fosforilado de ERK se encuentra sobreexpresado. Figura 3 c. MEFs-CIRP frente a MEFs-ras^Va112 muestran un patrón diferente de inhibidores de ciclo celular p21 y pl9. La ciclina A también se encuentra disminuida su expresión en MEFs-ras^Va112. Figura 3d. En MEFs-CIRP las proteínas c-fos y ciclina Dl están sobreexpresadas. MEFs-ras^Va112 también presentan esta sobreexpresión. Figura 3e. Ensayo kinasa en MEFs-CIRP frente a MEFs-GFP.

Figura 4. CIRP evita la inmortalización mediante el aumento de la síntesis proteica a través del factor de transcripción 4EBP1.

Figura 4a. Incorporación de S35 en MEFs-CIRP frente a MEFs-GFP. Figura 4b. 4EBP1 total y fosfo-4EBPl en la 36/46 están sobreexpresado en MEFs-CIRP frente a MEFs- GFP. 4EPB 1 también está sobreexpresado en MEFS-ras^Va112.

Figura 4c. MEFs-CIRP frente a MEFs-GFP se trataron con el inhibidor de ERK PD98058 durante una semana tras la selección. Número celular relativo se muestra tras el mareaje con cristal violeta de las células. Figura 4d. Número de células relativo de los MEFs indicados tras infección con retrovirus que expresan CIRP o ras^Va112 . Figura 4e. ras^Va112 oncogénico no contribuye a la trasnformación en MEFs-CIRP. Figura 5. CIRP en tumores humanos.

Figura 5a. La expresión de ARNm de CIRP en carcinomas de próstata. Se analizó tejido normal y tumoral de varios pacientes. N (normal) y T (tumor). Figura 5b. Expresión del ARNm de CIRP en carcinoma de colon. Figura 4c. Proteína CIRP en dos pacientes de carcinoma de colon.

Figura 6. Posible ruta molecular en MEFs-CIRP (a) frente a MEFs-ras^Val12.

En MEFs que expresan CIRP, las señales de proliferación dirigidas principalmente por

4EBP 1 y en menor extensión por c-fos, activan la ciclina Dl y su actividad quinasa asociada con CDK4 para la estimulación de la proliferación celular. Aunque se producen las mismas señales proliferativas en MEFs-ras^Va112 , las principales señales de inhibición son dirigidas principalmente por pl9 y p21, y de forma secundaria por pió. El balance final se mide por la célula para determinar una u otra respuesta.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención, usando un método de cribado genético basado en la capacidad de genes que se expresan en células troncales de origen embrionario de inhibir la senescencia replicativa celular en cultivos primarios de fibroblastos, han puesto de manifiesto que, sorprendentemente, la sobreexpresión de la proteína CIRP es capaz de evitar la senescencia replicativa en MEFs primarios.

Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con CIRP, una variante funcionalmente equivalente del mismo o un polinucleótido que codifica CIRP o una variante funcionalmente equivalente del mismo para su uso en medicina. En otro aspecto, la invención se relaciona con CIRP, una variante funcionalmente equivalente del mismo o un polinucleótido que codifica CIRP o una variante funcionalmente equivalente del mismo para el tratamiento de una enfermedad relacionada con una senescencia celular indeseada.

Por CIRP se entiende la proteína de unión al ARN inducida por frío (del inglés, cold- inducible RNA-binding protein) que se encuentra localizada en el locus cromosómico 19pl3.3 (Nishiyama et al. (1997) J CeIl Biol, 137 (4):899-908) y cuya secuencia viene definida por SEQ ID NO: 1. Por "variante funcionalmente equivalente" se entiende todas aquellas proteínas derivadas de la secuencia de SEQ ID NO: 1 mediante modificación, inserción y/o deleción de uno o más nucleótidos, siempre y cuando se mantenga sustancialmente la función inhibidora de la senescencia replicativa. La función de la variante puede ser determinada usando ensayos ampliamente conocidos en el estado de la técnica tales como la determinación de la capacidad de una variante de promover la supervivencia de MEF cuando son transfectadas con un vector que expresa dicha proteína, tal y como se demuestra en el ejemplo 1 que acompaña la presente descripción. El experto apreciará que la invención no contempla únicamente el uso de CIRP de origen humano sino que es posible utilizar homólogos de otras especies tales como ratón (SEQ ID NO: 2), rata, cerdo, bovina, gallina, etc.

En el caso de que se utilice la proteína CIRP o una variante funcionalmente equivalente del mismo, la invención contempla el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína CIRP o una variante funcionalmente equivalente de la misma acompañado de un excipiente farmacéuticamente aceptable. Para uso en medicina, los compuestos y combinaciones de compuestos de la invención pueden ser formulados conjuntamente con un excipiente que es aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Excipientes preferidos para su uso en la presente invención incluyen azúcares, almidones, celulosas, gomas y proteínas. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se formulará en una forma farmacéutica de administración sólida (p.ej., comprimidos, cápsulas, grageas, granulos, supositorios, etc.) o líquida (p.ej., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.). En otra realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por cualquier ruta, incluyendo, sin ser limitante, oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus ^• procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S. A. de Ediciones, 1993. Alternativamente, es posible poner en contacto la célula con una variante de la proteína que ha sido modificada con un péptido que sea capaz de promover la translocación de la proteína al interior celular, tales como el péptido Tat derivado de la proteína TAT de HFV-I, la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia de D.melanogaster, la proteína VP22 del virus del herpes simplex y oligómeros de arginina (Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al. , 2000, Trends Pharmacol. ScL, 21:45-48, Lundberg, M et al, 2003, Mol. Therapy 8:143-150 y Snyder, E.L. y Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393).

Alternativamente, cuando el principio activo comprende un polinucleótido que codifica CIRP O una variante funcionalmente equivalente de la misma, la composición farmacéutica de la invención puede formularse en forma de una composición destinada para su empleo en terapia génica; a modo ilustrativo, no limitativo, en este caso, la composición farmacéutica de la invención puede contener un vector, viral o no viral, que comprende un polinucleótido de la invención o una construcción génica de la invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores, que contienen un polinucleótido o una construcción génica de la invención pueden ser administrados directamente al cuerpo humano o animal por métodos convencionales. Alternativamente, dichos vectores pueden ser utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo, y, posteriormente implantarlas en el cuerpo humano o animal para obtener el efecto terapéutico deseado. Para su administración al cuerpo humano o animal dichas células se formularán en un medio adecuado que no afecte adversamente a la viabilidad de dichas células.

Por "enfermedad asociadas con una senescencia indeseada" se entiende, en el contexto de la presente invención, todas aquellas enfermedades en las que se produzca una desaparición de células en un determinado tejido causadas por una senescencia anormal de las mismas. A modo ilustrativo, no limitativo, la invención contempla el uso de CIRP y de variantes funcionalmente equivalente del mismo en el tratamiento de:

a) enfermedades relacionas con una senescencia indeseada en el sistema nervioso central, que afecta a células del sistema nervioso central incluyendo neuronas, células de la glial (p.ej. astrocitos), células endoteliales y fibroblastos tales como la enfermedad de Alzheimer en donde se produce degeneración neuronal en el sistema nervioso central, la enfermedad de Parkinson, al enfermedad de Huntington y el ictus,

b) enfermedades de la piel en relacionadas con la edad en donde se produce una senescencia indeseada de fibroblastos, células de las glándulas sebáceas, melanocitos, queratinocitos, células de Langerhans, células endoteliales de la microvasculatura y células del folículo piloso. Ejemplos de tales enfermedades son atrofia y adelgazamiento dérmicos, elastolisis y formación de arrugas, hiperplasia de glándulas sebáceas, lentigo senil y otras alteraciones de la pigmentación, encanecimento y alopecia y úlceras crónicas de la piel.

c) enfermedades degenerativas de las articulaciones en las que se produce senescencia de las células del cartílago articular y de los fibroblastos sinoviales y lacunales.

d) osteoporosis y otras condiciones degenerativas del sistema esquelético provocadas por la degeneración de osteoblastos, células de la médula ósea o células mesenquimales, células progenitoras del tejido óseo.

e) enfermedades del sistema vascular asociadas con la edad y con el estrés en las que se produce degeneración indeseada de células del corazón y del sistema vascular tales como células endoteliales, células de músculo liso y fibroblastos adventiciales. Ejemplos de estas enfermedades incluyen aterosclerosis, calcificación, trombosis y aneurismas.

f) degeneración macular relacionada con la edad causadas por la senescencia de células del ojo, incluyendo células del epitelio pigmentado y células endoteliales vasculares.

g) SIDA, caracterizado por la senescencia temprana de los linfocitos T citotóxicos que son responsables de destruir las células CD4+ infectadas y

h) inmunodepresión originada por una degeneración indeseada de células de las líneas linfoides, mieloides y eritroides, monocitos, macrofagos circulantes y especializados, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, células NKy sus respectivos progenitores tales como las asociadas al envejecimiento, el estrés, la quimioterapia, enfermedades agudas o crónicas y a ciertas alteraciones genéticas en la que se produce una degeneración en células del sistema inmune tales como el síndrome de Down, en donde se produce una degeneración de los linfocitos, i) enfermedades relacionadas con una curación deficiente de heridas, quemaduras, abrasiones, incisiones quirúrgicas, sitios de implantes, lesiones causadas por agentes infecciosos y condiciones crónicas tales como úlcera venosa crónica, úlcera diabética, úlcera de compresión, así como lesiones del epitelio causadas por una condición inflamatoria persistente o infección.

Las kinasas MAP son mediadores importantes de la señalización celular de la membrana celular al núcleo y ERK1/2 juega un papel central en el control de la proliferación celular. Varios estudios (Aguirre-Ghiso et al. (2003) Cáncer Res 63, 1684- 1695) han mostrado que la actividad de ERK está involucrada en el crecimiento tumoral en diversos tipos de cáncer (líneas celulares de cáncer de mama y próstata). Los inventores han observado claras diferencias en los niveles de fosforilación de ERK1/2 en MEFs-CIRP y MEFs-GFP. La proteína MEK aguas arriba en la ruta de señalización también estaba afectada (Figura 3b). Los inventores además encontraron que la ciclina Dl está claramente sobreexpresada en los MEFs-CIRP con respecto a los GFP (Figura 3d). Por otra parte, el tratamiento con el inhibidor de ERK PD98058 disminuyó la capacidad proliferativa de los MEFs-CIRP mientras que no tuvo un efecto significativo en los MEFs-GFP, sugiriendo que el efecto fenotípico de CIRP puede mediarse en gran manera a través de la ruta de señalización de ERK.

Así, en otra realización particular de la invención, dicha enfermedad asociada a una proliferación celular indeseada está causada por una actividad elevada de la vía de señalización de ERK.

Una diana posible para la inducción de la ciclina Dl es la proteína 4E-BP1. De hecho, un papel principal para la ruta ERK es en la fosforilación de S 6, elF4E y 4E-BP1 inducida en la actividad neuronal. 4E-BP1 y eIF4 tienen un papel fundamental en el control translacional y estimulación última de la síntesis de proteínas. 4E-BP1 está involucrado en la transcripción del ARNm dependiente de cap y dicha transcripción influye en la síntesis de la mayoría de las proteínas celulares. Varios estudios (Castellví et al. (2006) Cáncer, 15;107(8):1801- 11; Armengol et al. (2007) Cáncer Res. Aug 15; 67(16): 7551-5) han mostrado que la proteína 4E-BP1 en su forma fosforilada está relacionada con la progresión maligna de diversos tipos de cáncer.

Los inventores han encontrado que 4E-BP1 total y su forma fosforilada estaban sobreexpresadas en MEFs-CIRP frente a los GFP (Figura 4b). Este incremento total también estaba correlacionado con la fosforilación de S6. Así, el presente estudio propone que el mecanismo principal empleado por CIRP para inmortalizar células es mediante estimulación de la síntesis proteica general mediante la inactivación principalmente de 4EBP 1 a través de ERK.

Por tanto, en otra realización particular de la invención, dicha enfermedad asociada a una proliferación celular indeseada es una enfermedad que está causada por un aumento en la actividad de la proteína 4E-BP1.

Las composiciones que contienen CIRP o un variante funcionalmente equivalente de la misma también pueden ser utilizadas ex vivo sobre células que han sido obtenidas de un paciente con el fin de prolongar la supervivencia de dichas células durante su expansión in vitro antes de la reimplantación en el individuo. Por ejemplo, células satélite musculares puede ser utilizadas para el tratamiento de la distrofia muscular, osteoblastos para el tratamiento de la osteoporosis, células epiteliales pigmentadas de la retina para el tratamiento de la degeneración macular relacionadas con la edad, condrocitos para el tratamiento de la osteoartritis, etc.

El efecto de los compuestos de la invención sobre la proliferación celular o sobre la inhibición de la senescencia replicativa se puede determinar mediante: (i) determinación de la actividad telomerasa

La actividad enzimática de la telomerasa se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la actividad telomerasa se puede determinar mediante la determinación de la tasa de elongación de una determinadas secuencia repetitiva que contiene 2, 3 o más repeticiones de la secuencia unitaria telomérica (Yegorov,Y.E. et al., 1997,

Mol.Biol., 31:130-136). Para la medida de dicha actividad se pueden usar extractos citoplásmicos, extractos nucleares, lisados celulares o células intactas. Por "aumento" en la actividad telomerasa se entiende que el nivel absoluto de actividad telomerasa en una célula particular está aumentado comparado con las células normales en el mismo individuo o comparada con células normales en sujetos que no sufren al condición. Ejemplos de dichas condiciones incluyen el cáncer o condiciones relacionadas con al presencia en un sujeto de células que no se encuentran habitualmente presente en dicho individuo tales como infecciones por microorganismos que requieren telomerasa para su replicación.

(ii) determinación de la longitud de los telómeros Métodos para la determinación de la longitud de los telómeros han sido ampliamente descritos en la técnica por Harley, C. B., et al. (Nature, 1990, 345:458-460); Levy, M. Z.et al., (J. Mol.Biol., 1992, 225:951-960); Lindsey, J.et al., (Mutat. Res., 1991, 256:45-48) y Allsopp, R. C.et al., (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1992, 89:10114-10118), entre otros. Convencionalmente, se utilizan endonucleasas de restricción que no fragmentan el AND telomérico para después separar los fragmentos obtenidos por su peso molecular y detección de los telómeros mediante hibridación usando sondas específicas para la secuencia de los telómeros.

(iii) determinación de la proliferación celular la determinación de la proliferación celular se puede llevar a cabo mediante métodos ampliamente conocidos para el experto en la materia incluyendo la determinación del tiempo de duplicación celular tal y como ha sido descrito por Harley et al., (Nature, 1990, 345:458-460). La tasa de proliferación celular se puede determinar mediante la determinación de la incorporación de uridina tritiada en la célula o ensayos colorimétricos emplenado BrdU.

(iv) determinación de la senescencia celular

A medida que las células progresan hacia la senescencia muestran un alargamiento de la fase Gl del ciclo celular, lo que resulta en un aumento del tiempo total en el que transcurre un ciclo celular (Hayflick, L. and Moorhead, P. S., Exp. CeIl Res. 1961, 25: 585-621 (1961) y Hayflick, L., Exp. CeIl Res. 1965, 37:614-636). A medida que la célula progresa desde un estado mitóticamente activo a un estado de senescencia, las células pierden la capacidad de responder a señales mitóticas y permanecen en Fl. Esta incapacidad es una de las principales características entre células jóvenes y viejas, sin embargo, a diferencia de las células viejas, las células jóvenes entran en quiescencia al entrar en fase GO, pero pueden ser posteriormente inducidas a reentrar en el ciclo celular y a dividirse. Sin embargo, células senescentes, aún permaneciendo viables y activas metabólicamente, son incapaces de reentrar en el ciclo celular.

Las células que se han detenido en la fase Gl del ciclo celular contienen un doble juego de cromosomas. Estas células muestran una morfología características que puede ser detectada al microscopio y que permite detectar las células en estado de senescencia. Otra diferencia de la senescencia replicativa es que las células muestran cambios en el patrón de expresión génica a medida que las células progresan a la senescencia. Estos cambios se reflejan en la expresión de genes específicos de células jóvenes y específicos de células viejas. Genes que se expresan diferencialmente en células senescentes incluyen beta-galactosidasa, colagenasa, interferon- gamma, colágeno I, colágeno III, elastasa, elastina, TIMP3 e IL-Ia. Otros genes que se expresan diferencialmente en células senescentes se han descrito en la solicitud internacional WO 96/13610.

Los autores de la presente invención han identificado un mecanismo por el que se puede inhibir la senescencia replicativa en células. De manera análoga, el uso de inhibidores de CIRP tendrá el efecto opuesto de promover la senescencia celular. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un compuesto capaz de inhibir la expresión y/o la actividad de CIRP.

Compuestos capaces de inhibir la expresión y/o actividad de CIRP incluyen oligonucleótidos antisentido, ribozimas, ARNips, anticuerpos inhibidores, aptámeros z espiegelmeros.

ARNip de la invención Los ARN de interferencia pequeños o ARNip (SiRNA en su denominación en inglés) son agentes que son capaces de inhibir la expresión de un gen diana mediante interfería de ARN. Un ARNip se puede sintetizar químicamente, se puede obtener mediante transcripción in vitro o se puede sintetizar in vivo en la célula diana. Típicamente, los ARNip consisten en una cadena doble de ARN de entre 15 y 40 nucleótidos de longitud y que puede contener una región protuberante 3 ' y/o 5' de 1 a 6 nucleótidos. La longitud de la región protuberante es independiente de la longitud total de la molécula de ARNip. Los ARNip actúan mediante la degradación o el silenciamiento post-transcripcional del mensajero diana.

Los ARNip pueden ser los llamados shRNA (short hairpin RNA) caracterizados por que las cadenas antiparalelas que forman el ARNip están conectadas por una región bucle u horquilla. Estos ARNip están compuestos de una secuencia antisentido corta (de 19 a 25 nucleótidos), seguida de un bucle de entre 5 y 9 nucleótidos a la que sigue la cadena sentido. Los shRNAs pueden estar codificados por plásmidos o virus, particularmente retrovirus y, más particularmente, retrovirus y estar bajo el control de promotores tales como el promotor U6 de la ARN polimerasa III.

Los ARNip de la invención son sustancialmente homólogos al ARNm de CIRP o a la secuencia genómica que codifica dicha proteína. Por "sustancialmente homólogos" se entiende que tienen una secuencia que es suficientemente complementaria o similar al

ARNm diana de forma que el ARNip sea capaz de 'provocar la degradación de éste por interferencia de ARN. Los ARNip adecuados para provocar dicha interferencia incluyen

ARNip formados por ARN, así como ARNip que contienen distintas modificaciones químicamente tales como:

- ARNip en los que los enlaces entre los nucleótidos son distintos a los que aparecen en la naturaleza, tales como enlaces fosforotioato.

- conjugados de la cadena de ARN con un reactivo funcional, tal como un fluoróforo. - Modificaciones de los extremos de las cadenas de ARN, en particular el extremo 3' mediante la modificación con distintos grupos funcionales del hidroxilo en posición 2'. - Nucleótidos con azúcares modificados tales como restos O-alquilados en posición 2' tales como 2'-O-metilribosa p 2'-O-fluorosibosa.

- Nucleótidos con bases modificadas tales como bases halogenadas (por ejemplo 5-bromouracilo y 5-iodouracilo), bases alquiladas (por ejemplo 7- metilguanosina).

Los ARNip y ARNsh de la invención se pueden obtener usando una serie de técnicas conocidas para el experto en la materia. Por ejemplo, el ARNip puede ser sintetizado químicamente a partir de ribonucleósidos protegidos con forsforamiditas en un sintetizador de ADN/ARN convencional. Alternativamente, los ARNip pueden ser producidos de forma recombinante a partir de vectores plasmídicos y virales en cuyo caso la región que codifica la cadena o cadenas que forman los ARNip se encuentran bajo control operativo de promotores de ARN polimerasa III. En las células, la ARNase Dicer procesa los ARNsh en ARNip funcionales.

La región de CIRP que se toma como base para diseñar los ARNip no es limitante y puede contener una región de la secuencia codificante (entre el codón de iniciación y el codón de terminación) o, alternativamente, puede contener secuencias de la región no traducida 5' o 3'. es, preferentemente de entre 25 y 50 nucleótidos de longitud y en cualquier posición en posición 3' con respecto al codon de iniciación. Una forma de diseñar un ARNip implica la identificación de los motivos AA(N_1P)TT en donde N puede ser cualquier nucleótido en la secuencia de CIRP y seleccionando aquellos que presenten un alto contenido en G/C. Si no se encuentra dicho motivo, es posible identificar el motivo NA(N₂₁), en donde N puede ser cualquier nucleótido.

Oligonucleótidos antisentido de la invención

En otra forma de realización, la invención se relaciona con oligonucleótidos antisentido específicos para CIRP, esto es, moléculas cuya secuencia es complementara al ARNm que codifica CIRP, es decir, complementaria a la cadena codificante del ADNc. El oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región codificante completa o a una región de la misma que incluye tanto la región codificante como las regiones 5' y 3 no traducidas. Los oligonucleótidos antisentido pueden constar de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos antisentido se pueden obtener mediante síntesis química o mediante reacciones enzimáticas de ligación ampliamente conocidas para el experto en la materia, Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido puede además contente nucleótidos modificadas que aumenta su estabilidad biológica.o la estabilidad de los complejos bicatenarios ADN- ARN formados entre el oligonucleótido antisentido y el polinucleótido diana, tales como derivados de fosforotioato, ácidos nucleicos péptidos y oligonucleótidos sustituidos con acridina. Oligonucleótidos modificados que se pueden usar para preparar los ácidos nucleicos antisentido incluyen 5-fluoruracilo, 5-bromouracilo, 5- clorouracilo, 5-iodouracilo, hypoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6- isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D- manosilqueosina, 5'- methoxicarboximetiluracilo, 5-metoxuracilo, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2- tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ácido uracilo-5-oxiacetico, ester metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2- tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2- carboxipropil) uracilo, y 2,6- diaminopurina. Alrternativametne, el ácido nucleico antisentido puede ser producido biológicamente usando un vector de expression en el que se ha clonado el ácido nucleico en orientación antisentido.

Ribozimas de la invención

Otro grupo de compuestos contemplado en la presente invención son los ácidos nucleicos catalíticamente activos conocidos como ribozimas, Los ribozimas comprenden una región catalítica y una segunda región cuya secuencia es complementara con el ácido nucleico diana y que confiere especificidad de sustrato al ribozima. Tras la interacción entre el ribozima y su sustrato mediante hibridación y apareamiento entre regiones complementarias del ácido nucleico diana y del ribozima, se produce la activación de la región catalítica provocando la rotura inter- o intramolecular del ácido nucleico diana. Los ribozimas y las consideraciones básicas para su diseño son ampliamente conocidas para el experto en la materia (véase por ejemplo Doherty y Doudna (Annu. Ref. Biophys. Biomolstruct. 2000; 30: 457- 75). Anticuerpos inhibidores de la invención

Por "anticuerpo inhibidor" se entiende en el contexto de la presente invención todo aquel anticuerpo que es capaz de unirse a CIRP provocando la inhibición de la actividad pro-proliferativa de éste. Los anticuerpos pueden ser preparados usando cualquiera de los métodos que son conocidos para el experto en la materia. Así, los anticuerpos policlonales se preparan mediante inmunización de un animal con la proteína que se desea inhibir. Los anticuerpos monoclonales se preparan usando el método descrito por Kohler, Milstein y col. (Nature, 1975, 256: 495). Una vez identificados anticuerpos con capacidad de unión a CIRP, se seleccionarán aquellos que son capaces de inhibir la actividad de ésta proteína usando los ensayos mencionados anteriormente para la determinación de la actividad CIRP.

Anticuerpos adecuados en el contexto de la presente invención incluyen anticuerpos intactos que comprende una región variable de unión a antígeno y una región constante, fragmentos "Fab", "F(ab')2" y "Fab"", Fv, scFv, diabodies y anticuerpos biespecíficos.

Otros compuestos inhibidores de la actividad de CIRP de la invención Otros compuestos con capacidad de inhibición de la expresión de CIRP incluyen aptámeros y espiegelmeros, que son ácidos nucleicos D o L de cadena sencilla o doble que se unen específicamente a la proteína lo que resulta en una modificación de la actividad biológica de ésta. Los aptámeros y espiegelmeros tienen una longitud de entre 15 y 80 nucleótidos y, preferiblemente, entre 20 y 50 nucleótidos.

Los compuestos de la invención (ARNip, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, aptámeros y espiegelmeros) pueden ser administrados a las células en las que desea inhibir la expresión de CIRP mediante microinyección de una composición que comprende el agente o poniendo en contacto la célula con una composición que comprende el agente inhibidor. Alternativamente, se puede usar un método de administración mediado por virus tanto in vita) como in vivo. Otros métodos de administración de ácidos nucleicos con capacidad de inhibir CIRP incluyen co- precipitación en presencia de fosfato calcio o cloruro calcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación así como toda una serie de kits de transfección basados en las técnicas anteriores y que se encuentran comercialmente disponibles. La eficacia de la transfección dependerá de una serie de factores que incluyen el tipo de célula, el número de pases, el estado de confluencia así como las condiciones (tiempo, forma de preparación de los liposomas o de los precipitados, etc.) de la transfección. Todos estos parámetros pueden ser determinados y ajustados mediante experimentación rutinaria.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la expresión o actividad de CIRP de acuerdo con la invención. Para uso en medicina, los compuestos y combinaciones de compuestos de la invención pueden ser formulados conjuntamente con un excipiente que es aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Excipientes preferidos para su uso en la presente invención incluyen azúcares, almidones, celulosas, gomas y proteínas. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se formulará en una forma farmacéutica de administración sólida (p.ej., comprimidos, cápsulas, grageas, granulos, supositorios, etc.) o líquida (p.ej., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.). En otra realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por cualquier ruta, incluyendo, sin ser limitante, oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutana, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.

En otra realización particular, cuando el principio activo comprende un polinucleótido de la invención, la composición farmacéutica de la invención puede formularse en forma de una composición destinada para su empleo en terapia génica; a modo ilustrativo, no limitativo, en este caso, la composición farmacéutica de la invención puede contener un vector, viral o no viral, que comprende un polinucleótido de la invención o una construcción génica de la invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores, que contienen un polinucleótido o una construcción génica de la invención pueden ser administrados directamente al cuerpo humano o animal por métodos convencionales. Alternativamente, dichos vectores pueden ser utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo, y, posteriormente implantarlas en el cuerpo humano o animal para obtener el efecto terapéutico deseado. Para su administración al cuerpo humano o animal dichas células se formularán en un medio adecuado que no afecte adversamente a la viabilidad de dichas células.

En otro aspecto, la invención se relaciona con los compuestos inhibidores de la actividad y/o expresión de CIRP para su uso en medicina. En otro aspecto, la invención se relaciona con los compuestos inhibidores de la actividad y/o expresión de CIRP para el tratamiento de enfermedades asociadas a una proliferación celular indeseada. Enfermedades relacionadas con una proliferación celular indeseada incluyen el crecimiento, la progresión y la metástasis de cáncer y tumores.

Los términos "cáncer" y "tumor" se refieren a la condición fisiológica en mamíferos caracterizadas por el crecimiento celular desregulado. Los compuestos inhibidores de la actividad y/o expresión de CIRP de la invención tienen utilidad para el tratamiento de tumores de mama, corazón, pulmón, intestino delgado, colon, bazo, riñon, vejiga, cabeza, cuello, ovario, próstata, cerebro, páncreas, piel, hueso, médula ósea, sangre, timo, útero, testículos e hígado. En particular, tumores que pueden ser tratados con los compuestos de la invención incluyen adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial, germinoma, glioblastoma, glioma, hemangioendotelioma, hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma, meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma y teratoma. En particular, el tumor/cancer se selecciona del grupo de melanoma acral lentiginoso, queratosis actínica adenocarcinoma, carcinoma adenoidal cística, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, tumores astrocíticos, carcinoma de la glándula de Bartolino, carcinoma de células básales, carcinoma de glándulas branquiales, carcinoide capilar, carcinoma, carcinosarcoma, colangiocarcinoma, cistadenoma, tumor del seno endodermal, hiperplasia endometrial, sarcoma del estroma endometrial, adenocarcinoma endometroide, sarcoma ependial, sarcoma de Swing, hiperplasia nodular focal, gastrónoma, tumores de la línea germinal, glioblastoma, glucagonoma, hemagioblastoma, hemagioendotelioma, hemagioma, adenoma hepático, adenomastosis hepática, carcinoma hepatocelular, insulinita, neoplasia intraepitelial, neoplasia de células escamosas interepiteliales, carcinma de células escamosas invasivas, carcinoma de células grandes, leiomiosarcoma, melanoma, melonoma maligno, tumor mesotelial maligno, medulobastoma, meduloepitelioma, carcinoma mucoepidermoide, neuroblastoma, adenocarcinoma neuroepitelial, melanoma nodular, osteosacrcoma, adenocarcinoma seroso papilar, tumores pituitarios, plasmacitoma, pseudosarcoma, blastema pulmonar, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, carcinoma de células pequeñas, carcinoma de tejidos blandos, tumor secretor de somatostatina, carcinoa escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma no diferenciado, melanoma uveal, carcinoa verrugoso, vipoma, tumor de WiIm. Aún más preferiblemente, el tumor/cáncer a ser tratado con los compuestos de la invención incluye cáncer intracerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer rectal, astrocitoma, preferiblemente astrocitoma de grado II, III o IV, glioblastoma, preferiblemente glioblastoma multiforme, cáncer de células pequeñas, y cáncer de células no pequeñas, preferiblemente cáncer de pulmón de células no pequeñas, melanoma metastático, cáncer de próstata metastático independiente de andrógenos, cáncer de próstata metastático dependiente de andrógenos y cáncer de mama.

Método para la identificación de proteínas capaces de activar la proliferación celular de acuerdo a la invención.

Los autores de la presente invención han puesto de manifiesto que la capacidad inmortal observada en las células ES y las células cancerosas permite efectuar un cribado genético infectando fibroblastos embrionarios de ratón primarios (MEFs) con una genoteca de ADNc de células ES de ratón con el fin de identificar genes que confieren una ventaja selectiva para la proliferación celular. Los autores de la invención han demostrado que dichos cribados genéticos permiten la identificación de genes cuya implicación en la proliferación celular era desconocida hasta el momento. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación de proteínas capaces de activar la proliferación celular o de impedir la senescencia replicativa que comprende

(i) poner en contacto una célula de capacidad proliferativa limitada con una genoteca de ADNc de células troncales,

(ii) seleccionar aquellas células en las que se observe proliferación celular o la inhibición de la senescencia replicativa y (iii) caracterizar el miembro de la genoteca de las células seleccionadas en (ii).

Por "célula de capacidad proliferativa limitada" se entiende en el contexto de la presente invención, una célula que tras un número limitado de ciclos de división, deja de proliferar alcanzando un estado conocido como senescencia replicativa. Normalmente, células de capacidad proliferativa limitada son células somáticas en cultivo primario.

Por "célula troncal" se entiende, en el contexto de la presente invención, células no diferenciadas o poco diferenciadas, con capacidad para dividirse indefinidamente sin perder sus propiedades y llegar a producir células especializadas cuando se cultivan en ciertas condiciones. Células troncales incluyen células totipotentes, capaces de crecer y formar un organismo completo, pluripotentes, capaces de formar cualquier célula de los tres linajes embrionarios (mesodermo, endodermo y ectodermo), células multipotentes, capaces de generar células de su propio linaje embrionario de origen y células unipotentes, capaces de formar un único tipo de célula particular. Las células troncales pluripotentes pueden proceder de un blastocisto (embriones de 4 a 5 días), en cuyo caso se denominan células troncales embrionarias o de las gónadas de un feto de 5-10 semanas, en cuyo caso se denominan células germinales embrionarias, procedentes de las. Las células troncales multipotentes pueden proceder de tejido fetal (células troncales fetales) o de tejidos de animales adultos (células troncales adultas).

En una primera fase, el método de identificación de proteínas capaces de activar la proliferación celular de la invención comprende la puesta en contacto de una célula de capacidad proliferativa limitada, normalmente formando parte de un cultivo, con una genoteca de ADNc de una célula troncal. Las genotecas de ADNc de células troncales se obtienen usando cualquiera de los métodos ampliamente conocidos por el experto en la materia, ampliamente descritas en Sambrook, J. et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y.) y Ausubel,F (Current Protocols in Molecular Biology). Alternativamente, es posible el uso de genotecas de ADNc de células troncales comerciales. En una forma preferida de realización, la genoteca usada en el contexto de la presente invención deriva de células troncales de origen embrionario. Preferiblemente, las células troncales embrionarias son células no humanas. Aún más preferiblemente, las células troncales derivan de embriones murinos.

La genoteca de ADNs de células troncales se pone en contacto con la célula o población de células usando cualquiera de los métodos conocidos por el experto en la materia para introducir polinucleótidos en el interior de la célula. Métodos adecuados incluyen la transferencia mediada por un vector (por ejemplo, mediante infección con un virus recombínate o mediante transfección con un vector viral), métodos en los que se utilizan complejos del ADN a introducir en la células con proteínas, lípidos u otro tipo de polímeros (lipofección, DEAE-dextrano, polibreon) y métodos que permiten la introducción en la célula del ADN desnudo (electroporación, mediante métodos biolísticos, microinyección).

En la segunda fase, se seleccionan a partir de aquellas células que han sido transfectadas las células en las que se observe proliferación celular o células que hayan sido capaces de evitar la senescencia replicativa. Métodos para la selección de células que evitan la senescencia replicativa incluyen la identificación de colonias en placas de agar blando, aumento de la densidad de saturación de los cultivos, pérdida del requerimiento de suero, capacidad de crecer en agar o independientemente de la adhesión al sustrato, capacidad de formar tumores cuando se introduce en animales, pérdida de la inhibición por contacto del movimiento, capacidad de crecer en células cultivadas en monocapa, aumento de la aglutinación de lectinas, cambios en el perfil de glicoproteínas y glicolípidos, pérdida de uniones intercelulares herméticas, expresión de antígenos letales, alteración de las patrones de tinción, aumento de la tasa metabólica, aumento en la secreción de proteasas, alteraciones del citoesqueleto, alteración en los niveles de ciertas moléculas de señalización (nucleótidos cíclicos, fosfoinositoles). En la tercera fase, se procede a caracterizar el miembro de la genoteca de las células seleccionadas en la segunda fase. Para ello, es necesario realizar una preparación de ácidos nucleicos a partir de la célula seleccionada para efectuar a partir de dicha preparación una reacción de PCR empleando cebadores basados en las secuencias conocidas de las regiones del vector de la genoteca que flanquean el ADNc. Mediante la selección de cebadores adecuados, es posible obtener un fragmento de PCR que puede ser digerido con endonucleasas de restricción permitiendo el clonaje de los ADNc activos en vectores previamente linearizados y que presentan extremos cohesivos compatibles con los extremos generados en los productos de PCR. Si la genoteca de ADNc es una genoteca basadas en vectores virales, el rescate del ADNc se lleva a cabo poniendo en contacto la célula u organismo con un vector que aporta todas aquellas funcionalidades del virus que no están presentes en el vector viral de la genoteca.

El proceso descrito anteriormente puede resultar en el aislamiento de un único clon o en el aislamiento de una subpoblación de clones de la población original. Si ese es el caso, el proceso puede repetirse sucesivas veces empleando como material de partida la subpoblación de clones obtenidas tras el primer proceso de aislamiento. Tras uno o más ciclos de purificación adicionales, se obtendrá un clon único o una población de clones reducida con el ADNc con la función deseada. Una vez que se ha recuperado el gen que codifica el ANDc responsable de la capacidad proliferativa, se procede a secuenciar la región del inserto. La secuenciación se puede llevar a cabo usando métodos ampliamente conocidos para el experto en la materia tales como el método de Sanger usando dideoxinucleótidos, secuenciación por hibridación (sequencing-by-hybridization o SBH), secuenciación nanopore, secuenciación mediante síntesis (sequencing-by- syntehsis o SBS), pirosecuenciación y similares. Cebadores adecuados para la reacción de secuenciación se pueden obtener a partir de las secuencias que flanquean el ADNc.

En caso de que el vector seleccionado contenga únicamente una secuencia parcial del ADNc, es posible analizar bases de datos de secuencias para identificar el ácido nucleico completo. Preferiblemente, la identificación del ácido nucleicos completo se lleva a cabo usando los algoritmos conocidos para el experto en la materia, tales como el algoritmo BLAST (Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977)), BLAST 2.0 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990) o FASTA (W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:2444-2448). Alternativamente, si el vector seleccionado contiene únicamente una secuencia parcial del ADNc, se puede utilizar dicha secuencia parcial para construir sondas o cebadores que permitan el aislamiento de los ARNm diana completo. Así, la secuencia parcial puede utilizarse para la preparación de sondas marcadas radiactivamente para el screening de genotecas de ADNc y genómicas. Alternativamente, la secuencia parcial puede utilizarse para sintetizar cebadores que pueden ser utilizados para amplificar los ADNc a partir de una genoteca de ADNc o genómica mediante técnicas tales como 5'-RACE o 3'-RACE.

Método in vitro para activar la proliferación celular de la invención

La caracterización por parte de los autores de la presente invención de la capacidad de la proteína CIRP de evitar la senescencia replicativa en MEFs primarios cuando se encuentra sobre-expresada permite el desarrollo de métodos in vitro para activar la proliferación celular, para evitar la senescencia replicativa de una célula o para transformar una célula mediante la expresión de CIRP.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para activar la proliferación celular o para evitar la senescencia replicativa que comprende la introducción en una célula de CIRP, de una variante funcionalmente equivalente del mismo o de un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína CIRP o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

Los métodos in vitro para activar la proliferación celular, para evitar la senescencia replicativa o para transformar una célula de un cultivo primario implican la puesta en contacto de una célula con una composición capaz de provoca un aumento en los niveles intracelulares de CIRP. En una forma de realización, la célula se pone en contacto con una variante de la proteína que ha sido modificada con un péptido capaz de promover la translocación de la proteína al interior celular, tales como el péptido Tat derivado de la proteína TAT de HIV-I, la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia de D.melanogaster, la proteína VP22 del virus del herpes simplex y oligómeros de arginina (Lindgren, A. et al, 2000, Trenas Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al. , 2000, Trenas Pharmacol. ScL, 21:45-48, Lundberg, M et al, 2003, Mol. Therapy 8:143-150 y Snyder, EX. y Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393). En otra forma de realización, la célula se pone en contacto con un polinucleótido que codifica CIRP en presencia de reactivos capaces de promover la translocación del polinucleótido al interior celular. El polinucleótido se introduce en las células usando cualquiera de los métodos de transfección conocidos para el experto en la materia (véase secciones 9.1 a 9.5 en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; ringbou edition, 2003). En particular, las células se pueden transfectar mediante co-precipitación de ADN con fosfato calcico, DEAE-dextrano, polibreon, electroporación, microinyección, fusión mediada por liposomas, lipofección, infección por retrovirus y transfección biolística.

Método in vitro para la identificación de compuestos capaces de bloquear la proliferación celular de acuerdo con la invención.

La caracterización por parte de los autores de la presente invención de la capacidad de la proteína CIRP de evitar la senescencia replicativa en MEFs primarios cuando se encuentra sobre-expresada permite el desarrollo de métodos in vitro para la identificación de compuestos capaces de bloquear la activación de la proliferación celular o de bloquear la evitación de la senescencia replicativa.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación de compuestos capaces de bloquear la proliferación celular o de bloquear la evitación de la senescencia replicativa inducida por CIRP o variante funcionalmente equivalente del mismo que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una célula en la que proteína CIRP se encuentra sobre- expresada con un compuesto candidato y

(b) identificar aquellos compuestos que bloquean la proliferación celular o que bloquean la evitación de la senescencia replicativa.

Los métodos de la invención para identificar compuestos capaces de bloquear la proliferación celular o de evitar la entrada en senescencia replicativa requieren un primer paso en el que una célula que expresa CIRP se pone en contacto con un compuesto candidato. Por "poner en contacto" una célula con el compuesto candidato se incluye, según la presente invención, cualquier posible forma de llevar el compuesto candidato hasta el interior de la célula que expresa CIRP. Así, en caso de que el compuesto candidato sea una molécula de bajo peso molecular, es suficiente con añadir dicha molécula al medio de cultivo. En caso de que el compuesto candidato sea una molécula de alto peso molecular (por ejemplo, polímeros biológicos tales como un ácido nucleico o una proteína), es necesario aportar los medios para que esa molécula pueda acceder al interior celular. En caso de que la molécula candidata sea un ácido nucleico, pueden usarse métodos convencionales para transfección, según se ha descrito anteriormente para la introducción de la construcción de ADN. En caso de que el compuesto candidato sea una proteína, la célula puede ponerse en contacto tanto con la proteína directamente como con el ácido nucleico que la codifica acoplado a elementos que permitan su transcripción /traducción una vez que se encuentren en el interior celular. Para ello, se pueden usar cualquiera de los métodos mencionados anteriormente para permitir su entrada al interior celular. Alternativamente, es posible poner en contacto la célula con una variante de la proteína que se desea estudiar que ha sido modificada con un péptido que sea capaz de promover la translocación de la proteína al interior celular, tales como el péptido Tat derivado de la proteína TAT de HIV-I, la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia de D.melanogaster, la proteína VP22 del virus del herpes simplex y oligómeros de arginina (Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al. , 2000, Trends Pharmacol. Sd., 21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol. Therapy 8:143-150 y Snyder, E.L. y Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393).

Preferiblemente, el compuesto a ensayar no se encuentra aislado sino que se encuentra formando parte de una mezcla más o menos compleja bien derivada de una fuente natural o bien formando parte de una biblioteca de compuestos. Ejemplos de bibliotecas de compuestos que pueden ser ensayadas según el método de la presente invención incluyen, sin limitación, bibliotecas de péptidos incluyendo tanto péptidos como análogos peptídicos que comprenden D-amino ácidos o péptidos que comprenden enlaces no peptídicos, bibliotecas de ácidos nucleicos incluyendo ácidos nucleicos con enlaces no fosfodiester del tipo de fosforotioato o ácidos nucleicos peptídicos, bibliotecas de anticuerpos, de carbohidratos, de compuestos de bajo peso molecular, preferiblemente moléculas orgánicas, de peptidomiméticos, y similares. En el caso de que se use una biblioteca de compuestos orgánicos de bajo peso molecular, la biblioteca puede haber sido preseleccionada para que contengan compuestos que puedan acceder al interior celular con mayor facilidad. Así, los compuestos de pueden seleccionar en base a determinados parámetros tales como tamaño, lipofilicidad, hidrofilicidad, capacidad de formar puentes de hidrógeno.

En una segunda etapa, el método comprende la identificación de aquellas células en las que se ha bloqueado la proliferación celular inducida por CIRP, en las que se ha evitado la entrada senescencia replicativa inducida por CIRP. Cualquiera de los parámetros indicativos de senescencia celular o de proliferación celular indicados anteriormente puede ser utilizado para identificar compuestos que inhiben la actividad de CIRP.

En caso de que el compuesto candidato se encuentre formando parte de una mezcla de mayor o menor complejidad, la invención comprende adicionalmente una o varias etapas (iii) de fraccionamiento de dicha mezcla y la repetición de las etapas (i), (ii) y (iii) del método de la invención un número variable de veces hasta que el compuesto de la mezcla responsable de la actividad promotora de la transcripción se encuentre aislado. Métodos para el fraccionamiento de compuestos presentes en una mezcla incluyen cromatografía (en capa fina, de gases o de exclusión molecular en gel, de afinidad), cristalización, destilación, filtración, precipitación, sublimación, extracción, evaporación, centrifugación, espectrometría de masas, adsorpción y similares.

Método de diagnóstico de la invención

Los autores de la presente invención han observado que al analizar el ARNm de CEPR en carcinomas de próstata y de colon, en 7/19 (36%) de los pacientes de cáncer de próstata y en 8/27 (29%) de colon, se observó sobreexpresión del ARNm de CIRP. El hecho de que un subgrupo de cánceres de colon y próstata mostraran una sobreexpresión de ARNm de CIRP, sugiere un posible enlace entre CIRP y los tumores en humanos. Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vitro para el diagnóstico de cáncer en un sujeto o para determinar la predisposición de un sujeto a padecer cáncer, o para determinar el estadio o severidad de dicho cáncer en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicho cáncer, que comprende cuantificar los niveles de expresión del gen CIRP o de la proteína codificada por dicho gen o de cualquier variante funcionalmente equivalente de dicha proteína en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde un aumento de la expresión de CIRP o del nivel de expresión de la proteína codificada por dicho gen, o cualquier variante funcionalmente equivalente de dicha proteína CIRP, con respecto a la expresión de CIRP o del nivel de expresión de la proteína codificada por dicho gen, o cualquier variante funcionalmente equivalente de dicha proteína CIRP es indicativa de cáncer, o de mayor predisposición de dicho sujeto a padecer cáncer, o de mayor severidad del cáncer, o de la no respuesta a la terapia en relación con un control.

En una realización particular, dicho cáncer es cáncer de colon. En otra realización particular de la invención, dicho cáncer es cáncer de próstata. En una realización particular de la invención, dicho control es una muestra de tejido normal, es decir, no tumoral, de dicho sujeto tal como se muestra en el ejemplo que acompaña la presente descripción.

La cuantificación de los niveles de expresión del gen CIRP puede realizarse a partir del ARN resultante de la transcripción de dicho gen (ARNm) o, alternativamente, a partir del ADN complementario (ADNc) de dicho gen. Por tanto, en una realización particular, la cuantificación de los niveles de expresión de CIRP comprende la cuantificación del ARN mensajero (ARNm) de CIRP, o un fragmento de dicho ARNm, el ADN complementario (ADNc) de CIRP, o un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas.

Adicionalmente, el método de la invención puede incluir la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener el ARN total, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales (Chomczynski y cois., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532). Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm codificado por el gen CIRP o de su ADNc correspondiente. A modo ilustrativo, no limitativo, el nivel de ARNm codificado por dicho gen puede ser cuantificado mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNm y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesis y tinción, o alternativamente, mediante Southern blot y empleo de sondas apropiadas, northern blot y empleo de sondas específicas del ARNm del gen de interés o de su ADNc correspondiente, mapeo con la nucleasa Sl, RT-LCR, hibridación, microarrays, etc., preferentemente, mediante PCR cuantitativa a tiempo real usando juegos de sondas y cebadores apropiados. Análogamente, los niveles del ADNc correspondiente a dicho ARNm codificado por CIRP también puede ser cuantificado mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc. Métodos convencionales de cuantificar los niveles de expresión pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y cois., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., VoI. 1-3.

En una realización particular del método de la invención, la cuantificación de los niveles de expresión del gen CIRP comprende la cuantificación del ARN mensajero (ARNm) del gen CIRP, un fragmento de dicho ARNm, ADN complementario (ADNc) del gen CIRP, un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas.

En una realización particular de la invención, la cuantificación de los niveles de expresión de CIRP se realiza mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa.

Por otro lado, para la puesta en práctica de la invención, a parte de cuantificar los niveles de expresión del gen CIRP, también se pueden cuantificar los niveles de expresión de la proteína codificada por dicho gen. El nivel de expresión de la proteína codificada por CIRP puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dicha proteína en una muestra de un sujeto. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dicha proteína pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a dicha proteína (o a fragmentos de la misma que contenga un determinante antigénico) y la posterior cuantificación de los complejos formados. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar dicha proteína CIRP, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, etc.

En otra realización particular de la invención, la cuantificación de los niveles de la proteína codificada por el gen CIRP comprende la cuantificación de la proteína CIRP. En una realización particular de la invención, la cuantificación de los niveles de proteína codificada por el gen CIRP se realiza mediante western blot, inmunohistoquímica o ELISA.

La invención se describe a continuación mediante los siguientes ejemplos que deben ser considerados como meramente ilustrativos y no limitativos de la misma.

EJEMPLO 1

I. Materiales y Métodos 1.1 Construcción de una genoteca de ADNc

Se utilizaron dos tipos de células ES murinas (CGR8 y Rl) para la extracción de ARN. El ADNc de las dos líneas celulares se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y Xhol y se insertó en un vector retroviral p-puroMaRx previamente linearizado con estas enzimas (Promega, Madison, WI), como se ha descrito (Hannon, G. J., et al. Science, 283:1129-1130, 1999). La genoteca de ADNc resultante contenía 6x10⁶ clones diferentes.

1.2 Cultivo de células e infecciones En la Figura la se muestra una representación esquemática del screening genético realizado. Los fibroblastos embrionarios de ratón se generaron según se ha descrito previamente (Carnero, A., et al. (2000) Nat CeIl Biol, 2: 148-155). Se utilizó la línea celular de empaquetamiento LinXE para producir los retrovirus según descrito previamente (Hannon, G. J., et al (1999) 283:1129-1130). Las células se hicieron crecer en DMEM (Lonza, Basilea, Suiza) con suero FCS (suero fetal de ternera) al 10%.

Se infectaron MEFs en el pase 4 (P4) con la genoteca de ADNc. En paralelo, se incluyeron los controles positivo y negativo de proliferación, los genes de GFP y p53 , respectivamente, para validar que los clones hallados en el cribado genético eran realmente positivos. Después de la selección con puromicina, las células se sembraron a densidad baja y se hicieron crecer durante más de un mes. Se expendieron en cultivo los clones pequeños de células que habían evitado la senescencia replicativa, y se realizó la extracción del ARNm para detectar los clones insertados mediante RT- PCR con cebadores específicos del vector retroviral MaRx.

1.3 Curvas de crecimiento

Los fibroblastos embrionarios de ratón se infectaron con GFP, CIRP y p53^175H, y después se realizó la selección con higromicina (50mg/mL). Para las curvas de crecimiento, se sembraron 5x104 células por pocilio en placas de 24 pocilios por triplicado y se fijaron cada tres días. Las placas se tiñeron con cristal violeta para observar el ensayo de formación de colonias y después se destiñeron con ácido acético. Para el ensayo de formación de colonias, los MEFs se infectaron con CIRP frente a GFP y se seleccionaron con el antibiótico apropiado. Tras la selección, los MEFs infectados con los genes indicados, se sembraron a IxIO⁵ células por placa de 10 cm durante 20 días. Finalmente, se fijaron las célulasa, tiñeron con cristal violeta y destiñeron con ácido acético para su cuantificación relativa (595 nm).

1.4 Actividad SA-β-gal

La actividad β-gal se analizó según se ha descrito previamente (Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G, Roskelley C, Medrano EE, Linskens M, Rubelj I, Pereira- Smith O, et al. (1995). Proc Nati Acad Sci U S A 92: 9363-9367). Las células se fijaron con glutaraldehído al 0,5%, se lavaron con PBS (pH 6) suplementado con ImM de MgCl₂ y se tiñeron con solución X-gal de teñido al 37°C según indicaciones del fabricante (CeIl Signalling).

1.5 Medida de la síntesis de proteína

Para estudiar la incorporación de metionina 35S, se infectaron los MEFs con GFP frente a los CIRP. Tras la selección con antibióticos adecuada, se contaron las células y se sembraron por triplicado en placas de 24 pocilios a una densidad de 10⁵ células/pocilio.

Al día siguiente, se mantuvieron a 32°C o 37⁰C durante 6 horas. Transcurrido este tiempo, se añadió 35-S al medio de cultivo a una concentración final de 5mCi/mL durante 1,5 horas. Se lisaron las células y se midió en un contador de según se ha descrito previamente (Mishra-Gorur, K., et al (2002). J Biol Chem, 277: 33537-33540).

El experimento se realizó dos veces, cada una de ellas por triplicado.

1.6 Inmunotransferencia

Los ensayos de Western-blot se realizaron según se ha descrito previamente (Carnero, A., et al (2000). Nat CeIl Biol,2; 148-155) usando anticuerpos contra actina (Calbiochem), ρ53, ρ21, pl6 y ERK (Santa Cruz Biotechnology, CA), CIRP (Proteintech), pl9 (Abcam), antifosfo-ERK, Mnkl, fosfo-MEK, fosfo 4E-BP1 y 4E-BP total (CeIl Signalling Technology).

1.7 Ensayo de actividad quinasa

Los ensayos de actividad quinasa se realizaron según se ha descrito previamente (Matsushime H, et al (1994) Mol CeIl Biol. Mar;14(3):2066-76). 1.8 PCR a tiempo real

Las reacciones de PCR a tiempo real se llevaron a cabo por triplicado utilizando el Assays-on-Demand Taqman Gene Expression Assays de Applied Biosystems según se ha descrito anteriormente (ME, L. L., et al (2006) Oncol Rep, 16: 603-608).

1.9 Sujetos humanos

Se extrajo el ARN de tejido normal y tumoral de cada paciente (Quiagen, Hilden, Alemania) y la síntesis del ADNc se realizó como se ha descrito (Sakurai, T., et al (2006) Biochim Biophys Acta, 1763: 290-295). Se utilizaron muestras de seis pacientes para la extracción de proteínas para realizar inmunotransferencia con anticuerpos frente a p53 (DO-7) y CIRP. Todos los procedimientos del presente estudio han sido aprobados por el Comité de Ética del Hospital Valí d'Hebron.

II. Resultados y Discusión

Basándose en la observación de que la capacidad proliferativa de las células madre embrionarias y células cancerosas es bastante similar y diferente con respecto a la de las células primarias (Figura la), se infectaron MEFs WT con una genoteca de ADNc de células de ratón embrionario en vectores retrovirales pPuroMarX II. Los clones supervivientes se seleccionaron basados en el aspecto fenotípico de las células en proliferación Esto ha llevado a encontrar que el gen CIRP es un gen que inmortaliza. Un retrovirus que codifica el ADNc de CIRP confirió capacidad de proliferación ilimitada en MEFs primarios con una eficacia comparable a la de p53^175H (Figura Ib). La verificación de que CIRP evita la senescencia replicativa se probó mediante la ausencia de células positivas para la expresión de β-galactosidasa (datos no mostrados).

El papel proliferativo de CIRP se determinó mediante la elaboración de curvas de crecimiento tras la infección y subsiguiente selección en MEFs (Figura Ic) y mediante la realización de un ensayo de formación de colonias que mostró la capacidad de los MEFs-CIRP de formar colonias frente a los MEFs-GFP (Figura Id). Con el fin de verificar que el efecto fenotípico de los CIRP-MEFs era el resultado de la sobreexpresión del ADNc de CIRP, se coinfectaron CIRP junto con un vector vacío llamado vector S así como CIRP más un ADNc de la recombinasa Cre. La proliferación cesó sólo cuando el ADNc de Cre se sobreexpresó (Figura le).

El ARNm de CIRP se detectó mediante RT-PCR cuantitativa (Figura 2a) y la proteína CIRP mediante Western blot (Figura 2b).

Con el fin de investigar los mecanismos moleculares en los MEFs-CIRP que resultaron en el mantenimiento del crecimiento de las células, mientras que en las células control se producía senescencia, se analizó el estado de las proteínas pió y 19^A817, las cuales tienen un papel conocido en las rutas de Rb y p53, respectivamente (Figura 3 a). No se observaron diferencias en los niveles de dichas proteínas entre los MEFs-CIRP y GFP tras la infección y selección con los antibióticos apropiados. Con el fin de verificar que pió, pl9 y p21 no se acumularon en los MEFs-CIRP tal como lo hicieron en los GFP, se analizaron las células tras selección y durante la senescencia cuando se observó un fenotipo claramente positivo para β-galactosidasa en las células MEFs-GFP (Figura le y datos no mostrados). Mientras que las proteínas ρl6 y ρ21 se acumularon claramente en los MEFs-GFP en el pase P6 en presencia de células positivas para β-galactosidasa, indicando su estado senescente (Figura 3b y datos no mostrados), no se observó esta acumulación en los MEFs-CIRP. La ausencia de acumulación de proteínas inhibidoras del ciclo celular, confirmó en MEFs en P6 los resultados de que CIRP es un gen inmortalizador. Las kinasas MAP son mediadores importantes de la señalización celular de la membrana celular al núcleo y ERK1/2 juega un papel central en el control de la proliferación celular. La activación de ERK, medida como los niveles de ERKl /2 fosforilado, se ha observado tras tratamiento con inductores de apoptosis en células deficientes de CIRP cuando CIRP se sobreexpresa. Así, se han analizado los niveles de fosforilación de ERK. Sorprendentemente, se observaron claras diferencias cuando se observaron los niveles de fosforilación de ERK1/2 frente a ERK total en MEFs-CIRP y MEFs-GFP. La proteína MEK aguas arriba en la ruta de señalización también estaba afectada (Figura 3b). El nivel elevado de fosforilación de la quinasa ERK1/2 en los MEFs-CIRP frente a los MEFs-GFP es un resultado interesante. Sin embargo, la activación de ERK ha sido descrita para el ras^Va112 oncogénico como la causa principal de la entrada prematura en senescencia cuando se sobreexpresa en MEFs primarios. Con el fin de verificar que la senescencia prematura en MEFs-ras^Va112 ocurre antes de la senescencia en los MEFs- GFP, se trazaron curvas de crecimiento (datos no mostrados).

Con el fin de determinar el intrincado mecanismo que ocurre por abajo de fosfo-ERK en ras^Va112 y MEFs-CIRP que pudiera explicar el por qué unos entraban en senescencia y los otros la evitaban, se compararon los MEFs-CIRP, ras^Va112 y GFP. Los inventores encontraron que había un elevado incremento en los niveles de las proteínas pl9 y p21 al mismo tiempo que ocurría la fosforilación de ERK en los MEFs-ras^Va112 y que este fuerte incremento no tenía lugar en los MEFs-CIRP o GFP en el mismo pase (Figura 3c). Los datos aquí presentados sugieren que pl9 y p21 tienen un papel crucial en la inducción de la parada celular y en la senescencia prematura en MEFs-ras^Va112, primero porque la sobre expresión de ambas proteínas ocurre tan pronto como la activación de ERK, segundo porque la activación es de 10 veces más fuerte que la GFP y tercero, porque la sobreexpresión de pl9 y p21 se correlaciona con la presencia de células SA-β- gal positivas (datos no mostrados). Tras excluir la posibilidad de que podría existir una falta de señales inhibidoras en los MEFs-CIRP que pudieran explicar parcialmente porqué no entran en senescencia, se investigaron la presencia de señales proliferativas que pudieran diferenciar los MEFs- CIRP de los GFP y ras^Va112. Se han descrito varios sustratos ERK; se estudiaron las proteínas c-fos, c-myc y junB con el fin de determinar si estaban afectadas diferencialmente en los MEFs-CIRP comparados con los MEFs-ras^Va112. Aunque no se encontraron diferencias en c-myc o junB (datos no mostrados), la proteína c-fos estaba sobreexpresada en los MEFs-CIRP frente a los MEFs-GFP, indicando una posible implicación de los componentes AP-I en la inmortalización de CIRP (Figura 3d). Dado que c-fos pertenece a uno de los componentes de AP-I y que el promotor de la ciclina Dl contiene un sitio de unión a AP-I funcional, un posible mecanismo por el que la ruta de ERK podría estimular la proliferación podría ser mediante la activación de la ciclina Dl. De manera interesante, la ciclina Dl está claramente sobreexpresada en los MEFs- CIRP con respecto a los GFP (Figura 3d). Para analizar si dicho incremento estaba asociado con un incremento de actividad CDK4, se realizó un ensayo de quinasa en los MEFs-CIRP frente a los GFP. La figura 3e muestra que la actividad quinasa estaba asociada con una estimulación de la ciclina Dl. Notablemente, la ciclina Dl estaba también sobreexpresada en los MEFs-ras^Va112 frente a los GFP (Figura 3d). Varios estudios han mostrado que la expresión de ras activado es suficiente para inducir una acumulación de ciclina Dl en varios tipos celulares. Un aumento de la ciclina Dl ha sido relacionado con p21 en MEFs, dado que la ciclina Dl está ausente en MEFs deficientes para p21. Los datos aquí presentados sugieren que una multitud de eventos moleculares tienen lugar tras la sobreexpresión de ras y que la respuesta celular final es un equilibrio entre las señales proliferativas e inhibitorias. Los altos niveles de inducción de la ciclina Dl en los MEFs-CIRP sugieren que otras proteínas por debajo de ERK podrían estar involucradas a parte de la activación de c-fos. Una diana posible para la inducción de la ciclina Dl es la proteína 4E-BP1. Un papel principal para la ruta ERK es en la fosforilación de S6, elF4E y 4E-BP1 inducida en la actividad neuronal, un hecho que asocia la ruta de ERK con 4E-BP1 en las formas de larga duración de la memoria y plasticidad sináptica.

4E-BP1 y eIF4 tienen un papel fundamental en el control translacional y estimulación última de la síntesis de proteínas. Dado el hecho de que 4E-BP1 está involucrado en la transcripción del ARNm dependiente de cap y que dicha transcripción influye en la síntesis de la mayoría de las proteínas celulares (todos los ARNm transcritos en el núcleo llevan una tapa en 5'), se investigó en primer lugar la incorporación de metionina 35S en MEFs-CIRP frente a los GFP (Figura 4a). 4E-BP1 total y su forma fosforilada estaban sobreexpresadas en MEFs-CIRP frente a los GFP (Figura 4b). Este incremento total también estaba correlacionado con la fosforilación de S6 (datos no mostrados). En conclusión, el presente estudio propone que el mecanismo principal empleado por CIRP para inmortalizar células es mediante estimulación de la síntesis proteica general mediante la inactivación principalmente de 4EBP 1 a través de ERK. Así, esta ruta que involucra 4EBP 1 parece ser más decisiva que la activación de c-fos para mediar la inmortalización de CIRP .

El hecho de que 4EBP 1 total está sobreexpresada en tumores de alto grado en comparación con tumores de bajo grado y casi todas las proteínas 4EBP 1 están fosforiladas, soporta la noción de que CIRP es un gen de proliferación que puede estar involucrado en cáncer en humanos. Los resultados aquí presentados sugieren que aunque ambos, CIRP y ras oncogénico activan la misma proteína, fosfo-ERK, cada una de ellas apaga rutas de señalización divergentes aguas abajo que llevan a diferentes respuestas celulares. Mientras que en los MEFs-ras^Va112, pl9, p21 y pl6 evitan la proliferación celular, la inmortalización no está sólo libre de ocurrir debido a la falta de señales inhibidoras, sino que se estimula debido a la inactivación de 4EBP 1 en los MEFs-CIRP.

Con el fin de determinar si las respuestas celulares opuestas mediadas por P-ERK están relacionadas con la cantidad de activación de ERK, se cuantificó P-ERK en MEFs- CIRP frente a los MEFs-ras^Va112 en P4 (datos no mostrados). Los resultados muestran que la activación de ERK era más fuerte en MEFs-ras^VaI12 que en los MEFs-CIRP. Por tanto, basándose en los presentes resultados así como en estudios recientes que indican que la senescencia inducida por ras oncogénico depende de la intensidad de la señal, los inventores sugieren que la intensidad de la activación puede ser importante cuando las células apagan una ruta de señalización aguas abajo de ERKl /2 que finaliza con diferentes respuestas celulares. Sin querer estar unido a ninguna teoría, se puede especular que no sólo la intensidad, sino también la duración de la señal de ERK puede ser relevante para determinar la entrada o no en senescencia. Con el fin de determinar si la activación de ERK es responsable del fenotipo proliferativo de CIRP, se trataron MEFs-CIRP frente a los GFP diariamente con el inhibidor de ERK PD98058. Mientras que PD98058 no tuvo un efecto significativo en los MEFs-GFP, disminuyó la capacidad proliferativa de los MEFs-CIRP, sugiriendo que el efecto fenotípico de CIRP puede mediarse en gran manera a través de la ruta de señalización de ERK (Figura 4c y datos no mostrados).

También se examinó la capacidad de CIRP para proteger las células de la senescencia prematura inducida por ras^Va112 oncogénico. Los MEFs WT rápidamente sufrieron arresto tras la infección con un retrovirus que codifica ras^Va112, mientras que los MEFs que expresaban CIRP, continuaron proliferando aun en presencia de ras^Va112 (Figura 4d). Sin embargo, otro experimento mostró que mientras que ras oncogénico causó la transformación neoplástica de células EIa infectadas, ras^Va112 no adquirió la habilidad de formar foci o colonias en ensayos de agar blando en MEFs-CIRP. Así, la coexpresión de ambos ras^Va112 y CIRP no contribuyó a la transformación ni en MEFs primarios ni en células NIH3T3 inmortalizadas (Figura 4e).

Con el objetivo de determinar si el gen CIRP tiene algún efecto en tumores humanos, se comparó la expresión del ARNm de CIRP en tejido normal frente a mutado del mismo paciente. El ARNm de CIPR se analizó por RT-PCR cuantitativa en 15 carcinomas de próstata (Figura 5a) y 29 de colon (Figura 5b). En 7/19 (36%) de los pacientes de cáncer de próstata y en 8/27 (29%) de colon, se observó sobreexpresión del ARNm de CIRP.

Se realizó un análisis de proteína para confirmar la sobreexpresión de la proteína CIRP (Figura 5c). El hecho de que un subgrupo de cáncers de colon y próstata mostraran una sobreexpresión de ARNm de CIRP, sugiere un posible enlace entre CIRP y los tumores en humanos.

Estos resultados están en desacuerdo con un estudio previo de Hamid et al (2003) (Int J

Gynecol Pathol, 22; 240-247) en el que la expresión de CIRP se mostró como reducida en tejido tumoral. Las diferencias entre estos resultados y los presentados aquí, pueden relacionarse con el tipo de cáncer analizado y a la metodología empleada.

El descenso en el grado de crecimiento de las células de mamífero con condiciones de frío moderadas no se debe enteramente a arresto de metabolismo, sino que también involucra un proceso activo en el que posiblemente CIRP y otras proteínas de estrés tienen un papel fundamental en la estimulación de la proliferación. Los inventores, sin querer estar unidos a ninguna teoría, sugieren que a pesar de que la mayoría de las proteínas celulares están inhibidas con estrés de frío, la activación de CIRP puede estar asociada con una señal de proliferación que mantiene las células en un estado de proliferación activo. Aunque quizás la temperatura externa cuando hay frío moderado no sea la más apropiada, no es tan poco llevadera como para parar el crecimiento celular. CIRP esquiva la senescencia mediante de forma última activando la ciclina Dl, la cual estimula un incremento en la actividad de CDK4 a través de la ruta MAPK. En este caso, CIRP evita la senescencia replicativa cuando se sobreexpresa a temperatura fisiológica (37⁰C) a través de la activación de ERK mediante mecanismos que son similares, pero no idénticos, a los que ocurren con la sobreexpresión de ras^Va112 oncogénico.

Claims

REIVINDICACIONES

1. CIRP, una variante funcionalmente equivalente del mismo o un polinucleótido que codifica CIRP o una variante funcionalmente equivalente del mismo para su uso en medicina.

2. CIRP, una variante funcionalmente equivalente del mismo, un polinucleótido que codifica CIRP o una variante funcionalmente equivalente del mismo para el tratamiento de una enfermedad relacionada con una senescencia celular indeseada.

3. Un compuesto capaz de inhibir la expresión y/o la actividad de CIRP.

4. Un compuesto según la reivindicación 3 en donde el compuesto se selecciona del grupo formado por ARNips, oligonucleótidos antisentido, ribozimas específicos y anticuerpos inhibidores específicos de CIRP

5. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor según las reivindicaciones 3 ó 4.

6. Un compuesto según la reivindicaciones 3 ó 4 para su uso en medicina.

7. Un compuesto según las reivindicaciones 3 ó 4 para el tratamiento de enfermedades asociadas a una proliferación celular indeseada.

8. Compuesto según la reivindicación 7, donde la enfermedad asociada a una proliferación celular indeseada está causada por un aumento en la actividad de 4E- BPl.

9. Compuesto según la reivindicación 7, donde la enfermedad asociada a una proliferación celular indeseada está causada por una actividad elevada de la vía de señalización de ERK.

10. Método in vitro para activar la proliferación celular o para evitar la senescencia replicativa que comprende la introducción en una célula de CIRP, de una variante funcionalmente equivalente del mismo o de un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína CIRP o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

11. Método in vitro para la identificación de compuestos capaces de bloquear la proliferación celular o de bloquear la evitación de la senescencia replicativa inducida por CIRP o una variante funcionalmente equivalente del mismo que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una célula en la que proteína CIRP se encuentra sobre- expresada con un compuesto candidato e (ii) identificar aquellos compuestos que bloquean la proliferación celular o que bloquean la evitación de la senescencia replicativa.

12. Método in vitro para el diagnóstico de cáncer en un sujeto o para determinar la predisposición de un sujeto a padecer cáncer, o para determinar el estadio o severidad de dicho cáncer en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicho cáncer, que comprende cuantificar los niveles de expresión del gen CIRP o de la proteína codificada por dicho gen o de cualquier variante funcionalmente equivalente de dicha proteína en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde un aumento de la expresión de CIRP o del nivel de expresión de la proteína codificada por dicho gen, o cualquier variante funcionalmente equivalente de dicha proteína CIRP, con respecto a la expresión de CIRP o del nivel de expresión de la proteína codificada por dicho gen, o cualquier variante funcionalmente equivalente de dicha proteína CIRP es indicativa de cáncer, o de mayor predisposición de dicho sujeto a padecer cáncer, o de mayor severidad del cáncer, o de la no respuesta a la terapia en relación con un control.

13. Método según la reivindicación 12, donde dicho cáncer es cáncer de colon.

14. Método según la reivindicación 12, donde dicho cáncer es cáncer de próstata.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde la cuantificación de los niveles de expresión del gen CIRP comprende la cuantifícación del ARN mensajero (ARNm) del gen CIRP, un fragmento de dicho ARNm, ADN complementario (ADNc) del gen CIRP, un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas.

16. Método según la reivindicación 15, donde la cuantifícación de los niveles de expresión del gen CIRP se realiza mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en donde la cuantificación de los niveles de la proteína codificada por el gen CIRP comprende la cuantificación de la proteína CIRP.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en donde la cuantificación de los niveles de proteína codificada por el gen CIRP se realiza mediante Western blot, inmunohistoquímica o ELISA.

19. Un método in vitro para la identificación de proteínas capaces de activar la proliferación celular o de prevenir la senescencia replicativa que comprende

(i) poner en contacto una célula de capacidad proliferativa limitada con una genoteca de ADNc de células troncales, (ii) seleccionar aquellas células en las que se observe proliferación celular o inhibición de la senescencia replicativa y (iii) caracterizar el miembro de la genoteca de las células seleccionadas en (ii)

20. Método según la reivindicación 19 en donde las células troncales son de origen embrionario.