KR20070030219A

KR20070030219A - 더블유알엔이 매개체로 작용하고 텔로미어가 개시하는 세포시그널링의 조절체

Info

Publication number: KR20070030219A
Application number: KR1020067026455A
Authority: KR
Inventors: 바바라 에이 길치레스트; 마크 에스 엘러
Original assignee: 트르스티스 오브 보스톤 유니버시티
Priority date: 2004-05-19
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2007-03-15
Also published as: WO2005113764A2; BRPI0511142A; EP2434009A1; WO2005113764A3; TR200606490T1; TR200606490A2; NZ551323A; IL179199A0; MXPA06013263A; CN1965076A; CA2566859C; EP1761629A2; AU2005245932A1; CA2566859A1; RU2006144817A; NO20065782L; IL179199A; US20080221052A1; JP2007537758A; CN101869575A

Abstract

WRN의 조절체의 사용이 기술되어 있다. WRN의 활성체는 성장 억제, 세포 소멸 또는 증식 노화를 유도하기 위해 이용되며, WRN의 억제제는 성장 억제, 세포 소멸 또는 증식 노화를 감소시키기 위해 이용된다. WRN의 조절체들을 식별하는 방법도 기술되어 있다.

Description

더블유알엔이 매개체로 작용하고 텔로미어가 개시하는 세포 시그널링의 조절체{Modulator of WRN-mediated telomere-initiated cell signaling}

본 발명은 시그널링 경로의 조절에 관한 것이다. 자세하게는, 본 발명은 텔로미어에 의해 개시되는 노화, 세포 소멸, 타닌첨가 및 다른 DNA 손상반응의 조절에 관한 것이다.

인구가 노화함에 따라 인체내의 암세포의 발생 빈도도 선진국에서 증가되고 있다. 암의 몇 가지 형태와 진단시에 질병의 단계에 대해서는, 실험 대상자 및 사망률이 광범위한 연구에도 불구하고 대폭적으로 개선되고 있지 않고 있다. 암의 진행시에, 종양 세포는, 정상 세포가 조직과 관련되는 특수 환경과의 상호 작용이 조절되는 방법의 중요한 점들이 되는, 노화와 세포 소멸을 포함하는 부정적인 조절 제어와는 점점 더 관계가 없어지고 있다.

세포 노화는 암에 대해서 중요한 방어대책으로 제시되었다. 광범위한 증거는 (염색체의 3' 단부(ends)들을 복사할 수 없는 기능에 의해 발생되는) 진행되는 텔로미어 단축 또는 노화시에 텔로미어 역기능의 다른 형태를 포함한다. 생식계열 세포와 대부분의 암 세포에서는, 생존 가능성은 텔로미라제, 즉 염색체 단부의 3' 말단(terminus)에 TTAGGG 반복을 첨가하는 효소 복합체에 의한 텔로미어 길이의 보존과 관련된다. TTAGGG의 세로로 반복(tandem repeat)이 되는 텔로미어는 기부의(proximal) 텔로미어 이중 DNA내에 포함되며, 텔로메릭 반복 결합 인자(TRFs), 특히 TRF2에 의해 안정화되는 약 150-300 베이스에 한 개의 3' 단일한 스트랜드 돌출부를 가지는 루프 구조내에서 종료한다. TRF2(TRF2^DN)가 우세한 네가티브(dominant-negative)형태의 엑토픽(ectopic : 비정상적인 위치에서 생기는 것) 표현은 텔로미어 루프 구조를 파괴시키고, 3' 오버행(overhang)을 노출시키며, DNA 손상 반응을 발생시키며, 그 후에는 원시적인 섬유 아세포(fibroblast), 섬유육종(fibrosarcoma) 세포, 그리고 다른 종양 세포 형태의 노화가 이어진다.

노화는 또한 광범위한 DNA 손상 또는 어떤 종양 유전자의 과도 표현(overexpression)에 의해 현저하게 촉진될 수 있다. 텔로미라제 역 트랜스크립타제 촉매 서브유닛(TERT)의 엑토픽 표현은, 효소학적으로 텔로미어의 길이를 보존하거나 또는 증가시키며, 어느 인간의 세포 형태의 이어지는 생존 가능성에 따라 노화를 극복할 수 있으며, 이에 따라 복제 노화의 텔로미어에 의존하는 메카니즘을 강하게 제시하고 있다. 게다가, 종양 세포들은 보통 TERT를 표현하고/또는 변종을 포함하므로, 정상적인 노화 세포보다 더 짧은 텔로미어를 종종 가지고 있음에도 불구하고 세포가 노화 반응을 극복할 수 있으며, 무제한 증식할 수 있다. 그러나, 몇 개의 종양 세포는 여러 가지 암을 억제하는 인자에 반응하여 노화를 거치게 되며, 생존 가능성이 DNA 손상에 대한 이러한 기본적인 세포 반응의 손실을 반드시 의미하는 것은 아니다.

인간 세포의 노화는 주로 p53과 pRb 경로에 달려 있다. 종양 억제제 p53은 여러 가지 자극, 예를 들어, DNA 손상, 전사 또는 복제, 종양 유전자 변형의 조절기능의 해제와, 몇 개의 화학치료약에 의해 발생되는 미세소관의 조절기능 해제를 세포 성장 억제 또는 세포 소멸로 변환함으로써 세포의 스트레스 반응 메카니즘에서 주요한 역할을 한다. 활성화되면, p53은 세포 성장 억제 또는 프로그램이 된 자살 세포 죽음(세포 소멸)을 유도하며, 게놈의 안정성을 위해 중요한 제어 메카니즘으로 작용한다. 특히, p53은 세포 그룹으로부터 손상된 세포들을 유전학적으로 제거하여 게놈의 안정을 제어하므로, 그 주요 기능은 종양 형성을 방지하는 것이다.

순수한 종양 억제제 pRb 경로는 또한 종양 발생을 억제하는데 기여한다. 와일드 형태(wild type)의 p53을 포함하는 pRb^-/-종양 세포에서는, pRb가 노화를 발생시킨다. 경부 암 세포들은 자주 와일드 형태의 p53과 pRb 유전자를 보존하고 있지만, HPV E6와 E7 단백질은 각각 p53과 pRb 경로들에 대해 간섭한다. 바이러스의 E2 단백질의 엑토픽 표현은 HPV E6와 E7 유전자 전사(transcription)를 억제하며, 경부의 악성 종양 세포 라인에서 신속하고 현저한 노화 반응을 유발시킨다. 이것은 암세포 노화에 있어서 p53과 pRb의 중요한 역할을 확인시켜 주고 있다.

단지 p53과 pRb 경로를 억제하는 것만으로는, 섬유아세포가 복제 노화를 극복하기 위해 충분하지 않다. 사실은, SV 40T 항원에 의해 트랜스펙트(transfect) 되거나, 또는 아데노 바이러스 E1A+E1B 또는 HPV E6+E7의 결합에 의해 형질 도입되어 p53과 pRb 경로들을 억제하는 인간의 섬유아세포는 연장된 수명을 가지며 복제되는 노화를 피할 수 있다.

DNA내에서의 이중 스트랜드 브레이크(break)는 포유류 세포에 대해서 매우 세포 독성적이다. 잘 보존된 MRN 복합체는 진핵생물내의 이중 스트랜드 브레이크의 복구와 관련된다. MRN 복합체는 형성이 된 후에 바로 이중 스트랜드 브레이크의 위치에 부착한다. MRN 복합체는 또한 세포 주기의 S-형이 텔로메릭 반복 결합 인자(TRF)와 결합되는 동안에 텔로미어로 이동한다.

MRN 복합체는 Mre11, Rad50와 NBS(p95)로 구성된다. Mre11은, mre11/p95/Rad50 복합체의 부분으로서, 세포 주기가 S-형일 때 텔로미어와 결합한다. Mre11은 DNA 스트랜드의 3' 단부에 대한 선호도를 가지는 엑소뉴클레아제이다. Mre11의 활동은 ATPase가 되는 Rad50과의 상호작용에 달려있다고 여겨지고 있다. Nbs1은 이중 스트랜드 브레이크의 위치에 있는 그것의 집합체외에도, MRN 복합체의 핵편재화(nuclear localization)와 관련되어 있다고 여겨진다.

베르너 신드롬(Werner's Syndrome)에서 변형되는 단백질인, WRN 단백질은 MRN 복합체와 상호작용한다고 알려져 있다(Cheng et al., 2004, Vol. 2004). 베르너 신드롬은 조기 노화, 증가된 악성종양과 게놈의 불안정성과 같은 특징을 나타내는 상염색체의 퇴행적인 장애를 의미한다. WRN은 헬리카제와 3-5' 엑소뉴클레아제 영역들을 모두 포함하는 핵단백질이다(Oshima, J., 2002, Bioessays 22, 894-901). 지금까지, 베르너 신드롬에서 밝혀진 모든 변종은 단백질의 COOH기로부 터 핵편재화 신호를 제거하는 WRN 트렁케이션(truncation : 잘라 줄임)이다(Oshima, J., 2002). 그러므로, 베르너 신드롬내의 WRN 변종은 단백질이 세포핵내의 활동 위치에 도달하지 못하도록 함으로써 기능성 널 표현형(functional null phenotype : 기능은 없으나 환경에 따라 나타남)을 발생시킨다고 여겨지고 있다. 베르너 신드롬 환자의 세포들에서는, 베이스 라인 뿐만 아니라 DNA 손상후에도, 삭제와 염색체 이동(translocation)의 레벨이 증가되었다. 이것은 WRN 단백질이 DNA 복구, 복제 및 재결합에 관련되어 있다는 것을 의미한다(Opresko et al., 2003, Carcinogenesis 24, 791-802). 베르너 신드롬 세포에서는, 또한 나이와 부합되는 제어에 비해 빨리 노화가 진행되며(Martin et al., 1970, Lab Invest 23, 86-92), 또한 가속화된 텔로미어 단축현상이 나타난다(Schulz, et. al., 1996, Hum Genet 97, 750-4).

WRN 복합체와의 상호작용외에도, WRN은 DNA 손상반응과 DNA 복구/복제에 참여하는 다른 단백질과 상호작용한다고 알려져 있다. 다른 단백질은 다음과 같다. DNA-PK/Ku(karmakar et ai., 2002, Nucleic Acids res 30, 3583-91), p53(brosh et al., 2001, J Biol Chem 276, 35093-102)과 조숙한 노화 신드롬인 블룸 신드롬(Bloom's syndrome)(BLM)내에서 변형된 헬리카제가 있다(von Kobbe et al., J Biol Chem 277, 22035-44). 게다가, WRN은 텔로미어 반복 결합 인자 2가 되는 TRF2와 상호작용하며, 이러한 작용은 WRN 엑소뉴클레아제 활동의 특이성을 변경시키므로 텔로메릭 DNA의 3'-5' 다이제스쳔(digestion)을 촉진시킨다(Machwe et al., 2004, Oncogene 23, 149-56; Opresko et al, 2003, J Biol Chem 277, 41110- 9). 게다가, 이러한 데이터는 DNA 물질대사내의 WRN과 텔로미어 보존을 위해 수행되는 중요한 기능을 보여주고 있다. 그러나, 이러한 경로상에서 WRN의 정확한 기능은 알려져 있지 않다.

암은 일반적으로 정상 또는 악성 종양 세포들을 가리지 않고 동등하게 모든 증식 세포들을 손상시키는 화학치료법과 방사선 치료와 같은 매우 독성이 강한 치료법들에 의해 치료된다. 이러한 치료들의 부작용은 모발 손실외에도 림프계, 혈액 생성계와 내장 상피계에 심각한 손상을 가져오게 한다. 증식 세포를 제외하고 정상 세포에 대해 악성 종양 세포를 우선적으로 대상으로 하여 이러한 모든 또는 몇몇 부작용을 극복할 수 있는 대안적인 치료법을 위해, 좀 더 안전하고 효과적인 암 치료법이 개발될 필요가 있다.

본 발명은 WRN의 조절체를 검사하는 세포에 근거하는 방법과 관련되며, 상기 조절체가 상기 세포에 의해 포착되어지는 조건하에서 후보 조절체들을 상기 세포와 접촉시키는 단계와, DNA 손상 반응 경로의 활성화와 관련되는 상기 세포의 특징을 측정하는 단계를 구비하며, 상기 세포의 특징은 세포 증식; 세포 생존 가능성; 세포 형태학과; p53의 인산화 반응, p95의 인산화 반응, ATM의 인산화 반응, H2AX의 인산화 반응, S상 억제(S phase arrest) 유도와 세포소멸의 유도와 같은 SA-β-Gal 활동으로 구성된 그룹으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 조절 인자는 제어에 비유되는 특성을 변경함으로써 식별된다. 후보 조절체들은 WRN에 명확하게 결합되어 있는 인자가 된다. WRN은 엑소뉴클레아제 활동을 수행하는 WRN의 프래그먼트(fragment), 호모로그(homolog), 아나로그 또는 변종으로서 표현된다.

본 발명은 또한 WRN에 확실하게 결합되는 인자를 검사하는 시험관 방법에 관한 것이며, 후보 조절체와 WRN을 접촉시키는 단계와, 후보 인자가 WRN에 확실하게 결합되어 있는지를 판단하는 단계를 구비하고 있다. WRN은 고체 지지부에 부착되어 있다. 즉, 후보 인자는 고체 지지부에 부착될 수 있다.

본 발명은 또한 WRN의 조절체를 검사하는 시험관 방법에 관한 것이며, WRN에 대한 핵산 기질의 존재하에서 시험관내의 후보 조절체와 WRN을 접촉시키는 단계와, 상기 기질의 가수분해를 측정하는 단계를 구비한다. 조절체는 제어에 비유되는 상기 기질의 가수 분해를 변경시킴으로써 식별된다. 상기 핵산 기질은 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 올리고뉴클레오타이드이며 n은 1에서 20까지의 수가 된다. 선택적으로 상기 핵산 기질은 (TTAGGG)n으로 표현되는 적어도 50%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 올리고뉴클레오타이드이며, n은 1에서 20까지의 수가 된다. 기질 핵산의 가수분해는 UV 흡수법, 식별된 올리고의 겔 분해, 또는 촉진되지 않는 뉴클레오타이드 베이스의 복구에 의해 측정된다.

본 발명은 또한 DNA 손상 반응 경로의 조절체를 검사하는 세포에 근거하는 방법과 관련되며, 조절체가 상기 세포에 의해 포착되어지는 조건하에서, 올리고뉴클레오타이드 존재하에서, WRN을 표현하는 세포와 후보 조절체들을 접촉시키는 단계와, DNA 손상 반응 경로의 활성화와 관련되는 상기 세포의 특징을 측정하는 단계를 구비하며, 상기 세포의 특징은 세포 증식; 세포 생존 가능성; 세포 형태학과; β갈락토시다제와 관련된 노화(SA-β-Gal) 활동과; p53의 인산화 반응, p95의 인산화 반응, ATM의 인산화 반응, H2AX의 인산화 반응, S형 억제(S phase arrest) 유도와 세포소멸의 유도로 구성된 그룹으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 조절 인자는 제어에 비유되는 특성을 변경함으로써 식별된다. 올리고뉴클레오타이드는 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지며 n은 1에서 20까지의 수가 된다. 올리고뉴클레오타이드는 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 50%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가질 수 있으며, n은 1에서 20까지의 수가 된다. WRN은 엑소뉴클레아제 활동을 수행하는 WRN의 프래그먼트, 호모로그, 아나로그 또는 변종으로서 표현된다.

세포에 근거하는 상술한 검사방법에서 사용되는 세포는 암세포가 될 수 있다. 세포에 근거하는 상술한 검사방법에서 사용되는 세포는 텔로미라제 역(reverse) 트랜스크립타제 또는 ALT 경로에 의해 텔로미어를 보존할 수 있다. 시험관내에서의 검사 방법과 세포에 근거하는 상술한 검사방법에서 사용되는 후보 조절체들과 인자들은 탄수화물, 단당류, 올리고당류, 다당류, 아미노산, 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 레티노이드, 스테로이드, 글리코펩타이드, 당단백질(glycoprotein), 프로테오글리칸과 작은 유기 분자들이 된다.

본 발명은 또한 WRN의 활성체를 포함하는 화합물의 사용에 관한 것이다. 활성체는 암을 치료하고, 세포 소멸을 유도하고, 세포 노화를 유도하고, 타닌첨가의 촉진을 억제하며, 세포 식별을 촉진하거나 면역억제를 촉진하기 위해 이용된다. 활성체는 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 올리고뉴클레오타이드가 되며, 여기서 n은 1에서 20까지의 수이며, 그리고 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 50%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 올리고뉴클레오타이드가 될 수 있다. 여기서 n은 1에서 20까지의 수이다. 처음 x3' 뉴클레오타이드 링키지(linkage)의 1에서 10까지는 3'-5'누클레아제에 의해 가수분해된다.

본 발명은 또한 WRN의 억제제를 포함하는 화합물의 사용에 관한 것이다. 억제제는 세포 소멸을 억제하고, 세포 노화를 억제하고, 성장을 촉진하며, 타닌첨가를 억제하며, 세포 식별을 억제하거나 암 치료 부작용을 감소시키기 위해 이용된다. 억제제는 화학치료법 또는 이온화 방사선 치료법과 함께 제공된다. 억제제는 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 WRN의 올리고뉴클레오타이드 억제제이며, 여기서 n은 1에서 20까지의 수이며, 그리고 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 50%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 올리고뉴클레오타이드가 될 수 있다. 여기서 n은 1에서 20까지의 수이다. 처음 x3' 뉴클레오타이드 링키지(linkage)의 1에서 10까지는 3'-5'누클레아제에 의해 가수분해된다.

본 발명은 또한 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지며, 최소한 한 개의 가수분해가 되지 않는 인터뉴클레오타이드 링키지를 가지는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물에 관한 것이다. 여기서 n은 1에서 20까지의 수이다. 처음 x3' 뉴클레오타이드 링키지(linkage)의 1에서 10까지는 WRN과 같은 3'-5'누클레아제에 의해 가수분해된다. 올리고뉴클레오타이드는 TTAGGG에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지거나, TTAGGG에 의해 표현되는 적어도 50%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 GTTAGGGTTAG 배열식을 가질 수 잇다. 가수분해되지 않는 링키지는 인황화합물(phosphorothioate)이 될 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드는 PNA가 될 수 있다

도 1a-1h는 희석액(도 1a와 도 1e); 40μM 11mer-1 pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:2)(도 1b와 도1f); 40μM 11mer-2 pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO:3)(도 1c와 1g); 40μM 11mer-3 pGATCGATCGAT(SEQ ID NO:4)(도 1d와 1h)에 의해 처리된 프로피듐 요오드화물로 착색된 유르카트 세포(Jurkat cells)의 FACS 분석을 도시하고 있는 도면이다. 유르카트 세포들은 분석전(도 1a-1d) 48시간 동안 또는 72시간 동안(도1e-1h)기재된 시약에 의해 처리되었다.

도 2a-2f는 세포들에 다음과 같은 것을 첨가하기 위해, 형광 활동하는 세포 소팅(sorting)의 결과를 도시한 프로필들이다. 도 2a는 희석액, 도 2b는 0.40μM 11mer-1;도 2c는 0.4μM 11mer-1-S;도 2d는 희석액; 도 2e는 40μM 11mer-1; 도 2f는 0.4μM 11mer-1-S를 도시하고 있다.

도 3a-3g는, 세포들에 다음과 같은 것을 첨가하기 위해, 형광 활동하는 세포 소팅(sorting)의 결과를 도시한 프로필들이다. 도 3a는 희석액, 도 3b는 10μM 11mer-1;도 3c는 10μM 11mer-1;도 3d는 10μM 11mer-1과 5μM 11mer-1-S;도 3e는 10μM 11mer-1과 10μM 11mer-1-S; 도 3f는 20μM 11mer-1-S; 도 3g는 10μM 11mer-1-S를 도시하고 있다.

도 4는 희석액, pTpT 또는 pTspT로 처리된 세포들의 멜라닌 성분(pg/cell)을 도시한 막대 그래프이다.

도 5는 희석액, 11mer-1, 또는 11mer-1-S에 의해 처리된 세포들의 멜라닌 성분(pg/cell)을 도시한 막대 그래프이다.

도 6은 가짜로 조사된(방사 없음, 올리고뉴클레오타이드 없음), 또는 자외선(UV)으로 처리된, 또는 조사되지 않는 그러나 pTspT가 공급되거나, 또는 UV에 의해 조사되고 pTspT가 공급된 세포들의 멜라닌 성분(pg/cell)을 도시한 막대 그래프이다.

도 7은 인황화합물 링키지와 합성된 뉴클레오타이드 배열 SEQ ID NO : 2의 올리고뉴클레오타이드를 도시한 도면이다.

도 8은, β-갈락토시다제 활동에 대해 포지티브한 세포 착색에 의해 표시되는 세포 착색(cell staining)에 의해, 정상적인 신생아의 인간 섬유아세포의 배양시에 노화를 유발시키는데 있어서 도 7에 도시된 인황화합물 올리고뉴클레오타이드 1, 2, 3과 4의 효과를 시험한 결과를 도시한 막대 그래프이다. 올리고뉴클레오타이드 "11-1"은 포스포디에스테르 링키지와 합성된 SEQ ID NO : 2에 의해 처리된 섬유아세포 배양을 나타내고 있다. "Dil"은 올리고뉴클레오타이드를 포함하지 않는 희석액으로 처리된 섬유아세포 배양을 나타내고 있다.

도 9는 p53과 H2AX의 인산화반응을 유도하는 T-올리고의 활동이 녹 다운된(knock downed) WRN에 의해 감소된다는 것을 나타내는 도면이다. T-올리고로 처리한 날에 WRN의 단백질 레벨은 "0"시간에서 표시되어 있다. T-올리고(40μM, T) 또는 희석액(D)이 첨가되었으며, 웨스턴 분석을 위해 24 시간 또는 48시간 후에 세포들이 수집되었다. 제어 섬유아세포들은 10Gy IR(IR,+)에 의해 조사되거나 또는 가짜로 조사(IR, -)되었으며, 한 시간 후에 수집되었다. 웨스턴 블롯(western blot)은 WRN, p53 포스포세린 15, 또는 포스포 H2AX를 인지하는 항체에 의해 검사되었다.

도 10은 T-올리고가 ATM과 관련된 DNA 의존성 단백질 키나아제(DNA-PK) 촉매 서브 유닛(DNA-PKcs)의 인산화 반응을 유도한다는 것을 나타내는 도면으로서, ATM과 DNA-PKcs의 위치가 도시되어 있으며, 가짜로 조사된 것과 진짜로 조사(10Gy IR)된 섬유아세포가 제어로서 포함되어 있다.

도 11은 T-올리고 처리에 반응하여 p53의 세린 37이 인산화되는 것을 도시한 도면이다.

도 12는 T-올리고와 노출된 텔로미어 오버행을 "감지하는" WRN 단백질에 대한 잠재적인 메카니즘을 도시한 것으로서, 이 메카니즘은 ATM과 DNA-PK의 활동을 유도하며, 다른 기질과 p53 인산화반응을 유도하는 것을 도시한 도면이다.

본 발명은 WRN이 3' 텔로미어 오버행 배열의 가수분해에 의해 개시되는 DNA 손상과 같은 시그널링과 관련되어 있다는 사실에 근거하고 있다. 텔로미어 배 열의 가수분해는 세포의 노화, 타닌첨가와 세포 소멸을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 DNA 손상에 반응하는 보호적인 세포 반응을 위해 중요한 시그널링 캐스케이드(signaling cascades)를 개시한다. 여기에 참조로서 포함되어 있는 심리중인 국제 특허 번호 PCT/US2004/000819호와 본 발명에서 도시한 바와같이, 3' 단부에서 뉴클레아제 다이제스천에 대해 차단되어 있는 T-올리고는DNA 손상 반응을 자극하는 기능을 상실하고 있다. WRN이 DNA 복제와 복구 및 텔로미어 보존에 관여하는 3'-5'뉴클레아제가 된다는 것을 고려하면, WRN은 T-올리고의 세포핵 "감지기"가 된다.

이론에 의해 제한되는 것은 아니지만, UV 방사, DNA에 대한 산화적인 손상 또는 DNA에 대한 발암물질 부가 생성물의 형성, 또는 나이와 연관되는 텔로미어 단축과 같은 DNA 손상은 텔로미어 루프를 불안정화시키므로, TTAGGG의 반복으로 구성되는 3' 오버행 배열을 노출시키게 된다. 텔로미어와 연관되는 단백질은 배열에 의존하는 방식으로 오버행에 부착하여 스스로 또는 복합체의 일부로서, WRN을 위한 "앵커(anchor)"로서 작용한다. WRN은 3' 단부로부터 텔로미어 오버행을 가수분해하기 시작하며, 이는 궁극적으로 세포 주기 억제, 유전자 분화유도(induction), 세포 소멸과/또는 노화의 생물학적인 종점에 이르게 하는 다른 시그널링 캐스테이드에 이르게 한다. 여기에서 제시된 데이터는 WRN 단백질이 스스로 또는 Mre11/Rad50/p95(Nbs1) 복합체와 같은 복합체의 일부로서, T-올리고를 "감지하고"(senses) 그리고 수준을 저하시키게 된다. 그러므로 ATM과 DNA-PK 키나제의 활성화와 이후의 다운 스트림(downstream) 기질의 인산화반응을 유도한다.(도 12)

제시된 시그널링 경로내에서의 WRN의 역할에 근거하면, WRN의 활성체는 DNA 손상 또는 텔로미어 루프 파괴가 존재하더라도, 상관없이 DNA 손상 반응 경로를 활성화시킨다고 추측된다. 이와 같이, WRN의 억제제는 DNA 손상 또는 텔로미어 루프 파괴가 존재하더라도, 신호 변환(transduction) 경로를 억제할 것이라고 추측된다.

본 발명에 따르는 제품과 화합물 그리고 방법들이 발표되고 기술되기 전에, 여기에서 사용되는 용어는 단지 특별한 실시예를 기술할 목적으로 도입된 것이며, 제한되어 있지는 않다는 것을 알아야 한다. 명세서와 첨부된 청구항에서는, 단수 형태가 되는 "a", "an"과 "the"는 문맥에서 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상물을 나타낸다는 것을 명심하자.

특허 또는 공개 출판물이 참조되고 있는, 본 출원에서는, 본 출원과 관련되는 기술을 더욱 상세하게 기술하기 위해, 이러한 출판물의 전체 내용이 여기에서 참조로서 본 출원에 포함되어 있다.

1. 정의

여기에서 사용되는 용어 "활성체"(activator)는 단백질의 활동을 증가 또는 활성화시키는 무엇인가를 나타낸다.

조절 인자의 투여량을 기술하기 위해 사용될 때에, 여기에서 사용되는 용어 공급하다(administer)라는 것은 약품의 단일한 투여량 또는 복수의 투여량을 의미한다.

여기에서 사용되는 용어 "아나로그(analog)"는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 와 같이 사용될 때에는, 한 개 또는 그 이상의 표준이 아닌 아미노산 또는 종래의 한 세트의 아미노산으로부터 변화된 구조적인 변종을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미하며, 바람직스러운 것은 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유하고 있다. 그리고, 올리고뉴클레오타이드와 같이 사용될 때에는, 포스포디에스테르(phosphodiesther) 인터뉴클레오타이드 링키지가 아닌 한 개 이상의 인터뉴클레오타이드 링키지를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 바람직스러운 것은 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유하고 있다.

여기에서 사용되는 용어 "항체"(antibody)는 종류 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 또는 Fab, F(ab')₂, Fd를 포함하는 그들의 유도체 또는 프래그먼트 및 단일한 체인 항체, 다이어바디(diabodies), 바이스피시픽 항체(bispecific antibody), 이중기능성(bifunctional) 항체와 그들의 유도체를 의미한다. 항체는 모노클로널(monoclonal) 항체, 또는 폴리클로널(polyclonal) 항체, 친화력이 제거된(purified) 항체 또는 그들의 혼합물로서 소망하는 에피토프(epitope : 항원 결정기)에 대해서 충분한 결합 특성을 나타내거나 또는 그로부터 파생되는 배열(sequence)이 될 수 있다. 항체는 키메릭(chimeric) 항체도 될 수 있다. 항체는 기존의 기술에서 알려진 한 개 이상의 화학적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드 일부분(1/2)의 부착에 의해 파생되어진다. 항체는 화학적인 일부분과 접합될 수 있다.

여기에서 사용되는 용어 "세포 소멸"은, 세포질의 세포 소기관의 본질을 보 존함에 따라 세포 부피의 점진적인 수축, 빛 또는 전자의 현미경 검사법에 의해 관찰되는 염색질의 응축(예를 들어, 핵 응축), 및/또는 원심분리된 침전 시험물에 의해 결정되는 바와같이, 뉴클레오솜 크기의 프래그먼트로 분할되는 DNA 클리비지(cleavage)를 포함하고 있으나, 이에 한정되어 있지 않는 세포 사망의 형태를 언급하고 있다. 세포 사망은, 세포막이 원형을 잃을 때(막에 기포가 생기는 것) 생기며, 식세포(phagocytic cell)에 의한 순수한 세포 프래그먼트("세포 소멸체")의 침전(engulfment)시에 발생한다.

여기에서 사용되는 용어 "생물학적 활동"은, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아나로그, 유도체, 프래그먼트, 호모로그(동족체), 또는 변종과 같이 사용될 때에는, 아나로그, 유도체, 프래그먼트, 호모로그(동족체), 또는 변종이, 특정한 항체에 의해 결합되는 기능을 포함하고 있으나 이에 한정되어 있지 않는, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 최소한 한 개의 활동을 보유하고 있다는 것을 의미한다. 그리고, WRN과 같이 사용될 때에는, 헬리카제 활동, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활동과 WRN 복합체와의 상호작용 기능을 포함하나 이에 한정되어 있는 것은 아니다. 그리고, 올리고뉴클레오타이드의 아나로그, 유도체, 프래그먼트, 호모로그 또는 변종과 같이 사용될 때에는, 엄격한 교배 조건에 따라 아나로그, 유도체, 프래그먼트, 호모로그 또는 변종이 올리고뉴클레오타이드에 교배된다는 것을 의미한다. 이러한 사실은 1982년 콜드 스프링 하버 연구소의 Maniatis등에 의해 분자 클로닝(연구소 매뉴얼)에 기술되어 있으며, 이 내용은 여기에 참조로서 포함되어 있다.

여기에서 사용되는 용어 "암치료"는 화학적 치료와 방사선 치료를 포함하고 있으나 이에 한정되지 않는 기술에서 알려진 암의 어느 치료법을 의미한다.

여기에서 사용되는 용어인 "..과의 결합"은 조절 인자의 공급과 추가 치료를 기술하고자 할 때에, 추가 치료 또는 그들의 결합 이전에, 또는 그들과 함께, 또는 그 후에, 조절체가 공급된다는 것을 의미한다.

여기에서 사용되는 용어 "유도체"는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 같이 사용되면, 원시적인 구조(아미노산과 아미노산 아나로그)가 아닌 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미하며, 바람직스럽게 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유하고 있다. 올리고뉴클레오타이드와 같이 사용되면, 뉴클레오타이드 배열 내부가 아닌 다른 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 바람직스럽게 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유하고 있다. 도면에 의하면, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 유도체들은 글리코실화됨으로써(glycosylated : 단백질에 글리코실기를 부가하는 작용)달라지며, 유전 정보가 번역된 후(post-translational)의 수정된 형태를 의미한다. 예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 이질 조직계(heterologous system)내의 표현에 의해 글리코실화 패턴을 나타낸다. 최소한 한 개의 생물학적인 활동이 보유된다면, 이러한 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 본 발명에 따르는 유도체가 된다. 다른 유도체들은, 공유 원자가에 의해 수정된 N- 또는 C- 터미너스(terminus)를 가지는 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드, PEGylated 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 지질 성분(lipid moieties)과 연관되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 알킬레이티드(alkylated) 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 아미노산 사이드 체인(side-chain) 기능성 그룹을 통해 다른 펩타이드, 폴리펩타이드 도는 화학제품에 링크되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 해당 기술에서 알려진 다른 변형물들을 포함한다.

여기에서 사용되는 용어 "프래그먼트"는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 같이 사용되면, 아미노산의 길이가 약 5에서 약 300까지가 바람직한, 아미노산의 길이가 약 8에서 약 50까지가 더욱 바람직한 어느 펩타이드 또는 폴리펩타이드 프래그먼트를 의미한다. 그리고, 바람직스러운 것은 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유한다. 그리고 올리고뉴클레오타이드와 같이 사용되면, 약 2에서 약 250까지가 바람직한, 그리고 약 2에서 약 20까지가 더욱 바람직한 올리고뉴클레오타이드 프래그먼트를 의미한다. 그리고, 바람직스러운 것은 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 프래그먼트의 대표적인 보기들은 아미노산의 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50이 되는 것이다. 올리고뉴클레오타이드 프래그먼트의 대표적인 보기들은 뉴클레오타이드의 길이가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이 되는 것이다.

여기에서 사용되는 용어 "호모로그"는 최소한 50%의 동일성(identity)을 가지거나 또는 공통적인 진화된 원종(ancestor)을 공유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미하며, 바람직스러운 것은 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유한다. 올리고뉴클레오타이드와 같이 사용되면, 최소한 50%의 동일성(identity)을 가지거나 또는 공통적인 진화된 원종(ancestor)을 공유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 를 의미하며, 바람직스러운 것은 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유한다.

여기에서 사용되는 용어 "억제하다(inhibit)"는 단백질의 활동을 참조할 때에, 효소의 활동의 방지, 억압(suppressing), 억제(repressing), 또는 제거를 의미한다.

여기에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 어느 조건으로부터 포유동물을 보호하는 것을 참조할 때에, 그 조건의 방지, 억압, 억제, 또는 제거를 의미한다. 조건의 방지는 그 조건의 시작전에 포유동물에게 본 발명에 따르는 화합물을 공급하는 것을 포함한다. 조건의 억압은 조건의 발생후에 그러나 임상학적인 현상 이전에 포유동물에게 본 발명에 따르는 화합물을 공급하는 것을 포함한다. 조건의 억제는 조건이 감소되거나 또는 더욱 악화되는 것을 방지하기 위해 조건의 임상학적인 현상 이후에 포유동물에게 본 발명에 따르는 화합물을 공급하는 것을 포함한다. 조건의 제거는 포유 동물이 조건으로부터 더 이상 고통을 당하지 않도록 그 조건의 임상학적인 현상 이후에 포유동물에게 본 발명에 따르는 화합물을 공급하는 것을 포함한다.

여기에서 사용되는 용어 "변종(variant)"은 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 같이 사용되며, 아미노산의 삽입, 삭제, 또는 보존적인 대체에 의해 아미노산의 배열이 달라지는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 그리고, 바람직스러운 것은 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유한다. 올리고뉴클레오타이드와 같이 사용되면, 뉴클레오타이드의 삽입, 삭제, 또는 보존적인 대체에 의해 뉴클레오타이드의 배열이 달라지는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 그리고, 바람직스 러운 것은 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 보유한다.

2. 조절체(Modulators)

a. WRN의 조절체

본 발명은 WRN 활동의 조절체에 관한 것이다. 조절체는 WRN 활동을 발생 또는 증가시키게 된다. 조절체는 WRN 활동을 또한 억제 또는 감소시킨다. 조절체는 인공적으로 합성된 화합물 또는 자연적으로 발생하는 화합물이 될 수 있다. 조절체는 저분자량 화합물, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 프래그먼트, 아나로그, 호모로그, 변종 또는 유도체가 될 수 있다.

올리고뉴클레오타이드 조절체는 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 약 33%에서 약 100%, 또는 적어도 50%에서 약 100% 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 올리고뉴클레오타이드가 되며, n은 1에서 20까지의 수가 된다. 여기에서 사용되는 (TTAGGG)n은 핵 배열 식별식의 비교와 같이 사용되면, 기준 핵산을 언급한다. 배열 식별식은 올리고뉴클레오타이드와 기준 핵산을 재정렬하고, 그 정렬내의 동일한 뉴클레오타이드의 갯수(a)를 올리고뉴클레오타이드의 베이스 쌍의 총수(b)만큼으로 분할함으로써 연산된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 (TTAGGG)₂로 표현되는 91%보다 많은 배열 식별식을 가지는, 배열 GTTAGGGTTAG에 의해 표현되는 11-bp가 될 수 있다.

올리고뉴클레오타이드는 단일한 스트랜드, 이중 스트랜드 또는 그 결합을 포함하나, 그에 한정되지 않는 형태가 될 수 있다. 바람직스러운 것은 올리고뉴클 레오타이드가 약 2에서 약2000까지의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직스러운 것은 약 2에서 약 200까지의 뉴클레오타이드의 단일한 스트랜드 3' 단부를 포함하고 있다는 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 EST가 될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드의 아나로그, 유도체, 프래그먼트, 호모로그, 또는 변조가 상세하게 고찰될 것이다.

보기에서 도시한 바와같이, 본 발명의 어느 올리고뉴클레오타이드는 세포의 증식 억제와 소멸 유도를 발생시키고, 반면에 본 발명의 다른 올리고뉴클레오타이드는 세포 소멸의 억제와 증식억제를 발생시킨다. 올리고뉴클레오타이드의 활동 차이는 3' 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 링키지의 갯수에 달려 있었다. 3' 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합 갯수를 변화시킴으로써, 올리고뉴클레오타이드의 효과도 변화되었다.

이론에 구속되지 않으면서 우리는 올리고뉴클레오타이드가 WRN에 의해 인식되며, 3' 엑소뉴클레아제 WRN을 위한 기질로서 작용한다는 것을 믿는다. 그 추론은 3' 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 WRN의 억제제 또는 길항제(antagonist)로서 작용한다는 것이다. WRN 활동 레벨을 결정하는 다른 요소들은 3' 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합의 총 농도, 베이스 배열과 G 성분을 포함하나 이에 한정되어 있지는 않다.

(i) 그것이 포스포디에스테르(phosphodiester) 링키지 또는 생리학적인 조건하에서 WRN에 의해 가수분해가 가능한 아나로그이고, (ii) 모든 인터뉴클레오타이드 결합 3'가 가수분해 가능하다면, 인터뉴클레오타이드 결합은 본 발명의 목적들 을 위해 가수분해 가능하다고 여겨진다. 인터뉴클레오타이드 결합은, 3'가 되는 가수분해 가능한 인터뉴클레오타이드 링키지의 갯수와 관계없이, 생리학적인 조건하에서 WRN에 의해 가수분해가 되지 않는다면, 본 발명의 목적들을 위해 가수분해가 불가능하다고 여겨진다. 가수분해가 불가능한 인터뉴클레오타이드 링키지의 대표적인 보기들은 인황화합물 링키지와 펩티이드 핵산 링키지(PNA)를 포함하나 이에 한정되어 있는 것은 아니다.

본 발명의 한 실시예에서는, 올리고뉴클레오타이드가 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 약 1에서 약 200까지의 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 가수분해가 불가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 약 0에서 약 199까지의 가수분해가 불가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함할 수 있다.

다른 실시예에서는, 올리고뉴클레오타이드가 가수분해가 불가능한 결합을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 약 1에서 약 200까지의 가수분해가 불가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 약 0에서 약 5까지의 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함할 수 있다. 양호한 올리고뉴클레오타이드는, 여기에 참조로서 그 내용이 포함되어 있으며, 2002년 4월 12일 제출된 공동 심리중인 미국 특허 츨원 번호 10/122,630호에 기재된 바와 같이 그리고 여기에 기재된 T-올리고이다.

b. DNA 손상 경로의 조절체

본 발명은 또한 DNA 손상 경로에 관한 것이다. 조절체는 DNA 손상 경로를 유도한다. 조절체는 또한 DNA 손상 경로를 억제한다. 조절체는 인공적으로 합성된 화합물 또는 자연적으로 발생하는 화합물이 될 수 있다. 조절체는 저분자량 화합물, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 프래그먼트, 아나로그, 호모로그, 변종 또는 유도체가 될 수 있다.

3. 화합물

본 발명은 또한 상술한 조절체를 포함하는 화합물과 관련된다. 화합물은 WRN의 활성체를 포함한다. 화합물은 또한 WRN의 억제제를 포함한다. 화합물은 또한 한 개 이상의 본 발명의 조절체를 포함한다. 화합물은 추가적인 치료약품과 함께 한 개 이상의 조절체를 포함할 수도 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 화합물은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합 또는 가수분해가 불가능한 인터뉴클레오타이드 결합 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 양호한 실시예에서는, 올리고뉴클레오타이드는 WRN의 활성체이다. 다른 양호한 실시예에서는, 올리고뉴클레오타이드는 WRN의 억제제이다. 상술한 바와같이, 올리고뉴클레오타이드의 활동은 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합의 총농도에 근거하여 WRN을 억제 또는 발생시키도록 조절된다.

a.형성

본 발명의 화합물은 종래의 방법에 의해 형성되는 정제 또는 마름모 모양의 형태가 된다. 예를 들어, 구강 투여를 위한 정제와 캡슐은 결합제, 충전제(filler), 윤활액, 붕괴제(disintegrant : 정제 분해 물질)와 습윤제(wetting agent)를 포함하나 이에 한정되어 있지 않은 종래의 엑시피언트(excipient : 부형제)를 포함한다. 결합제(binding agent)는 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨(sorbitol), 트라가칸스(tragacanth), 녹말의 점액과 폴리비닐피로리돈을 포함하나 이에 한정되어 있지는 않다. 필러는 락토스, 설탕, 마이크로크리스탈린 셀룰로스, 옥수수 녹말, 인산칼슘과 소르비톨을 포함하나 이에 한정되어 있지 않다. 윤활제는 마그네슘 스테아르산염, 스테아르산, 활석(talc), 폴리에틸렌 글리콜과 실리카를 포함하나 이에 한정되어 있지 않다. 붕괴제는 감자 녹말과 나트륨 녹말 글리콜레이트(glycollate)를 포함하나 이에 한정되어 있지 않다. 습윤제는 나트륨 로릴 황산염을 포함하나 이에 한정되어 있지 않다. 정제는 기존의 공지 방법에 따라 코팅된다.

본 발명의 화합물은 또한 수성 또는 유성 현탁액, 에멀젼, 시럽과 일릭서(elixir)를 포함하나 이에 한정되어 있지 않는 액체 형태가 될 수 있다. 화합물은 또한 사용 이전에 물 또는 적합한 매개체를 가지고 구성을 위한 건조한 제품으로 형성될 수 있다. 이러한 액체 준비물은 서스펜딩제(suspending agent), 유화제(emulsifying agent), 비수성 운반체(vehicle)와 보존제를 포함하나 이에 한정되어 있지 않다. 서스펜딩제는 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로스, 클루코스/설탕 시럽, 젤라틴, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 알루미늄 스테아르산염 젤과 수소를 첨가한 식용 지방을 포함하나 이에 한정되어 있지 않다. 유 화제는 레시틴, 소르비탄모노올레아산염, 아카시아를 포함하나 이에 한정되어 있지 않다. 비수용성 매개체는 식용 기름, 아몬드 오일, 분류된 코코넛 오일, 지성의 에스테르, 프로필렌 글리콜과 에틸 알코올을 포함하나 이에 한정되어 있지 않다. 보존제는 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트와 소르빅산을 포함하나 이에 한정되어 있지 않다.

본 발명의 화합물은 코코아 버터 또는 글리세라이드를 포함하나 이에 한정되지 않는 좌약 베이스(suppositorty base)를 포함하는 좌약으로서 형성될 수 있다.

디클로로디플루오로메탄 또는 트리클로로플루오로메탄과 같은 촉진제를 이용하여 아에로졸의 형태나 또는 마른 분말로서 투여될 수 있는 용액, 서스펜션, 또는 에멀젼을 포함하나 이에 한정되지 않는 형태로 되어 있는 본 발명의 화합물은 흡입용으로 형성될 수 있다. 본 발명의 화합물은 크림, 연고, 로션, 페이스트, 의약용 플라스터, 패치 또는 막을 포함하나 이에 한정되지 않는 수용성 및 비수용성 매개체를 포함하는 경피적인(transdermal) 형성물로서 형성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 주사 투입 또는 연속되는 정맥 주입(infusion)을 포함하나 이에 한정되지 않는 비경구적인 투여를 위해 형성될 수 있다. 주사 투입을 위한 형성은 지성(oily) 또는 수용성 매개체내에서 서스펜션, 용액 또는 에멀젼 형태로 된다. 그리고 약품의 서스펜딩제, 안정화제와 분산제를 포함하나 이에 한정되지 않는 조형제를 포함할 수 있다. 화합물은 또한 재구성을 위해 분말 형태로 제공될 수 있다. 이 때, 살균한 발열 물질이 없는 물을 포함하나 이에 한정되지 않는 적합한 매개체가 제공된다.

본 발명의 화합물은 또한 임플란테이션(implantation) 또는 근육내 주사에 의해 투여되는 저장물질(depot preparation)로서 형성될 수 있다. 화합물은 적합한 중합적인(polymeric) 또는 소수성(hydrophobic) 물질(예를 들어, 허용가능한 오일내의 에멀젼), 이온 교환 레진에 의해 형성되거나 또는 (예를 들어, 잘 녹지 않는 소금과 같은)잘 녹지 않는 유도체로서 형성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 리포좀 준비체로서 형성될 수 있다. 리포좀 준비체(liposome preparation)는 관심있는 세포 또는 각질층을 관통하는 리포좀을 포함할 수 있다. 그리고 세포막과 결합하여 리포좀의 내용물을 세포내로 전달하게 된다. 예를 들어, Yarosh의 미국 특허 번호 5,077,211호와 Redziniak등의 미국 특허 번호 4,621,023호와, Redziniak등의 미국 특허 번호 4,508,703호에 기재된 바와 같은 리포좀이 사용될 수 있다. 피부 조건을 대상으로 하는 본 발명의 화합물은 포유 동물의 피부가 산화적인 손상을 일으키는 인자 또는 UV에 노출되기 이전에, 이후에 또는 노출되는 동안에 투여될 수 있다. 다른 적합한 형성은 니오좀(niosome)을 이용할 수 있다. 니오좀은 리포좀과 비슷한 지질(lipid) 매개체이며, 막들이 주로 비이온(non-ionic) 형태의 지질로 구성되며, 몇몇은 각질층에 대해 복합물을 전달하는데 유효하다.

4.치료의 방법들

a. WRN의 활성체

WRN의 활동을 증가시키거나 유도하는 본 발명의 조절체들은 홀로 이용되거나 또는 성장 억제, 세포 소멸 또는 증식 노화의 실패와 관련되는 조건들을 치료하기 위해 다른 치료법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 조건들의 대표적인 보기들은 암과 같은 엄청난 증식을 하는 질병과, 마른 버짐(psoriasis) 또는 피부아세포 하이퍼트로픽(hypertrophic) 상처내의 케라틴 생성 세포, 켈로이드 또는 어느 자기면역 질병의 경우 림프구의 어느 소그룹과 같은 정상적인 범위를 넘는 세포들의 유익한 성장을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 방법들에 의해 치료되는 암의 형태들은 여러 가지 형태로 나타나며, 신체의 기관과 여러 가지 세포 형태에서 발생하며, 예를 들어 경부암, 림프종, 골육종, 피부에서 발생하는 흑색종과 다른 암들과 백혈병이 있다. 치료가 가해지는 암 세포들의 형태들중에서는, 가슴, 폐, 간, 전립선, 췌장, 난소, 방광, 자궁, 결장, 뇌, 식도, 위와 갑상선암이 있다. 조절체들은 타닌첨가의 촉진을 억제하고, 세포 식별을 촉진하고, 면역억제를 위해 이용된다.

본 발명의 한 실시예에서는, 기수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함하는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는, 올리고뉴클레오타이드를 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여되어, 성장 억제, 세포 소멸 또는 증식 노화의 실패와 관련되는 조건들을 치료하는데 이용된다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 가수분해가 불가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함한다. 상술한 바와같이, 올리고뉴클레오타이드의 활동은 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합의 총 농도에 근거하여 성장 억제 또는 세포 소멸을 발생시키기 위해 조절된다. 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 조절체들과 또는 다른 치료법과 함께 투여될 수 있다.

양호한 실시예에서는, 올리고뉴클레오타이드가 경부, 림프종, 골육종, 흑색 종, 피부, 백혈병, 가슴, 폐, 간, 전립선, 췌장, 난소, 방광, 자궁, 결장, 뇌, 식도, 위와 갑상선으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 암을 치료하기 위해 이용된다.

T-올리고는 면역억제의 중개자로 알려진 TNF-α와 IL10의 업레규레이션(upregulation)을 통해 쥐 모델에서 UN 방사와 같이 효과적으로 알레르기 접촉 과민증을 유도하거나 빌생시키는 것을 차단할 수 있다. 그러므로, WRN의 국부적인 또는 조직적인 활동은, 예를 들어 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 홍반성 낭창과 같은 림프구가 개입되어 있는 시스템내의 질병과 마른 버짐 또는 습진과 같은 림프구가 개입되는 피부질환 및 다른 질병의 치료시에 스테로이드 치료법을 대체할 수 있다.

b. WRN의 억제제

WRN의 활동을 억제시키거나 감소시키는 본 발명의 조절체들은 홀로 이용되거나 또는 성장 억제, 세포 소멸 또는 증식 노화와 관련되는 조건들을 치료하기 위해 다른 치료법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 조건들의 대표적인 보기들은 UV 방사선에 대한 노출과, 화학치료법과 방사선 치료와 같은 정상적인 조직에 대한 암치료의 부작용, 또는 햇빛에 노출된 정상적인 피부내에서 타닌첨가 반응의 억제를 촉진하는 것을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 조절체들은 또한 세포 식별을 억제하기 위해 이용될 수 있다.

다른 실시예에서는, 가수분해가 불가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는, 올리고뉴클레오타이드를 이러한 치료가 필요한 환자에 게 투여함으로써, 성장 억제, 세포 소멸과 관련되는 조건들을 치료하는데 이용된다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합을 포함할 수 있다. 상술한 바와같이, 올리고뉴클레오타이드의 활동은 가수분해가 가능한 인터뉴클레오타이드 결합의 총 농도에 근거하여 성장 억제 방지 또는 세포 소멸을 억제시키기 위해 조절된다. 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 조절체들과 또는 다른 치료법과 함께 투여될 수 있다.

양호한 실시예에서는, 올리고뉴클레오타이드는 화학치료법과 방사선 치료와 같은, 암치료중에서 UV 방사선에 대한 노출과 부작용을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 조건을 치료하기 위해 이용된다.

c. 투여

본 발명의 화합물은 흡입, 구강 투여, 또는 그들의 결합을 통해서, 입으로, 비경구적으로, 혀의 아래에, 경피적으로, 직장으로, 점막으로, 국소부에 투여하는 단계를 포함하나 이에 한정되지 않는 방법으로 투여될 수 있다. 비경구 투입은 정맥내, 동맥내, 복막내, 피하조직, 근육내, 포막내, 관절내에 투여하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

d. 투여량

치료에 요구되는 화합물의 치료학적으로 효과적인 양은, 치료되는 조건의 특성, 활동이 요구되는 시간의 길이와 환자의 나이와 조건에 따라 달라진다. 그리고 참여하는 외과의사에 의해 결정된다. 그러나, 일반적으로 성인 남자를 대표작으로 치료하기 위해 선택되는 투여량은 하루 0.001mg/kg에서 200mg/kg의 범위내 에서 선택된다. 투여량은 하루 약 1μg/kg에서 약 100μg/kg가 된다. 희망하는 투여량은 편리하게 한 번의 투여량만큼 공급되거나 또는 예를 들어 매일 2, 3, 4 또는 그 이상의 중간 투여량과 같은 적절한 시간 간격에서 투여되는 여러 번의 투여량으로 투여된다. 여러 번의 투여량은 자주 희망되거나 또는 요구된다.

조절체의 투여량은 약 1μg/kg, 25μg/kg, 50μg/kg, 75μg/kg, 100μg/kg, 125μg/kg, 150μg/kg, 175μg/kg, 200μg/kg1, 225μg/kg, 2501μg/kg, 275μg/kg, 300μg/kg, 325μg/kg, 350μg/kg, 375μg/kg1, 400μg/kg, 425μg/kg, 450μg/kg, 475μg/kg, 500μg/kg, 525μg/kg, 550μg/kg, 575μg/kg, 600μg/kg, 625μg/kg, 650μg/kg, 675μg/kg, 700μg/kg, 725μg/kg, 750μg/kg, 775μg/kg, 800μg/kg, 825μg/kg, 850μg/kg, 875μg/kg, 900μg/kg, 925μg/kg, 950μg/kg, 975μg/kg, 또는 1mg/kg를 포함하나 이에 한정되지 않는 어느 투여량이 된다.

5.검사방법

본 발명은 또한 WRN 활동의 조절체들을 식별하는 검사방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 DNA 손상 경로의 조절체들을 식별하는 검사방법에 관한 것이다. 검사 방법들은 시험관내의, 세포에 근거하는, 유전적인 그리고 생체내의 분석물을 포함하나 이에 한정되지 않는 여러 가지 형태에서 실행된다.

WRN의 조절체들은 WRN에 분명하게 결합되어 있는 물질을 검사함으로써 식별된다. 특정한 결합 물질들은 면역침강반응(immunoprecipitation)과 친화성 크로마토그라피(affinity chromatography)를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 표준 기술을 이용하는 해당 기술자에 의해 생체내에서 식별된다. 특정한 결합 물질들 은 효소 2개의 하이브리드(yeast 2-hybrid)와 위상 표시를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 표준 기술을 이용하는 해당 기술자에 의해 유전 검사를 이용하여 식별된다. 특정한 결합 물질들은 또한 칩과 같은 고체 기질(예를 들어, 유리, 플라스틱 또는 실리콘)에 WRN의 부착을 포함하나 이에 한정되지 않는 높은 스루풋(throughput) 검사방법을 이용하여 식별된다.

WRN의 조절체들은 또한 WRN의 활동을 조절하는 물질들에 대한 생체내 검사법에 의해 식별된다. 조절체는 WRN을 의심되는 조절체와 접촉시키는 단계와, WRN의 활동을 의심되는 조절체가 변화시키는지를 판단하는 단계에 의해 식별된다. WRN의 활동은 WRN의 핵산 기질의 가수분해를 측정함으로써 결정된다. 핵산 기질의 가수분해는 UV 흡수 측정, 더욱 바람직한 것은 라벨이 붙은 올리고의 젤 분석과 침강되지 않는 뉴클레오타이드 베이스의 회복을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법에 의해 측정된다.

WRN의 조절체는 세포 분석물내의 WRN의 활동을 조절하는 물질을 검사하여 식별된다. DNA 손상 경로의 조절체도 이와같이 식별된다. 조절체는, 의심되는 조절체와 세포를 접촉시키는 단계와, 의심되는 조절체가 세포 소멸, 노화 또는 p53,p95, ATM, H2AX의 인산화반응, S-형 억제의 유도, 또는 세포소멸의 유도를 변화시키는지를 판단하는 단계에 의해 식별된다. 후보 조절체는 상술한 바와같이 WRN에 분명하게 결합하는 물질이다. 세포 소멸의 조절체는 FACS 분석에서 서브-G0-G1 피크의 크기, TUNEL 분석물, DNA 래더(ladder) 분석물, 어넥신(annexin) 분석물 또는 ELISA 분석물을 측정하는 단계를 포함하나 이에 한정되지 않는 방법에 의해 측정된다. 노화 조절체는 세포 일드(yield)를 증가시키거나 또는 pRb를 인신화시키거나 또는 미토제닉 촉진(mitogenic stimulation) 후에 ³H-티미딘을 포함시키는, 노화와 연결된 β-갈락토시다제 활동 또는 실패를 측정함으로써 결정된다. p53의 조절체는 p53 프로모터(promoter)에 의해 활성화되는 CAT, 또는 루시페라제 구조 판독에 의한 젤 이동 분석물(gel shift assay), 또는 p21과 같은 p53에 의해 조절되는 유전자 제품의 유도에 의해, 세린(serine) 15 또는 세린 37에서 p53의 인산화 반응을 측정함으로써 결정된다. p95의 조절체는 웨스턴 분석법(western blot analysis)에서 p95 밴드내의 이동과, S-형 억제를 검출하는 FACS 분석에 의해, 세린 343에서 p95의 인산화 반응을 측정함으로써 결정된다. WRN의 조절체는 생체내의 발암성을 조절하는 물질을 검사하여 식별된다.

어느 세포들도 세포 분석물과 같이 사용될 수 있다. 바람직한 것은, 본 발명에서 사용되는 세포들은 포유 동물 세포이며, 더욱 바람직한 것은 인간과 인간이 아닌 영장류 동물 세포를 포함한다. 적합한 세포들의 대표적인 보기들은 주요한(정상적인) 인간의 피부 섬유아세포, 표피의 케라틴 생성세포, 멜라닌 형성 세포와 반응하는 죽지 않는 또는 변형된 세포 라인들과, 주요한 죽지 않고 또는 변형된 쥣과의 세포 라인(murine cell lines)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 단백질 인산화반응의 양은 비색정량분석(colorimetry), 루미노메트리(luminometry)와 플루오리메트리(fluorimetry)와 웨스턴 블로팅법(blotting)을 포함하나 이에 한정되지 않는 표준 기술을 이용하여 측정된다.

의심되는 조절체가 혼합에 의해 세포에 부가되는 조건은, 세포 소멸 또는 시그널링(signaling)에 간섭하는 다른 조절 복합물이 실제로 존재하지 않는다면, 세포가 세포 소멸 또는 시그널링 단계를 거칠 수 있는 조건들을 의미한다. 효과적인 조건들은 적합한 매개체, 온도, pH와 세포 성장을 허용하는 조건들을 포함하고 있으나 이에 한정되어 있지는 않다. 적합한 매개체(medium)는, 적절한 소금, 미네랄과 금속 그리고 비타민과 같은 다른 영양소외에도, 성장 인자, 융합할 수 있는 탄소, 질소와 인산염 소스들를 포함하는 고체 또는 액체 매개체를 의미하며, 세포가 세포 소멸 또는 시그널링을 나타낼 수 있도록 세포가 배양될 수 있는 효과적인 매개체를 포함한다. 예를 들면, 포유 동물의 세포에 대해서는, 그 매개체들이 10% 송아지 태아 혈청을 포함하는 Dulbecco의 수정된 독수리 매개체를 포함한다.

세포들은 조직 배양 플라스크, 시험관, 마이크로티터(microtiter) 접시와 페트리 접시를 포함하나 이에 한정되지 않는 여러 가지 용기내에서 배양된다. 배양은 세포에 적합한 어느 온도, pH와 이산화탄소 성분에서 실행된다. 이러한 배양 조건은 종래의 기술 범위내에 속한다.

의심되는 조절체를 세포에 부가하는 방법들은 전기천공법(electroporation), 현미주사(microinjection), (예를 들면, 노출된 핵산 분자, 재결합 바이러스, 레트로바이러스 표현 벡터와 아데노바이러스 표현을 포함하는 표현 시스템을 이용하는)세포 표현, 인자를 매개체에 부가하는 단계, 이온 쌍 인자와 세포 투과성을 위한 청정제의 사용을 포함한다.

후보 조절체들은, 탄수화물, 단당류, 올리고당류, 다당류, 아미노산, 펩타이 드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드와 같은, DNA와 DNA 프래그먼트, RNA와 RNA 프래그먼트등, 지질(lipid), 레티노이드, 스테로이드, 글리코펩타이드, 당단백질(glycoprotein), 프로테오글리칸등을 포함하는 자연적으로 발생하는 분자들이거나; 또는 펩티도미메틱스(petidomimetics)등과 같은 자연적으로 발생하는 분자들의 아나로그 또는 유도체와; "작은 분자 유기 화합물"과 같은 자연적으로 발생하지 않는 분자들이 될 수 있다. "작은 분자 유기 화합물"이라는 것은 약 1,000보다 적은, 더욱 바람직한 것은 약 500보다 적은 분자량을 일반적으로 가지는 유기 화합물을 언급한다.

후보 조절체들은 조합의 화학기술, 발효 방법, 식물과 세포 추출 절차등을 포함하나 이에 한정되지 않는 어느 수단에 의해 준비 또는 얻어지는 라이브러리(library)(예를 들면 화합물의 집합체)내에 존재하게 된다. 조합 라이브러리(combinatorial library)를 만드는 방법들은 기존의 기술에서 공지되어 있다. 예를 들면, E. R. Felder, Chimia 1994, 48, 512-541; Gallop et al., J. Med. Chem. 1994, 37, 1233-1251; R. A. Houghten, Trends Genet. 1993, 9, 235-239; Houghten et al., nature 1991, 354, 84-86; Lam et al., Nature 1991, 354, 82-84; Carell et al., chem, Biol. 1995, 3, 171-183; Madden et al., Perspectives in Drug Discovery and Design 2, 269-282; Cwirla et al., Biochemistry 1990, 87, 6378-6382; Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5381-5383; Gordon et al., J. Med. Chem. 1994, 37, 1385-1401; Lebl et al., Biopolymers 1995, 37 177-198; 그리고 그 안에 기재된 참조물들을 참조하시오.

본 발명은 다음의 제한되지 않는 실시예들에 의해 설명되는 여러 가지 특징들을 가지고 있다.

실시예들

실시예 1

올리고뉴클레오타이드는 세포 소멸을 유도할 수 있다.

텔로미어 오버행 반복 배열(TTAGGG;SEQ ID NO:1)과, 배열(11mer-1;pGTTAGGGTTAG;SEQ ID NO:2)과 동일하며, 이 배열 (11mer-2;pCTAACCCTAAC;SEQ ID NO:3)과 상보적이며, 텔로미어 배열 (11mer-3;pGATCGATCGAT;SEQ ID NO:4)과 무관한 올리고뉴클레오타이드가 유르카트 세포(Jurkat cells)의 배양에 첨가되었다. 이 세포들은 텔로미어 파괴에 반응하여 세포 소멸을 거친다고 보고된 인간의 T 세포들의 라인이다. 제어 세포들에 대해서는 25-30%가 되는 것과 비교할 때에(p<0.0003, 쌍을 이루지 않는 t-시험; 도 1a-1d 참조.), 48시간내에 SEQ ID NO:2의 40μM으로 처리된 세포들의 50%가 S-형내에서 축적되었다. 그리고 제어 세포들에 대해서는 2-3%가 되는 것과 비교할 때에(p<0.007, 쌍을 이루지 않는 t-시험; 도 1e-1h 참조.), 72시간까지는, 이러한 세포들의 13%는 서브-G0/G1 DNA 성분에 의해 결정되는 바와 같이 소멸되었다. 제어 세포들에 대해서는 3-5%가 되는 것과 비교할 때에(p<0.0001, 쌍을 이루지 않는 t-시험), 96시간에서, 11mer-1로 처리된 세포들의 20±3%가 소멸되었다. 11mer-1의 우선적인 흡수를 독특한 효과의 설명으로서 제외하기 위해, 유르카트 세포들은 플루오레세인 포스포라미다이트에 의해 3' 단부상에 라벨링된 올리고뉴클레오타이드에 의해 처리되었으며, 그 후에 초점을 공유하는(confocal) 마이크로스코피(microscopy)와 FACS 분석법을 거치게 되었다. 새포들의 형광의 세기는 4시간과 24시간에서 모든 처리 후에 동일하였다. 웨스턴 분석법은 11mer-1의 첨가 후에 24시간까지 p53의 증가를 보여주고 있다. 그러나 11mer-2 또는 11mer-3에서는 해당되지 않으며, 이 때에, 세포 소멸의 유발시에 p53과 협조하고, S-형 검사점을 조절하고, p53에 의존하는 방식으로 인간의 섬유아세포내에서의 노화된 페노타이프(phenitype)를 발생시킨다고 알려진, E2F1 전사 인자(transcription factor)의 레벨 증가가 동시에 발생하게 된다.

실시예 2

텔로미어 오버행 호모로그 11mer-1의 인황화합물 형태는 세포소멸을 유도하지 않는다. 유르카트 인간 T 세포들의 배양은 11mer-1(SEQ ID NO:1) 또는 인황화합물 11mer-1(11mer-1-S)의 두 희석액으로 96시간 처리한 다음에, FACS 분석법을 위해 수집되고 처리되었다. 올리고뉴클레오타이드의 두 농도들을 검사한다. 즉 0.4μM(도 2a-2c)과 40μM(도 2d-2f)였다. 0.4μM에서는, 올리고뉴클레오타이드의 어느 것도 유르카트 세포들의 기하급수적으로 성장하리라고 예측된 세포 주기 프로필에 영향을 미치지 않았다. 40μM에서는, 11mer-1이 서브-G0/G1 피크에 의해 표시된 바와 같이 확장된 세포 소멸을 유도하였으며, 이 때에 11mer-1-S는 아무 영향도 미치지 않았다.

실시예 3

11mer-1의 인황화합물 형태는 인산염 백보운(backbone) 11mer-1에 의해 S-형 억제의 유도를 막는다.

케라틴 생성 세포 라인의 배양(SSC12F, 100,000세포/38cm²)은 11mer-1-S의 농도가 증가하는 상태에 있을 때 11mer-1과 함께 또는 단지 11mer-1(SEQ ID NO:2)에 의해서 48시간 동안 처리되었다. 이미 실시예 1에서 기재한 바와같이, 11mer-1은 FACS에 의해 증명된 바와 같이 S-형 억제를 유도하였다(Becton-Dickinson FacScan). 제어 세포, 즉 희석액으로 처리된 세포의 26%에 비하면, 세포의 43%가 S-형내에 있었다. 그러나, 인황화합물 11mer-1의 증가하는 농도가 이러한 배양에 첨가되었을 때에, 소수의 세포들이 거의 억제되지 않았다. (도 3a-3g). 이러한 억제의 완전한 처리는 2:1의 11mer-1 : 11mer-1-S의 비율에 의해 관찰되었다. 11mer-1-S 스스로 S-형 억제를 유도하지 않았다.

실시예 4

텔로미어 올리고뉴클레오타이드의 인황화합물 형태는 구성과 관련되며 UV에 의해 발생된 색소 형성을 감소시키며, 멜라닌 형성을 자극하지 않는다.

멜라닌 성분 조사를 위해 S91 생쥐의 흑색종 세포의 배양(100,000세포/38cm2)은 100μM pTpT 또는 인황화합물 pTpT(pTspT)(도 4) 또는 40μM 11mer-1 또는 인황화합물 11mer-1(11mer-1-S)(도 5)로 6일 동안 처리되고 수집, 및 계산되고, 분석되었다. pTpT와 11mer-1(도 4와 도 5를 각각 참조)가 이러한 세포내에서 멜라닌 형성을 촉진하는 동안에, pTspT와 11mer-1-S는 이러한 세포내에서 멜라닌 형성을 촉진하지 않았다(도 4와 도 5를 각각 참조). 게다가, pTspT(도 4)와 11mer-1-S(도 5)는 이러한 세포내에서 구성과 관련되는 색소 형성을 유도하였으며, 이것은 텔로미어 복구/복제가 이루어지는 동안에 이러한 배열의 상습적인 노출은 멜라닌 형성을 위해 일정하고 낮은 레벨의 신호를 공급하며, 이러한 신호는 pTspT와 11mer-1-S에 의해 차단된다는 것을 의미한다.

실시예 5

인황화합물 pTspT는 UV에 의해 발생되는 멜라닌 형성을 억제한다.

S91 세포들의 복제 배양(100,000세포/39cm²)은,검사 방사선 측정계(모델 IL1700A, International Light, Newburyport, MA)를 이용하여 285.5nm에서 측정된 1kW 제논 아크 태양 시뮤레이터(XMN 1000-21, Optical Radiation, Azuza, CA)로부터 방출된 5mJ/cm2의 태양 빛으로 조사되거나 또는 가짜로 조사되었다. 두 개의 가짜로 조사된 판들은 100μM pTspT에 의해 보충되었으며, 두 개의 조사된 배양세포들은 pTspT에 의해 비슷하게 처리되었다. 일주일 후에, 세포들이 수집된 후에 카운트하고, 1N NaOH내에 세포 펠릿(pellet)을 용해시키고 475nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 멜라닌 성분에 대한 분석이 실행되었다. UV 방사는 이러한 세포내의 멜라닌 성분의 2배 증가를 가져오게 하였다. 그러나, 이러한 반응은 pTspT의 첨가에 의해 차단되었다(도 6). 게다가, 이러한 세포의 구성과 관련되는 색소 형성은 도 4와 도 5에 제시된 데이터와 같이, 가짜로 조사된 배양내에서는 pTspT에 의해 감소되었다.

실시예 6

T-올리고의 가수분해는 활동을 위해 필요하다.

SEQ ID NO:2에 근거하는 올리고뉴클레오타이드가 합성되었다. 올리고뉴클레오타이드 1은 인황화합물 백보운에 의해 전적으로 합성되었다. 올리고뉴클레오타이드 2는 각 단부에 두 개의 인황화합물을 가지며, 중간의 다른 링키지들은 포스포디에스테르(phosphodiester) 링키지가 된다. 올리고뉴클레오타이드 3은 5' 단부(5' 단부는 차단됨)상에서 두 개의 인황화합물 링키지를 가지며, 나머지 링키지들은 포스포디에스테르 링키지가 된다. 올리고뉴클레오타이드 4는 두 개의 인황화합물 링키지를 3'단부(3' 단부는 차단됨)상에서 가지며, 나머지 링키지들은 포스포디에스테르 링키지가 된다. 도 7을 참조하자.

이러한 올리고뉴클레오타이드는 정상적인 신생아의 섬유아세포의 배양에 첨가되었다. 48시간 이후에, 세포들이 수집되어 웨스턴 블롯법(western blot)에 의해 p53 세린 15 인산화반응과 p95/Nbsl 인산화반응에 대해 분석되었다. 다른 배양들은 일주일 동안 올리고뉴클레오타이드의 존재하에서 보존되었으며, 노화와 관련되는 β-갈락토시다제 활동(SA-β-Gal)을 위해 세포들이 착색되었다. β-갈락토시다제 포지티브 세포들은 전체 세포의 비율로 계산되어 제시되었다(도 8).

누클레아제-접근가능한 3' 터미너스를 가지는 올리고뉴클레오타이드는 p53과 p95/Nbsl 인산화반응과 같은 "신속한" 반응을 촉진하는데 가장 유효하다. 그러나, 누클레아제-접근가능한 5' 터미너스를 가지는 올리고뉴클레오타이드는 일주일 후에 노화 페노타이프를 발생시킬 수 있으나, 48시간에서 인산화반응을 유도할 수 없게 된다. 이것은 3'-5' 누클레아제 민감반응성(susceptibility)이 노화를 유발 시키는 활동에 바람직하다는 것을 의미한다.

실시예 7

WRN 단백질 레벨을 하향 조절하는 것은 T-올리고의 반응을 감소시킨다.

정상적인 신생아의 섬유아세포들은 제어 녹색 형광 단백질(GFP)에 대해 WRN siRNA의 50ρmol 또는 siRNA의 50ρmol로 연속 2일 동안 처리되었다. 제 2의 siRNA 처리후의 하루가 지나면, 대표적인 배양들이 단백질을 제거할 때에 WRN siRNA의 효과를 분석하기 위한 웨스턴 블롯분석법을 위해 수집된다. 또한 이 때에, WRN siRNA로 처리된 복제 배양 또는 GFP siRNA로 처리된 배양들에 대해 40μM T-올리고(11mer-1;SED ID NO:2) 또는 동일한 희석액이 투여되었다. 모든 조건하에 있는 세포들이 T-올리고 또는 희석액의 첨가 후 하루 또는 이틀이 지난후에 수집되었으며, 모두 잘 정리된 DNA 손상 반응이 되는, 세린 15에 대한 p53 인산화 반응과 히스톤(histone) H2AX의 인산화 반응을 위해 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다(Lambert et al., 1998, J Biol Chem 273, 33048-53; Burma et al., 2001, J Biol Chem 276, 42462-7). 또한 제어로서, 가짜로 조사된 세포들 또는 10Gy 이온화 방사(ionizing radiation : IR)에 의해 조사된 세포들로부터 얻어지는 세포 분리물(lysates)이 포함되었다. 블롯은 WRN, p53 포스포세린 15와 포스포-H2AX에 대해서 특정한 항체를 가지고 검사되었다. 도 9에 제시된 데이터는 WRN의 "녹다운(knock-down)"이 0일(T-올리고 치료의 날)째에 WRN의 레벨과, p53과 H2AX의 인산화 반응을 유도하는 T-올리고의 활동을 현저하게 감소시킨다는 것을 나타내고 있다.

실시예 8

DNA-PK는 T-올리고의 효과를 전달한다.

정상적인 신생아의 섬유아세포들은 4, 6, 8, 16, 24 또는 48시간동안 40μm T-올리고 또는 동일한 양의 희석액으로 처리된 후 수집되어, ATM 포스포세린 1981에 대한 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 도 10은 섬유아세포내에서의 T-올리고의 처리는, ATM(370kDa)에 대한 마커의 상부로 이동된 450kDa의 확실한 분자량을 가지는 단백질의 인산화반응을 유도한다는 것을 보여주고 있다. 인산화된 단백질은, 매우 유사성이 높은 ATM 단백질에 대해 발생되는 항체를 결합시킨다고 합리적으로 추측되며, ATM과 관련된 DNA 의존성 단백질 키나아제(DNA-PKcs)의 촉매 서브유닛과 함께 이동하는 이후의 실험에서 나타났다.

DNA-PKcs는 T-올리고 처리 후에 발생된다고 제시된 바와같이, 활동될 때에 자동 인산화된다(Ding et al., 2003, Mol Cell Biol 23, 5836-48)(도 10) 그리고 헤테로다이머 Ku 단백질(DNA-PK 복합물의 일부)을 통해 WRN과 결합하며, DNA-PK에 의해 인산화되는 위치가 되는, 세린 37에 대한 p53 인산화반응을 위해 섬유아세포가 분석되다(Lees et al., 1992, Mol Cell Biol 12, 5041-9). 새로 탄생된 섬유아세포는 상술한 바와같이 치료되었으며, 이와같이 세린 37에 대해 인산화된 p53에 대한 항체를 이용하여 분석되었다. 웨스턴 분석은 p53 세린 37이 T-올리고 치료에 반응하여 인산화된다는 것을 보여주었다(도 11).

본 발명은 WRN의 억제제를 포함하는 화합물의 사용에 관한 것으로서, 억제제 는 세포 소멸을 억제하고, 세포 노화를 억제하고, 타닌첨가를 촉진하며, 세포 식별을 억제하거나 암 치료 부작용을 감소시키기 위해 이용된다. 억제제는 화학치료법 또는 이온화 방사선 치료법과 함께 제공된다.

Claims

WRN의 조절체를 검사하는 방법에 있어서,

(a) WRN을 표현하는 세포를 제공하는 단계와,

(b) 상기 조절체가 상기 세포에 의해 포착되어지는 조건하에서 후보 조절체들을 상기 세포와 접촉시키는 단계와,

(c) DNA 손상 반응 경로의 활성화와 관련되는 상기 세포의 특징을 측정하는 단계를 구비하며,

제어에 비유되는 상기 특징의 변화는 WRN의 조절체를 나타내는 검사방법.
제 1항에 있어서,

상기 후보 조절체들은 WRN에 확실하게 결합되어 있는 검사방법.
제 1항에 있어서,

상기 세포의 특징은 세포 증식; 세포 생존 가능성; 세포 형태학과; p53의 인산화 반응, p95의 인산화 반응, ATM의 인산화 반응, H2AX의 인산화 반응, S상 억제(S phase arrest) 유도와 세포소멸의 유도와 같은 SA-β-Gal 활동으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 검사방법.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서,

상기 세포는 암 세포가 되는 검사방법.
제 4항에 있어서,

상기 후보 조절체들은 탄수화물, 단당류, 올리고당류, 다당류, 아미노산, 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 레티노이드, 스테로이드, 글리코펩타이드, 당단백질(glycoprotein), 프로테오글리칸과 작은 유기 분자들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 검사방법.
WRN에 확실하게 결합하는 인자를 검사하는 방법에 있어서,

(a) WRN을 후보 인자와 접촉시키는 단계와,

(b) 후보 인자가 WRN에 확실하게 결합하고 있는지를 판단하는 단계를 구비하는 검사방법.
제 6항에 있어서,

WRN은 고체 지지체에 부착되어 있는 검사방법.
제 6항에 있어서,

상기 후보 인자는 고체 지지체에 부착되어 있는 검사방법.
WRN의 조절체를 검사하는 방법에 있어서,

(a) WRN에 대한 핵산 기질의 존재하에서 시험관내의 후보 조절체와 WRN을 접촉시키는 단계와,

(b) 상기 기질의 가수분해를 측정하고, 그에 의해 제어에 비유되는 상기 기질의 가수 분해를 변경시킴으로써 조절체가 식별되는 단계를 구비하는 검사방법.
제 9항에 있어서,

상기 핵산 기질은 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 올리고뉴클레오타이드가 되며, n은 1에서 20까지의 수가 되는 검사방법.
암을 치료하는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 활성체로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 치료방법.
세포소멸을 유도하는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 활성체로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 세포소멸 유도방법.
세포 노화를 유도하는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 활성체로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 세포 노화 유도방법.
타닌첨가를 촉진시키는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 활성체로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 타닌첨가 촉진방법.
세포 식별을 향상시키는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 활성체로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 세포 식별 방법.
면역억제를 촉진시키는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 활성체로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 면역억제 촉진방법.
제 11항 내지 16항중 어느 한 항에 있어서,

상기 활성체는, (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 WRN의 활성체 올리고뉴클레오타이드가 되며, 최소한 처음 x3' 뉴클레오타이드 링키지(linkage)는 3'-5'누클레아제에 의해 가수분해되며, 여기서 n은 1에서 20까지의 수가 되며, x는 1에서 약 10까지가 되는 방법.
세포소멸을 억제하는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 억제제로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 세포소멸 억제방법.
세포 노화를 억제하는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 억제제로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 세포 노화 억제방법.
성장을 촉진하는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 억제제로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 촉진 방법.
타닌첨가를 억제하는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 억제제로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 타닌첨가 억제방법.
세포 식별을 억제하는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 활성체로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 세포 식별 억제 방법.
암치료 부작용을 감소시키는 방법에 있어서,

치료시에 WRN의 억제제로 구성되는 화합물을 실험 대상자에게 투여하는 단계를 구비하는 부작용 감소 방법.
제 23항에 있어서,

상기 화합물은 화학치료법 또는 이온화 방사와 함께 투여되는 부작용 감소방법.
제 18항 내지 24항중 어느 한 항에 있어서,

상기 억제제는 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지는 WRN의 억제제 올리고뉴클레오타이드가 되며, 최소한 처음 x3' 뉴클레오타이드 링키지(linkage)는 3'-5'누클레아제에 의해 가수분해되며, 여기서 n은 1에서 20까지의 수가 되며, x는 1에서 약 10까지가 되는 방법.
올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물에 있어서,

상기 올리고뉴클레오타이드는 (TTAGGG)n에 의해 표현되는 적어도 33%의 뉴클레오타이드 배열 식별식을 가지며, 적어도 한 개의 가수분해가 불가능한 인터뉴클레오타이드 링키지를 가지며, 최소한 처음 x3' 뉴클레오타이드 링키지(linkage)는 3'-5'누클레아제에 의해 가수분해되며, 여기서 n은 1에서 20까지의 수가 되며, x는 1에서 약 10까지가 되는 화합물.
제 26에 있어서,

상기 3'-5'누클레아제는 WRN이 되는 화합물.