CN109486828A

CN109486828A - 一种编码重组人白细胞介素12的基因及其应用

Info

Publication number: CN109486828A
Application number: CN201811607464.3A
Authority: CN
Inventors: 熊盛; 卢加; 谢秋玲; 李军; 夏倩坤; 陈纯; 洪岸
Original assignee: Guangdong Jida Genetic Pharmaceutical Engineering Research Center Co Ltd
Current assignee: Guangdong Jida Genetic Pharmaceutical Engineering Research Center Co Ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109486828B

Abstract

本发明公开了一种编码重组人白细胞介素12的基因及其应用。该基因包含编码P35亚基的核苷酸序列和编码P40亚基的核苷酸序列；其中，编码P35亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码P40亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因转入CHO细胞表达系统中，在CHO细胞表达得到的重组人白细胞介素‑12的表达量高。经过密码子优化后的质粒组合在相同瞬时表达条件下的表达量约为未经密码子优化的5倍左右。含有该基因的重组CHO细胞在流加发酵后，IL‑12的表达水平达到300mg±40mg/L，生产成本大大降低。

Description

一种编码重组人白细胞介素12的基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种编码重组人白细胞介素12的基因及其应用。

背景技术

白细胞介素12(IL-12)由两家美国实验室发现于1992年，发现伊始即显示IL-12有强烈的抗病毒和抗肿瘤效应，被誉为免疫系统行使抗病毒、抗肿瘤的核心调控因子，也被誉为机体天然免疫系统的关键蛋白质。

白细胞介素12(IL-12)最初称作自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(CLMF)，主要是由激活的单核细胞和其他类型的细胞(树突状细胞、B细胞、中性粒细胞以及角质细胞)产生，是一种异二聚体细胞因子。IL-12所具备的增加自然杀伤(NK)细胞和激活T细胞的细胞毒活性、诱生γ干扰素(IFN-γ)、调节Th1细胞的发育等免疫学活性是IL-12抗肿瘤、抗病毒效应的理论基础，可预防肿瘤遗传高危个体及癌前病变，且对多种肿瘤(结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌等)的生长和转移具有明显的抑制作用。利用IL-12家族细胞因子提高宿主免疫能力，破坏肿瘤细胞的免疫逃逸功能是肿瘤生物治疗的重要策略。动物实验亦充分证实其药用价值。以此为基础，重组人IL-12(rhIL-12)作为一种药物已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病、哮喘、自身免疫性疾病、白血病等领域的临床试验阶段。其中，部分rhIL-12的临床试验提示rhIL-12是一种极有前景的抗肿瘤细胞因子，比已经上市的rhIL-2和rhIFN-γ的功能强。在rhIL-12抗肿瘤临床试验的同时，亦观察了rhIL-12的抗病毒效应，结果提示rhIL-12也具备对肝炎病毒的清除作用以及针对HIV感染细胞的清除作用，从而为rhIL-12的临床应用展示了更广阔的前景。在传染病方面主要涉及抗爱滋病、抗丙肝、抗结核及非结核类胞内菌感染，它的应用既包括单独使用，也包括与其它细胞因子、化疗药物、疫苗和基因治疗载体的配伍应用，是目前应用范围最广的细胞因子，市场前景巨大。IL-12在国外已经进入Ⅱ/Ⅲ期临床试验阶段，目前的临床实验方案已近30余项，涉及多种传染性疾病、多种肿瘤、甚至多种自身免疫系统疾病、哮喘、肿瘤放化疗血象恢复、再生障碍性贫血。近十几年来，在临床试验方面，国外进行Ⅰ期、Ⅱ期临床试验有30多项报告，少部分正在进行Ⅲ期临床试验。并已总结出经验，只要在剂量方面控制好，rhIL-12的临床试用是安全有效的。rhIL-12被列为治疗癌症的高潜力免疫治疗药物中的第三名。

此外，近年来发现IL-12对紫外线(中波及长波)引起的表皮角质层细胞的DNA损伤有促进其修复作用。IL-12对皮肤的作用主要有以下几个方面：1)IL-12可以逆转紫外线和衰老引起的皮肤损害，IL-12通过激活DNA的修复机制减少紫外线对表皮细胞DNA的损伤；2)紫外线辐射和衰老都可以导致皮肤的免疫抑制作用。紫外线可以引起皮肤的朗罕氏细胞(LC)的功能损害，而LC是皮肤的主要抗原提呈细胞(APC)，对维持皮肤正常免疫力有重要作用。大量的研究表明，在紫外线已经造成免疫耐受的情况下，IL-12能够打破免疫耐受，抑制调节性T细胞的活性，研究表明IL-12通过一种新的机制恢复皮肤的免疫功能，从而使皮肤保持一种健康的状态。3)IL-12透皮吸收到真皮和皮下组织，通过LC介导可以活化真皮的T淋巴细胞，促使其产生V-干扰素，而V-干扰素可以抑制纤维母细胞增殖，抑制胶原合成所需要的脯氨酸羟化酶，阻止胶原产生。此外γ-干扰素还能刺激胶原酶的分泌，促进胶原水解，还应指出，γ-干扰素可以降低纤维母细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA水平，抑制纤维母细胞分泌碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)，进而抑制胶原合成，阻止瘢痕增生。动物试验也表明γ-干扰素抑制纤维母细胞增殖，促进其凋亡，从而可以起到消除瘢痕的效果。综上所述，IL-12对皮肤具有三重作用，即通过激活DNA修复机制预防或减轻紫外线或衰老导致的表皮、DNA损伤，减轻紫外线或衰老引起的皮肤免疫抑制，阻止胶原纤维的增生，促进胶原纤维的水解，从而具有清除皱纹，瘢痕的功能。如此可见，由于IL-12维护了正常表皮不受损害，避免或减少表皮基底层色素细胞中酪氨酸氧化酶被激活，从而减少酪氨酸激活后生成的黑色素转移到皮肤全层。以致起到皮肤的美白作用，由于保持表皮的正常状态，皮肤的水分蒸发减少，达到皮肤保湿的作用。IL-12还避免或减少角化细胞的凋亡，以致“晒斑细胞”和“皱纹细胞”减少，减少弹性硬蛋白酶的分泌，使得弹性硬蛋白维持正常状态，增加了皮肤弹性，减少了皱纹的出现。可见IL-12具有美白、保湿、防皱、除瘢的作用。

国内外已经利用细菌、酵母、腺病毒、逆转录病毒、EB病毒、腺伴病毒以及杆状病毒等载体表达IL-12。由于IL-12是一种糖蛋白，哺乳动物细胞表达系统是最理想的选择。在真核细胞表达体系中，陈慰峰(生物化学与生物物理进展.1998；25：254-258)、刘锰等采用共转染的方式在CHO细胞中表达，羊东晔(湖南医科大学学报2003；28：338-342)利用双启动子控制表达IL-12的双亚基，而陈诗书(中国生物化学与分子生物学报，1999；15：48-53)则采用IRES连接小鼠IL-12双亚基，在COS细胞中表达。以上各种表达，由于转染效率、整合效率等的不均一性，导致表达效率不一、双亚基表达水平差异、双亚基相互不匹配等。目前已知正常细胞中IL-12的表达水平主要是由p35决定的，而一般情况下p35表达水平偏低，导致IL-12的表达水平难以大幅度提高，其生产和应用受到很大的限制。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种编码重组人白细胞介素12的基因。

本发明的另一目的在于提供上述编码重组人白细胞介素12的基因的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种编码重组人白细胞介素12的基因，包含编码P35亚基的核苷酸序列和编码P40亚基的核苷酸序列；其中，编码P35亚基的核苷酸序列如下所示(亦如SEQ ID NO.1所示)：

CGCAACCTGCCAGTGGCCACACCAGACCCCGGCATGTTCCCCTGCCTGCACCATTCTCAGAACCTGCTGCGGGCCGTGTCCAATATGCTGCAGAAGGCCAGACAGACCCTGGAGTTTTACCCCTGTACAAGCGAGGAGATCGACCACGAGGATATCACCAAGGATAAGACCTCTACAGTGGAGGCTTGCCTGCCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCCTGTCTGAATAGCCGCGAGACCTCTTTCATCACAAATGGCTCCTGCCTGGCCTCCAGGAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTGTCCAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTATCAGGTGGAGTTCAAGACAATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCAAAGCGGCAGATCTTTCTGGATCAGAATATGCTGGCTGTGATCGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTCAATTCTGAGACCGTGCCCCAGAAGTCTTCCCTGGAGGAGCCTGATTTCTACAAGACAAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCATGCTTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATCGACAGAGTGATGTCCTATCTGAACGCCAGCTGAGTCGACAAGCTT；

编码P40亚基的核苷酸序列如下所示(亦如SEQ ID NO.2所示)：

GCCGCCACCATGTGCCACCAGCAGCTGGTCATCTCCTGGTTCAGCCTGGTGTTTCTGGCCAGCCCTCTGGTGGCTATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCAGATGCTCCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCAGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGTCCAGCGAGGTGCTGGGCTCTGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCTGGCCAGTACACATGTCATAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACTCCCTGCTGCTGCTGCATAAGAAGGAGGATGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGAGATGCGAGGCCAAGAATTATAGCGGCCGCTTTACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCAGCACCGACCTGACATTTTCTGTGAAGTCTTCCAGAGGCAGCTCTGATCCTCAGGGAGTGACATGCGGAGCTGCTACCCTGTCTGCTGAGAGGGTGCGGGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATTCTGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCTGCTGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCTGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACATCCAGCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAACTCCAGGCAGGTGGAGGTGAGCTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACATTCTTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGAGCAAGAGGGAGAAGAAGGACCGGGTGTTCACCGATAAGACATCTGCCACCGTGATCTGTCGCAAGAACGCCAGCATCTCCGTGAGGGCCCAGGACCGCTACTATTCTTCCAGCTGGAGCGAGTGGGCTTCTGTGCCATGTTCCTGA

所述的编码重组人白细胞介素12的基因在重组人白细胞介素12制备中的应用，优选包括如下步骤：是将上述编码P35亚基的核苷酸序列和上述编码P40亚基的核苷酸序列分别克隆到CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)表达载体上，再共同转染CHO细胞，分选得到稳定表达的细胞株，发酵表达。

所述的CHO细胞表达系统优选为真核表达载体pcDNATM3.4-(6011bp,Thermo A14697)和真核表达载体-Mu-H(8355bp,Millpore，Cat.No.5.04866.0001)；更优选为将上述编码P40亚基的核苷酸序列克隆至真核表达载体pcDNATM3.4-(6011bp)，将上述编码P35亚基的核苷酸序列克隆至真核表达载体-Mu-H(8355bp)；UCOE元件能阻止基因转录沉默，使转录的目的基因不受“位置效应”的影响，从而使目的蛋白在细胞中高表达。

由于目前已知正常细胞中IL-12的表达水平主要是由p35决定的，而一般情况下p35表达水平偏低，导致IL-12的表达水平难以大幅度提高，其生产和应用受到很大的限制。因此，将p35亚基克隆至拥有UCOE元件的表达载体上，有利于增强p35亚基的表达，平衡p35亚基与p40亚基的表达水平，从而提高重组人白细胞介素12的表达水平。

一种表达重组人白细胞介素-12的CHO细胞，为含有上述编码P35亚基的核苷酸序列和上述编码P40亚基的核苷酸序列的细胞；

所述的人白细胞介素-12的CHO细胞，优选通过如下步骤得到：

(1)分别在上述编码P35的核苷酸序列和上述编码P40的核苷酸序列的5’端设计上信号肽、起始密码子和Kozak序列及酶切位点NheI，再分别在3’端设计上终止密码子，酶切位点SalI及HindIII，具体如下所示：

设计有信号肽(粗体带横线部分)、Kozak序列(斜体+下划线部分)、限制性内切酶位点(NheI、SalI及HindIII)、起始密码子和终止密码子的编码P35亚基的核苷酸序列，命名为rhIL-12-P35序列：

rhIL-12-P35序列(如SEQ ID NO.1所示)：

设计有信号肽(粗体带横线部分)、Kozak序列(斜体+下划线部分)、限制性内切酶位点(NheI、SalI及HindIII)、起始密码子和终止密码子的编码P40亚基的核苷酸序列，命名为rhIL-12-P40序列：

rhIL-12-P40序列(如SEQ ID NO.2所示)：

ATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCAGATGCTCCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCAGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGTCCAGCGAGGTGCTGGGCTCTGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCTGGCCAGTACACATGTCATAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACTCCCTGCTGCTGCTGCATAAGAAGGAGGATGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGAGATGCGAGGCCAAGAATTATAGCGGCCGCTTTACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCAGCACCGACCTGACATTTTCTGTGAAGTCTTCCAGAGGCAGCTCTGATCCTCAGGGAGTGACATGCGGAGCTGCTACCCTGTCTGCTGAGAGGGTGCGGGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATTCTGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCTGCTGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCTGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACATCCAGCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAACTCCAGGCAGGTGGAGGTGAGCTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACATTCTTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGAGCAAGAGGGAGAAGAAGGACCGGGTGTTCACCGATAAGACATCTGCCACCGTGATCTGTCGCAAGAACGCCAGCATCTCCGTGAGGGCCCAGGACCGCTACTATTCTTCCAGCTGGAGCGAGTGGGCTTCTGTGCCATGTTCCTGA

(2)通过基因合成，得到如步骤(1)所示的rhIL-12-P35序列和rhIL-12-P40序列；

(3)以rhIL-12-P35序列和rhIL-12-P40序列为模板，使用PCR后能在得到的产物3'端添加A碱基的酶，通过如下引物分别PCR扩增得到带有突出A碱基的rhIL-12-P35序列的PCR产物和带有突出A碱基的rhIL-12-P40序列的PCR产物；

P35-F-NheI+KOZAK：5’-ATAAAAGCTAGCGCCGCCACCATGTGGCCACCTGGATCCGCCTCCCAGCCA-3’；

P35-R-HindIII+SalI+HIS:5’-ATAAAAAAGCTTGTCGACTCAGCTGGCGTTCAGATAGGAC-3’；

P40-F-NheI+KOZAK:5’-ATAAAAGCCGCCACCATGTGCCACCAGCAGCTGGTCATCTCCTGG-3’；

P40-R-HindIII+SalI+HIS:5’-ATAAAATCAGGAACATGGCACAGAAGCCCACTCGCT-3’。

(4)将带有突出A碱基的rhIL-12-P40的PCR产物与载体pcDNATM3.4-连接，得到pcDNATM3.4--rhIL-12-P40重组载体，简称P-P40载体；将rhIL-12-P35的PCR产物使用NheI与SalI双酶切暴露出粘性末端，同时载体-Mu-H使用NheI与SalI双酶切暴露出粘性末端，分别回收双酶切产物，将带rhIL-12-P35的双酶切产物与载体-Mu-H的双酶切产物连接，得到-Mu-H-rhIL-12-P35重组载体，简称U-P35载体；

(5)将P-P40载体和U-P35载体共同转染至CHO细胞，转染取样收集上清；向培养物中加入G418与潮霉素筛选，培养至细胞活率回升至95％以上，将细胞以0.5～1个细胞每孔铺96孔板分选单克隆细胞，获得表达IL-12高的单克隆细胞株。

步骤(2)中所述的基因合成为通过基因合成公司进行合成。

步骤(3)中所述的PCR后能在得到的产物3'端添加A碱基的酶优选为HS DNA聚合酶(CodeNo.DR044A)。

步骤(3)中所述的PCR扩增的条件如下：

当模板为rhIL-12-P40序列时，PCR扩增的条件为：98℃1分钟；98℃10秒、57℃5秒、72℃1分钟，34个循环；72℃延伸5分钟；

当模板为rhIL-12-P35序列时，PCR扩增的条件为：98℃1分钟；98℃10秒、57℃5秒、72℃40秒，34个循环；72℃延伸5分钟。

步骤(4)中所述的载体pcDNATM3.4-为线性化且突出末端为T的载体，从而其能与3'带有突出A碱基的PCR产物进行连接；连接后的产物转入大肠杆菌，复制，筛选，得到阳性克隆，抽提，得到重组载体。

步骤(4)中所述的载体-Mu-H载体为环状的含有多克隆位点(包括NheI与SalI限制性内切酶位点)的载体，从而其能经NheI与SalI双酶切的目的基因产物进行连接；连接后的产物转入大肠杆菌，复制，筛选，得到阳性克隆，抽提，得到重组载体。

步骤(5)中所述的转染采用GIBCO/BRL的Lipofectin进行细胞转染，操作按说明书进行。

步骤(5)中所述的取样的时间优选为转染48h后。

步骤(5)中所述的G418的筛选浓度为200～500mg/L。

步骤(5)中所述的潮霉素的筛选浓度为200～500mg/L。

一种发酵表达重组人白细胞介素12的CHO细胞的方法，包含如下步骤：

I、将表达重组人白细胞介素12的CHO细胞接种到生长培养基中培养至对数生长期，培养条件如下：温度为36～38℃、转速为170～200rpm，体积分数为5～8％CO₂；

II、接着将步骤I中处于对数生长期的细胞使用生长培养基进行逐级放大；

III、将逐级放大后的细胞转接到5L搅拌式发酵罐中进行培养，培养体积为1.5～2.5L生长培养基；调节转速200～250rpm，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.6～7.2；溶解氧始终保持为35～45％，葡萄糖浓度始终保持为3～6g/L；培养过程中分别流加相当于初始培养体积4％～8％的补料培养基A及0.4～0.8％的补料培养基B；

IV、当细胞活力降为60％以下时，放出发酵液，结束发酵。

步骤I中所述的生长培养基为含6～8mM谷氨酰胺的CD-FORTI培养基或是含6～8mM谷氨酰胺、300mg/LG418和300mg/L潮霉素的CD-FORTI培养基。

步骤I中所述的培养优选为使用50ml Tubespin旋转振荡培养。

步骤II中所述的逐级放大的步骤优选为：依次使用容积为500ml、1000ml的康宁(CORNING)摇瓶进行培养，加入生长培养基的体积为康宁(CORNING)摇瓶容积的1/5～1/4、细胞接种后最终浓度为4×10⁵～6×10⁵个/ml、培养温度为36～38℃、转速为110～180rpm；每一级培养至对数生长期就进行转接。

步骤II中所述的逐级放大的步骤中的转速优选为110～140rpm。

步骤III优选为：将逐级放大后的细胞转接到5L搅拌式发酵罐中进行培养，培养体积为1.5～2.5L生长培养基；调节转速200～250rpm，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.6～7.2；溶解氧始终保持为35～45％，葡萄糖浓度始终保持为3～6g/L；分别流加相当于初始培养体积4％～8％的补料培养基A及0.4％～0.8％的补料培养基B；更优选为：将逐级放大后的细胞转接到5L搅拌式发酵罐中进行培养，培养体积为2.5L生长培养基；调节转速220rpm，温度为37℃，pH值为7.0±0.2，空气流量为9-11L/h，培养第3天调节pH至6.8±0.3；溶解氧始终保持为40％，葡萄糖浓度始终保持为3～6g/L；分别流加相当于初始培养体积约5％的补料培养基A和相当于初始培养体积约0.5％的补料培养基B。

补料培养基A的配方为在DPM Cell Boost7a(HyClone，SH31026.04)中添加如下物质，添加量按其各物质在补料培养基A中的终浓度计算，具体如下(确定)：半乳糖100mM、氯化锰40μM、L-赖氨酸盐酸盐5g/L、L-半胱氨酸盐酸盐7.5mg/L、L-酪氨酸18mg/L、甘氨酸8.5mg/L、L-组氨酸盐酸盐5mg/L。

补料培养基B为DPM Cell Boost7b(HyClone，SH31027.04)。

所述的流加的时机优选为培养第72小时、120小时、168小时和216小时。

所述的5L搅拌式发酵罐优选为型号为的发酵罐SartoriusBiostatBplus-5L。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明通过信号肽优化与密码子优化，得到本发明所提供的编码重组人白细胞介素-12的核苷酸序列。该段序列是经过特别设计的，经过大量随机筛选工作得到的，是其他研究者不能够通过常规密码子优化方法或通用设计理论轻易得到的，非自然界天然纯在的基因。将该编码重组人白细胞介素-12的基因重组于CHO细胞表达系统中，在CHO细胞表达得到的重组人白细胞介素-12的表达量高。经过密码子优化后的质粒组合在相同瞬时表达条件下的表达量约为未经密码子优化的5倍左右。

(2)本发明所述的CHO细胞表达系统优选真核表达载体pcDNATM3.4-(6011bp)和真核表达载体-Mu-H(8355bp)，其中真核表达载体-Mu-H目的基因启动子上游添加便在染色质开放元件UCOE(3.2kb)；优选将上述编码P35亚基的核苷酸序列克隆至真核表达载体-Mu-H(8355bp)；UCOE元件能阻止基因转录沉默，使转录的目的基因不受“位置效应”的影响，有利于增强p35亚基的表达，平衡p35亚基与p40亚基的表达水平，从而提高重组人白细胞介素12的表达水平。

(3)本发明所提供了表达白细胞介素-12的CHO细胞的流加培养方法，特别是在添加补料培养基后，可显著提高表达水平至300mg±40mg/L，降低生产成本，获得高纯度的目的蛋白。流加培养方法优于灌流技术方法的优点是，操作简单，污染风险小，培养周期相对较短，单位体积的产量高。

附图说明

图1是P35亚基信号肽的分析图；其中，图A为原始的P35亚基的信号肽分析图，图B为截短的P35亚基的信号肽分析图。

图2是P35亚基密码子的适应指数调整图；其中，图A是GenBank公布的P35亚基的CDS区(222-983)密码子适应指数图，图B是rhIL-12-P35序列的密码子适应指数图，图C是rhIL-12-P35’序列的密码子适应指数图。

图3是P40亚基原信号肽分析图。

图4是P40亚基密码子的适应指数调整图；其中，图A是GenBank公布的P40亚基的CDS区(43-1029)密码子适应指数图，图B是rhIL-12-P40序列的密码子适应指数图，图C是rhIL-12-P40’序列的密码子适应指数图。

图5是真核表达载体的双酶切鉴定图；其中，泳道M为DNA Marker，泳道1为p-C2-P35质粒，泳道2为p-C1-P40质粒。

图6是IL-12密码子优化前后的质粒组合在CHO细胞中瞬时表达的研究结果图。

图7是不同的稳定表达单克隆细胞株批次培养的生长与表达曲线图；其中，图A是细胞密度曲线图，图B是细胞活率曲线图，图C是表达量曲线图。

图8是IL-12稳定表达细胞株5L生物反应器流加培养细胞生长与表达曲线图；其中，图A是细胞密度曲线图，图B是细胞活率曲线图，图C是表达量曲线图。

图9是纯化后IL-12蛋白的电泳鉴定图；其中，泳道M为Marker，泳道1为还原电泳，泳道2为非还原电泳。

图10是纯化后IL-12生物学活性测定图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1密码子优化与信号肽分析：

(1)P35亚基的改造

已知公开的重组人白细胞介素-12蛋白的P35亚基(GenBank公布的rhIL-12(hIL-12)的P35亚基氨基酸序列与编码基因序列>gi|325974478|ref|NM_000882.3|homosapiens interleukin 12A(IL12A),transcript variant 1,mRNA。其中，CDS区222….983，信号肽区域为222….389。

将P35亚基的氨基酸序列输入signalP软件进行信号肽分析，结果如下图1显示，原信号肽序列分泌能力弱，C值和Y值较小，预测可能是P35亚基分泌表达能力弱的原因之一，因此对P35亚基进行截短改造，将原信号肽序列(MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLA)截短为MCPARSLLLVATLVLLDHLSLA。信号肽经过改造后，经signalP软件进行信号肽分析。

经过信号肽截短改造的P35亚基的氨基酸序列如下：

MCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(共219个氨基酸，其中1-22个氨基酸为信号肽)。

由于密码子在不同表达系统中具有密码子使用偏好性，这可能是影响基因序列在不同表达系统中表达强弱的又一个重要原因，因此我们分别在根据CHO细胞密码子偏好性将原基因序列进行优化，并在P35亚基上游添加限制性内切酶位点NheI以及Kozak序列，下游添加限制性内切酶位点SalI及HindIII，同时屏蔽掉基因内部的SalI、NheI、SacI、Xbal、EcoRI、HindIII等限制性内切酶位点。优化后两条基因序列如下：设计有信号肽(粗体带横线部分)、Kozak序列(斜体+下划线部分)、限制性内切酶位点(NheI、SalI及HindIII)、起始密码子和终止密码子的编码P35亚基的核苷酸序列，分别命名为rhIL-12-P35序列和rhIL-12-P35’序列，序列信息如下：

rhIL-12-P35(如SEQ ID NO.1所示)：

CGCAACCTGCCAGTGGCCACACCAGACCCCGGCATGTTCCCCTGCCTGCACCATTCTCAGAACCTGCTGCGGGCCGTGTCCAATATGCTGCAGAAGGCCAGACAGACCCTGGAGTTTTACCCCTGTACAAGCGAGGAGATCGACCACGAGGATATCACCAAGGATAAGACCTCTACAGTGGAGGCTTGCCTGCCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCCTGTCTGAATAGCCGCGAGACCTCTTTCATCACAAATGGCTCCTGCCTGGCCTCCAGGAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTGTCCAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTATCAGGTGGAGTTCAAGACAATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCAAAGCGGCAGATCTTTCTGGATCAGAATATGCTGGCTGTGATCGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTCAATTCTGAGACCGTGCCCCAGAAGTCTTCCCTGGAGGAGCCTGATTTCTACAAGACAAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCATGCTTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATCGACAGAGTGATGTCCTATCTGAACGCCAGCTGAGTCGACAAGCTT。

rhIL-12-P35’(如SEQ ID NO.3所示)：

ATGTGCCCAGCCAGATCTCTGCTGCTGGTGGCTACACTGGTGCTGCTGGATCATCTGTCCCTGGCTAGAAACCTGCCAGTGGCTACACCAGATCCCGGCATGTTTCCATGCCTGCACCATTCCCAGAACCTGCTGAGAGCCGTGTCCAACATGCTGCAGAAGGCTAGGCAGACACTGGAGTTCTATCCCTGCACATCCGAGGAGATCGACCATGAGGACATCACCAAGGACAAGACCAGCACAGTGGAGGCTTGCCTGCCTCTGGAGCTGACCAAGAACGAGTCCTGTCTGAACTCCAGAGAGACCAGCTTCATCACCAATGGCAGCTGTCTGGCTTCCAGAAAGACCTCCTTCATGATGGCTCTGTGCCTGAGCTCCATCTATGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCAAAGAGACAGATCTTCCTGGACCAGAACATGCTGGCCGTGATCGATGAGCTGATGCAGGCTCTGAACTTCAATTCCGAGACCGTGCCTCAGAAGTCTAGCCTGGAGGAGCCTGATTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCATGCCTTTAGAATCCGGGCTGTGACAATCGACAGAGTGATGTCCTACCTGAACGCCAGCTGAGTC GACAAGCTT。

经过优化后，rhIL-12-P35在CHO细胞中的密码子适应指数由原来的0.81上升到0.97，rhIL-12-P35’在CHO细胞中的密码子适应指数由原来的0.81上升到0.97(如图2所示)，进一步保证了P35亚基的高效表达。

(1)P40亚基的改造

已知公开的重组人白细胞介素-12蛋白P40亚基的氨基酸序列(GenBank公布的rhIL-12(hIL-12)的>gi|24497437|ref|NM_002187.2|Homo sapiens interleukin 12A(IL12A),transcript variant 1,mRNA。其中CDS区43..1029,信号肽区域为43…108。

将P40亚基的氨基酸序列输入signalP软件进行信号肽分析，结果如图3显示，原信号肽序列分泌能力较强无需进行改造。

根据CHO细胞密码子偏好性将原基因序列进行优化，并在P40亚基上游添加限制性内切酶位点NheI以及Kozak序列，下游添加限制性内切酶位点SalI及HindIII，同时屏蔽掉基因内部的SalI、NheI、SacI、Xbal、EcoRI、HindIII等限制性内切酶位点。设计有信号肽(粗体带横线部分)、Kozak序列(斜体+下划线部分)、限制性内切酶位点(NheI、SalI及HindIII)、起始密码子和终止密码子的编码P40亚基的核苷酸序列，分别命名为rhIL-12-P40序列和rhIL-12-P40’序列，序列信息如下：

rhIL-12-P40(如SEQ ID NO.2所示)：

rhIL-12-P40’(如SEQ ID NO.4所示)：

ATGTGCCATCAGCAGCTGGTAATCTCTTGGTTTAGCCTGGTGTTCCTGGCTTCCCCACTGGTGGCCATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGATTGGTACCCAGATGCCCCCGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGATACACCTGAGGAGGACGGCATCACATGGACCCTGGATCAGTCTTCCGAGGTGCTGGGCTCTGGCAAGACACTGACCATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTATACATGCCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCCCACTCTCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGATGGCATCTGGAGCACCGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGAGATGTGAGGCCAAGAACTACTCTGGCAGGTTTACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCCACCGATCTGACCTTCTCCGTGAAGTCTTCCAGGGGCAGCTCTGATCCACAGGGCGTGACATGTGGCGCTGCCACACTGTCCGCTGAGAGAGTGAGAGGCGATAACAAGGAGTACGAGTACTCCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCTGCTTGCCCTGCTGCCGAGGAGTCTCTGCCAATCGAGGTAATGGTGGATGCCGTGCATAAGCTGAAGTATGAGAACTATACATCCAGCTTCTTTATCCGGGACATCATCAAGCCCGATCCACCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCTCTGAAGAATAGCAGGCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTATCCTGATACATGGAGCACCCCACACTCCTACTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAGAGAGAGAAGAAGGACAGAGTGTTCACCGACAAGACCTCTGCCACAGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCTATCTCCGTGAGAGCCCAGGATCGCTACTATAGCTCTTCCTGGTCTGAGTGGGCCTCTGTGCCTTGTTCTTGA

经过优化后，rhIL-12-P40在CHO细胞中的密码子适应指数由原来的0.77上升到0.96，rhIL-12-P40’在CHO细胞中的密码子适应指数由原来的0.77上升到0.96(如图4所示)，进一步保证了P40亚基的高效表达。

实施例2基因扩增与表达载体构建

将实施例1中经密码子优化后的基因委托上海生工生物工程有限公司合成。得到重组人白细胞介素-12的P35亚基与P40亚基的序列，并测序。将两条P35亚基序列rhIL-12-P35及rhIL-12-P35’、两条P40亚基序列rhIL-12-P40及rhIL-12-P40’分别构建在pcDNATM3.4-及-Mu-H两个真核表达载体上。

首先将编码重组人白细胞介素-12的P35亚基使用引物P35-F-NheI+KOZAK及引物P35-R-HindIII+SalI进行PCR扩增，将编码重组人白细胞介素-12的P40亚基使用引物P40-F-NheI+KOZAK及引物P40-R-HindIII+SalI进行PCR扩增。

P35-R-HindIII+SalI：5’-ATAAAAAAGCTTGTCGACTCAGCTGGCGTTCAGATAGGAC-3’；

P40-F-NheI+KOZAK：5’-ATAAAAGCTAGCGCCGCCACCATGTGCCACCAGCAGCTGGTCATCTCCTGG-3’；

P40-R-HindIII+SalI：5’-ATAAAAAAGCTTGTCGACTCAGGAACATGGCACAGAAGCCCACTCGCT-3’。

在上游引物和下游引物两端分别加入NheI(GCTAG↓C)和HindⅢ(A↓AGCTT)、SalI(G↓TCGAC)酶切位点，并在上游引物起始密码前加入一个kozak序列，有助于增强P35亚基及P40亚基基因在真核细胞中表达，在下游加入终止密码TGA，保证翻译终止。P35亚基扩增产物长688bp，用NheI(GCTAG↓C)和HindIII(A↓AGCTT)双酶切后，产生粘性末端，可克隆于载体-Mu-H上。P40亚基扩增产物长1014bp，扩增产物带有突出的碱基，可克隆于载体pcDNATM3.4-上。根据HS DNAPolymerase with GC buffer(CodeNo.DR044A)说明书配制反应体系，设置反应参数。其中编码P35亚基的核苷酸序列的PCR扩增的条件为：98℃1分；98℃10秒、57℃5秒、72℃40秒，34个循环；72℃延伸5分钟；反应体系为：模板DNA 100ng、HS 0.5μl、2×PCR缓冲液25μl、2.5mM dNTP 4μl、浓度为20μM的引物P35-F-NheI+KOZAK 1μl、浓度为20μM的引物P35-R-HindIII+SalI 1μl，用ddH₂O补足50μl。其中编码P40亚基的核苷酸序列的PCR扩增的条件为：98℃1分；98℃10秒、57℃5秒、72℃1分钟，34个循环；72℃延伸5分钟；反应体系为：模板DNA 100ng、HS 0.5μl、2×PCR Buffer 25μl、2.5mM dNTP 4μl、浓度为20μM的引物P40-F-NheI+KOZAK 1μl、浓度为20μM的引物P40-R-HindIII+SalI 1μl，用ddH₂O补足50μl。分别得到长度为688bp的p35基因产物以及长度1014bp的p40基因产物，均与预期大小相一致。对产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离，根据OMEGABIOTEK公司的GELEXTRACTIONKIT(#D2501)说明书操作，切胶回收目的片段。

P40亚基扩增产物长1014bp，扩增产物带有突出的A碱基，可直接通过AT连接克隆于载体pcDNATM3.4-上。根据Thermo的T4DNA连接酶说明书(T4DNA连接酶，15224017)配制反应体系，4℃连接过夜。连接产物根据按照《分子克隆实验指南》(2002年，科学出版社)所述方法进行转化大肠杆菌DH5α，将转化细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取质粒克隆至液体LB培养基中培养，260rpm摇菌14小时，由无内毒素的质粒试剂盒(QIAGEN，Cat.no.12381)抽提质粒。通过NheI及HindIII双酶切鉴定，结果如图5所示。鉴定得到的阳性克隆送上海生工进行测序鉴定，基因序列如上，得到真核表达载体pcDNA3.4-il12-P40及pcDNA3.4-il12-P40’，分别命名为P-P40及P-P40’。

根据Thermo Fast Digest NheI(FD0973)、Thermo Fast Digest SalI(FD0644)说明书，对两条p35基因的PCR产物，及载体-Mu-H进行双酶切，使载体及P35基因目的片段同时暴露出NheI及SalI粘性末端，切胶回收目的片段及线性化的载体，根据Thermo的T4DNA连接酶说明书(T4DNA连接酶，15224017)配制反应体系，4℃连接过夜。连接产物根据按照《分子克隆实验指南》(2002年，科学出版社)所述方法进行转化大肠杆菌DH5α(宝生物工程(大连)有限公司)中，将转化细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取质粒克隆至液体LB培养基中培养，260rpm摇菌14小时，由无内毒素的质粒试剂盒(QIAGEN，Cat.no.12381)抽提质粒。通过NheI及SalI双酶切鉴定，鉴定得到的阳性克隆送上海生工进行测序鉴定，基因序列如上，得到真核表达载体-Mu-H-IL-12-P35、-Mu-H-IL-12-P35’，分别命名为U-P35及U-P35’。

实施例3密码子优化前后序列在CHO细胞中的瞬时表达研究

同样，按照实施例2中所述方法将GenBank公布的人白细胞介素12，P35亚基的CDS区(>gi|325974478|ref|NM_000882.3|homo sapiens interleukin 12A(IL12A),transcript variant 1,mRNA。其中，CDS区222….983)克隆至载体-Mu-H，得到载体命名为U-P35-O。将GenBank公布的重组人白细胞介素-12蛋白P40亚基的氨基酸序列的CDS区(>gi|24497437|ref|NM_002187.2|Homo sapiens interleukin 12A(IL 12A),transcript variant 1,mRNA。其中CDS区43..1029)克隆至载体pcDNATM3.4-上，得到载体命名为P-P40-O。将重组表达载体按下表组合以P40亚基：P35亚基比例1：3，按照CHO瞬时表达试剂盒ExpiCHO^TMExpression System(Thermo,A29133)所述方法转染于ExpiCHO-S细胞中瞬时表达。

表1

序号	载体组合	序号	载体组合
				1	P-P40-O:U-P35-O＝1:3	4	P-P40:U-P35’＝1:3
2	P-P40’:U-P35’＝1:3	5	P-P40:U-P35＝1:3
				3	P-P40’:U-P35＝1:3

按照如下ELISA方法测定瞬时表达第5天的表达量，夹心ELISA方法具体过程如下：

(1)用包被液(pH9.6、0.1M的碳酸盐缓冲液)稀释人IL-12p70抗体(商品编号：MAB611-500)至2μg/ml用于包被抗体，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃过夜。

(2)扣干包被液，用PBST(pH7.4、0.1M的磷酸盐缓冲液+吐温20，吐温20的终浓度为体积百分比0.05％)以300μl/孔加至96孔酶标板内，洗板1次，每次3min。

(3)将稀释好的标准品(重组人IL-12标准品购自R&D公司，货号：219-IL)用含质量体积比1％BSA的PBST以2倍梯度稀释，稀释范围为0.12ng/L～7.8ng/L；待测样品用含质量体积比1％BSA的PBST稀释10000倍，均以100μl/孔加至板内，37℃放置1小时。

(4)用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。

(5)用含质量体积比5％的BSA的二抗稀释液(2g BSA+40ml PBST)将生物素标记的生物素标记的人IL-12抗体(Catalog#BAF219)稀释为0.1μg/ml，以100μl/孔加至板内，37℃放置1小时。

(6)扣干微孔板，加入1×PBST，300μL/孔，静置3min，洗5次。

(7)加入HRP标记的链霉亲和素(1:1000稀释，索莱宝，货号：S9170)，100μL/孔，用1×PBS或1×PBST稀释。37℃孵育45min。

(8)扣干微孔板，加入洗液，300μL/孔，静置3min，洗5次。

(9)加入TMB显色底物(碧云天P0209)，100μL/孔，避光，室温孵育5～30min。

(10)加入20％硫酸终止，100μL/孔从蓝变黄为正常，若变绿或颜色变化不均，请轻轻叩击板框，充分混匀。

(11)30min内检测OD₄₅₀、OD₆₃₀,OD值＝OD₄₅₀-OD₆₃₀，通过标准品做标准曲线，计算样品中重组人白细胞介素12(rhIL-12)的含量。检测时每个样品做3个复孔，取平均值。

结果如图6所示，1、2、3、4、5分别为按表1中描述的载体组合经CHO细胞瞬时表达后第五天的表达量。可见在相同实验条件下经过密码子优化的质粒组合P-P40与U-P35可得到更高的表大量，约为未经密码子优化的5倍。

实施例4 CHO细胞的稳定转染与稳定细胞株筛选

基因在CHO-S^TMCells(ThermoFisher)中的转染与表达，具体步骤如下：

取分别转有实施例2构建的重组质粒P-P40、U-P35的大肠杆菌(Escherichiacoli.)DH5α，分别接种于500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、260rpm振荡培养16小时。用Ultra pure Plasmid Purification Kit(QIAGEN)抽提质粒。经过优化P-P40和U-P35按照比例1：2～1：5的比例范围共转染CHO-S^TMCells细胞。CHO-S^TMCells细胞使用CD-FORTI(Thermo Fisher)培养基，36～37℃、6～8％CO₂、110rpm培养。转染试剂盒是购自Invitrogen公司的FreeStyle^TMMAXReagent(Invitrogen，货号16447-100)。转染时分别取上述纯化的质粒按照上述组合对CHO细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。按试剂盒说明操作转染，转染48h后，向培养物中加入200-500mg/L G418与200-500mg/L潮霉素筛选(以200、300、400和500mg/L的浓度筛选，每个浓度使用5～7天)。培养约20-30天，每天取样，用Counter Star细胞计数仪计数，细胞活率逐渐下降至15％后又缓慢回升至95％以上。然后按照有限稀释法进行单克隆化(即将细胞稀释至96孔板，每孔0.5～1个克隆)。待细胞长到2～4×10⁶个细胞/ml将细胞以0.5-1个细胞每孔铺30-60块96孔板分选单克隆细胞，从中检测出表达量最高的5个克隆，形成工程细胞株。对这5株细胞进行批次培养，评估表达能力，将获得的各个单克隆细胞株以0.5×10⁶个细胞/ml的密度接种于Tubespin-50中旋转振荡培养，培养基为CD-FORTI(ThermoFisher)，培养体积为10ml，培养温度为36-37℃，转速为180rpm，6-8％CO₂，葡萄糖含量低于3g/L补至5g/L，连续培养8-10天。取培养72h的细胞培养上清100μl，3000rpm离心5min收集上清，分别取培养第4、5、7、9、10天的培养上清。用实施例4中所述ELISA方法测定表达量，结果如图7所示。

本实施例构建的CHO细胞稳定表达重组人白细胞介素12的细胞株可达最高80mg/L的表达量(克隆E36F4)，这在重组人白细胞介素12大规模生产中具有重要的经济意义。在表达量最高的5株单克隆细胞(克隆编号分别为E54B9、E57E7、E40E4、E36F4、E53E9)中选择蛋白表达量高并且生长状况好的单克隆细胞株E36F4号作为大规模生产的候选细胞株。

实施例5稳定表达重组人白细胞介素12的CHO细胞株的发酵培养

5L搅拌式生物反应器中补料发酵培养，具体步骤如下：

补料培养基A配方为DPM Cell Boost7a(HyClone，SH31026.04)，另外添加半乳糖100mM、氯化锰40μM、L-赖氨酸盐酸盐5g/L、L-半胱氨酸盐酸盐7.5mg/L、L-酪氨酸18mg/L、甘氨酸8.5mg/L、L-组氨酸盐酸盐5mg/L。补料培养基B为DPM Cell Boost7b(HyClone，SH31027.04)。

取所构建筛选得到的表达重组人白细胞介素-12的CHO细胞(E36F4)，以约5×10⁵个细胞/ml接种于CD-FORTI(ThermoFisher)培养基(含8mM谷氨酰胺)中，采用50mlTubespin进行，培养体积为10ml，培养温度37℃，转速为180rpm。在细胞传代扩增过程中，逐级放大培养，依次使用容积为500ml、1000ml的康宁(CORNING)摇瓶进行培养进行细胞扩增，当细胞密度达到4×10⁶个细胞/ml时，转移采用5L搅拌式生物反应器中发酵培养(Sartorius BiostatB plus-5L)进行发酵培养，培养体积为2.5L，调节转速220rpm，温度为37℃，pH值为7.0±0.2，空气流量为9-11L/h，培养第3天调节pH至6.8±0.3；溶解氧始终保持为40％，葡萄糖浓度始终保持为3～6g/L；培养第72小时、120小时、168小时、216小时分别流加相当于初始培养体积约5％的补料培养基A和相当于初始培养体积约0.5％的补料培养基B。

在5L搅拌式生物反应器中发酵培养，每天取样用Counter Star细胞活力计数仪测定细胞密度，用台盼蓝染色法测定细胞活力，收取样品用3000转离心8分钟，取上清测定表达量，用ACCU-CHEK血糖仪检测葡萄糖的浓度，根据所测葡萄糖的浓度来添加葡萄糖，使发酵液中葡萄糖浓度为3～6g/L。用实施例3中的夹心ELISA方法检测蛋白表达量。

结果如图8所示，结果表明，添加补料培养基后细胞周期可达16天；同时在添加补料培养基后，在培养第9天时，细胞最高密度达到26×10⁶个细胞/ml，在添加补料培养基后重组人白细胞介素-12的表达量可达300mg±40mg/L。因此本发明所构建的表达重组人白细胞介素-12的重组CHO细胞在旋转振荡培养方式下，通过实施例5中所述流加培养方法，有着极好的蛋白表达量，可达300mg±40mg/L。其在用于蛋白大规模生产中具有极大优势。

实施例6 CHO细胞表达的重组人白细胞介素12的纯化

采用Q柱+肝素亲和层析两步法进行CHO细胞表达的重组人白细胞介素12的纯化。选用QSepharose FastFlow介质(GE公司)，流动相A(简称A液)采用20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，流动相B(简称B液)：20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，2mol/L NaCl。色谱条件：以A液平衡色谱柱2～3个柱体积，流速50～400cm/h。待色谱柱平衡充分后，培养上清经0.22μm的微孔滤膜过滤后上样，柱压＜0.3MPa。上样结束后，用A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；再以3％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰Ⅰ，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用10％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用100％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰Ⅲ，并充分流洗色谱柱至基线平稳；将上述洗脱峰Ⅱ采用肝素(Heparin Sepharose6 Fast Flow，GE公司)亲和层析进行进一步纯化，平衡液采用20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，100Mm NaCL，流动相A采用20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，流动相B：20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，2mol/L NaCl。色谱条件：以平衡液平衡色谱柱2～3个柱体积，流速60～300cm/h。待色谱柱平衡充分后，经QSepharose FastFlow介质纯化的洗脱峰B在4℃条件下上样，上样结束后，用平衡液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；再以10％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰Ⅰ，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用25％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰Ⅱ，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用60％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰Ⅲ，并充分流洗色谱柱至基线平稳；洗脱峰Ⅱ中可见明显目的蛋白，经过纯化的重组人白细胞介素-12经还原及非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定如图9所示，泳道1为还原电泳，在35KD-40KD位置可见明显的两条带，分别为重组人白细胞介素12的P35亚基与P40亚基；泳道2为非还原电泳，在70kd-100KD位置可见明显的一条带，为重组人白细胞介素12。

实施例7 CHO细胞表达的重组人白细胞介素12的活性。

测活用的人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞NK-92mi细胞购自中国食品药品检定研究院：使用的培养基成分如下：76％a-MEM培养基+12％胎牛血清+12％马血清、1％青霉素/链霉素、0.2mM肌醇、0.02mM叶酸，以及0.1mMβ-巯基乙醇，培养备用。

(1)NK-92mi细胞生长至对数生长期，吹打分散均匀，重悬于新鲜的完全培养基，调整细胞密度至1×10⁶个细胞/ml，接种96孔细胞培养板。接种体积100μl/孔。

(2)37℃、5％CO₂，饱和湿度的条件下过夜培养。

(3)用完全培养基稀释纯化后的重组人白细胞介素-12至0.18ng/ml、0.75ng/ml、3ng/ml、12ng/ml。50μl/孔，加入96孔板中，使得作用终浓度分别是0.06ng/ml、0.25ng/ml、1ng/ml、3ng/ml。37℃孵育培养。

(4)24～48小时后用eBiosciences88-7317试剂盒方法检测培养上清中的IFN-Y的含量。

实验结果如图10所示，实验结果表明，使用上述实施例5制得的重组人白细胞介素-12在作用浓度0.06ng/ml、0.25ng/ml、1ng/ml、3ng/ml时对效应细胞NK92mi有明显的促进IFN-Y分泌的作用，并且呈剂量依赖性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东暨大基因药物工程研究中心有限公司

<120> 一种编码重组人白细胞介素12的基因及其应用

<130> 1

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码P35亚基的核苷酸序列

<400> 1

gctagcgccg ccaccatgtg cccagctagg agcctgctgc tggtggccac cctggtgctg 60

ctggatcatc tgagcctggc tcgcaacctg ccagtggcca caccagaccc cggcatgttc 120

ccctgcctgc accattctca gaacctgctg cgggccgtgt ccaatatgct gcagaaggcc 180

agacagaccc tggagtttta cccctgtaca agcgaggaga tcgaccacga ggatatcacc 240

aaggataaga cctctacagt ggaggcttgc ctgcctctgg agctgacaaa gaacgagtcc 300

tgtctgaata gccgcgagac ctctttcatc acaaatggct cctgcctggc ctccaggaag 360

acctctttta tgatggccct gtgcctgtcc agcatctacg aggacctgaa gatgtatcag 420

gtggagttca agacaatgaa cgccaagctg ctgatggacc caaagcggca gatctttctg 480

gatcagaata tgctggctgt gatcgacgag ctgatgcagg ccctgaactt caattctgag 540

accgtgcccc agaagtcttc cctggaggag cctgatttct acaagacaaa gatcaagctg 600

tgcatcctgc tgcatgcttt taggatccgg gccgtgacca tcgacagagt gatgtcctat 660

ctgaacgcca gctgagtcga caagctt 687

<210> 2

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码P40亚基的核苷酸序列

<400> 2

gctagcgccg ccaccatgtg ccaccagcag ctggtcatct cctggttcag cctggtgttt 60

ctggccagcc ctctggtggc tatctgggag ctgaagaagg acgtgtacgt ggtggagctg 120

gactggtatc cagatgctcc aggagagatg gtggtgctga cctgcgacac accagaggag 180

gatggcatca cctggacact ggaccagtcc agcgaggtgc tgggctctgg caagaccctg 240

acaatccagg tgaaggagtt cggcgatgct ggccagtaca catgtcataa gggcggcgag 300

gtgctgtctc actccctgct gctgctgcat aagaaggagg atggcatctg gtccacagac 360

atcctgaagg atcagaagga gcccaagaac aagaccttcc tgagatgcga ggccaagaat 420

tatagcggcc gctttacctg ttggtggctg accacaatca gcaccgacct gacattttct 480

gtgaagtctt ccagaggcag ctctgatcct cagggagtga catgcggagc tgctaccctg 540

tctgctgaga gggtgcgggg cgacaacaag gagtacgagt attctgtgga gtgccaggag 600

gattccgcct gtccagctgc tgaggagtcc ctgcctatcg aagtgatggt ggacgctgtg 660

cacaagctga agtacgagaa ttatacatcc agcttcttta tcagggacat catcaagcca 720

gatcccccta agaacctgca gctgaagccc ctgaagaact ccaggcaggt ggaggtgagc 780

tgggagtacc ctgatacctg gtccacacca cattcttatt tctccctgac cttttgcgtg 840

caggtgcagg gcaagagcaa gagggagaag aaggaccggg tgttcaccga taagacatct 900

gccaccgtga tctgtcgcaa gaacgccagc atctccgtga gggcccagga ccgctactat 960

tcttccagct ggagcgagtg ggcttctgtg ccatgttcct gagtcgacaa gctt 1014

<210> 3

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rhIL-12-P35’序列

<400> 3

gctagcgccg ccaccatgtg cccagccaga tctctgctgc tggtggctac actggtgctg 60

ctggatcatc tgtccctggc tagaaacctg ccagtggcta caccagatcc cggcatgttt 120

ccatgcctgc accattccca gaacctgctg agagccgtgt ccaacatgct gcagaaggct 180

aggcagacac tggagttcta tccctgcaca tccgaggaga tcgaccatga ggacatcacc 240

aaggacaaga ccagcacagt ggaggcttgc ctgcctctgg agctgaccaa gaacgagtcc 300

tgtctgaact ccagagagac cagcttcatc accaatggca gctgtctggc ttccagaaag 360

acctccttca tgatggctct gtgcctgagc tccatctatg aggacctgaa gatgtaccag 420

gtggagttca agaccatgaa cgccaagctg ctgatggacc caaagagaca gatcttcctg 480

gaccagaaca tgctggccgt gatcgatgag ctgatgcagg ctctgaactt caattccgag 540

accgtgcctc agaagtctag cctggaggag cctgatttct acaagaccaa gatcaagctg 600

tgcatcctgc tgcatgcctt tagaatccgg gctgtgacaa tcgacagagt gatgtcctac 660

ctgaacgcca gctgagtcga caagctt 687

<210> 4

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rhIL-12-P40’ 序列

<400> 4

gctagcgccg ccaccatgtg ccatcagcag ctggtaatct cttggtttag cctggtgttc 60

ctggcttccc cactggtggc catctgggag ctgaagaagg acgtgtacgt ggtggagctg 120

gattggtacc cagatgcccc cggcgagatg gtggtgctga cctgcgatac acctgaggag 180

gacggcatca catggaccct ggatcagtct tccgaggtgc tgggctctgg caagacactg 240

accatccagg tgaaggagtt cggcgatgcc ggccagtata catgccacaa gggcggcgag 300

gtgctgtccc actctctgct gctgctgcac aagaaggagg atggcatctg gagcaccgac 360

atcctgaagg accagaagga gcccaagaac aagaccttcc tgagatgtga ggccaagaac 420

tactctggca ggtttacctg ttggtggctg accacaatct ccaccgatct gaccttctcc 480

gtgaagtctt ccaggggcag ctctgatcca cagggcgtga catgtggcgc tgccacactg 540

tccgctgaga gagtgagagg cgataacaag gagtacgagt actccgtgga gtgccaggag 600

gattctgctt gccctgctgc cgaggagtct ctgccaatcg aggtaatggt ggatgccgtg 660

cataagctga agtatgagaa ctatacatcc agcttcttta tccgggacat catcaagccc 720

gatccaccta agaacctgca gctgaagcct ctgaagaata gcaggcaggt ggaggtgtct 780

tgggagtatc ctgatacatg gagcacccca cactcctact tctccctgac cttttgcgtg 840

caggtgcagg gcaagtccaa gagagagaag aaggacagag tgttcaccga caagacctct 900

gccacagtga tctgtcggaa gaacgcctct atctccgtga gagcccagga tcgctactat 960

agctcttcct ggtctgagtg ggcctctgtg ccttgttctt gagtcgacaa gctt 1014

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物P35-F-NheI+KOZAK

<400> 5

ataaaagcta gcgccgccac catgtggcca cctggatccg cctcccagcc a 51

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物P35-R-HindIII+SalI

<400> 6

ataaaaaagc ttgtcgactc agctggcgtt cagataggac 40

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物P40-F-NheI+KOZAK

<400> 7

ataaaagcta gcgccgccac catgtgccac cagcagctgg tcatctcctg g 51

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物P40-R-HindIII+SalI

<400> 8

ataaaaaagc ttgtcgactc aggaacatgg cacagaagcc cactcgct 48

<210> 9

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 经过信号肽截短改造的P35亚基的氨基酸序列

<400> 9

Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro

20 25 30

Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val

35 40 45

Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys

50 55 60

Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser

65 70 75 80

Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys

85 90 95

Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala

100 105 110

Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr

115 120 125

Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys

130 135 140

Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu

145 150 155 160

Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr

165 170 175

Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys

180 185 190

Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr

195 200 205

Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser

210 215

Claims

1.一种编码重组人白细胞介素12的基因，其特征在于：包含编码P35亚基的核苷酸序列和编码P40亚基的核苷酸序列；其中，编码P35亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码P40亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的编码重组人白细胞介素12的基因在重组人白细胞介素12制备中的应用。

3.根据权利要求2所述的编码重组人白细胞介素12的基因在重组人白细胞介素12制备中的应用，其特征在于包括如下步骤：是将权利要求1所述的编码P35亚基的核苷酸序列和权利要求1所述的编码P40亚基的核苷酸序列分别克隆到CHO细胞表达载体上，再共同转染CHO细胞，分选得到稳定表达的细胞株，发酵表达。

4.根据权利要求3所述的编码重组人白细胞介素12的基因在重组人白细胞介素12制备中的应用，其特征在于：所述的CHO细胞表达系统为真核表达载体和真核表达载体

5.根据权利要求4所述的编码重组人白细胞介素12的基因在重组人白细胞介素12制备中的应用，其特征在于：将编码P40亚基的核苷酸序列克隆至真核表达载体将码P35亚基的核苷酸序列克隆至真核表达载体

6.一种表达重组人白细胞介素-12的CHO细胞，其特征在于：含有权利要求1所述的编码重组人白细胞介素12的基因。

7.根据权利要求6所述的人白细胞介素-12的CHO细胞，其特征在于通过如下步骤得到：

(1)设计，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的rhIL-12-P35序列以及核苷酸序列如SEQID NO.2所示的rhIL-12-P40序列；

P35-R-HindIII+SalI+HIS:5’-ATAAAAAAGCTTGTCGACTCAGCTGGCGTTCAGATAGGAC-3’；

P40-F-NheI+KOZAK:5’-ATAAAAGCTAGCGCCGCCACCATGTGCCACCAGCAGCTGGTCATCTCCTGG-3’；

P40-R-HindIII+SalI+HIS:5’-ATAAAAAAGCTTGTCGACTCAGGAACATGGCACAGAAGCCCACTCGCT-3’；

(4)将带有突出A碱基的rhIL-12-P40的PCR产物与载体连接，得到重组载体，简称P-P40载体；将rhIL-12-P35的PCR产物使用NheI与SalI双酶切暴露出粘性末端，同时载体使用NheI与SalI双酶切暴露出粘性末端，分别回收双酶切产物，将带rhIL-12-P35的双酶切产物与载体的双酶切产物连接，得到-rhIL-12-P35重组载体，简称U-P35载体；

8.根据权利要求7所述的人白细胞介素-12的CHO细胞，其特征在于通过如下步骤得到：

步骤(3)中所述的PCR扩增的条件如下：

9.一种发酵表达重组人白细胞介素12的CHO细胞的方法，其特征在于包含如下步骤：

I、将权利要求6～8任一项所述的表达重组人白细胞介素12的CHO细胞接种到生长培养基中培养至对数生长期，培养条件如下：温度为36～38℃、转速为170～200rpm，体积分数为5～8％CO₂；

IV、当细胞活力降为60％以下时，放出发酵液，结束发酵；

步骤I中所述的生长培养基为含6～8mM谷氨酰胺的CD-FORTI培养基或是含6～8mM谷氨酰胺、300mg/LG418和300mg/L潮霉素的CD-FORTI培养基；

补料培养基A的配方为在DPM Cell Boost7a中添加如下物质，添加量按其各物质在补料培养基A中的终浓度计算，具体如下：半乳糖100mM、氯化锰40μM、L-赖氨酸盐酸盐5g/L、L-半胱氨酸盐酸盐7.5mg/L、L-酪氨酸18mg/L、甘氨酸8.5mg/L、L-组氨酸盐酸盐5mg/L；

补料培养基B为DPM Cell Boost7b。

10.根据权利要求9所述的发酵表达重组人白细胞介素12的CHO细胞的方法，其特征在于：

步骤I中所述的培养为使用50ml Tubespin旋转振荡培养；

步骤II中所述的逐级放大的步骤为：依次使用容积为500ml、1000ml的康宁摇瓶进行培养，加入生长培养基的体积为康宁摇瓶容积的1/5～1/4、细胞接种后最终浓度为4×10⁵～6×10⁵个/ml、培养温度为36～38℃、转速为110～180rpm；每一级培养至对数生长期就进行转接；

步骤III为：将逐级放大后的细胞转接到5L搅拌式发酵罐中进行培养，培养体积为1.5～2.5L生长培养基；调节转速200～250rpm，温度为36～38℃，空气流量为9～11L/h，pH值为6.6～7.2；溶解氧始终保持为35～45％，葡萄糖浓度始终保持为3～6g/L；分别流加相当于初始培养体积4％～8％的补料培养基A及0.4％～0.8％的补料培养基B；

所述的流加的时机为培养第72小时、120小时、168小时和216小时。