实施例4Western-blot检测CNE10蛋白表达情况
1.总蛋白提取
培养细胞裂解
(1)将表皮干细胞贴壁细胞,去除培养液,用PBS洗一遍,悬浮细胞,离心收集,PBS洗一遍。
(2)通常每106个细胞可加0.1ml RIPA buffer,裂解液和细胞充分接触。
(3)冰上放置数分钟,用枪头轻轻吹打,使细胞充分裂解,再轻轻倾斜培养皿使裂解产物流向瓶皿的一边或一角,然后将之转移到1.5ml离心管,剧烈振荡30秒。
(4)12,000×g,4℃离心5分钟,取上清,即可进行后续的电泳、Western或免疫沉淀操作。
组织块裂解
(1)组织剪切成细小的碎片。每100毫克组织加入1ml RIPA裂解液。用玻璃匀浆器匀浆上下手动匀浆20次。
(2)将匀浆物转移到1.5ml离心管。
(3)12,000×g,4℃离心5分钟,取上清,即可进行后续的电泳、Western或免疫沉淀操作。
2.蛋白浓度测定(BCA测蛋白浓度)
工作液的配制
(1)测定前,按照BCA Reagent A:BCA Reagent B=100:1的比例混合后配制成工作液,例如配制30ml的工作液时,在30ml的BCA Reagent A中添加0.3ml的BCA Reagent B后,充分振荡混配制后的工作液可在4℃保存三天使用。
(2)所需工作液量的计算方法如下:
所需工作液总体积(ml)=[(BSA标准溶液8份或7份+检测样品数)×平行样本数(n)+1]×1个样品所需的工作液体积
例)标准操作流程【1ml反应体系】检测样品数为12个、平行样(n=2)时:[(8+12)×2+1]×1ml=41ml
例)标准操作流程【200μl反应体系】、检测样品数为20个、平行样(n=2)时:[(8+20)×2+1]×0.2ml=11.4ml
例)低浓度蛋白质样品测定的操作流程【1ml反应体系】、检测样品数为12个、平行样(n=2)时:[(7+12)×2+1]×0.5ml=19.5ml
3.低浓度蛋白样品的标准操作流程(定量范围:0~200μg/ml)
【0.2ml反应体系.使用微孔板测定】
1)BSA标准品溶液的配制。
(1)0.2mg/ml BSA标准品溶液的制备:取120μl BSA Standard Solution(2mg/ml),加入1,080μl稀释液后充分混合。
(2)按照不同的浓度稀释BSA标准品溶液,BSA标准品溶液和检测样品的稀释可使用去离子水、0.9%NaCl或PBS。
2)BSA标准曲线的制备
(1)分别取100μl稀释后的BSA标准品溶液加入到微孔板中,每个浓度取2个平行样。
(2)加入100ul工作液后,立即混匀。
(3)37℃水浴槽中反应60分钟后,冷却至室温。
(4)使用分光光度计测定562nm处的吸光度值。测定时,使用1mL比色皿,用水校零。尽可能在20分钟内检测完毕所有样品。
(5)各浓度BSA标准品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值,绘制BSA标准品溶液的标准曲线。
3)检测样品的测定
检测样品测定时,建议同BSA标准品溶液同时进行测定。
(1)分别取100μl检测样品加入到微孔板中,每个样品取2个平行样进行测定。
(如果必要,也可选择与BSA标准品溶液相同的稀释方法稀释检测样品后测定)
(2)加入100μl工作液后,立即混匀。
(3)37℃水浴中反应60分钟后,冷却至室温。
(4)酶标仪波长设定在562nm处进行测定。用水校零。尽可能在20分钟内检测完毕所有样品。
(5)各样品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值,根据标准曲线计算出检测样品的蛋白浓度。
4.SDS-PAGE电泳
(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
(2)配制10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
(3)当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)配制4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
(5)用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外。若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)
(6)取出上样样品与5×SDS上样缓冲液按4:1比例混合,混匀后沸水中煮5min使蛋白变性。
(7)加足够的电泳液后按等量蛋白上样。
(8)电泳,80V跑过浓缩胶后转换电压至120V,待溴酚兰跑到胶板底部刚好没有跑出即可。
(9)将夹子打开使黑的一面保持水平,在上面依次垫海绵垫、滤纸、胶、PVDF膜(经甲醇活化)、滤纸、海绵垫;同时将电泳液换成转移液。
(10)将电流调整到恒流200mA,转移约1小时。
(11)取出膜,并做好正反面标记,在TBST中清洗1分钟,然后用封闭液封闭。
(12)用封闭液将对应的一抗稀释成一定的浓度(1:500),内参一抗的稀释终浓度为1:3000,然后温育1.5小时或4℃孵育过夜。
(13)用TBST清洗3次,每次5分钟。
(14)用封闭液将二抗稀释成一定的浓度(1:3000),然后温育1.5小时。
(15)用TBST清洗4次,每次5分钟。
5.化学发光,显影,定影
(1)将A和B两种试剂在试管内等体积混合,然后加在PVDF膜的正面,温育大概2分钟。
(2)进入暗室,PVDF膜上盖一层保鲜膜,擦去多余的发光剂。将胶片压在保鲜膜上,依照发光的强度选择不同的曝光时间。
(3)将胶片放入显影液中,出现条带后,立即放入定影液中,流水冲洗胶片后晾干。
(4)对胶片进行扫描,然后用UVP凝胶图象处理系统Labworks4.6软件分析目的条带的灰度值。
(5)通过Western-blot对转染后表皮干细胞中CNE10蛋白质表达进行检测,结果如图1所示,表皮干细胞空白对照,蛋白表达没有影响;未导入增效蛋白的gRNA1能够敲除目的基因,蛋白表达有一定影响;而导入增效蛋白的gRNA1具有显著的提高基因敲除效果蛋白抑制率达到94.5%;导入增效蛋白的gRNA2的蛋白表达抑制率达到98.9%,效果极其显著。具有极好的应用前景和应用价值。
最后所应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 洛阳轩智生物科技有限公司
<120> 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行CNE10基因敲除
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2280
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgatatact ttattagaat aatcatgggc cagactggga agaaatctga gaagggacca 60
gtttgttggc ggaagcgtgt aaaatcagag tacatgcgac tgagacagct caagaggttc 120
agacgagctg atgaagtaaa gagtatgttt agttccaatc gtcagaaaat tttggaaaga 180
acggaaatct taaaccaaga atggaaacag cgaaggatac agcctgtgca catcctgact 240
tctgtgagct cattgcgcgg gactagggag tgttcggtga ccagtgactt ggattttcca 300
acacaagtca tcccattaaa gactctgaat gcagttgctt cagtacccat aatgtattct 360
tggtctcccc tacagcagaa ttttatggtg gaagatgaaa ctgttttaca taacattcct 420
tatatgggag atgaagtttt agatcaggat ggtactttca ttgaagaact aataaaaaat 480
tatgatggga aagtacacgg ggatagagaa tgtgggttta taaatgatga aatttttgtg 540
gagttggtga atgcccttgg tcaatataat gatgatgacg atgatgatga tggagacgat 600
cctgaagaaa gagaagaaaa gcagaaagat ctggaggatc accgagatga taaagaaagc 660
cgcccacctc ggaaatttcc ttctgataaa atttttgaag ccatttcctc aatgtttcca 720
gataagggca cagcagaaga actaaaggaa aaatataaag aactcaccga acagcagctc 780
ccaggcgcac ttcctcctga atgtaccccc aacatagatg gaccaaatgc taaatctgtt 840
cagagagagc aaagcttaca ctcctttcat acgcttttct gtaggcgatg ttttaaatat 900
gactgcttcc tacatcgtaa gtgcaattat tcttttcatg caacacccaa cacttataag 960
cggaagaaca cagaaacagc tctagacaac aaaccttgtg gaccacagtg ttaccagcat 1020
ttggagggag caaaggagtt tgctgctgct ctcaccgctg agcggataaa gaccccacca 1080
aaacgtccag gaggccgcag aagaggacgg cttcccaata acagtagcag gcccagcacc 1140
cccaccatta atgtgctgga atcaaaggat acagacagtg atagggaagc agggactgaa 1200
acggggggag agaacaatga taaagaagaa gaagagaaga aagatgaaac ttcgagctcc 1260
tctgaagcaa attctcggtg tcaaacacca ataaagatga agccaaatat tgaacctcct 1320
gagaatgtgg agtggagtgg tgctgaagcc tcaatgttta gagtcctcat tggcacttac 1380
tatgacaatt tctgtgccat tgctaggtta attgggacca aaacatgtag acaggtgtat 1440
gagtttagag tcaaagaatc tagcatcata gctccagctc ccgctgagga tgtggatact 1500
cctccaagga aaaagaagag gaaacaccgg ttgtgggctg cacactgcag aaagatacag 1560
ctgaaaaagg acggctcctc taaccatgtt tacaactatc aaccctgtga tcatccacgg 1620
cagccttgtg acagttcgtg cccttgtgtg atagcacaaa atttttgtga aaagttttgt 1680
caatgtagtt cagagtgtca aaaccgcttt ccgggatgcc gctgcaaagc acagtgcaac 1740
accaagcagt gcccgtgcta cctggctgtc cgagagtgtg accctgacct ctgtcttact 1800
tgtggagccg ctgaccattg ggacagtaaa aatgtgtcct gcaagaactg cagtattcag 1860
cggggctcca aaaagcatct attgctggca ccatctgacg tggcaggctg ggggattttt 1920
atcaaagatc ctgtgcagaa aaatgaattc atctcagaat actgtggaga gattatttct 1980
caagatgaag ctgacagaag agggaaagtg tatgataaat acatgtgcag ctttctgttc 2040
aacttgaaca atgattttgt ggtggatgca acccgcaagg gtaacaaaat tcgttttgca 2100
aatcattcgg taaatccaaa ctgctatgca aaagttatga tggttaacgg tgatcacagg 2160
ataggtattt ttgccaagag agccatccag actggcgaag agctgttttt tgattacaga 2220
tacagccagg ctgatgccct gaagtatgtc ggcatcgaaa gagaaatgga aatcccttga 2280
<210> 2
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Ile Tyr Phe Ile Arg Ile Ile Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met
20 25 30
Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser
35 40 45
Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu
50 55 60
Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr
65 70 75 80
Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp
85 90 95
Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val
100 105 110
Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe
115 120 125
Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp
130 135 140
Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Asp Gly Lys Val His Gly Asp Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp
165 170 175
Glu Ile Phe Val Glu Leu Val Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp
180 185 190
Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp Pro Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln
195 200 205
Lys Asp Leu Glu Asp His Arg Asp Asp Lys Glu Ser Arg Pro Pro Arg
210 215 220
Lys Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe Glu Ala Ile Ser Ser Met Phe Pro
225 230 235 240
Asp Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Thr
245 250 255
Glu Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu Pro Pro Glu Cys Thr Pro Asn Ile
260 265 270
Asp Gly Pro Asn Ala Lys Ser Val Gln Arg Glu Gln Ser Leu His Ser
275 280 285
Phe His Thr Leu Phe Cys Arg Arg Cys Phe Lys Tyr Asp Cys Phe Leu
290 295 300
His Arg Lys Cys Asn Tyr Ser Phe His Ala Thr Pro Asn Thr Tyr Lys
305 310 315 320
Arg Lys Asn Thr Glu Thr Ala Leu Asp Asn Lys Pro Cys Gly Pro Gln
325 330 335
Cys Tyr Gln His Leu Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Ala Ala Leu Thr
340 345 350
Ala Glu Arg Ile Lys Thr Pro Pro Lys Arg Pro Gly Gly Arg Arg Arg
355 360 365
Gly Arg Leu Pro Asn Asn Ser Ser Arg Pro Ser Thr Pro Thr Ile Asn
370 375 380
Val Leu Glu Ser Lys Asp Thr Asp Ser Asp Arg Glu Ala Gly Thr Glu
385 390 395 400
Thr Gly Gly Glu Asn Asn Asp Lys Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Glu
405 410 415
Thr Ser Ser Ser Ser Glu Ala Asn Ser Arg Cys Gln Thr Pro Ile Lys
420 425 430
Met Lys Pro Asn Ile Glu Pro Pro Glu Asn Val Glu Trp Ser Gly Ala
435 440 445
Glu Ala Ser Met Phe Arg Val Leu Ile Gly Thr Tyr Tyr Asp Asn Phe
450 455 460
Cys Ala Ile Ala Arg Leu Ile Gly Thr Lys Thr Cys Arg Gln Val Tyr
465 470 475 480
Glu Phe Arg Val Lys Glu Ser Ser Ile Ile Ala Pro Ala Pro Ala Glu
485 490 495
Asp Val Asp Thr Pro Pro Arg Lys Lys Lys Arg Lys His Arg Leu Trp
500 505 510
Ala Ala His Cys Arg Lys Ile Gln Leu Lys Lys Asp Gly Ser Ser Asn
515 520 525
His Val Tyr Asn Tyr Gln Pro Cys Asp His Pro Arg Gln Pro Cys Asp
530 535 540
Ser Ser Cys Pro Cys Val Ile Ala Gln Asn Phe Cys Glu Lys Phe Cys
545 550 555 560
Gln Cys Ser Ser Glu Cys Gln Asn Arg Phe Pro Gly Cys Arg Cys Lys
565 570 575
Ala Gln Cys Asn Thr Lys Gln Cys Pro Cys Tyr Leu Ala Val Arg Glu
580 585 590
Cys Asp Pro Asp Leu Cys Leu Thr Cys Gly Ala Ala Asp His Trp Asp
595 600 605
Ser Lys Asn Val Ser Cys Lys Asn Cys Ser Ile Gln Arg Gly Ser Lys
610 615 620
Lys His Leu Leu Leu Ala Pro Ser Asp Val Ala Gly Trp Gly Ile Phe
625 630 635 640
Ile Lys Asp Pro Val Gln Lys Asn Glu Phe Ile Ser Glu Tyr Cys Gly
645 650 655
Glu Ile Ile Ser Gln Asp Glu Ala Asp Arg Arg Gly Lys Val Tyr Asp
660 665 670
Lys Tyr Met Cys Ser Phe Leu Phe Asn Leu Asn Asn Asp Phe Val Val
675 680 685
Asp Ala Thr Arg Lys Gly Asn Lys Ile Arg Phe Ala Asn His Ser Val
690 695 700
Asn Pro Asn Cys Tyr Ala Lys Val Met Met Val Asn Gly Asp His Arg
705 710 715 720
Ile Gly Ile Phe Ala Lys Arg Ala Ile Gln Thr Gly Glu Glu Leu Phe
725 730 735
Phe Asp Tyr Arg Tyr Ser Gln Ala Asp Ala Leu Lys Tyr Val Gly Ile
740 745 750
Glu Arg Glu Met Glu Ile Pro
755
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gacgtcggat tccagcctcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
ccagcgcctg gggctctccg 20