CN105218659A

CN105218659A - 人骨形成蛋白2成熟肽及其表达

Info

Publication number: CN105218659A
Application number: CN201510731405.7A
Authority: CN
Inventors: 筴文奎
Original assignee: 筴文奎
Current assignee: Zhuhai shenhongxin Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2035-11-03
Also published as: CN105218659B

Abstract

本发明提供了人骨形成蛋白2，其为成熟肽，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示或是在SEQ？ID？NO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。本发明还提供了包含该人骨形成蛋白2的药物组合物，用于促骨分化钙化。

Description

人骨形成蛋白2成熟肽及其表达

技术领域

本发明属于蛋白质或多肽技术领域，具体而言，本发明涉及人骨形成蛋白2(尤其是重组产生的，简称为rhBMP2)及其药物和促骨分化钙化应用等。

背景技术

骨形成蛋白(BMP)，又称人骨形态发生蛋白，除人骨形成蛋白1(BMP1)之外，其余均属于转化生长因子-β超家族，其中研究得较多的是人骨形成蛋白2(BMP2)，例如，中国专利申请第98113048号公开了用于治疗造血功能障碍和损伤的可溶性重组人骨形成蛋白2，其中的BMP2是野生型蛋白；中国专利申请第200610032800号公开了一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法，其中的BMP2也是野生型蛋白；中国专利申请第201410310953号公开了一种重组人骨形态发生蛋白-2截短体及其优化表达方法，其中获得的蛋白共有115个氨基酸残基；中国专利申请第200910045832号也公开了一种重组人骨形成蛋白-2截短体及其优化表达方法，其中获得的蛋白共有114个氨基酸残基，其产量最高在10mg/L左右。

然而，除了本发明人之外，再也没有人继续研究更为截短的BMP2了。本发明人没有受现有技术趋势的影响，数十年致力于BMP2(尤其是rhBMP2)的开发研究，在截短的极限下，又十分令人意外地研发出一种新的人骨形成蛋白2，其促骨分化钙化的能力提高，从而具有更好的骨形成活性/疗效，更具有实际药用推广前景。另外，本发明人还研发了一种新的人骨形成蛋白2的编码基因，其跳出了现有的密码子优化的框架，获得了全新的编码基因，能够在大肠杆菌中大幅提高表达量，非常适合基因工程的产业化生产。

发明内容

本发明的要解决的技术问题在于提供新的人骨形成蛋白2及其药物和促骨分化钙化应用等。另外，本发明还提供了人骨形成蛋白2的基因工程制备方法及其多核苷酸等。

具体而言，在第一个方面，本发明提供了人骨形成蛋白2，其氨基酸序列

(1)如SEQIDNO：2所示；或

(2)是在SEQIDNO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的，而且其促骨细胞分化钙化的能力提高。

本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2的氨基酸序列可以是在SEQIDNO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个(优选一个至五个，更优选一个至三个)氨基酸残基而得的氨基酸序列。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。在本发明的具体实施方式中，人骨形成蛋白2的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示或者在其N端增加一个甲硫氨酸(M)残基，其经国家权威部门鉴定，符合规定。

优选本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2相对于其他的截短的BMP2的促骨分化钙化提高。其中，其他的截短的BMP2包括中国专利申请第201410310953号和中国专利申请第200910045832号的BMP2。优选本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2的促骨分化钙化效果较中国专利申请第201410310953号和中国专利申请第200910045832号的BMP2有提升。

在第二个方面，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2。本发明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以获得编码本发明的第一个方面的多肽的核酸分子或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过培养宿主细胞进行增殖。优选本发明的多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。该优选序列没有受常规表达优化密码子的限制，优化了在大肠杆菌中的表达，表达效果有更大幅提升。

在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二个方面所述的多核苷酸。本文中的载体包括表达载体，例如，细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His，Leu，Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。本发明的载体优选为原核载体，更优选是大肠杆菌表达载体。

在第四个方面，本发明提供了细胞，其含有本发明第二个方面所述的多核苷酸。该细胞可以用本发明第三个方面所述的载体转化或转染而获得。细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。合适的转化或转染方法包括但不限于：用于细菌细胞，如氯化钙法、电穿孔法；用于酵母细胞，如电穿孔法和原生质体融合法；用于哺乳动物细胞等，如质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法。优选本发明的细胞是大肠杆菌细胞。

在第五个方面，本发明提供了制备本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2的方法，其包括在适合蛋白质表达的条件下培养本发明第四个方面所述的细胞，然后从培养物中分离出本发明的第一个方面的多肽。分离的方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱(又称为分子尺寸排阻色谱)，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，等电聚焦以及变性/复性处理等。

在第六个方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2和药学上可接受的载体。本文中所用的“药物组合物”和“药物”，可以互换使用，如不特别指明，指的均是人用的药物组合物和药物。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。本领域的技术人员可以根据治疗目的、给药途径(如注射或口服)的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如冻干剂、片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂或喷雾剂，更优选该药物组合物为注射制剂，如冻干剂或注射液。优选的药学上可接受的载体可以是生理盐水。该药物组合物可以用于促骨分化钙化。

在第七个方面，本发明提供了本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2在制备促骨细胞分化钙化的药物中的应用。该应用可以是本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2单独在制备药物中的应用，也可以是联合其他促骨细胞分化钙化活性成分在制备药物中的应用。另外其中，促骨细胞分化钙化的活性/疗效可以相对于中国专利申请第201410310953号和中国专利申请第200910045832号的BMP2的促骨细胞分化钙化性/疗效提高。在本发明的具体实施方式中，骨细胞是骨髓基质细胞。

本发明取得的有益效果在于：没有受现有技术的BMP2研究的截短极限的影响，开发出新的rhBMP2，其促骨细胞分化钙化活性/疗效提高，更适合实际的推广药用；其跳出了现有的密码子优化的框架，获得了全新的优化编码基因，能够在大肠杆菌中大幅提高表达量，非常适合基因工程的产业化生产。

为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。

以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

具体实施方式

以下实施例将具体描述本发明，其中如有未详尽之处，可参见《分子克隆实验指南》、《细胞实验指南》等实验手册所述的方法进行，或者根据实验中具体用到的试剂、仪器的厂商所提供的说明书或手册来进行。

实施例1本发明的rhBMP2的表达

本发明人发现了氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的rhBMP2，并且精心设计了其表达优化的编码基因(核苷酸如SEQIDNO：1所示)在大肠杆菌中表达制备。简而言之，委托上海捷瑞生物技术有限公司人工合成该基因，然后连接入pEVT载体(NewEnglandBiolabs公司)的EcoRI和HindIII的酶切位点之间，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，于含氨苄青霉素50mg/L的LB平板上筛选，筛选阳性的菌中包含的表达载体被命名为pEVT-hBMP2，抽提质粒，测序鉴定正确。

取阳性菌接种于5mLLB培养基中，以30℃、200r/min培养12h，然后以按2％(V/V)接种量接种于400mLLB培养基中，以30℃、200r/min培养8h。然后进行发酵，将上述培养的400mL发酵种子菌接种入8L发酵培养基(每升含：蛋白胨5g，甘油5mL，十二水磷酸氢二钠6g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铵1.5g，氯化铵1g，七水合硫酸镁0.25g，氯化钙0.02g，硫酸亚铁0.04g，甘氨酸0.5g，pH7.0)中，利用NBSBiofloIV20L发酵罐进行发酵，发酵全过程共20h，期间pH始终控制在7.0～7.2；溶解氧控制在40％(空气流量设定为12L/min，搅拌速度为200r/mim～1000r/min)；当细菌密度OD₆₀₀达到20时，加入0.35mM的IPTG进行诱导表达；在未加入IPTG前，当以最低搅拌速度搅拌，溶解氧仍旧在在3min内持续达到60％或以上，则补加补料培养基(每升含：甘油120mL，蛋白胨50g，酵母抽提物50g，七水合硫酸镁2g，pH7.0)直至溶解氧恢复到40％；在加入IPTG后，当以最低搅拌速度搅拌，溶解氧仍旧在在3min内持续达到50％或以上，则补加上述补料培养基直至溶解氧恢复到40％。取样溶菌后用15％SDS-PAGE检测，在14kDa有大量表达。

离心收集菌体后，每10g湿重菌体加入8摩尔/升的尿素150mL变性溶解，在冰浴下，搅拌裂解8小时，取上清液，采用反相层析纯化(分离介质：SOURCE30RPC，在pH8.5，6M尿素条件下，以0～40％异丙醇梯度洗脱纯化)，再用阴离子柱离子层析纯化(分离介质：SOURCE30Q，在pH8.5，8M尿素条件下，以0～1mol/L氯化钠梯度洗脱纯化)，以SDS-PAGE检测收集纯化所得的相应峰，然后加入复性液(含：2摩尔/升尿素，0.1％(V/V)TritonX100，1mM还原型谷胱苷肽，1克/升聚乙二醇4000，和5％(V/V)甘油，pH8.5)中复性24h，再用阴离子交换层析纯化(分离介质：SOURCE30Q，在pH8.5，1.5M尿素条件下，以0～1mol/L氯化钠梯度洗脱，再用分子排阻层析纯化(分离介质：Sephacryls100，在pH7.5，0.15mol/L氯化钠的条件下洗脱纯化，以SDS-PAGE检测收集纯化所得的相应峰，可得到纯度达到95％以上的本发明的rhBMP2，各批次产量为359～378mg/L。

另外，将基于大肠杆菌密码子使用率的常规优化方式获得的编码本发明的rhBMP2的编码基因(核苷酸如SEQIDNO：3所示)，参照以上方法进行构建、本发明的rhBMP2原液表达和纯化得到(纯度SEC-HPLC％)≥95％，经中国药品生物制品检定所检定，符合规定，N-末端氨基酸序列结果符合规定。

实施例2本发明的rhBMP2的促骨形成实验

采用本发明的rhBMP2以及中国专利申请第201410310953号和中国专利申请第200910045832号的BMP2进行促骨分化钙化试验。具体而言，取SD大鼠1只(雄性)的骨髓液，加入含200ml/L胎牛血清、100U/ml青霉素和100Lg/ml链霉素的DMEM培养液中，以37℃、50ml/L二氧化碳进行细胞培养，每隔3天换培养液，至骨髓基质细胞融合80％时，用2.5g/L胰蛋白酶消化，按1：2比例传代培养。取传代至第4代的骨髓基质细胞，以10⁴/孔的量接种到96孔板上，24小时后弃去培养液，然后随机分成4组(在同一96孔板上有全部各组，共三块96孔板)，每孔加入含200ug/L的不同BMP2的DMEM培养液(对照组不含BMP2)，每隔3天换培养液，分别在培养10、20和30天各取出一块96孔板进行Vonkossa染色，检测其灰度值来表明分化钙化程度。

结果如表1所示。结果表明，本发明的rhBMP2以及中国专利申请第201410310953号和中国专利申请第200910045832号的BMP2都相对于对照组能促骨分化钙化，从而相对于对照组，更大幅地降低Vonkossa染色的灰度值。其中，本发明的rhBMP2的效果最好，最具有药用前景；尤其是配合实施例1的优化编码基因，非常适合基因工程的产业化生产。

表1大鼠骨髓基质细胞分化钙化的Vonkossa染色灰度值

Claims

1.人骨形成蛋白2，其氨基酸序列

(1)如SEQIDNO：2所示；或

2.权利要求1所述的人骨形成蛋白2，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

3.多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的人骨形成蛋白2。

4.权利要求3所述的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

5.载体，其包含权利要求3或4所述的多核苷酸。

6.细胞，其包含权利要求3或4所述的多核苷酸。

7.制备权利要求1或2所述的人骨形成蛋白2的方法，其包括在适合蛋白质表达的条件下培养权利要求6所述的细胞，然后从培养物中分离出权利要求1或2所述的人骨形成蛋白2。

8.药物组合物，其包括权利要求1或2所述的人骨形成蛋白2和药学上可接受的载体。

9.权利要求1或2所述的人骨形成蛋白2在制备促骨细胞分化钙化的药物中的应用。

10.权利要求9所述的应用，其中骨细胞是骨髓基质细胞。