CN101134963A - 重组人甲状旁腺素(1~34肽)的串联表达方法 - Google Patents
重组人甲状旁腺素(1~34肽)的串联表达方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种重组人甲状旁腺素的核苷酸序列,通过串连表达高效生产重组人甲状旁腺素的生产方法,以及有关的工程细胞构建、表达和纯化的工艺。优化后的重组人甲状旁腺素蛋白基因,非常适合在原核细胞进行串连表达,同时通过发酵与纯化工艺优化,提高了表达量,具有高表达、高稳定的优点。本发明可高效、简便、低成本的获得重组人甲状旁腺素纯品。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域。更具体地,本发明提供了一种高效生产重组人甲状旁腺素(1~34)肽的方法,包括有关的串联体的获得、工程菌的构建、重组人甲状旁腺素(1~34)肽串联体的表达和相应的纯化工艺。
背景技术
1925年,Collip从牛甲状旁腺组织中分离到甲状旁腺激素,但提取产物不稳定,活性组分不单一,之后Aurbach(1959)用酚抽提获得了均一稳定的产物直到1974年Henry等用酚、三氯乙酸及柱层析才获得纯度很高的产物,并使之用于生物学功能及化学结构方面的研究。
人甲状旁腺素(human parathyroid hormone,PTH)是一种直链多肽激素,由84个氨基酸组成,N端1~34肽段具有完整的生物学功能。
钙在体内对维持肌肉收缩、细胞膜特性、酶活性、骨组织的成熟等方面发挥着重要作用;磷则是遗传物质和细胞膜的重要组分,同时在代谢过程中成为能量转换的媒介。维持钙和磷在体内的相对平衡对机体是十分重要的。甲状旁腺素就是在人体内起调节钙、磷代谢,使血液中钙磷浓度相对稳定的一种因子。甲状旁腺素属多肽激素,由一条多肽链组成,分子中不含半胱氨酸和酪氨酸,分子量为9425,等电点为9.58,含84个氨基酸残基。人血浆中PTH有三种存在形式,除了完整的激素外,还包括分子量约7000和4500两种降解产物。
hPTH通过对肾和骨的作用成为体内最重要的钙磷代谢平衡的调节因子。PTH直接作用于骨,可使Ca2+释放,血Ca2+浓度升高。能促进成骨细胞的消失和破骨细胞的增殖。PTH还作用于肾脏的近球小管,抑制磷的重吸收,增加尿磷的排出,促进肾小管上皮细胞对Ca2+的重吸收,使血Ca2+浓度升高,临床上如果PTH分泌速度过快,就会导致持续的不正常的激素浓度。骨的重吸收代替了骨的形成,导致病理上的甲旁亢。如果PTH的活性片段在较低或中等剂量的浓度下长时间作用于骨,就会刺激骨的形成并且通过诱导骨中的合成作用而有效地治疗骨质疏松症。反之,在甲状旁腺机能减退或缺损时,就会引起肌肉痉挛和手足抽搐。PTH主要是和肾、骨组织中的受体相结合而调节细胞外钙磷的浓度。最初的步骤至少是通过激素受体复合物对于腺苷酸环化酶信号系统的激活,通过增加cAMP的浓度而发挥效应。PTH还通过肾中25-羟-维生素D3转化为活性形式的1,25-二羟-维生素D3的间接作用而保持钙浓度的平衡和骨的形成。PTH还有舒张主动脉,减少外周血管阻力,降低血压,增加输出量的作用。这可能由于影响了细胞膜钙通道Ca2+/ATP酶泵活动,减少了钙的跨膜内流。另外PTH还通过促进心肌细胞穿膜钙内流而对心脏产生作用。因此PTH在生物学及医学方面都受到人们的关注。
随着甲状旁腺激素的发现,人们一直在努力试图大量获得,用于结构功能的研究和骨、肌肉疾病的治疗。起初是从人、猪、牛甲状旁腺组织提取,这种方法提取效率及产量很低。据资料记载。从欧洲及北美许多医院手术切除积累的50g甲状旁腺肿瘤组织中才能获得3.2mg甲状旁腺激素。生物工程技术的兴起及发展使得生物大分子的体外表达成为可能。PTH基因序列的阐明也为建立体外高效表达体系的研究奠定了基础。Born等(1987)将preproPTH基因导人到大肠杆菌中进行了表达,发现prepro序列不能提高PTH的分泌表达,可能是由于原核生物对真核生物的prepro序列不能识别。随后,Born等将目光转向酵母,然而天然蛋白质在酵母细胞中表达很不稳定,另外一个问题是酵母细胞不易破碎。因此,preproPTH基因在酵母中表达产量较大肠杆菌体系没有明显的提高。Rabbani等(1988)将人工合成的PTH基因在大肠杆菌中表达,产物不均一,包括了PTH(8-84),PTH(3-84),fMet-PTH和完整PTH。为了提高目标产物的稳定性,人们想到用融合蛋白形式。Hogset等(1990)采用金黄色葡萄球菌蛋白A的启动子和信号肚序列在大肠杆菌中表达PTH,产物分泌到培养基中,分离纯化方法简单迅速。酵母б因子表达系统也是比较理想的融合蛋白表达体系,即用外源基因代替α因子的编码序列,外源蛋白会与α因子引导肽形成融合蛋白。在一系列与膜相关的蛋白运输和分泌过程中,融合蛋白在KEX2基因产物类胰蛋白酶和STE13基因产物二肽氨肽酶作用下生成具有正确高级结构的外源蛋白。这些外源蛋白或直接分泌到培养基中或在细胞周质空间积累。采用α因子表达系统在啤酒酵母中表达PTH,也出现产物不均一现象,除了完整PTH,还有两个不同的糖基化形式。
尽管人们采用不同的表达体系以提高PTH的表达量,但由于其分子内无二硫键,本身不稳定,以及mRNA的不稳定,PTH的表达量都比较低。Sung等(1991)改造了PTH基因的核苷酸组成,利用简并密码使PTH(1~5)区域富含腺嘌呤,使表达产量有很大提高。Paulsen等(1995)用生物反应器培养细菌,以β-半乳糖苷酶-hPTH融合蛋白方式表达产生hPTH,并建立了大规模纯化方法,这是hPTH大规模生产方面取得较大的进展。
迄今hPTH的研究已深人展开,有关hPTH的结构与功能、体外表达、激素与受体的相互作用及hPTH信号传导过程的研究都正在进行中,并可望具有理论研究价值和临床应用价值。
因此,迫切需要开发新的高效生产重组hPTH的方法,由于商用人甲状旁腺素(hPTH)只有34个氨基酸,分子量太小,同时为了提高最终产物的得率,本发明通过对hPTH基因的优化,将多个PTH基因串联在一起进行表达,并考虑到后续的纯化工艺,在每个单体前5’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BglII酶切位点,在其3’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BamHI酶切位点。将获得的PTH串连体,与硫氧还蛋白融合表达载体进行体外连接,获得高水平的表达菌株;通过控制发酵条件,达到了较高融合蛋白表达率;在此基础上对可溶表达的rhPTH串联体的纯化进行了大量的摸索和研究后,得到了高纯度、高得率、可供动物实验的rhPTH蛋白。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组人甲状旁腺素(1~34肽)的方法。
本发明的另一目的就是提供优化的重组人甲状旁腺素(1~34肽)的编码序列和PTH串联体的获得,以及用于该方法的表达载体及工程菌株。
在本发明的第一方面,就是提供了一种优化的编码重组人甲状旁腺素(1~34肽)的核苷酸序列,其特征在于,所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有95%的同源性。
在另一优选例中,所述的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示核苷酸序列。
在本发明的第二方面,就是提供了一种获得串联体方案,通过该方案获得了由多个优化的编码重组人甲状旁腺素(1~34肽)串联的核苷酸序列。
在本发明的第三方面,提供了一种表达载体,含有权利要求2所述的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述的表达载体是pThioHisA/PTH串联,该载体提供了一个融合蛋白-硫氧还蛋白(HP-Thioredoxin)。
在本发明的第四方面,提供了一种工程细胞,其特征在于,含有权利要求2所述的表达载体。
在另一优选例中,所述的工程细胞是大肠杆菌BL21(DE3),是多个蛋白酶的基因缺陷菌株,基因型为hsdSgal(λcIts857 indlSam7nim51acUV5-T7基因),非常适合外源基因的高效表达。
在本发明的第四方面,提供了一种生产重组人甲状旁腺素(1~34肽)的方法,该方法包括步骤:
a)在适合的表达条件下,培养如权利要求4所述的宿主细胞,从而表达出人甲状旁腺素(1~34肽)蛋白;较佳地,所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞BL21(DE3)。
b)分离纯化出表达的人甲状旁腺素(1~34肽)蛋白。
在本发明的另一优选例中,所述的步骤(a)的培养条件包括:
培养分为培养阶段和诱导阶段,培养阶段培养菌液浓度达到OD600为5.0左右,诱导时间为3~4hr,发酵及诱导温度保持在37℃,微量元素的量为0.1-2ml/L,诱导期的pH值为7.0,诱导期IPTG浓度在0.1-1mg/L。
在本发明的另一优选例中,诱导过程还可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白胨(peptone)、奶粉、精氨酸等作为保护剂。
在本发明的另一优选例中,所述的步骤(b)包括步骤:
v)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清,获得发酵后菌体;
vi)对发酵沉淀进行压榨破菌、收集压榨上清;
vii)层析纯化,所述的层析选自:阴离子交换层析、金属螯和亲和层析、阳离子交换层析及其组合。
viii)采用肠激酶EK酶切后,经进一步纯化获得串联体蛋白。
ix)串联体经羧肽酶B、Kex2酶切后获得PTH(1~34)单体蛋白。
在本发明的另一优选例中,压榨上清经Q-Sepharose F.F.层析、Ni螯和亲和层析、SP-Sepharose F.F.层析、EK酶切、SP-Sepharose F.F.层析、羧肽酶B、Kex2酶切后获得PTH(1~34)单体蛋白。进一步纯化以后得到纯度大于98%、得率在20%以上的纯品。
附图说明
图1.hPTH(1~34肽)理论序列与hPTH(1~34肽)优化序列的同源性比较。Query:天然hPTH(1~34肽)基因序列;Sbjct:优化的hPTH(1~34肽)基因序列。
图2.获得PTH(1~34)串联体方案
图3.pThioHisA/PTH串联表达质粒的构建路线图。
具体实施方式
本发明人通过深入而广泛的研究,通过优化设计人甲状旁腺素(1~34肽)基因编码序列,并考虑到目的基因编码后的目的蛋白分子量较小,将优化后的人甲状旁腺素(1~34肽)编码序列串联一起后构建入合适表达载体,转化宿主细胞,获得高表达菌株,并通过优化发酵、纯化、酶切工艺,实现了人甲状旁腺素(1~34肽)融合蛋白高效表达,并且表达出的人甲状旁腺素(1~34肽)保持生物学活性。在此基础上完成了本发明。
本发明根据人甲状旁腺素(1~34肽)天然氨基酸序列,按密码子偏爱性,在不改变氨基酸序列的条件下,优化其核苷酸序列,全基因合成经优化的重组人甲状旁腺素(1~34肽)蛋白的目的基因序列,将该基因克隆到pThiHisA中测序验证后,将多个PTH基因串联在一起,并考虑到后续的纯化工艺,在每个单体前5’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BglII酶切位点,在其3’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BamHI酶切位点。将获得的PTH串连体,与硫氧还蛋白融合表达载体进行体外连接,转入大肠杆菌,通过施加抗生素筛选出表达工程细胞。试管筛选获得高表达工程细胞。摇瓶试验表明,诱导4小时后,目的蛋白占总蛋白30%以上,表达水平150mg/L以上。
在获得工程细胞后,便可在适合的条件下培养工程。在本发明中,工程菌表达重组人甲状旁腺素(1~34肽)的发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。例如,合适的培养基包括(但不限于)以下组成:
(i)氮源含有机氮源和无机氮源,其中有机氮源如蛋白胨、酵母提取粉,或二者的混合物,总浓度0.5-1%;无机氮源如氨水或(NH4)2SO4等铵盐,浓度0.35-25%。
(ii)无机盐包括磷酸盐、Ca2+盐、Mg2+盐等。较佳地,磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM,pH5-8;Mg2+盐0-5mM。
(iii)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素,浓度1~1000PPM。
(iv)根据M9培养基中的微量元素配方,微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源为葡萄糖,是单一碳源。较佳地,葡萄糖浓度为1.0%,补料中葡萄糖浓度为11.25%。
为大规模获得重组人甲状旁腺素(1~34肽),需要在发酵罐中进行表达培养。本发明研究了中试发酵工艺,优化后的表达水平达到500mg/L。
在发酵表达后,对表达的重组人甲状旁腺素(1~34肽)蛋白进行分离。通常,发酵样品先离心获得发酵液后沉淀即菌体。然后压榨破菌经离心获得压榨上清,后经Q-Sepharose F.F.层析、Ni2+螯和亲和层析、SP-sepharose F.F.层析、EK酶切、SP-Sepharose F.F.层析进一步纯化、羧肽酶B和Kex2酶切后获得PTH(1~34)单体蛋白。
经不同层析过程比较,优化的纯化方法包括:
1.对发酵样品进行离心获得发酵后沉淀;
2.通过压榨获得压榨上清后经Q Sepharose F.F.层析、Ni2+螯和亲和层析、SP-sepharose F.F.层析、EK酶切、SP-Sepharose F.F.层析进一步纯化,羧肽酶B和Kex2酶切后获得的纯品纯度98%以上,得率约120mg/L发酵液。
纯品的活性按细胞病变抑制法进行测定,结晶紫染色,用酶标仪测定OD570值,最后以国际标淮品校正活性单位。生物活性检测目的蛋白比活性达2.5×106U/mg。
纯化后重组人甲状旁腺素(1~34肽)可用常规技术制成各种剂型。
在本发明的一个实例中,构建了生产重组人甲状旁腺素(1~34肽)串联蛋白的大肠杆菌表达工程细胞,IPTG诱导,高水平可溶表达。
在本发明的另一个实例中,经过发酵工艺的优化,进一步提高了重组人甲状旁腺素(1~34肽)的表达量。
在本发明的另一个实例中,由于蛋白可溶表达,菌体经压榨、离心获得压榨上清,再经一系列纯化步骤后可得到纯品120mg/L。
纯化后原液加入适当辅料,制成重组人甲状旁腺素(1~34肽)的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明,该粉针剂稳定。
中试研究表明,产品制造工艺稳定,操作简单,周期短,成本低,每升发酵液可获得重组人甲状旁腺素(1~34肽)纯品120mg,适合产业化生产。
本发明的优点在于:
(1)优化后的重组人甲状旁腺素(1~34肽)蛋白基因非常适合在大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中表达,具有高表达、高稳定的特点,而且以可溶形式表达。
(2)将优化后获得的PTH单体串联一起表达,串联体其5’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BglII酶切位点,在其3’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BamHI酶切位点,可方便地对串联表达后得到的蛋白进行酶切获得PTH单体。
(3)通过控制关键的发酵工艺条件,使表达水平达到500mg/L。
(4)由于蛋白是以可溶形式表达,确定了较佳的工艺路线,使可溶的目的蛋白能够折叠成结构正确的天然形式,经纯化能得到高纯度的PTH蛋白,每升发酵罐培养液可获得120毫克以上、纯度大于98%重组人甲状旁腺素(1~34肽)。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得
根据人甲状旁腺素(1~34肽)天然氨基酸序列,按密码子偏爱性,在不改变氨基酸序列的条件下,全基因合成重组人甲状旁腺素(1~34肽)蛋白的目的基因序列(SEQ ID NO:1),该优化的PTH基因序列与天然的PTH基因序列同源性为85%(见图1)。将该基因克隆到pThiHisA中并测序验证。
表达载体构建方法见图2。在每个单体基因前5’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BglII酶切位点,在其3’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BamHI酶切位点。通过PCR扩增得到目的人甲状旁腺素(1~34肽)基因,PCR产物经BglII、BamHI双酶切后,回收目的片断;在合适的条件下,通过BglII+BamHI位点连接入表达载体,获得载体/PTH1,BglII+BamHI双酶切载体/PTH1,获得PTH1-BglII-BamHI,将PTH1-BglII-BamHI连接入经过BamHI和碱性磷酸酶处理后获得的载体/PTH1载体片段,获得载体/PTH2,再以同样的方法获得载体/PTH2,如此循环,可以获得含有编码串联蛋白基因的表达载体。该重组质粒命名为pET30a(+)/PTH-fusion。
以重组质粒pET30a(+)/PTH-fusion为模板进行PCR,将PCR产物和质粒载体pThioHisA用BamHI和EcoR I分别进行双酶切后分别回收相应片段,用T4DNA聚合酶连接后转化DH5α,在氨苄抗性平板上挑取阳性单克隆,提质粒进行酶切或PCR鉴定,并测序验证。
将构建正确的表达质粒pThioHis/PTH-fusion转化感受态细胞BL21(DE3),从平板上随机挑取单克隆进行小摇表达筛选,获得PTH-fusion表达的菌株。实施例2重组人甲状旁腺素(1~34肽)的表达及表达形式的确定
挑选一株确证好的表达工程菌BL21(DE3)/pThiHisA/PTH-fusion,用LB培养基进行培养及用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测是否有目的条带的出现,并分析其表达量。取一部分发酵后的菌液离心,重悬于pH7.4,20mM PB,+2.5mM EDTA缓冲液,在冰浴下超声破菌,离心收集超声上清和超声沉淀,SDS-PAGE电泳检测,确定其表达形式。分析其超声上清和超声沉淀,目的蛋白绝大部分在超声上清中,表明目的蛋白是以可溶形式表达。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海新生源医药研究有限公司
上海新生源生物医药有限公司
<120>重组人甲状旁腺素(1~34肽)的生产方法
<160>2
<210>1
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<222>(1)..(105)
<223>优化的重组人甲状旁腺素(1~34肽)基因
<400>1
tctgttagtg aaatccagct gatgcacaat ctgggtaaac acctgaactc catggaaagg 60
gttgaatggc tgcgtaagaa actgcaggac gttcacaact tctaa 105
<210>2
<211>34
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu
1 5 10 15
Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp
20 25 30
Val His Asn Phe
34
Claims (9)
1.一种编码重组人甲状旁腺素(1~34肽)的DNA序列,其特征在于,其编码如SEQID NO:2所示的氨基酸序列,其与SEQ ID NO:1所示的DNA序列有95%的同源性。
2.一种含有编码串联蛋白基因的表达载体的制备方法,其特征在于,它包括步骤:
a.在每个单体基因前5’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BglII酶切位点,在其3’端引入一个Lys(K)、Arg(R)和BamHI酶切位点。
b.通过PCR扩增得到目的人甲状旁腺素(1~34肽)基因,PCR产物经BglII、BamHI双酶切后,回收目的片断;
c.在合适的条件下,通过BglII+BamHI位点连接入表达载体,获得载体/PTH1,BglII+BamHI双酶切载体/PTH1,获得PTH1-BglII-BamHI,将PTH1-BglII-BamHI连接入经过BamHI和碱性磷酸酶处理后获得的载体/PTH1载体片段,获得载体/PTH2,再以同样的方法获得载体/PTH2,如此循环,可以获得含有编码串联蛋白基因的表达载体。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(a)中所述的单体基因是核苷酸序列。较佳地,所述的单体基因是如权利要求1所述的核苷酸序列。
4.一种表达载体,其特征在于,它含有权利要求2所述的DNA序列。较佳地,所述的表达载体是pThioHisA/PTH-fusion。
5.一种宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求4所述的表达载体或权利要求2所述的编码串联重组人甲状旁腺素(1~34肽)的DNA序列。
6.一种生产重组人甲状旁腺素(1~34肽)的方法,其特征在于,它包括步骤:
a)在适合的表达条件下,培养如权利要求5所述的宿主细胞,从而表达出重组人甲状旁腺素(1~34肽)串联蛋白;
b)分离纯化出表达的人甲状旁腺素(1~34肽)蛋白。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(a)中所述的宿主细胞是大肠杆菌。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,在步骤(a)中进行高密度悬浮培养。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的步骤(b)包括步骤:
i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清,获得发酵后菌体;
ii)对发酵沉淀进行压榨破菌、收集压榨上清;
iii)层析纯化,所述的层析选自:阴离子交换层析、金属螯和亲和层析、阳离子交换层析及其组合。
iv)采用肠激酶EK酶切后,经进一步纯化及羧肽酶B和Kex2酶切后获得目的蛋白。对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清,获得发酵后菌体;
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20080305 |
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