CN101003806A - 利用植物油体表达人金属硫蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用植物油体表达人金属硫蛋白(MT)的方法。本发明方法按照植物密码子的偏好性设计合成了人金属硫蛋白基因，将所述人金属硫蛋白基因与油体蛋白基因融合，构建了含有该融合基因的表达载体，将该表达载体进一步转化受体植物，得到转化植株，该转化植株的种子可以高效表达人金属硫蛋白。活性测定实验证实提纯得到的重组MT蛋白具有与人源MT蛋白的生物活性相当。本发明利用植物生物反应器来生产MT，避免了动物病原体及大肠杆菌内毒素的可能产生的侵害，同时可以大大简化目的蛋白的分离纯化过程，降低生产成本，有利于人MT的产业化。

Description

利用植物油体表达人金属硫蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种金属硫蛋白(Metallothionein，MT)及其在植物油体中表达的方法，具体地说涉及利用植物油体蛋白-目的蛋白组成融合蛋白基因表达体系生产金属硫蛋白的方法。

背景技术

金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类低分子质量(2～7kD)、富含半胱氨酸(20％～30％)、能结合重金属并能被金属诱导产生的金属结合蛋白。这个蛋白的名称来源于其所含的极高量金属和巯基。自从1957年Margoshes和Valee等在马肾皮质中首次分离出金属硫蛋白以来，随后的研究发现MT广泛存在于动植物和微生物的组织中，例如在其它哺乳动物、植物、真菌、蓝细菌、鱼类、原生动物中等。典型的MT具有如下特点：

1)低分子量，一般只有60～80个氨基酸残基；

2)高金属含量，一般每分子MT含7～12个金属离子，且由金属配位键结合；

3)高半胱氨酸含量，可高达23％～33％(摩尔百分比)，不含二硫键，不含芳香族氨基酸及组氨酸或含量极低；

4)独特的氨基酸序列，具有保守的Cys位置，有大量Cys-X-Cys及Cys-X-X-Cys(X表示除了半胱氨酸以外的其它氨基酸残基)序列的存在；

5)存在着独特的金属-硫四面体的络合结构，故具有特征吸收光谱；

6)具有两个金属-SH簇状结构，即两个结构域(domain)。

MT具有非常保守的一级结构和相似的空间结构，在许多物种中MT通常没有常规的二级结构元件，不含α螺旋和β折叠，单体MT分子通常以一种僵硬的构象形式存在，因此它具有的强抗热变性和抗蛋白酶消化能力与此坚固的构象有关中MT以多种亚型存在。

在哺乳动物中存在4种MT亚型，即MT-I，MT-II，MT-III，MT-IV，这些亚型又分为不同的异构体，如MT-1A.MT-1B.MT-1E.MT-1F.MT-1G.MT-1H.MT-1X.MT-IIA和MT-IIB等。其中MT-I和MT-II存在于所有器官中，而MT-III仅存在于脑组织中，最早是在Alzheimer′s病人的脑中检测到的，MT-IV仅发现于鳞状上皮组织；各异构体之间在序列上高度同源，但在性质和功能上却不完全一致。

图1显示了哺乳动物MT的氨基酸序列图(Winge etal.1985)。金属硫蛋白的三级结构由两个大小相当(直径15～20U)、近似球形的结构域(domain)构成，即N端的1～29残基形成的β结构域，C端的31～61残基形成的α结构域；两个结构域相对独立并呈球状，两者通过第29，30和31位的赖氨酸残基(Lys-Lys)相连，使得整个分子呈哑铃状，图B及图C分别表示MT的结构模型及其三维空间结构。MT的两个结构域相互独立且功能上有明显的区别，其中α结构域含11个Cys，可结合4个二价金属离子如Cd²⁺或Zn²⁺，或者结合5～6个Cu²⁺；β结构域含9个Cys，可结合3个二价金属离子如Cd²⁺或Zn²⁺，或者6个Cu²⁺，即一个MT可以结合7～12个金属离子。金属离子与MT的相对亲和力不同，其稳定性次序为：Hg＞Cu＞Cd＞Zn＞Co＞Fe(Moffatt P，Denizeau F.Metallothionein inphysiologicalnd physiopathological processes[J].Drug Metab Rev，1997，29：261-307.)，其中Cd和Hg首先与α区结合，然后才结合β区；而Cu和Zn正好相反。从上述的MT分子三级结构可知，连接两个结构域的Lys-Lys二肽链是具有很大柔性的铰链结构，因此，两个结构域间的相对位置不确定，并具较大的柔性和可变性，从而使结合金属的机会增加，容易与溶液中的金属离子发生交换。

金属硫蛋白从发现以来，随着研究的不断深入发现金属硫蛋白在生物体的生命活动的很多环节中都起着重要的作用，包括：

1、MT对重金属解毒作用  MT富含巯基及其重金属结合能力决定了它在重金属解毒方面起着重要的作用，特别是对镉的解毒作用(Liu Y，Liu J，Habeebu SS，et al.Susceptibility of MT-null mice tochronic CdCl2-induced nephrotoxicity indicates that renal injury is notmediated by the Cd-MT complex[J].Toxicol Sci 1998，46：197-203.)。MT的巯基基团(-SH)能强烈螯合有毒金属Hg、Pb、Cd、As等，其中螫合Pb的强度比Zn大200倍，而螫合Cd的强度又比Pb大10倍，并可将之排出体外，从而使它们无法毒害人体，同时对体内Zn等微量元素无影响。MT的解毒机理可能为：减少进入细胞内的金属量；鳌合进入细胞内的金属，形成无活性的金属-MT复合物；增加金属输出细胞的机会。MT是目前临床是最为理想的生物整合解毒剂，具有无可替代的作用。

2、参与体内微量元素的代谢  微量元素大多数是金属元素，与半胱氨酸的配位位置严格固定，因此MT与金属离子的代谢具有密切关系。MT对Zn²⁺和Cu²⁺具有强亲和力，能够与它们结合，从而充当它们的储存蛋白，当机体需要Zn²⁺和Cu²⁺时，MT能够释放所结合的金属离子，提供给需要它的生理过程(Zeng 1，Vallee BL，Kagi JHR.Zinc transfer from transcription factor IIIA fingers to thioneinclusters[J].Proc Natl Acad Sci，1991，88：9984-9988.)。

3、清除体内自由基、防止机体衰老  氧自由基可在体内自发地通过酶促反应或非酶促反应产生，一些正常生理过程或生化反应都需要一定量的氧自由基参与，但多余的自由基在体内有很强的氧化能力，对核酸、蛋白质和脂质等产生伤害作用。

由于天然形式下MT中的巯基均以还原状态存在，其中的金属又具有动力学不稳定性，而巯基具亲核性，从而使MT易与亲电性物质特别是某些自由基相互作用，因此，其对自由基如羟自由基(·OH)，氧自由基(·O₃)或一氧化氮(NO)等有较强的清除作用(Zangger K，Gjz，Haslinger E，etal.Nitiricoxide selectively releasesmetals from the N-terminal domain of metallothioneins：potential role atinflammatory sites[J].FASE13 J，2001，15：1303-1305.)。MT可以消除由于辐射形成的OH自由基，而且在与谷胱甘肽(GSH)作用后，MT得以再生。MT在体内清除自由基的能力非常强，比较而言，其清除羟自由基(·OH)的能力约为SOD的10,000倍，而清除氧自由基(·O₃)的能力约是谷胱甘肽(GSH)的25倍(Zangger K，Gjz，Haslinger E，etal.Nitiricoxide selectively releases metals f rom the N-terminal domain ofmetallothioneins：potential role at inflammatory sites[J].FASE13 J，2001，15：1303-1305.)。

目前来说对于金属硫蛋白的实际开发和应用也有也了诸多的实例。用途主要集中在几个方面，包括：个人日用护理品、保健品、食品、肥料、药品及环境保护用品，并在以上几个金属硫蛋白应用的领域都已经有相关专利出台，包括：

1、个人日用护理品方面的专利，包括：上述的金属硫蛋白具有消除皮肤中(·OH)和氧自由基，具有抗衰老和防晒的功效。故将其作为添加剂配制成护肤霜、护肤液和抗肤粉、防晒霜等的金属硫蛋白系列化妆品(参见CN/93103270.9、CN/02129492.5)。另外将金属硫蛋白添加到传统的牙膏中制成一种含有金属硫蛋白的牙膏，由于金属硫蛋白的抗氧化作用故上述牙膏可以广泛预防各类口腔疾病且无副作用(参见CN/93106909.3)。

2、保健品方面的专利，包括：在生产初乳片的原料中加入适当量的金属硫蛋白制成含有金属硫蛋白的初乳片，这种乳片具有(1)中所述的功效，包括抗氧化，抗衰老等(参见CN/200310107989.2)。另外采用金属硫蛋白为有效成分并辅配多种重要成份制成片剂或口服液类保健品具有解毒，抗药化，抗衰老的作用(参见CN/92111199.1)。

3、食品方面的专利，包括：将金属硫蛋白作为一种有效成份，添加到传统的口香糖或泡泡糖的生产原料中，制成含有金属硫蛋白的口香糖或泡泡糖，开发出了一种新型的健康食品(参见CN/93106910.6)。另外将金属硫蛋白添加到饮料中，制成含有金属硫蛋白的新型健康饮料，此类饮料能够调节机体中微量元素的代谢，并对胃肠道溃疡有预防和治疗的作用(参见CN/93106693.X)。

4、肥料方面的专利，利用含有金属硫蛋白的肥料培育植物，使植物中吸收大量的金属硫蛋白，则上述植物可以作为药用，或保健品(参见CN/200310107788.8)。

5、药品方面的专利，包括：由于金属硫蛋白具有清除重金属的解毒作用，抗氧化作用，抗衰来作用，对于重金属中毒，口腔疾病，皮肤疾病，胃肠道疾病以及糖尿病一起的并发症的预防和治疗都有相助的作用(参见CN/200310107790.5、CN/95103689.0、CN/01114118.2)。

6、环境保护方面的专利，利用原核表达系统，表达MT蛋白，则上述重组表达菌可以投放到重金属污染的江河或湖泊中，以清除水中的重金属(参见WO/5824512)。

许多专利包括了以重组DNA技术在原核生物，真核生物包括酵母，植物，动物中生产MT及其改构体的方法、大规模发酵的方法，以及启动子和转录系统的研究(参见WO/5824512、WO/6774282、WO/5955428、WO/5583009、WO/6391590、CN/01131966.6、CN/95102106.0、CN/96100897.0、CN/01128543.5)。

目前，对于外源重组蛋白的生产主要还是应用传统的原核生物反应器，及宿菌为原核生物主要是大肠杆菌。利用原核生物作为生物反应器具有成本低，易操作，周期短，产量高，表达稳定，易放大等优点，但对于表达具有生物活性的蛋白或具有糖基化的真核生物蛋白，原核生物就暴露出了巨大的缺陷，很多外源蛋白在原核生物中表达为高量表达，表达产物在原核细胞中由于未能及时的正确折叠，在宿主胞浆内形成所谓“包涵体”，即生物学活性的不溶性聚合体。虽然形成包涵体的优点是可保护被表达的蛋白质免于遭受宿主细胞中蛋白酶的降解，并能够用离心方法很容易地将包涵体分离出来。但为了得到有生物学活性的蛋白质产物，必须对包体进行变性-溶解-复性处理。这个过程一般要在反复试验的基础上完成，而且常常不能得到令人满足的产物回收率。为了解决这一难题，人们试图采用真核植物来表达药用蛋白，使蛋白质正确折叠和糖基化，以此维持蛋白质的生物学活性。

利用转基因植物生产医用蛋白，近年越来越受到人们的关注，在植物油体中表达药用蛋白，使目的基因插在油体蛋白基因的N端或C末端，构建成融合蛋白基因。由于油体蛋白镶嵌在油体表面，构建的融合蛋白基因便可在受体植物种子的油体中特异表达，这样便可大大提高外源蛋白在植物组织中的表达量，并可利用油体亲脂疏水的特性，将种子粉碎后，再经液体抽提离心等步骤，回收油相，便可将融合蛋白或目的蛋白与细胞内的其它组份分开，这样便可明显简化目的蛋白的分离纯化过程，这种植物油体表达体系有利于外源基因的表达及产业化研究。但由于植物油体蛋白表达的外源蛋白是一种与油体蛋白偶联的融合蛋白，这种融合蛋白是否会影响MT的生物学活性，如果要分离MT和油体蛋白，这样会在一定程度上会增加其生产成本和周期，并且会造成目的蛋白产量的降低。这些都为理论上的油体表达MT蛋白的不足。然而，目前还没有利用植物油体表达系统表达MT的报道。

发明内容

本法明的目的在于提供一种利用植物油体表达系统生产人金属硫蛋白的方法，为MT的产业化研究打下基础。

本法明首先根据植物密码子的偏好性设计合成了人金属硫蛋白(Metallothionein，MT)基因的全序列，该序列如SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2；

进一步，本法明构建了含有油体蛋白与上述人金属硫蛋白的融合蛋白基因的表达载体，所述油体蛋白优选为大豆油体蛋白，表达载体所用的启动子优选为油菜油体蛋白启动子；

然后，将上述表达载体转化植物中，并整合到植物基因组中，培植出带有上述融合基因的转基因植物，该植物能够产生所述人金属硫蛋白。

具体地，本法明可以采用如下技术方案：

(1)构建植物油体表达载体；

(2)按植物偏好的密码子合成MT的核苷酸序列；

(3)将MT的核苷酸序列连接到油体蛋白核苷酸序列的3｀端，克隆进表达载体中；

(4)用步骤(3)的重组表达载体用农杆菌侵染转化适当的真核宿主愈伤组织；

(5)筛选转基因抗性愈伤组织；

(6)筛选抗性植物转化苗；

(7)将得到的植物种子经粉碎、用提取液萃取，离心可除去90％以上的杂质，经洗涤纯化回收所需的酸性成纤维细胞生长因子活性多肽。

本发明涉及以重组DNA技术生产MT的方法，特别是涉及以真核植物作为宿主生产MT的方法。更具体的说，本发明涉及用于在真核植物种子油体蛋白中融合表达MT蛋白。本发明进一步涉及按本发明的方法制备的MT在预防和治疗重金属中毒、预防和治疗口腔溃疡，预防和治疗胃肠道溃疡，食品，皮肤护理品，环境保护品及其在肥料中的应用。

为了提高基因的表达效率和产物的产率，本发明选择用油体蛋白与MT融合表达，优选地采用油菜油体蛋白与MT融合表达，从而使融合蛋白表达量大大提高，并且更加稳定。

为了提高遗传转化效率，本发明采用了多种转化技术将重组人MT基因转入靶植物愈伤组织。这些方法包括但不仅限于农杆菌侵染法，基因枪转化法，花粉管通道法等等。

为了避免转基因植物之间发生基因漂移，导致严重的环境问题和生态危机，本发明采用了自花授粉的大豆，红花，油菜，作为生物反应器。

可按照本领域已知的技术进行基因的分离和合成、克隆和表达载体的构建、DNA序列分析及鉴定、宿主细胞转化和培养，以及表达产物的分离和纯化等操作(参见Sambrook ct al.，Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor laboratory Press，ColaSpring Harbor，NY，1989)。

可以将按本发明方法制备的MT与选自人血清白蛋白、多聚甘氨酸、金属阳离子(如Zn²⁺、Mn⁺和Mg²⁺)及低分子量肽的活性蛋白质保护剂，选自聚乙二醇、谷胱甘肽的稳定剂混合，并加入本领域技术人员熟知的药物载体或赋形剂，制成适于经胃肠道途径，特别是经胃肠道外途径给药的药物组合物。可以按照制药领域的常规方法，将这样的药物组合物制成适于经血管内、肌肉内、或腹腔内给药的溶液剂、经口服给药的片剂或粉术剂，或制成适合于外用的栓剂、软膏、霜剂、乳化剂等剂型。

本发明的产品可以应用在多个领域，包括：重金属中毒、体内微量元素补充调节剂、预防和治疗口腔溃疡类药物，预防和治疗胃肠道溃疡类药物，食品，皮肤护理品，环境保护品及其在肥料中的应用。

1、药物组合物可用于预防和治疗重金属中毒，包括Cd中毒，Hg中毒，Ag中毒，Co中毒，Ni中毒。

2、体内微量元素补充调节剂，主要调节和补充体内所需的Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等微量元素。

3、本发明的产品可以开发成牙膏，含片，粉剂用于预防和治疗由于氧化引起的口腔溃疡。

4、本发明的产品可以最为一种有相成份添加到传统的治疗胃肠道溃疡的药物中制成冲剂，片剂或胶囊类药物，则上述药物能有效预防和治疗胃肠道溃疡，缓解和治疗患者的痛苦。

5、本发明的产品也可以作为一种有效成份加入到各类食物，饮品中。则上述食物将具有抗氧化，抗衰老，预防和治疗机体由于过量自由基产生而导致的疾病。

6、本发民的产品可以开发成护肤品，包括护肤霜，护肤水，洗发水，洗浴液，防晒霜。上述产品能有效防止肌肤的老化，抗氧化，防止紫外线伤害。

7、本发明的产品可以开发成一种环境保护品，将表达有MT的种子最为有效成份添加到污水处理剂中，喷洒到重金属污染严重的江河湖泊中，由于MT吸附重金属的特性，可以大大降低受污染水中重金属的含量。

8、本发明还可以开发成肥料，用含有本产品的配料培育植物，使植物吸收大量的MT蛋白，收获后植物可以开发成多种产品，包括：重金属中毒、体内微量元素补充调节剂、预防和治疗口腔溃疡类药物，预防和治疗胃肠道溃疡类药物，食品，皮肤护理品，环境保护品及其在肥料或上述产品的有效成份。

本方法提供了一种利用植物油体系统表达外源蛋白的新方法。本方法利用植物，例如，红花，大豆，油菜等高产作物生产MT，相对于传统基因工程的方法，该方法在外源蛋白表达阶段具有操作简便，成本低廉，产量高的特点；在纯化阶段，由于MT-油体蛋白是与油体相偶联表达的，所以通过两部液体抽提可以除去95％以上的杂蛋白，相对于传统基因工程方法，具有纯化步骤简化，以操作，价格低廉，易分离，纯度高等优点。

附图说明

图1是哺乳动物MT的氨基酸序列图；

图2是MT目的蛋白的Western检测图，其中第一泳道为标准品MT；第二泳道为利用油体表达系统表达的重组MT；

图3是MT的活性检测；

图4是表达载体p1390R的图谱；

图5是pUCON质粒构建图；

图6是pUCOE质粒构建图；

图7是重组中间载体p1390ON构建示意图；

图8是重组中间载体p1390ONE构建示意图；

图9是重组表达载体p1390ONE-insulin构建示意图。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本法明所要保护的的范围。

实施例1：MT基因的制备及序列测定

首先根据植物偏好性密码子对从GENEBANK中查找到的编码人源MT蛋白的核酸序列进行修改，将植物中含量较少的稀有氨基酸密码子替换成植物偏好性的密码子，而并不改变MT一级结构中的氨基酸序列。具体修改方法参考 www.kazusa.or.jp/codon/相关列表。并按照密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点，利用在线软件Primerfinder及DNASTAR设计引物，为了合成含植物偏好的MT全长基因，共设计合成了六条引物，每条引物长度约为57～59bp：F₁、F₂、F₃为正向引物，R₁、R₂、R₃为反向引物，其中_F1和R₁；F₂和R₂为互补的嵌合引物(有20个互补碱基)；R₃中包括编码六个组氨酸标签的核酸序列，在引物F₃和R₃中分别引入了Hind III、Kpn I和凝血酶切位点及Spe I、EcoR I酶切位点和保护碱基，以便克隆进中间克隆载体及植物表达载体中。其中割断引物的核苷酸序列列表如下：

F₃：cgcggatccatggaccccaactgctcctgcgccactggtggctcctgcacctgcactgg

F₂：ggctcctgcacctgcactggctcctgcaaatgcaaagagtgcaaatgcaactcctgcaa

F₁：tgcaaatgcaactcctgcaagaagagctgctgctcctgctgccccatgagctgtgccaa

R₁：ttctctgatgcccctttgcagatgcagccctgggcacacttggcacagctcatggggca

R₂：cctcaatgatgatgatgatgatgggcacagcagctgcacttctctgatgcccctttgca

R₃：gaatcctcaatgatgatgatgatg

MT全长基因合成

第一轮PCR扩增，如下建立20μl的反应体系：

10×pfu缓冲液          2μl

dNTP(2.5mM)            1.6μl

引物F₁(10μmol/L)      1μl

引物R₁(10μmol/L)      1μl

pfu DNA聚合酶          0.2μl

ddH₂O                  14μl

                                       

总量                   20μl

反应参数：

94℃      5min

55℃      5min

72℃      5min

4℃       保存

经2％琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收，回收产物命名为①。

第二轮PCR扩增，如上采用100μl反应体系：

10×pfu缓冲液          10μl

dNTP(2.5mM)            8μl

引物F₂(10μmol/L)      1μl

引物R₂(10μmol/L)      1μl

产物①                 1μl

pfu DNA聚合酶          1μl

ddH₂O                  78μl

                                         

总量                   100μl

经2％琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收，回收产物命名为②。

反应参数如下：

第三轮PCR扩增，如上采用100μl反应体系：

10×pfu缓冲液          10μl

dNTP(2.5mM)            8μl

引物F₃(10μmol/L)      1μl

引物R₃(10μmol/L)      1μl

产物②                 1μl

pfu DNA聚合酶          1μl

ddH₂O                  78μl

                                        

总量                   100μl

反应参数如下：

反应产物即为包含有酶切位点的MT基因编码序列。用DNA胶回收试剂盒纯化回收，回收产物即为MT编码基因。

将PCR产物MT经Hind III及EcoR I双酶切后连接到pUC19上，得到pUC-MT。重组质粒pUC-MT的DNA序列测序结果表明，本发明设计合成的MT核苷酸序列正确。获得了186bp的MT基因，如序列表SEQ ID NO.1所示，其具有六组氨酸的编码序列。

实施例2：重组油体表达载体的构建

以白菜型油菜的总DNA为模板，以oleosin基因的启动子的序列设计引物，引物1含有Hind III酶切位点，引物2引入Xba I和EcoR I酶切位点，经PCR扩增获得了约900bp的20 KD oleosin基因的启动子(PCR反应条件为：94℃，5分钟；94℃ 30秒，58℃30秒，72℃ 1分钟；25个循环结束后72℃延伸5分钟)，PCR产物用Hind III和EcoR I双酶切后，将其连接到pUC19上，得到pUCON，其测序结果表明克隆产物为油菜油体蛋白基因的启动子。

以大豆24kD油体蛋白基因序列设计引物：引物1序列为：5′-GAA TCT AGA GAT GAT GAT GAT AAG ATG ACC ACA CAAGTA CC，引物2序列为：5′-GCC GGT ACC ATC ATC ATC ATC CTTGGT TGT TGC TGT CAC TG。引物1含有Xba I酶切位点，引物2引入Kpn I酶切位点，以含完整大豆24kDa油体蛋白基因的pTO质粒为模板，经PCR扩增获得完整的大豆24kDa油体蛋白基因编码区序列678bp(PCR反应条件为：94℃，5分钟；94℃ 30秒，58℃30秒，72℃ 30秒；25个循环结束后72℃延伸7分钟)，PCR产物用Kpn I和Xba I双酶切后，将其连接到pUC19上，得到pUCOE，其测序结果表明克隆产物为大豆油体蛋白基因。

将pUCON质粒用Hind III和Xba I双酶切后，将酶切片段油菜油体蛋白启动子连接到pCAMBIA1390(以下简称p1390R)(MscS-like Proteins Control Plastid Size and Shape in Arabidopsisthaliana.Current Biology，Volume 16，Issue 1，Pages 1-11 E.Haswell，E.Meyerowitz)中，重组质粒命名为p1390ON，经酶切鉴定正确后进行后续工作。将pUCOE质粒经Xba I和Kpn I双酶切后，将酶切片段大豆油体蛋白基因与p1390ON连接，重组质粒命名为p1390ONE，此即油体表达载体。

实施例3：含MT基因的重组油体表达载体的构建

将实例1中构建的pUC-MT质粒用Kpn I和Spe I双酶切后，将得到的MT酶切片段与重组油体表达载体p1390ONE连接，得到重组植物油体表达载体p1390ONE-MT。

实施例4：农杆菌介导的油菜、红花等遗传转化

p1390ONE-MT质粒DNA转入农杆菌

取1μg p1390ONE-MT质粒DNA加入到100微升LBA4404感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置5分钟；然后置液氮中冷冻5分钟后迅速转至37℃水浴中温育5分钟。加入1毫升LB液体培养基，在28℃摇床上180rpm振荡培养4小时。取适量菌液涂布到含链霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上，置28℃培养24～48小时，经抗性筛选、PCR及酶切鉴定获得带有p1390ONE-MT质粒DNA的农杆菌单菌落。

含p1390ONE-MT质粒的农杆菌的活化

从平板上挑取含p1390ONE-MT质粒的农杆菌单菌落，接种到5毫升LB液体培养基中(含卡那霉素50mg/L，链霉素50mg/L)，振荡培养过夜，取100微升菌液接种到50毫升LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，链霉素50mg/L)中，28℃，180rpm振荡培养至OD600为1，1500rpm离心10分钟，菌体用浸染培养基重悬，使OD600为0.5。

油菜或红花等植物的遗传转化

将油菜或红花等子叶或下胚轴在重悬的农杆菌菌液中浸泡15分钟，放到含适当激素配比的MS固体培养基上共培养3天，之后转到含有潮霉素15mg/L+头孢霉素250mg/L的MS固体培养基上进行抗性愈伤组织的筛选及进行芽分化选择培养，约8周左右有抗性芽出现，待抗性芽伸长至2～5厘米时转至生根培养基上，一般15～30天左右即可生根。

实施例5：转基因油菜、红化等植物的PCR检测

提取转基因油菜或红花等植物基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以MT基因的一对引物扩增目的基因MT、以大豆油体蛋白基因的一对引物扩增大豆油体蛋白基因、以大豆油体蛋白基因5｀端引物和MT基因的3｀端引物扩增融合蛋白基因。扩增MT基因的PCR反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 35秒，58℃ 35秒，72℃ 35秒，25个循环；72℃延伸7分钟。扩增大豆油体蛋白基因的PCR反应条件为：94℃ 5分钟，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒；25个循环；72延伸7分钟。扩增融合蛋白基因的PCR反应条件为：94℃ 5分钟，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒；25个循环；72延伸7分钟。分别扩增出预期的(186bp)的MT基因(含酶切位点和凝血酶切位点)、690bp的大豆油体蛋白基因及1130bp的融合蛋白基因。重组表达载体经过测序鉴定，证实插入基因序列全部正确。

实施例6：油菜籽和红花籽中MT目的蛋白的Western检测

提取油菜籽中和红花籽中的油体蛋白，经凝血酶切割后过利用Ni-NTA亲和纯化系统纯化MT，分离纯化得到MT纯品，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经转膜后用羊抗兔组氨酸抗体进行Western分析，结果表明，在转基因油菜和红花的种子中有MT蛋白的表达，表达产物大小约为6500道尔顿，与预期的大小一致，Western结果见附图1。

实施例7：油体蛋白与MT融合蛋白的分离纯化及生物活性测定

1、油菜和红花籽中油体蛋白-MT融合蛋白的提取

(1)取油菜种子10粒去掉外壳，加2.5倍体积的缓冲液A(0.15M Tricine-KOH pH7.5，10mM  KCI，1mM  MgC12，1mMEDTA，0.6M蔗糖)研磨，5000g、4℃离心15分钟。

(2)上清用含0.65M蔗糖的缓冲液A重悬。

(3)液面上覆以等体积的含O.12M蔗糖的缓冲液A。

(4)15000g、4℃离心25分钟，重复两次，取上清。

至此将油体与种子中的其它成份分开。

(5)上清中加2倍体积的乙醚，15000g离心8分钟，上部的乙醚层中多为中性脂类，磷脂留在下面的水相中，取中间的蛋白层。

(6)以适量含0.1M蔗糖的缓冲液A重悬蛋白，加三倍体积的氯仿/甲醇(2∶1)混合物，抽提3次。

(7)取中间蛋白层，用乙醚抽提一次，-70℃超低温冰箱中冻干保存。

用上述相同的方法可从红花籽中提取融合蛋白。

2、油体蛋白与MT蛋白的分离

(1)将油体蛋白-MT融合蛋白溶于无菌水中，加入0.2U凝血酶，37℃酶切过夜。

(4)对于金属硫蛋白的纯化采用Invitrogen公司出品的Ni-NTA的纯化系统，纯化原理是通过MT-His中的6个组氨酸结构与树脂中Ni2+的螯合作用从而分离目的蛋白。主要操作步骤如下：将酶切反应液上Ni-NTA亲和层析柱，用Native Binding Buffer(50mmol/LNaH2PO4，pH8.0，500m mol/L NaCl)洗至基线，用Native WashBuffer(50mmol/L NaH2PO4，pH8.0，500m mol/L NaCl，20mmol/LImidazole)洗除杂蛋白，再用含1.2mol/L NaCl的PBS缓冲液进行洗脱，收集活性峰，经SDS-PAGE、考马氏亮蓝染色，BandScan软件分析得到MT纯品，纯度达95％。

在红花种子提取得到的重组人MT占红花种子总蛋白的1.5％，超过了重组药物蛋白在植物中表达的最低商业化要求(1％)，因此，利用植物油体蛋白系统来实现重组人MT的产业化，具有可行性和广阔的应用前景。

3、采用Millipore公司出品的超滤管对纯化的MT进行浓缩脱盐，所得产物冻干后保存。

4、重组MT活性测定采用Cd/牛血红蛋白饱和法：在100μL的蛋白溶液中加入0.01M pH8.6的Tris-HCI缓冲液500μL，终浓度为700μM的CdCl₂溶液，再加入质量百分比为2％的牛血红蛋白200μL混匀，以吸附剩余Cd²⁺，静置10分钟，沸水浴中加热2-3分钟，12000rpm离心10min，收集上清；再加入2％牛血红蛋白100μL混匀，静置10分钟，沸水浴中加热2-3分钟，12000rpm离心10min，收集上清，重复多次后，确保彻底清除剩余的Cd²⁺，原子吸收光谱法测定其中Cd含量，重复三次实验；同样的操作方法，将商品化的MT与重组的MT作活性对比，结果两者吸附重金属Cd²⁺的能力相当，即P＜0.05。表明利用油体表达的重组MT的吸附重金属的活性与商品化的MT活性等同。见表1及图3。

表1重组MT及标准品MT对Cd²⁺的吸收

group	Cd2+原子吸收值(mg/L)
		标注品MT	4.72±0.05*
重组MT	4.48±0.10*

序列表

<110>吉林农业大学

<120>利用植物油体表达人金属硫蛋白的方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>204

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(4)..(204)

<400>1

atg gac ccc aac tgc tcc tgc gcc act ggt ggc tcc tgc acc tgc act        48

    Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys Thr

    1               5                   10                  15

ggc tcc tgc aaa tgc aaa gag tgc aaa tgc aac tcc tgc aag aag agc        96

Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Asn Ser Cys Lys Lys Ser

                20                  25                  30

tgc tgc tcc tgc tgc ccc atg agc tgt gcc aag tgt gcc cag ggc tgc       144

Cys Cys Ser Cys Cys Pro Met Ser Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys

            35                  40                  45

arc tgc aaa ggg gca tca gag aag tgc agc tgc tgt gcc cat cat cat       192

Ile Cys Lys Gly Ala Ser Glu Lys Cys Ser Cys Cys Ala His His His

        50                  55                  60

cat cat cat tga                                                       204

His His His

    65

<210>2

<211>66

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys Thr Gly

1               5                   10                  15

Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Asn Ser Cys Lys Lys Ser Cys

            20                  25                  30

Cys Ser Cys Cys Pro Met Ser Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys Ile

        35                  40                  45

Cys Lys Gly Ala Ser Glu Lys Cys Ser Cys Cys Ala His His His His

    50                  55                  60

His His

65

Claims (10)

1、人金属硫蛋白基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2、含有权利要求1所述基因与油体蛋白基因的融合基因的表达载体。

3、如权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述油体蛋白基因为大豆油体蛋白基因。

4、如权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述表达载体的启动子为油菜油体蛋白启动子。

5、如权利要求2～4所述的表达载体，其为p1390ONE-MT。

6、权利要求2～5所述的表达载体在制备人金属硫蛋白中的应用。

7.一种利用植物种子油体生产人金属硫蛋白的方法，其包括如下步骤：

1)用权利要求2～5所述的表达载体转化受体植物，筛选得到转含有目的基因的转基因植物；

2)将上述转基因植物栽培得到植物种子；

3)从上述种子中分离纯化得到人金属硫蛋白。

8、如权利要求7所述的方法，其中受体植物为油菜、大豆或红花。

9、如权利要求7所述的方法，其中转化受体植物的方法是采用农杆菌介导法。

10、如权利要求7所述的方法，其中分离纯化人金属硫蛋白的方法是将种子粉碎后用有机溶剂萃取得到油体蛋白-MT融合蛋白，使用凝血酶酶切，再通过Ni-NTA亲和层析得到人金属硫蛋白。

Images