CN103732758A - 表达和纯化植物中重组蛋白的低成本方法 - Google Patents

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Abstract

通过弹性蛋白样多肽(ELP)-内含肽融合表达并通过ELP的反相变和内含肽的切割反应对来自基于植物的样品的重组蛋白进行下游纯化。

Description

表达和纯化植物中重组蛋白的低成本方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年12月21日提交的美国临时申请61/425,703的优先权。该文件的内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明提供低成本且有效地表达和纯化转基因植物中重组蛋白的方法。所述重组蛋白表达为融合有ELP-内含肽标签的融合蛋白，并且包括药物、抗体链和其它有用的蛋白质。其可在植物不同部分例如叶、种子、根、块茎、果实和细胞培养物中产生。
背景技术
使用转基因植物来大规模生产药物蛋白已被证实是有吸引力的系统，该系统相较于传统微生物和哺乳动物生物反应器有着低成本、高产量、易收获和降低健康风险的优势，并且多种有价值的重组治疗蛋白已在转基因植物中表达，作为概念验证和可行性证明(Giddings,G.等,Nat.Biotechnol.(2000)18:1151-1155;Twyman等,Trends Biotechnol.(2003)21:570-578;Ko,K.等,Curr.Top.Microbiol.Immunol.(2009)332:55-78)。为了进一步发展植物反应器，来自植物样品的目标蛋白的下游纯化(估计占治疗蛋白情况中生产成本的80%)(Walter,J.K.等,在Subramanian,G(编)Bioseparation and Bioprocessing(《生物分离和生物处理》)，Wiley-VCH,Weinheim,Vol.I:465-496(1998))是在由基于植物的生物反应器大规模工业生产重组蛋白中的最重要因素。
传统的蛋白纯化方法涉及以融合有亲和标签的融合形式表达目标蛋白，所述亲和标签例如His标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、c-myc标签、strepII表位、钙调蛋白结合肽和麦芽糖结合蛋白(Desai,U.A.等,Protein Expr.Purif.(2002)25:195-202;Witte,C.P.等,Plant Mol.Biol.(2004)55:135-147;Rubio,V.等,Plant J.(2005)41:767-778;Valdez-Ortiz,A.等,J.Biotechnol(2005)115:413-423;Streatfield,S.J.,PlantBiotechnol J.(2007)5:2-15)。这些方法的缺陷在于使所需亲和层析规模扩大化有困难且成本高。已出现若干种简化下游蛋白纯化的新策略。油质蛋白融合(Parmenter,D.L.等,Plant Mol.Biol.(1995)29:1167-1180;Bhatla,S.C.等,Biotechnol Adv.(2010)28:293-300)使所需蛋白质靶向至可从水溶性部分容易地分离的油体。疏水蛋白融合(Lahtinen,T.等,Protein Expr.Purif.(2008)59:18-24)改变所述融合蛋白的疏水性，因而便利了通过基于表面活性剂的水性两相系统的纯化。融合有γ-玉米醇蛋白结构域(Torrent,M.等,Methods Mol Biol(2009)483:193-208)使所述重组蛋白能够形成包含高浓度所需蛋白质的紧密、ER-定位的蛋白颗粒，其使用基于密度的分离方法可容易地从细胞物质分离。然而，因为融合标签可能会影响重组蛋白的生物活性，所以需要将其去除，而这通常依赖蛋白酶来蛋白水解切割。该附加切割步骤导致较高成本，这归因于蛋白酶的成本和移除所述蛋白酶的额外步骤的成本，此外还可能出现非特异性蛋白质切割。因此，非常需要发展简单且低成本的下游重组蛋白纯化系统。弹性蛋白样多肽(ELP)-内含肽系统是用于纯化大肠杆菌源性蛋白的简单且有效的方法(Kang,H.J.等,J.Microbiol Biotechnol(2007)17:1751-1757;Lim,D.W.等,Biomacromolecules(2007)8:1417-1424;Floss,D.M.等,Trends Biotechnol(2010)28:37-45;Hu,F.等,Appl Biochem Biotechnol(2010)160:2377-2387)。ELP蛋白由重复的五肽V-P-G-X-G(X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸)组成，且具有引人注意的温度敏感性相变性质：当温度升高至其转变温度(Tt)时，可溶性ELP会聚集成不可溶相，其通过离心可容易地沉淀成团块；但添加冷缓冲液时，可使聚集的ELP重溶并回复到可溶相。可通过盐浓度、温度和所述重复五肽的长度与成分调节所述Tt。ELP具有低成本和易于扩大规模的优势。
内含肽是一种催化自切割的蛋白质剪接元件，随着其氨基酸中的一些被取代，内含肽可被调控以响应pH变化或硫醇试剂来在其N和/或C末端处切割。内含肽存在于大量蛋白质中，并且催化“前体”形式自切割成为成熟蛋白质。已经鉴定了许多内含肽，且可在网站“neb.com”的“neb/inteins”标志下找到所述序列的目录。因此，可应用内含肽的自切割性质来替代蛋白水解切割。也已公开描述了多种内含肽蛋白：(Perler,F.B.,Nucleic Acids Res.(1999)27:346-347并且作为ELP或其它亲和标签的融合伙伴使用(Fong,B.A.等,Protein Expr Purif(2009)66:198-202;Gillies,A.R.等,Methods Mol.Biol.(2009)498:173-183;Srinivasa Babu,K.等,Biotechnol Lett(2009)31:659-664;Hong,I.等,J.Microbiol Biotechnol(2010)20:350-355;Ma,C.等,Protein Pept Lett.(2010)17:1245-1250)。
因此，ELP-内含肽(Ei)融合策略是用于蛋白质纯化的具有吸引力的方法。ELP相变数个循环之后，通过温度变化和离心分离融合蛋白与其它蛋白质。然后，可通过pH变化或化学添加来触发内含肽切割，以从所述Ei标签切割所需蛋白质，然后进行ELP的另一相变以分离所需蛋白(上清)和Ei标签(沉淀)。在所述整个过程中，无需额外的蛋白酶或特殊装置，因而降低了纯化成本并大幅简化了操作。美国专利公开号20060263855(申请人Wood)公开了通过ELP-内含肽融合系统对大肠杆菌细胞源性重组蛋白的纯化。
在过去的二十年中，已研究了ELP或内含肽各自在转基因植物中的应用(Morassutti,C.等,FEBS Lett(2002)519:141-146;Scheller,J.等,Plant Biotechnol J.(2006)4:243-249;Lao,U.L.等,Biotechnol.Bioeng.(2007)98:349-355;Patel,J.等,Transgenic Res.(2007)16:239-249;Conley,A.J.等,Biotechnol Bioeng(2009a)103:562-573;Conley,A.J.等,BMC Biol(2009b)7:48;Floss等,同上(2010))。
经报道，ELP融合增强了转基因种子与叶中的重组蛋白表达(Scheller,J.等,Transgenic Res(2006)13:51-57;Patel等,同上(2007))，并且指示ELP的长度对逆转变循环过程中的重组蛋白累积和蛋白质回收有不同的影响(Conley等,同上(2009a))。此外，Conley等人，同上(2009b)评估了ELP融合对靶标至细胞质、叶绿体、质外体和内质网(ER)的GFP累积的影响。
Morassutti,C.等人,同上(2002)提供了利用所述内含肽介导的自切割机制在转基因植物中生产重组蛋白的首个证据。
但是，所有这些报道都是使用ELP或内含肽分别作为融合标签。申请人并未注意到关于在转基因植物中联合使用ELP和内含肽的任何报道。
已有报道ELP融合蛋白在烟草叶中形成蛋白颗粒(protein body)(Conley,A.J.等，同上(2009b)).我们还发现融合有ELP-内含肽标签的重组蛋白在稻米种子中形成ER源性的蛋白颗粒(Tian,L.等，未公开)。鉴于ELP的疏水性质，ELP融合蛋白可能形成蛋白颗粒，造成难以提取可溶ELP融合蛋白用于进一步纯化。可能需要对提取方法和纯化工艺(例如提取缓冲液、提取方法和纯化操作)进行例行的优化，以通过所述ELP-内含肽系统纯化来自植物样品的目标蛋白质。
尽管先前关于植物内重组蛋白的ELP融合表达的许多报道表示ELP融合蛋白可以被纯化，但这些实验中的大多数是在烟草叶中通过瞬时基因表达进行的，这可能会导致异种蛋白质暂时性高度积累。然而，在我们最初尝试表达并纯化重组蛋白时，融合有来自烟草叶稳定转化的ELP-内含肽标签的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)表达水平很低且纯化时很难大量地回收目标蛋白(Tian,L.等，未发表)。因此，似乎ELP融合表达与ELP-内含肽融合表达甚是不同，并且在稳定植物转化体中ELP-内含肽融合的表达与纯化情况似乎更加复杂。同样，应对条件进行例行的优化。
发明内容
本发明提供用于表达和纯化来自植物的重组蛋白的低成本、有效且可扩大规模的方法。本发明还涉及ELP-内含肽融合蛋白、重组物质及其生产方法和植物转化体。
本发明利用ELP-内含肽融合表达与纯化系统纯化来自植物样品的重组蛋白。所述重组蛋白包括药物、抗体链、工业用酶和任何其它有用的蛋白质。这些蛋白质可产自任何植物及不同植物部分，例如愈伤组织(calli)、叶、种子、根、块茎、果实和细胞培养物。通过ELP的温度敏感性逆相变且无需亲和层析与特殊装置，该方法操作简单，并且可易于扩大规模用于工业生产。相比应用于植物中融合表达策略的传统纯化方法，本发明方法利用自切割内含肽蛋白从融合标签释放所需重组蛋白，因而避免使用蛋白酶来切割融合标签。
本发明的一个方面涉及从植物、植物部分或植物细胞获得所需蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)从产生所需蛋白质为融合蛋白的所述植物、植物部分或植物细胞制备蛋白质提取物，所述融合蛋白在所需蛋白质的N末端或C末端或所述两个末端包含ELP-内含肽标签，该标签包含弹性蛋白样多肽(ELP)结构域和内含肽剪接元件(内含肽)，其中，所述内含肽在所需蛋白质的N和/或C末端或所述两个末端与所述ELP结构域之间；
(b)可任选地从所述提取物去除不溶性物质；
(c)使所述融合蛋白聚集并与所述提取物的剩余部分分离；
(d)使所述融合蛋白重溶于水性溶液；
可任选地重复步骤(c)和(d)；
(e)实行所述融合蛋白的切割；以及
(f)分离所需蛋白质和所述一个或多个标签。
本发明的其它方面涉及可在植物中操作以产生所述融合蛋白的表达系统，包含所述融合蛋白或包含所述表达系统的植物、植物部分或植物细胞，以及在植物、植物部分或植物细胞中产生所述融合蛋白的方法。
附图说明
图1(a)-1(c)显示下文示例性转化的质粒信息。
图2(a)-2(b)显示在成熟转基因稻米种子中累积的ELP-内含肽-PAL融合蛋白的SDS-PAGE和Western印迹分析。
图3显示从稻米种子纯化ELP-内含肽-PAL融合蛋白的纯化方案。
图4显示通过ELP-内含肽系统从转基因稻米种子成功纯化PAL。
图5(a)-5(e)以示意图显示按本发明方法在不同细胞系中纯化PAL的效果。图6以示意图显示用于在烟草内生成含hG-CSF的融合蛋白的表达系统。
图7(a)-7(c)显示在烟草叶中以融合蛋白表达的人G-CSF的SDS-PAGE结果。
图8以示意图显示从烟草种子中纯化以融合蛋白产生的hG-CSF的步骤。
图9显示烟草叶中融合蛋白表达的hG-CSF的纯化SDS-PAGE结果。
本发明的实施方式
本发明结合靶基因表达和基于植物生成重组蛋白的下游纯化方法。所述植物样品可来自任何种类的植物、单子叶或双子叶植物，以及不同植物部分，例如愈伤组织(calli)、叶、种子、根、块茎或细胞培养物。根据样品性质，可以改变所述表达和纯化的策略。例如，新鲜样品(例如叶或愈伤组织)可优选以其简单裂解物进行提取和进一步纯化，而干燥样品(例如种子)具有低蛋白降解度、高蛋白含量和便于运输的优势，是以供提取和纯化的良好起始样品。
通过本发明方法产生并纯化的重组蛋白可具有任何肽尺寸，来自哺乳动物、细菌或植物的任何来源，并且具有对人、动物或植物奏效的任何功能。
利用所述ELP-内含肽系统表达所需蛋白质和ELP-内含肽标签的融合物，其中，内含肽位于ELP和所述重组蛋白之间。利用ELP的温度敏感性相变性质分离融合蛋白和其它细胞成分，而内含肽的自切割功能使所述重组蛋白从ELP-内含肽标签释放。切割后，可通过ELP相变使ELP-内含肽标签转换成不溶性聚集体，该聚集体可容易地从可溶重组蛋白分离并去除。
所述融合蛋白由连续开放阅读框编码，该连续开放阅读框的序列包含编码ELP、编码内含肽和编码重组蛋白的基因序列，其中，内含肽基因插在ELP和重组蛋白基因序列之间。若需要，可将编码短氨基酸序列的合适接头序列插在ELP与内含肽或内含肽与重组蛋白或甚至多个ELP单元之间，以允许必要的ELP、内含肽和重组蛋白折叠。
一个ELP蛋白结构域可包含一个或多个ELP单元，即V-P-G-X-G肽，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。ELP单元的重复数量可能会影响ELP蛋白的相变温度，因此可按实际需要调节ELP结构域的长度(即，ELP单元的数量)。ELP单元的数量可从一个至数百个不等；因此，可以使用具有5、10、20、30、50、100或更多个单元的ELP结构域。也包括其间的数字。所述融合蛋白包含至少一个ELP结构域，但可包含多于一个。例如，两个ELP结构域可以分开位于所述重组蛋白的N和C末端，而所述内含肽蛋白位于所述末端和所述ELP结构域之间。
内含肽通常位于ELP和重组蛋白之间，并且可以通过取代内含肽蛋白中的一些氨基酸来调节切割位点、内含肽的N或C末端。所述切割反应可由环境条件变化(例如pH、硫醇试剂的添加和温度升高)实现。在本发明的一个实施方式中，可使pH从8.5变化至6.0-6.5来实现内含肽在其C末端切割以从ELP-内含肽释放重组蛋白。在另一个实施方式中，通过添加硫醇试剂使内含肽在其N末端切割。
连接内含肽切割位点的目标蛋白的第一个或最后一个氨基酸可能在切割反应中起作用并决定切割效率。因此，为使切割有效，应考虑改变或保留目标蛋白的第一个/最后一个氨基酸或添加另一个氨基酸。在一个实施方式中，添加氨基酸Met至重组蛋白(即，露兜树(Pandanus)凝集素(PAL))的N末端。此类修饰不限于所述具体蛋白质。所述修饰可以是无关所需蛋白的性质而有益的。若所述标签在C末端，则也可能需要修饰所述C末端氨基酸。
在植物中重组蛋白的累积水平通常在其后续下游纯化中起重要作用。就纯化而言，一般优选高度累积。因此，可通过使用强启动子，使用优化密码子和/或通过靶向信号使蛋白质靶向至特定细胞区域对质粒构建体中的任何成分进行优化以增加目标蛋白质的蛋白表达并促进其在特定器官、组织或细胞内区域中的累积。在优化表达的一个实施方式中，使用泛素融合策略。
编码融合表达质粒构建体的融合蛋白的核酸序列包含编码ELP-内含肽融合蛋白的开放阅读框，其中，编码ELP-内含肽融合标签的序列可位于重组蛋白的N或C末端。任何接头序列可位于ELP与内含肽和/或内含肽与重组蛋白和/或ELP单元自身之间，但以不影响所述融合蛋白或任何其成分的折叠为前提选择所述接头序列。通过控制ELP单元的数量以及取代内含肽蛋白内的氨基酸可使编码ELP和内含肽蛋白结构域的序列优化以改善重组蛋白的表达和纯化。可在转录、翻译和翻译后水平优化表达，并通过选择启动子、任何信号肽或应用的靶标肽、5’UTR组成、使用的密码子和其它融合组成来实现靶标定位。
不同的转化方法引起ELP-内含肽融合蛋白的瞬时表达或稳定表达，例如可使用土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化和生物弹射颗粒递送系统。
可通过以下方法对从植物样品提取并纯化所需蛋白质进行例行优化，所述方法包括：
(a)优化提取技术，包括但不限于，提取缓冲液、应用的器具、提取温度、根据融合蛋白定位的任何组织的样品裂解和预纯化；
(b)在通过ELP相变纯化之前对粗提样品进行预处理，包括去除任何不溶性成分和其它非特异性成分；
(c)调整触发ELP相变的条件，包括温度、pH、盐成分、应用装置、额外ELP蛋白或任何其它成分的添加；
(d)选择使聚集的ELP融合蛋白与其它污染成分分离的方法，例如微过滤、离心或导致分离的任何其它方法；
(e)改变方法(包括温度、缓冲液成分、pH和任何应用的装置)使聚集的ELP融合蛋白重溶；
(f)改变ELP相变操作以获得纯ELP-内含肽融合蛋白，例如改变ELP相变循环，联合使用与上述(c)、(d)和(e)中基于ELP纯化相关的不同方法；
(g)调节条件(例如缓冲液成分、pH、温度和化学添加)以触发内含肽诱导的切割；以及
(h)进行优化(例如相关ELP相变和任何其它纯化)以在内含肽诱导的切割之后使最终的经切割的重组蛋白和经切割的ELP-内含肽标签分离。
有时，内含肽的自切割尤其是固有的响应pH的切割功能会在体内发生，而pH可因细胞内区域或甚至是植物生长环境而不同。在下文实施例中，涉及ELP-内含肽-PAL融合蛋白的体内部分切割。然而，所述体内切割不影响未切割融合蛋白的纯化。
可实施本方法来纯化瞬时表达和稳定表达的重组蛋白。还可根据实际状况(例如实验条件和宿主植物)调整并实施转化方法。
表达之后，蛋白质提取是后续纯化步骤中的关键因素之一。可对提取条件进行例行优化，包括缓冲液成分、pH、温度、裂解细胞所用的装置和必要的梯度分离。还可依照本领域已知的方式根据目标蛋白的细胞内定位来调整提取方法。在本发明的示例性实施方式中，使用种子粉末提取并向提取缓冲液添加尿素以提取稻米种子的蛋白颗粒中与内源性醇溶谷蛋白聚集在一起的融合蛋白。
在通过ELP-内含肽系统纯化之前，可能需要通过过滤、离心或其它可行方法进行预处理以去除任何不可溶成分。若提取缓冲液中存在的一些成分影响融合蛋白的溶解度或随后的ELP相变或内含肽切割，可通过脱盐、透析、过滤和进一步离心实现预清除。在本发明的示例性实施方式中，通过脱盐或透析去除提取缓冲液中的尿素。
在样品提取之后，开始通过ELP-内含肽系统的纯化。如上文发明背景中所述，ELP的相变温度受许多因素影响，所述因素包括ELP蛋白的长度和成分、ELP融合蛋白的浓度、内含肽和重组蛋白的尺寸与性质、温度以及盐浓度和成分。为实现ELP的聚集，可对条件进行调整和优化，优选采用适度的温度和缓冲液成分。
聚集步骤之后，使所得ELP-内含肽融合蛋白聚集物重溶。低温和冷缓冲液通常帮助所述聚集的融合蛋白回到其可溶相。可通过调节重溶缓冲液的成分、延长冰浴或低温孵育或甚至借助于装置(例如微过滤和振荡)来进行优化。使聚集的融合蛋白重溶之后，可能需要进一步离心以去除任何不可溶成分。在本发明的一个实施方式中，使用微过滤来替代第一循环离心以便利融合蛋白的回收，而在第二和第三循环中采用常规离心。在另一个实施方式中，4℃搅拌(例如过夜)增强ELP的重溶。
在使ELP融合蛋白与其它污染蛋白分离的整个过程中，定义从可溶ELP融合蛋白聚集到使聚集的融合蛋白恢复为可溶状态的步骤为一个分离的循环。为获得纯融合蛋白，可重复所述循环数次，并可采用不同方法(例如通过微过滤和/或离心)调整所述循环中的分离操作。然而，尽管大量且较长的分离过程会产生较高纯度，但融合蛋白的产量也会减低。
一旦获得具有所需纯度的ELP-内含肽融合蛋白，即可通过改变反应pH和/或温度和/或通过添加其它化学品(例如调节盐浓度)来触发内含肽的切割反应。可额外施加补充性操作以促进切割，例如通过延长反应时间和冻融。切割率可通过SDS-PAGE或其它方法估计。
优选在最终分离经切割的ELP-内含肽标签和释放的重组蛋白之前实现完全切割。以类似方式通过聚集ELP-内含肽部分并将其从内含可溶蛋白质的上清液中移出来分离ELP-内含肽标签和重组蛋白。可使所需重组蛋白的终产物进一步透析或脱盐以去除任何不需要的所用缓冲液中的微小成分。
在下文的一个实施例中，使用转基因稻米种子作为露兜树(Pandanus)凝集素(PAL)的生产系统，所述PAL以融合有ELP-内含肽标签的形式表达。PAL蛋白是来自挺花露兜树(Pandanus amaryllifolius)的单子叶甘露糖结合凝集素。所述PAL蛋白，分子量(Mw)约为12.5kD(蛋白序列示于图1(c))，显示对于若干人癌细胞系增殖的抑制活性(Tian,L.等，未发表))。
本发明融合蛋白的表达和纯化系统的实用性也如下在烟草中予以证明。
提供以下实施例以说明但非限制本发明。
实施例1
从转基因稻米种子纯化重组抗肿瘤蛋白
在该实施例中，采用转基因稻米种子作为生产系统，采用分子量(Mw)约为12.5kD(蛋白质序列示于图1(c))的露兜树(Pandanus)凝集素(PAL)作为目标蛋白。PAL显示对于若干人癌细胞系(HepG2、A549、DLD-1、U87和Capan-2)增殖的抑制活性。PAL以融合有ELP-内含肽标签的形式表达，其中，ELP包含60个重复的“VPGXG”肽，且所述内含肽蛋白响应低pH在其C末端切割。所述ELP-内含肽标签插在PAL的N末端，从而在从稻米种子纯化ELP-内含肽-PAL融合蛋白之后，可通过降低缓冲液的pH来触发内含肽切割以分离所述目标PAL蛋白和Ei标签。
所述ELP-内含肽-PAL融合蛋白的表达盒示于图1(a)，该表达盒由稻米谷蛋白GluA(Gt1)启动子和信号肽驱动。将该序列克隆进入用于稻米转化的T-DNA二元载体pSB130的多克隆位点。该构建体称为SA。
编码ELP60结构域的序列由六个重复的ELP10基因(示于图1(b))通过类似Scheller,J.等(Transgenic Res.(2006)13:51-57)所述的方法生成。Ssp DnaB内含肽(称为内含肽1)和接头基因获自pTWIN2载体(接头基因5902-5940bp，内含体基因5941-6402bp)，所述载体购自NEB(见万维网neb.com/nebecomm/products/productN6952.asp)。ELP10和内含肽基因使用优选稻米密码子优化并由GS公司(GenScript Corporation)合成。
使用稻米培养变种9983采用上述载体构建体进行土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化。稻米种子愈伤组织诱导，土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化，稻米植株的选择和重建按CAMBIA(万维网cambia.org/daisy/cambia/4214.html)提供的方案进行。重建的转基因稻苗转移至土壤并在香港中文大学的转基因植物设备中生长。通过PCR对重建稻米植株进行最初筛选之后，通过Southern印迹进一步确认转基因进入稻米植株基因组的完整性。获得含有一套或两套转基因拷贝的若干转基因植株。收集成熟的转基因阳性稻米种子作为T1种子。通过SDS-PAGE和western印迹，采用特异性抗体对由阳性T1植株产生的T2种子进行蛋白质分析。
通过SDS-PAGE和western印迹分析，使用如图2所示并如下文所述的抗PAL抗体检测转基因稻米种子中PAL蛋白的表达。
用搅拌机将成熟稻米种子研磨成粉末。以20μl/mg向所述种子粉末添加总蛋白提取缓冲液(0.1M Tris-HCl,pH8.5,50mM NaCl,5%SDS,4M尿素,5%β-巯基乙醇)，并在35-37℃剧烈振荡孵育2-4小时。全部均质物两次在室温下以20,000×g离心10分钟。收集上清液作为来自种子的总提取蛋白(TEP)用于表达分析。就Western印迹而言，使用上样缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.5,2%SDS;10%甘油;0.02%溴酚蓝)通过15%SDS-PAGE分离TEP并转移至PVDF膜。Western印迹使用兔源性抗PAL一抗和抗兔IgG-过氧化物酶抗体(西格玛公司(Sigma))进行。使用由大肠杆菌产生的重组PAL作为阳性对照。
就SA转化的稻米种子而言，预计能在SDS-PAGE分析中观察到Mw(56kD)的融合蛋白。一些融合蛋白在SA种子中体内自切割，导致检测到游离的PAL和糖基化的PAL。针对独立稻米种系源性的种子总蛋白的Western印迹分析示于图2(a)和2(b)。若仅关注由Western印迹测定的体内未切割EiP融合蛋白，SA转基因稻米种子中的EiP蛋白累积总计达1.40mg/g干燥种子。
从总蛋白提取至最终纯化的过程示意性地示于图3。获得纯EiP蛋白通常需要进行二或三个循环的ELP相变，且需要约2-3天，这归因于其中两个步骤中的过夜孵育。
更详细地说，通过Bt缓冲液(0.1M Tris-Cl,pH8.5;50mM NaCl;6M尿素;0.5%吐温TM-20)提取总蛋白。提取的样品(EX)过滤(EXF)以去除任何碎片，通过PD-10柱(GE卫生保健公司(GE Healthcare))脱盐(DS)或用Bp缓冲液(0.1M Tris-HCl,pH8.5;50mM NaCl)透析以去除尿素，然后以20,000×g在4℃离心(DSC)10分钟以去除任何不可溶碎片。收集所得上清液用于纯化。
向所述样品以1:1(v/v)的比例添加5M NaCl，并在45℃孵育所述混合物10分钟以触发ELP的温度敏感性逆相变。如Ge等(Biotechnol Bioeng(2006)95:424-432)所述并稍加改动进行第一纯化循环。将NaCl处理的样品转移至配有MilliporeTM滤器(PES膜，0.22μm)的注射器，弃去滤液，而聚集的ELP-内含肽-PAL融合蛋白留在所述滤器中。使1mL冷Bs缓冲液(0.1M Tris-HCl,pH8.5;50mM NaCl;0.1%吐温TM-20)快速通过以从所述滤器去除额外NaCl，收集洗液，由于一些融合蛋白可能回到可溶状态并通过所述滤器。向无活塞的的注射器另添加1-3mL(或原始TEP样品的1/10体积)的冷Bs缓冲液，使整个系统保持在4℃过夜，用试管接在滤器下方以通过重力收集洗出液(可溶的EiP)。用活塞推出任何剩余溶液以收集余下的可溶EiP。合并所得洗出液和洗液作为1CS样品。
第二循环通过如Wu等(Nature Protoc.(2006)1:2257-2262)报道的逆相变方法进行。以1:1v/v比例添加NaCl(5M)，所得混合物在45℃孵育10分钟，然后直接离心。温和搅拌使所得沉淀在1/5原始体积的冷Bs缓冲液中重悬，并在冰上保留1小时。在4℃离心之后，收集上清液作为2CS样品。第三循环如第二循环进行，但使用50mMPBS缓冲液(pH7.2)使所得沉淀重溶。收集上清液作为3CS样品。
向3CS样品添加1/10体积的1M Tris-HCl(pH4.5)至终pH值在6.0-6.5以触发内含肽的切割反应。使样品在室温切割2小时，然后4℃过夜(为实现完全切割)。通过添加NaCl进行另一相变然后离心。收集上清液作为最终纯化的目标蛋白(FS)，重悬沉淀作为最终ELP-内含肽标签(FP)。
2或3个循环后，可在SDS-PAGE中观察到纯化的EiP融合蛋白。在切割步骤中，通过添加低pH的Tris缓冲液实现的pH变化起始所述内含肽的切割反应，但采用较长孵育(例如在4℃24～36小时)来进行完全切割。可使用冻融处理来加速所述切割。所述切割和后续的纯化步骤是有效的，鉴于没有ELP-内含肽标签余留在PAL的最终上清液中(图4，FS泳道)。通过所述高度优化的方法，纯PAL蛋白的产量约为30-80μg/g干燥种子。
PAL属于单子叶甘露糖结合凝集素，且表现对人癌细胞增殖的抑制活性(图5，样品PH)。我们采用对若干不同的人癌细胞系(HepG2(肝)、A549(肺)、DLD-1(结肠)、U87(成胶质细胞瘤)和Capan-2(胰腺))增殖的抑制活性进行分析，测试了通过ELP-内含肽系统从稻米种子纯化的PAL蛋白的生物活性。结果显示，由ELP-内含肽系统纯化的PAL显示的剂量依赖性抑制活性与纯化自大肠杆菌的PAL蛋白相似(如图5所示)，指示ELP-内含肽融合表达和纯化系统并未减少所述重组蛋白的生物活性。
实施例2
从转基因烟草纯化重组人G-CSF
在该实施方式中，使用转基因烟草叶作为生产系统，而使用人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)作为目标蛋白，所述hG-CSF是重要的人细胞因子，其已被广泛应用于肿瘤学和感染防护。
使用二元载体pBI121中的CaMV35S启动子构建hG-CSF融合表达嵌合体，并引入菜豆球蛋白(phaseolin)信号肽以指引经表达的融合蛋白进入植物细胞分泌通路。所述表达盒示于图6。引入泛素以改善目标蛋白的表达，并将由内源性泛素特异性蛋白酶(Ubp)从所述融合蛋白准确加工(Tian,L.和Sun,S.S.M.,BMC Biotechnol(2011)11:91)。图6显示由括号表示的编码hG-CSF-内含肽2-ELP110融合蛋白的序列，而箭头指示通过添加DTT或β-巯基乙醇触发内含肽2切割的位点。
hG-CSF以C末端融合有内含肽-ELP(IE)标签的形式表达，显示为hG-CSF-内含肽-ELP或“GIE”(图6)，其中ELP包含110个重复的“VPGXG”肽，而内含肽蛋白(称为内含肽2)响应硫醇试剂(例如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇)的添加在其N末端切割。来自烟草叶的GIE融合蛋白纯化之后，通过添加β-巯基乙醇触发内含肽切割以从所述IE标签释放目标hG-CSF蛋白。
ELP110基因由11个重复的ELP10基因(图1(b))通过上述类似方法生成。MthRIRI内含肽和接头基因获自pTWIN2载体(内含肽基因6445-6846bp，接头基因6847-6888bp)，该载体购自NEB(万维网上：neb.com/nebecomm/products/productN6952.asp)。
通过电穿孔将pBI121表达载体中的嵌合基因转化进入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并如先前所述(Tian,L.和Sun,S.S.M,BMCBiotechnol(2011)11:91)对用幼烟草叶进行土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化。植株重建之后，使用hG-CSF特异性引物PCR筛选个体植株，15株转化植株中的11株显示阳性结果。
为检测转化植株中GIE蛋白的表达，用提取缓冲液[0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH7.2;1mM EDTA;0.1%吐温TM-20;100mM抗坏血酸;2%聚乙烯吡咯烷酮;完全蛋白酶抑制剂(混合物片剂，罗氏公司(Roche))]从21天龄的转基因植株的新鲜幼叶提取可溶总蛋白。在研钵中用液氮将新鲜叶子(1g)研磨成粉末，并添加1mL提取缓冲液。转移全部均质物至2mL Eppendorf管，在冰上孵育15分钟并以20,000×g在4℃离心10分钟。收集上清液并另离心10分钟。收集最终的上清液作为从叶子提取的可溶总蛋白。
从叶子提取的可溶总蛋白用4×上样缓冲液(0.2M Tris-HCl,pH6.8;0.8g SDS;40%甘油;5%β-巯基乙醇;50mM EDTA;8mg溴酚蓝)稀释，煮沸5分钟并以10-50μg蛋白质/泳道在15%SDS-PAGE上分离，然后由考马斯亮蓝（
Figure BDA00003691536300121
）染色使蛋白质显色。通过SDS-PAGE分离的总蛋白不经染色直接转移至PVDF膜用于免疫印迹。使用兔多克隆抗-hG-CSF抗体(派罗科技公司(PeproTech))和抗ELP抗体作为一抗，而抗兔IgG-过氧化物酶抗体(西格玛公司(Sigma))作为二抗进行Western印迹，并使用ECL检测系统(英国巴克斯的安玛西亚公司(Amersham Co.))显影。重组hG-CSF购自派罗科技公司(Pepro Tech)，并使用由大肠杆菌产生的ELP60蛋白作为阳性对照。
如图7(a)所示，合成预计分子量(80kD)的GIE融合蛋白，其在转基因烟草叶无体内自切割，尽管通过SDS-PAGE没有观察到野生型(WT)和转基因植株之间蛋白条带模式的明显差异。对来自个体植株的可溶总蛋白的Western印迹分析示于图7(b)和7(c)。转基因烟草叶中GIE蛋白累积的平均水平计为126μg/g新鲜叶重(FW)。
从总可溶蛋白提取开始至最终纯化获得纯化目标蛋白的过程示意性示于图8。获得纯GIE蛋白通常需要进行三个或更多循环的ELP相变，持续两天或更多天，这归因于其中两个步骤中的过夜孵育。
在该实施例中，我们使用由110个VPGXG重复组成的ELP来改善ELP相变效率。因为烟草叶中GIE融合蛋白累积水平低，在纯化过程中采用添加等体积的3MNaCl并在37℃孵育1-3小时来触发GIE聚集。GIE蛋白聚集后，离心，在第一循环中通过添加悬浮缓冲液(50mM磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH7.2;0.1%吐温TM-20;完全酶蛋白抑制剂)并在4℃下搅拌过夜进行目标融合蛋白的重溶。所得悬液以2000×g在4℃离心20分钟，然后收集所得上清液作为样品1CS。
在第二和第三循环中使用类似的纯化方法，但在第三循环中使用预切割缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.5;50mM NaCl;1mM EDTA)重溶聚集的GIE融合蛋白。随着纯化过程的进行，提取物中的色素也逐渐被去除。
在三个循环后向样品添加β-巯基乙醇至终浓度10mM以触发内含肽切割，并使样品保持在室温30分钟，4℃2小时以使所述切割完全。在室温孵育10分钟后收集部分样品(样品CL)以监测该切割反应。切割之后，如上所述进行ELP的另一相变循环，收集上清液中最终切割的hG-CSF(样品FS)和沉淀中的内含肽-ELP标签(样品FP)。见图9。
三次循环后，能在SDS-PAGE中清楚地观察到纯化的GIE融合蛋白，并能够触发所述内含肽切割以从内含肽-ELP标签释放hG-CSF。如图9所示，所述切割和后续纯化步骤是有效的，因为最终的hG-CSF上清液中无IE标签余留(泳道FS)。最终hG-CSF的回收是10-20ng/g新鲜叶子，而所述目标蛋白的表达水平为126μg/g新鲜叶子。
人G-CSF是重要的药物蛋白质，其可用于加强患者免疫系统抵抗人免疫缺陷病毒(HIV)、肺炎、糖尿病足感染、白血病和发热性嗜中性白细胞减少症，并可治疗正经历化疗的癌症患者以减轻细胞毒性化疗剂对白细胞水平的抑制。
hG-CSF的最终上清液(上述样品FS)经脱盐、冻干并重悬于检测缓冲液(50mMPBS，pH7.2)以通过测量促hG-CSF依赖性NFS-60细胞系增殖的能力而进行生物活性测试。所述细胞系仅在hG-CSF或其它已知的生长因子存在下生长。孵育72小时之后，用检测缓冲液处理的细胞显示的基线增殖水平与未处理样品相似。用1ng市售hG-CSF处理时，NFS-60细胞的增殖比未处理样品CT提高了260%，而含补充1ng从烟草叶纯化的hG-CSF的检测缓冲液的样品显示相似的促NFS-60细胞增殖能力，指示纯化的hG-CSF与市售hG-CSF生物活性相当。并且，纯化的GIE蛋白也经检测显示生物活性，但细胞增殖活性相应下降，表示内含肽-ELP标签并未破坏目标hG-CSF的生物活性。这些结果证实了EFP-内含肽融合表达，且纯化系统不减少所述重组蛋白的生物活性。

Claims (18)

1.一种从植物、植物部分或植物细胞获得所需蛋白质的方法，所述方法包括
(a)从产生所需蛋白质的所述植物、植物部分或植物细胞制备蛋白质提取物，其中，所需蛋白质为融合蛋白形式，所述融合蛋白在所需蛋白质的N末端或C末端或所述两个末端包含ELP-内含肽标签，该标签包含弹性蛋白样多肽(ELP)结构域和内含肽剪接元件(内含肽)，其中，所述内含肽在所需蛋白质的N和/或C末端或所述两个末端与所述ELP结构域之间；
(b)可任选地从所述提取物去除不溶性物质；
(c)使所述融合蛋白聚集并与所述提取物的剩余部分分离；
(d)使所述融合蛋白重溶解于水性溶液；
可任选地重复步骤(c)和(d)；
(e)实行所述融合蛋白的切割；以及
(f)分离所需蛋白质和所述一个/多个标签。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ELP结构域包含至少一个ELP单元。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白在所需蛋白质与内含肽和/或内含肽与ELP和/或多个ELP单元之间还包含一个或多个接头序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白是凝集素或细胞因子。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)包括对温度、pH、溶剂内含物和/或所用装置进行一种或多种调节。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中的分离包括离心或微过滤。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括改变含所述聚集物的水性混合物的温度、pH、盐和/或其它成分。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(e)包括调整所述水性溶液的pH、温度和成分。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(f)包括聚集和分离所述ELP-内含肽标签。
10.一种可在植物细胞内操作以在所述植物细胞中表达融合蛋白的核酸，所述融合蛋白在所需蛋白质的N末端或C末端或所述两个末端包含ELP-内含肽标签，该标签包含弹性蛋白样多肽(ELP)结构域和内含肽剪接元件(内含肽)，其中，所述内含肽在所需蛋白质的N和/或C末端或所述两个末端与所述ELP结构域之间。
11.包含权利要求10所述的核酸的植物、植物细胞或植物部分。
12.一种生产在所需蛋白质的N和/或C末端具有ELP-内含肽标签的融合蛋白的方法，所述方法包括培养权利要求11所述的植物、植物细胞或植物部分。
13.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述ELP结构域包含至少一个ELP单元。
14.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述融合在所需蛋白质与内含肽和/或内含肽与ELP和/或多个ELP单元之间还包括一个或多个接头序列。
15.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述重组蛋白是凝集素或细胞因子。
16.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述内含肽在所需蛋白质的N末端与一个/多个所述ELP结构域之间。
17.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述内含肽在所需蛋白质的C末端与一个/多个所述ELP结构域之间。
18.包含融合蛋白的植物、植物细胞或植物部分，所述融合蛋白在所需蛋白质的N末端或C末端或所述两个末端含有ELP-内含肽标签，该标签包含弹性蛋白样多肽(ELP)结构域和内含肽剪接元件(内含肽)，其中，所述内含肽在所需蛋白质的N和/或C末端或所述两个末端与所述ELP结构域之间。
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