CN113881669A

CN113881669A - 一种水稻表达系统的诱导性启动子及合成生物平台和其应用

Info

Publication number: CN113881669A
Application number: CN202111073635.0A
Authority: CN
Inventors: 夏隽棋; 刘忠; 李满妹; 李嘉雯; 廖碧虹; 吴侑峻
Original assignee: Guangzhou Kepurui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Kepurui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-14
Filing date: 2021-09-14
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2041-09-14
Also published as: US20240218388A1; CN113881669B; WO2023040047A1

Abstract

本发明公开了一种经茉莉酸甲酯诱导驱动的启动子序列；还提供了包含该启动子序列的表达盒、重组载体以及重组细胞。此外，还提供了一种使用该表达载体生产外源蛋白的方法；特别是使用该表达载体在水稻细胞中生产人类弹性蛋白的方法。同时，本发明还提供了包含以上外源蛋白的皮肤护理组合物。该组合物对于HaCaT细胞株及CCD966SK细胞株皆无细胞毒性；且可以提高细胞中保水相关基因hHAS2、hHAS3、hAQP3及hFLG的表达量，从而提升细胞的保水度以及屏障功能，具有广阔的应用前景。

Description

一种水稻表达系统的诱导性启动子及合成生物平台和其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地，涉及一种水稻表达系统的诱导性启动子及合成生物平台和其应用。

背景技术

目前，分子农场(molecular farming)已广泛应用于生产诸如酵素、抗体以及医药蛋白等的外源蛋白，商业上常见的分子农场表达系统包含细菌表达系统、酵母菌表达系统、真菌表达系统、哺乳动物表达系统、植物表达系统以及昆虫表达系统等。

细菌表达系统缺乏转译后修饰功能导致所表现的产物的生物活性较低，且所生产的蛋白质产物通常系以包涵体的形式存在，导致蛋白质纯化困难。此外，细菌表达系统在蛋白质纯化过程中亦会存在内毒素去除不完全的安全性问题。

哺乳动物表达系统虽然具有转译后修饰功能，然而在应用上，哺乳动物表达系统具有蛋白质产量低、生产成本高、操作步骤复杂且生产外源蛋白的过程中具有污染的风险等问题。

植物表达系统相较于其他表达系统具有许多的优势，包括所需资本较小、生产成本和植物栽培成本较低、产量大、所生产的外源蛋白在植物体内可进行转译后修饰，使外源蛋白具有接近原本蛋白质的功能及活性。

弹性蛋白构成弹性纤维(elastic fibers)，在脊椎动物体内是维持结缔组织弹性的蛋白质，可使脊椎动物体内许多组织在拉伸或收缩的后，能恢复其原始的形状。此外，弹性蛋白具有极高的经济价值，可广泛地应用于医药或美容用途，例如可作为干细胞(stemcell)培养系统的支撑材料以使干细胞生长、作为皮下注射填充成分、手术伤口愈合凝胶、3D打印材料、添加至保湿抗老化妆品或口服营养补充品等。

目前弹性蛋白的来源主要自动物组织萃取获得，在现有技术中，弹性蛋白系萃取自动物的大动脉组织，然而，由于弹性蛋白的胺基酸序列在物种的间的差异度大，例如，人类弹性蛋白与猪源弹性蛋白的相似度仅有79％，人类弹性蛋白与牛源弹性蛋白的相似度仅有78％，因此自动物组织所萃取的弹性蛋白可能会在人体内引起过敏反应，且亦可能存在人畜共通感染病原的风险。

因此，如何发展出低成本、高产量且能生产出具有接近原本蛋白质的功能及活性的外源蛋白的表达系统是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经分离的启动子序列、一种包含经分离的启动子序列的表达载体、一种包含表达载体的转基因植物细胞、一种表达目的基因的方法以及一种皮肤护理组合物。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种核酸分子，为以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：

(Ⅰ)核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的核酸分子；

(Ⅱ)与(Ⅰ)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性且具有启动子功能的核酸分子；

(Ⅲ)与(Ⅰ)限定的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核酸分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的特异DNA分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的核酸分子的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要具有启动子功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的核酸分子的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明的第二个方面，提供一种表达盒，含有本发明第一个方面所述的核酸分子。

进一步地，所述表达盒(从5’端至3’端)可包括启动子区(由本发明第一个方面所述的核酸分子组成)、转录起始区、目的基因区、转录终止区和任选的翻译终止区。所述启动子区和目的基因区对宿主细胞而言可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和目的基因区相互之间可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和/或目的基因区对宿主而言或者其相互之间为异源的。“异源的”指序列为源自外来物种的序列，或，如果来自相同物种，则通过刻意的人为干预在组分和/或基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。任选含有的转录终止区可与转录起始区同源，与可操作地连接的目的基因区同源，与宿主同源；或；目的基因区、宿主为外源或异源。

所述表达盒还可包括5’端的引导序列。5’端的引导序列可增强翻译。

在制备表达盒时，可应用衔接头或联结子连接DNA片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的DNA、去除限制酶切位点等。为达到这一目的，可进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换，例如转换和颠换。

所述表达盒还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如GUS蛋白、荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性标记基因。

本发明的第三个方面，提供一种载体，含有本发明第一个方面所述的核酸分子。

进一步地，所述载体还含有目的基因序列。

更进一步地，所述目的基因可进行密码子优化。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，根据宿主细胞的转录翻译偏好对目的基因序列进行密码子优化。

更进一步地，所述目的基因为人类弹性蛋白(elastin)的核苷酸序列或部分人类弹性蛋白(elastin)的核苷酸序列。

所述部分人类弹性蛋白(elastin)更优选为多种人弹性蛋白mRNA修饰型(RNAsplicing)中，序列保守区域的部分片段。

优选地，所述部分人类弹性蛋白(elastin)的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。

更优选地，所述部分人类弹性蛋白(elastin)的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

更进一步地，所述载体还含有转录起始序列、目的基因序列、转录终止序列和任选的翻译终止序列。

更进一步地，所述载体还可包括5’端的引导序列。5’端的引导序列可增强翻译。

更进一步地，所述载体还可包括可应用衔接头或联结子连接DNA片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的DNA、去除限制酶切位点等。

更进一步地，所述载体还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如GUS蛋白、荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性标记基因。

更具体地，所述载体包括潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase，hpt)的核苷酸序列。

更具体地，所述载体包括信号肽(signal peptide，SP)的核苷酸序列；

优选地，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

更具体地，所述载体包括终止子序列。

更具体地，所述载体包括卡那霉素(kanamycin)抗性基因的核苷酸序列等。

更优选地，本发明第一个方面所述的核酸分子位于所述目的基因序列的上游。

更优选地，所述信号肽序列位于本发明第一个方面所述的核酸分子与目的基因序列之间。

更优选地，所述终止子序列位于所述目的基因序列下游。

本发明的第四个方面，提供一种细胞，含有本发明第三个方面所述的载体。所述细胞为非植物或动物新品种。

优选地，所述细胞为农杆菌。

优选地，所述细胞为水稻细胞、拟南芥细胞、烟草细胞、胡萝卜细胞或番茄细胞。

更优选地，所述细胞为基于植物悬浮培养技术制得的水稻悬浮细胞、拟南芥悬浮细胞、烟草悬浮细胞、胡萝卜悬浮细胞或番茄悬浮细胞。

本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述核酸分子作为启动子的应用。

进一步地，所述启动子受茉莉酸甲酯诱导。

本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述的核酸分子、本发明第二个方面所述的表达盒、本发明第三个方面所述的载体或本发明第四个方面所述的细胞在启动目的基因的表达中的应用。

本发明的第七个方面，提供一种表达目的基因的方法，所述方法以本发明第一个方面所述的核酸分子作为启动子来启动目的基因的表达。

本发明的第八个方面，提供一种表达目的基因的方法，所述方法包括以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一项所述的步骤：

(Ⅰ)将本发明第一个方面所述的核酸分子插入到任意目的基因或增强子的上游；

(Ⅱ)将目的基因插入本发明第二个方面所述表达盒的所述核酸分子的下游；

(Ⅲ)将目的基因插入本发明第三个方面所述载体的所述核酸分子的下游。

本发明的第九个方面，提供一种转基因植物的构建方法，所述方法包括将本发明第一个方面所述的核酸分子、本发明第二个方面所述的表达盒或本发明第三个方面所述的载体转入受体植物中的步骤。

优选地，所述植物为水稻、拟南芥、烟草、胡萝卜或番茄。

本发明的第十个方面，提供一种组合物，所述组合物中包含以下(Ⅰ)或(Ⅲ)中的任意一种：

(Ⅰ)本发明第七个方面所述方法制备得到的目的基因的表达产物；

(Ⅱ)本发明第八个方面所述方法制备得到的目的基因的表达产物；

(Ⅲ)本发明第九个方面所述方法构建得到的转基因植物的培养液、提取液或萃取液。

优选地，所述目的基因的表达产物包括细胞培养液、提取液或萃取液。更优选地，将转基因的植物培养液或转基因的植物细胞培养液进行过滤，以得到过滤液；

将该过滤液进行透析，以得到透析液；以及将该透析液进行过滤，以得到植物萃取液。

优选地，所述目的基因为人类弹性蛋白(elastin)的核苷酸序列或部分人类弹性蛋白(elastin)的核苷酸序列。

优选地，所述转基因植物为水稻、拟南芥、烟草、胡萝卜或番茄。

更优选地，所述转基因植物的萃取液通过将该转基因植物培养液进行过滤，以得到过滤液；将该过滤液进行透析，以得到透析液；以及将该透析液进行过滤，以得到植物萃取液。

本发明的第十一个方面，提供本发明第十个方面所述的组合物在制备化妆品或护肤品中的应用。

进一步地，所述化妆品或护肤品具有保湿和/或修复皮肤屏障的功能。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种经茉莉酸甲酯诱导驱动的启动子序列；还提供了包含该启动子序列的表达盒、重组载体以及重组细胞。此外，还提供了一种使用该表达载体生产外源蛋白的方法；特别是使用该表达载体在水稻细胞中生产人类弹性蛋白的方法。同时，本发明还提供了包含以上外源蛋白的皮肤护理组合物。该组合物对于HaCaT细胞株及CCD966SK细胞株皆无细胞毒性；且可以使CCD966SK细胞株中与保水相关的人类玻尿酸合成酶hHAS2及hHAS3的基因表现分别提升9％及15％、与细胞渗透相关的人类水通道蛋白hAQP3的基因表现提升15％，以及与细胞结构及屏障功能相关的人类丝聚蛋白hFLG的基因表现提升9％。细胞中的hHAS2、hHAS3、hAQP3及hFLG基因表现的增加可提升细胞的保水度以及屏障功能。

附图说明

图1为质粒的结构示意图。A图为：pMeJA-GFP-GUS质粒图谱。其中OsMeJA启动子表示来自水稻可由茉莉酸甲酯诱导驱动的启动子序列；GFP-GUS表示绿荧光蛋白-β-葡萄糖醛酸苷酶报告基因；NOS表示终止子序列。B图为：pCAM-OsMeJA-hPELN-Ostml质粒图谱。其中，LB表示嵌入DNA的左边界(left border)序列；RB表示嵌入DNA的右边界(right border)序列；hpt表示潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase，hpt)的核苷酸序列；OsMeJA表示来自水稻台农67号的可由茉莉酸甲酯诱导驱动的启动子序列；SP表示信号肽(signal peptide，SP)的核苷酸序列；hPELN表示部分人类弹性蛋白(elastin)的核苷酸序列；Ostml表示来自水稻的终止子序列；NOS表示终止子序列；以及Kan^R表示卡那霉素(kanamycin)抗性基因的核苷酸序列。

图2为经pCAMBIA1390质粒(阴性对照组)、pCAMBIA1304质粒(阳性对照组)及pMeJA-GFP-GUS质粒转染的烟草叶圆盘经由茉莉酸甲酯(MeJA)处理后或未经茉莉酸甲酯(MeJA)处理，GUS染色的结果图。

图3为经pCAMBIA1390质粒(阴性对照组)、pCAMBIA1304质粒(阳性对照组)及pMeJA-GFP-GUS质粒转染的烟草叶圆盘经由茉莉酸甲酯(MeJA)处理后或未经茉莉酸甲酯(MeJA)处理，GUS活性分析的柱状图。

图4为经hPELN转染的水稻萃取液的抗人类α-弹性蛋白Western Blot检测结果图，箭头处为约32kDa的hPELN外源蛋白。

图5为经hPELN转染的水稻萃液的细胞株皆无毒性实验结果。其中，A图显示将蛋白质浓度为0.5μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、20μg/mL及50μg/mL的野生株的水稻萃取液及经hPELN转殖的水稻萃取液处理HaCaT细胞株后，HaCaT细胞株的细胞存活率的柱状图。B图显示将蛋白质浓度为0.5μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、20μg/mL及50μg/mL的野生株的水稻萃取液及经hPELN转殖的水稻萃取液处理CCD966SK细胞株后，CCD966SK细胞株的细胞存活率的柱状图。

图6为将200μl的蛋白质浓度为50μg/mL的野生株的水稻萃取液或经hPELN转殖的水稻萃取液处理CCD966SK细胞株后，CCD966SK细胞株中的人类玻尿酸合成酶hHAS2及hHAS3、人类水通道蛋白hAQP3，及人类丝聚蛋白hFLG等水嫩基因的相对表现水平的柱状图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

实施例1建构pMeJA-GFP-GUS质粒

提取水稻台农67号(Oryza sativa L.cv Tainung 67)的叶片基因体DNA，设计包含如SEQ ID NO：1所示序列的正向引物以及如SEQ ID NO：2所示序列的反向引物的第一引物对，并以水稻基因体DNA作为聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)的模板DNA进行PCR，以扩增如SEQ ID NO：3所示OsMeJA启动子全长核苷酸序列。之后，依据参考文献Karimi等人(2002)的内容，利用

技术以将OsMeJA启动子全长核苷酸序列嵌入至具有绿荧光蛋白-β-葡萄糖醛酸苷酶(GFP-GUS)报导基因的pHGWFS7目的载体中(ThermoFisher Scientific，麻萨诸塞州，美国)，以得到如图1中A所示的pMeJA-GFP-GUS质粒。

实施例2建构pCAM-OsMeJA-SP-hPELN-Ostml质粒

设计包含如SEQ ID NO：4所示序列的正向引物以及如SEQ ID NO：5所示序列的反向引物的第二引物对，并以水稻基因体DNA作为聚合酶连锁反应的模板DNA进行PCR，以扩增得到MeJA-SP序列，该MeJA-SP序列具有如SEQ ID NO：3所示OsMeJA启动子全长核苷酸序列及如SEQ ID NO：6所示OsMeJA信号肽的核苷酸序列。

设计包含如SEQ ID NO：7所示序列的正向引物以及如SEQ ID NO：8所示序列的反向引物的第三引物对，并以人类胚胎干细胞(目录编号：PT-5006，购自Lonza公司，瑞士)的DNA作为聚合酶连锁反应的模板DNA进行PCR，以扩增得到如SEQ ID NO：9所示hPELN部分人类弹性蛋白(elastin)的核苷酸序列。该部分人类弹性蛋白为多種人类弹性蛋白mRNA修饰性(RNA splicing)中序列保守区域的部分片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。

设计包含如SEQ ID NO：10所示序列的正向引物以及如SEQ ID NO：11所示序列的反向引物的第四引物对，并以水稻基因体DNA作为聚合酶连锁反应的模板DNA进行PCR，以扩增得到如SEQ ID NO：12所示Ostml水稻终止子的核苷酸序列。

利用

HD试剂盒(

HD Cloning Kit)(购自Takara Bio公司，日本)将hPELN部分人类弹性蛋白的核苷酸序列及Ostml水稻终止子的核苷酸序列插入pCAMBIA1301载体中(binary vector)(购自CAMBIA公司，澳州)，以得到如图1中B所示的pCAM-OsMeJA-hPELN-Ostml质粒。

实施例3通过瞬时转染分析OsMeJA启动子的活性

将叶龄为30天至35天的野生型烟草的叶片消毒后，利用打孔器将叶片进行打孔，以取得直径为1公分的叶圆盘。

将pCAMBIA1390质粒(阴性对照组)、pCAMBIA1304质粒(阳性对照组)及pMeJA-GFP-GUS质粒分别转化至EHA105农杆菌中，之后将经过转化的EHA105农杆菌接种于含有卡那霉素(kanamycin)的固体YEP培养基上，并于28℃黑暗条件下培养约36小时，以生成单一菌落。挑取阳性菌落，并分别培养于含有20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)的MS液体培养基中，以活化阳性EHA105农杆菌。利用农杆菌渗透缓冲液(agroinfiltration buffer)将各阳性EHA105农杆菌的浓度(OD₆₀₀)稀释至0.8，以得到浸泡液，之后将各叶圆盘浸泡于各浸泡液中，并真空抽气15至20分钟，使浸泡液完全浸润叶圆盘，以得到经转染的叶圆盘。

将经转染的叶圆盘自浸泡液中取出，并以擦手纸擦拭后，置放于塑料培养皿中。将浓度为0.0095％酒精(对照)或含有30μM茉莉酸甲酯(MeJA)的酒精分别喷洒于各叶圆盘的表面后，静置2天，以得到未经MeJA处理或经MeJA处理的经转染的叶圆盘。

将未经MeJA处理或经MeJA处理的经转染的叶圆盘分别与1ml X-Gluc溶液混合，并抽气60分钟后，于37℃且黑暗条件下反应16小时；的后再以95％酒精去除未经MeJA处理或经MeJA处理的经转染的叶圆盘的叶绿素后，将未经MeJA处理或经MeJA处理的经转染的叶圆盘保存于70％乙醇中，以得到各经GUS染色的叶圆盘。如附图2所示，结果显示相较于未经MeJA处理的经pMeJA-GFP-GUS转染的叶圆盘，经MeJA处理的经pMeJA-GFP-GUS转染的叶圆盘呈现较深的蓝色染色结果。说明经MeJA处理的转染了pMeJA-GFP-GUS的叶圆盘中能够增强目的蛋白的表达。

将各经转染的叶圆盘于4℃下与450μL GUS萃取缓冲液混合并进行研磨，于4℃下以16,000g转速离心后，取上清液，以得到各经萃取的蛋白质。各经萃取的蛋白质再以牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)标准品进行蛋白质定量。

将20μL各经萃取的蛋白质分别与30μL GUS萃取缓冲液及50μL GUS分析缓冲液混合，于37℃且黑暗环境下反应10分钟、40分钟及70分钟，以得到各反应液。于反应10分钟、40分钟及70分钟后分别取20μL反应液与180μL 0.2M Na₂CO₃混合以终止反应，并检测4-甲基伞型酮(4-methylumbelliferone,4-MU)的荧光值，以计算各经萃取的蛋白质于单位时间所产生的相对荧光量。

将各经萃取的蛋白质于单位时间所产生的相对荧光量除以各经萃取的蛋白质的总蛋白质量，以得到各经萃取的蛋白质的GUS活性。4-MU为标准品，受UV激发能产生荧光。GUS活性分析是一种相对定量方法。将固定量总蛋白质萃取与作用物4-MUG反应，作用物会被GUS转化为4-MU，GUS含量越多或活性越强，说明产生的4-MU越多，经UV激发检测在单位反应时间内的荧光强度相当于多少浓度4-MU标准品所发出的荧光量，可以代表GUS蛋白的活性。结果如附图3所示，结果说明经MeJA处理确实能增强OsMeJA启动子的活性。

实施例4在水稻悬浮细胞内使OsMeJA启动子经由MeJA诱导表现hPELN外源蛋白

依据参考文献Nishimura等人(2006)的内容，利用农杆菌转染方法，透过pCAM-OsMeJA-hPELN-Ostml质粒，将OsMeJA启动子、hPELN与Ostml嵌合基因导入水稻基因体内，以得到独立的转染水稻株。

随机挑选转染水稻株，并依据参考文献Lu等人(1998)的内容，建立各转染水稻株的水稻悬浮细胞，使水稻悬浮细胞在28℃黑暗中且在含有30μMMeJA的培养环境下进行培养。在培养一周后，收集水稻悬浮细胞的培养液。在4℃下，将培养液以转速8000rcf(g)离心20分钟，并取上清液。利用5μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)将上清液进行过滤，以得到过滤液；之后利用12至14kD MW CO透析膜将过滤液对MilliQ水进行透析(过滤液与MilliQ水的体积比为1：10)，期间更换2次MilliQ水，以得到透析液。最后利用0.45μm PVDF膜将透析液进行过滤，以得到经hPELN转染的水稻萃取液。

将经hPELN转染的水稻萃取液浓缩10倍后，利用抗人类α-弹性蛋白抗体(目录编号：ab21607，购自Abcam公司，英国)进行西方墨点法分析，如附图4所示，结果显示经hPELN转染的水稻萃取液中存在约32kDa的hPELN外源蛋白(附图4中箭头所示)，证实在水稻悬浮细胞内经由MeJA诱导确实能够使OsMeJA启动子表现hPELN外源蛋白，并将hPELN外源蛋白从水稻悬浮细胞分泌至水稻萃取液中。实施例5检测添加经hPELN转染的水稻萃取液对于人类皮肤角质细胞株及人类上皮纤维母细胞株的毒性

将HaCaT人类皮肤角质细胞株(

CRL-2404^TM，购自ATCC公司，美国)种植于的含有5％胎牛血清及1％抗生素P/S的高葡萄糖达尔伯克氏必需基本培养基DMEM的96孔盘中，以及将CCD966SK人类上皮纤维母细胞株(购自生物资源保存及研究中心BCRC，中国台湾)种植于含有0.1mM非必需氨基酸、1.5g/L碳酸氢钠、1mM丙酮酸钠、10％胎牛血清及1％抗生素P/S的MEM/EBSS液体培养基的96孔盘中，使各孔中含有3,000至5,000个细胞株，并将96孔盘置放于细胞培养箱中培养24小时，以使各细胞株贴附于96孔盘中。的后去除细胞培养液，并于各孔中分别加入200μl的含有蛋白质浓度为0.5μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、20μg/mL及50μg/mL的野生株的水稻萃取液或经hPELN转染的水稻萃取液的细胞培养液，培养36小时后再去除含有野生株的水稻萃取液或经hPELN转染的水稻萃取液的细胞培养液，并利用1X磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)清洗各细胞株。的后于各孔中加入100μl的与5mg/mL溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)混合的细胞培养液(MTT：细胞培养液的体积比为1：9)，并于细胞培养箱中避光培养3小时。的后去除与MTT混合的细胞培养液后，于各孔中加入100μl二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)并于震荡器中摇晃5分钟，最后测定OD₅₇₀的吸光值，以检测细胞存活率。结果如附图5所示，结果说明蛋白质浓度为0.5μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、20μg/mL及50μg/mL的野生株的水稻萃取液及经hPELN转染的水稻萃取液对于HaCaT细胞株及CCD966SK细胞株皆无毒性。

实施例6检测添加经hPELN转染的水稻萃取液对于CCD966SK细胞株中保水相关基因表达的影响

将CCD966SK细胞株种植于含有细胞培养液的6孔盘中，使各孔中含有50,000个细胞株，并将6孔盘置放于细胞培养箱中培养24小时，以使各细胞株贴附于6孔盘中。的后去除培养液，并于各孔中加入200μl的蛋白质浓度为50μg/mL的野生株的水稻萃取液或经hPELN转染的水稻萃取液，培养36小时后再去除培养液，并利用1X磷酸盐缓冲生理盐水清洗各细胞株。的后于各孔中加入0.5ml TRIzol^TM试剂(目录编号：15596026,Invitrogen)及异丙酮，以得到细胞混合物；将细胞混合物于室温下静置10分钟后，以12,000xg转速于4℃下离心10分钟；的后去除上清液，并利用1ml的70％酒精清洗沉淀物后，以10,000xg转速于4℃下离心5分钟，并去除上清液。最后利用经焦碳酸二乙酯处理的水溶解沉淀物，以得到各细胞株的RNA。

利用SuperScript^TM III Transcriptase(目录编号：18080-093)(Thermo FisherScientific，麻萨诸塞州，美国)制备各细胞株的cDNA，的后利用KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix(2X)套组(目录编号：KR0389_S，Sigma-Aldrich)并设计包含如SEQ ID NO：13所示序列的正向引物以及如SEQ ID NO：14所示序列的反向引物的第五引物对、包含如SEQ IDNO：15所示序列的正向引物以及如SEQ ID NO：16所示序列的反向引物的第六引物对、包含如SEQ ID NO：17所示序列的正向引物以及如SEQ ID NO：18所示序列的反向引物的第七引物对，以及包含如SEQ ID NO：19所示序列的正向引物以及如SEQ ID NO：20所示序列的反向引物的第八引物对，以各细胞株的cDNA作为模板进行实时聚合酶连锁反应(real-timepolymerase chain reaction，RT-PCR)，分别扩增如SEQ ID NO：21所示的人类玻尿酸合成酶hHAS2核苷酸序列、SEQ ID NO：22所示的人类玻尿酸合成酶hHAS3核苷酸序列、SEQ IDNO：23所示的人类水通道蛋白hAQP3核苷酸序列，以及及SEQ ID NO：24所示的人类丝聚蛋白hFLG核苷酸序列。

结果如附图6所示，相较于在CCD966SK细胞株中添加野生株的水稻萃取液，在CCD966SK细胞株中添加经hPELN转染的水稻萃取液可使CCD966SK细胞株中与保水相关的人类玻尿酸合成酶hHAS2及hHAS3的基因表现分别提升9％及15％、与细胞渗透相关的人类水通道蛋白hAQP3的基因表现提升15％，以及与细胞结构及屏障功能相关的人类丝聚蛋白hFLG的基因表现提升9％。细胞中的hHAS2、hHAS3、hAQP3及hFLG基因表现的增加可提升细胞的保水度以及屏障功能。说明该组合物具有保湿和修复皮肤屏障的功能。

上述实施例仅例示性说明本发明的经分离的启动子序列以及其用途，而非用于限制本发明。任何熟习此项技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围，应如后述的申请专利范围所载。

序列表

<110> 广州可普睿生物科技有限公司

<120> 一种水稻表达系统的诱导性启动子及合成生物平台和其应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

aaaaagcagg cttcctttcc aacatatcgg tatctc 36

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

agaaagctgg gttggtgact tctgtgatgg ag 32

<210> 3

<211> 1034

<212> DNA

<213> Oryza sativa L. cv Tainung 67

<400> 3

ttggcttatg atgacaacta cgacactaca aatcaatttt cacaatgaat ctgctcttaa 60

tttagtgaga gcaaccatga ggacgatgct tcacaggcaa gtgctattgc tctgctagcc 120

tgctacatgc agttccaatt aatgtgtatc tcaaaccttt acagaacatg tattatttat 180

gagaaaaaga tgtccgcata tcctttccaa catatcggta tctcatcttt ttaagtcaaa 240

attgttagta tcagaacaga atatctatca gatagcaggc ctaactttct gacctactcc 300

ttatatctta gttcagggtt gttcacagaa gaaacagccc aatttagcag ctgttctttc 360

cttttctcct gtcactgtag caagagagaa agaaagtgaa agattagccc cactattcac 420

aaactactga aatagatcca agaagaaaag tatttcaaaa agaaaatttg aaaaagaata 480

atgttttttt tctcctgtca gtcatgccaa aatccaaatg agacagtgta gttgaccttt 540

gcagtcaacc agtttggcct ctgtactagc cctgctttgg atcttctgga agctgtccct 600

gtaaggttta cttcagtttg tggatttcaa aagttgggac ttttctttga tatagttagt 660

tggaagagta agacagaagt gtacctaata atcagaatat tgtgaatttt tttagtcaca 720

tattctctct tcacatctta aagattatcc tgcatggcaa atcaaataag agtcagccat 780

tgaggaaccc ttccaacctc atccaatcga atcagttgaa aattttgacc ttatctccta 840

cattcaaacc ttggttgagc agtccattca gaaggctctg tttcttcagc accatttaat 900

ttttcatttg acaaaatctt ggtggttgat ttgtgagcca caaaacaagt tataaattca 960

gcgttcttct gaagattgca gcagcgtcct caaccaatca attgcaagca atttctccat 1020

cacagaagtc acca 1034

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ccaagctttc ctttccaaca tatcggtatc tc 32

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

aaccatggcg aggttggagt ttactgccg 29

<210> 6

<211> 75

<212> DNA

<213> Oryza sativa L. cv Tainung 67

<400> 6

atgggctccg ccaagctcat tgctgtagtc ctcctcccgg cccttctggc cttccaagct 60

ccaatggcca cggca 75

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

aaccatggtc ccactggggt atcccatcaa 30

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ccagatcttc aaatgcctcc aactccgact c 31

<210> 9

<211> 585

<212> DNA

<213> human

<400> 9

atggtcccac tggggtatcc catcaaggcc cccaagctgc ctggtggcta tggactgccc 60

tacaccacag ggaaactgcc ctatggctat gggcccggag gagtggctgg tgcagcgggc 120

aaggctggtt acccaacagg gacaggggtt ggcccccagg cagcagcagc agcggcagct 180

aaagcagcag caaagttcgg tgctggagca gccggagtcc tccctggtgt tggaggggct 240

ggtgttcctg gcgtgcctgg ggcaattcct ggaattggag gcatcgcagg cgttgggact 300

ccagctgcag ctgcagctgc agcagcagcc gctaaggcag ccaagtatgg tgctgctgca 360

ggcttagtgc ctggtgggcc aggctttggc ccgggagtag ttggtgtccc aggagctggc 420

gttccaggtg ttggtgtccc aggagctggg attccagttg tcccaggtgc tgggatccca 480

ggtgctgcgg ttccaggggt tgtgtcacca gaagcagctg ctaaggcagc tgcaaaggca 540

gccaaatacg gggccaggcc cggagtcgga gttggaggca tttga 585

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gagaaaatga agatctataa atctagcata tacataggct 40

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tggtcacctg taattcacac gtggtacaac atgcccaata ca 42

<210> 12

<211> 263

<212> DNA

<213> Oryza sativa L. cv Tainung 67

<400> 12

ataaatctag catatacata ggctatgcgt acaatacgat aatgcataca tacatacgtc 60

gtaccgtgta gcagtatatg cagatgtgag atcaatccca ataatagtat ttatgtttat 120

gtttaatttc aggaatatgt atgcaacgaa taaatcatat gtaaaaggtt atatatgtat 180

aaagttgtat cacccttatt tatcatgcta gctgcagttt gtttggaata aattaataaa 240

gatgtgtatt gggcatgttg tac 263

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

cctcatcatc caaagcctgt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

aaacagttgc cctttgcatc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

gtcatgtaca cggccttcaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

cctacttggg gatcctcctc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

catctacacc ctggcacaga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ggctgtgcct atgaactggt 20

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

gttacaattc caatcctgtt gttttc 26

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

cgttgcataa taccttggat gatc 24

<210> 21

<211> 100

<212> DNA

<213> human

<400> 21

cctcatcatc caaagcctgt ttgccttttt ggagcaccga aaaatgaaaa aatccctaga 60

aacccccata aagttgaaca aaacagttgc cctttgcatc 100

<210> 22

<211> 131

<212> DNA

<213> human

<400> 22

gtcatgtaca cggccttcaa ggccctcggc gattcggtgg actacatcca ggtgtgcgac 60

tctgacactg tgctggatcc agcctgcacc atcgagatgc ttcgagtcct ggaggaggat 120

ccccaagtag g 131

<210> 23

<211> 202

<212> DNA

<213> human

<400> 23

catctacacc ctggcacaga cgctgggagc cttcttgggt gctggaatag tttttgggct 60

gtattatgat gcaatctggc acttcgccga caaccagctt tttgtttcgg gccccaatgg 120

cacagccggc atctttgcta cctacccctc tggacacttg gatatgatca atggcttctt 180

tgaccagttc ataggcacag cc 202

<210> 24

<211> 92

<212> DNA

<213> human

<400> 24

gttacaattc caatcctgtt gttttcaagg aaagatctga tatctgtaaa gcaagtgcgt 60

ttggtaaaga tcatccaagg tattatgcaa cg 92

<210> 25

<211> 194

<212> PRT

<213> human

<400> 25

Met Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly

1 5 10 15

Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro

20 25 30

Gly Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr

35 40 45

Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

50 55 60

Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala

65 70 75 80

Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala

85 90 95

Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys

100 105 110

Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly

115 120 125

Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val

130 135 140

Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro

145 150 155 160

Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala

165 170 175

Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly

180 185 190

Gly Ile

Claims

1.一种核酸分子，为以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：

(Ⅰ)核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的核酸分子；

2.一种表达盒，含有权利要求1所述的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒还含有目的基因区。

4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，权利要求1所述的核酸分子位于目的基因区的上游。

5.根据权利要求2至4任一项所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒中还含有转录起始区、转录终止区和翻译终止区。

6.根据权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒依次包含有启动子区、转录起始区、目的基因区、转录终止区和翻译终止区；其中启动子区由权利要求1所述的核酸分子组成。

7.一种载体，含有权利要求1所述的核酸分子。

8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于，所述载体中还含有转录起始序列、目的基因序列、转录终止序列和翻译终止序列。

9.根据权利要求7所述的载体，其特征在于，所述载体中还含有限制酶切位点。

10.根据权利要求7所述的载体，其特征在于，所述载体中还含有标记基因。

11.根据权利要求7至10所述的载体，其特征在于，所述载体中还含有目的基因序列。

12.根据权利要求11所述的载体，其特征在于，所述目的基因序列为人类弹性蛋白的核苷酸序列或部分人类弹性蛋白的核苷酸序列。

13.根据权利要求12所述的载体，其特征在于，所述部分人类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。

14.一种细胞，含有权利要求7至13任一项所述的载体。

15.根据权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述细胞为水稻细胞。

16.权利要求1所述的核酸分子作为启动子的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述启动子受茉莉酸甲酯诱导。

18.权利要求1所述的核酸分子、权利要求2至6任一项所述的表达盒、权利要求7至13任一项所述的载体或权利要求14至15任一项所述的细胞在启动目的基因的表达中的应用。

19.一种表达目的基因的方法，其特征在于，所述方法以权利要求1所述的核酸分子作为启动子来启动目的基因的表达。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述启动子受茉莉酸甲酯诱导。

21.一种表达目的基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一项所述的步骤：

(Ⅰ)将权利要求1所述的核酸分子插入到任意目的基因或增强子的上游；

(Ⅱ)将目的基因插入权利要求2至6任一项所述表达盒中权利要求1所述核酸分子的下游；

(Ⅲ)将目的基因插入权利要求7至13任一项所述载体中权利要求1所述核酸分子的下游。

22.一种转基因植物的构建方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的核酸分子、权利要求2至6任一项所述的表达盒或权利要求7至13任一项所述的载体转入受体植物中的步骤。

23.一种组合物，所述组合物中包含以下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：

(Ⅰ)权利要求19或20所述方法制备得到的目的基因的表达产物；

(Ⅱ)权利要求21所述方法制备得到的目的基因的表达产物；

(Ⅲ)权利要求22所述方法构建得到的转基因植物的培养液、提取液或萃取液。

24.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述目的基因的表达产物包括细胞培养液、提取液或萃取液。

25.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述目的基因的序列为人类弹性蛋白的核苷酸序列或部分人类弹性蛋白的核苷酸序列。

26.权利要求23至25任一项所述的组合物在制备化妆品或护肤品中的应用。