CN101864433B - 一种基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法及其应用，在构建外源性表达载体pPIC-Rpf的基础上，将其转化毕赤酵母制备重组子，经过抗性筛选得到分泌Rpf蛋白的毕赤酵母重组子。该毕赤酵母表达系统能够持续分泌具有生物活性的Rpf蛋白，该蛋白能够促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和结核分枝杆菌H37Ra的生长，促进临床TB病人痰标本中MTB的生长，可用于临床TB的快速诊断。

Description

一种基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及细菌复活促进因子(Rpf因子)的表达与纯化，特别涉及一种基于转化体的分泌型Rpf蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

1、Rpf因子的功能与结构

Rpf(Resuscitation-promoting factor，Rpf)是一种细菌复活促进因子，其功能类似于真核生物的生长因子，可以在皮克(10^-12)水平以自分泌和旁分泌形式促进休眠菌的复活和生长，所以被称为细菌的生长因子。该因子最初是在藤黄微球菌(M.luteus)中发现，Rpf因子除能促使休眠菌复活和生长以外，对正常生长的细菌也有相应的效果；其机制可能是参与了细胞间的信号转导。目前已查明了Rpf氨基酸顺序并确定了编码这种蛋白的基因，相似的Rpf基因广泛分布在高G+C％含量的革兰氏阳性菌中。

藤黄微球菌Rpf蛋白理论上是一个分子量为19kD的蛋白质，氨基端是由75个氨基酸残基组成的保守区，三级结构具有溶菌酶样折叠，形成一个能与寡聚糖结合的裂隙，在第54位有一个非常保守的谷氨酸残基，推测其有催化功能。保守区氨基酸序列与结核分枝杆菌Rpf样蛋白相似(75％的氨基酸残基相同)；羧基端是可变区，由109个氨基酸残基组成，包括与细胞壁肽聚糖结合的LysM结构域，该区域有结合细胞壁的能力；两个结构域由较短的连接区连接。Viktoria等研究琥珀中分离的藤黄微球菌发现：它的Rpf的保守区和可变区与实验室保存菌株区别不大，但连接区区别较大，保存菌株的连接区只有10个氨基酸而分离菌有120个氨基酸之多，推测可能是环境适应的结果；分离菌另一个特点是Rpf结合到细胞壁上，而不释放到周围环境，分离菌抗溶菌酶能力也比保存菌强。

Mukamolova等通过实验证明了藤黄微球菌Rpf蛋白具有胞壁溶解活性：当表达并分泌到细胞质中能够引起大肠埃希氏菌裂解；能够从荧光胺标记的细胞壁上释放荧光；能水解人工合成的溶菌酶底物；能水解藤黄微球菌细胞壁粗提物；使含有细胞壁粗提物的聚丙烯酰胺凝胶形成透明圈。他们测定的Rpf溶菌活性只有溶菌酶的五十分之一，另外，藤黄微球菌Rpf还有弱的胰蛋白酶样活性；当改变Rpf多肽链的第54位的谷氨酸时，其水解肽聚糖的活性降低。

大肠杆菌表达体系中获得的Rpf往往以包涵体形式存在，纯化过程必须先变性再复性才能得到该蛋白，这样剧烈的条件难以保证Rpf的生物活性。毕赤酵母表达系统是近年发展起来的高效分泌表达系统，可对目的蛋白进行翻译后修饰。该表达系统不含有特异性的病毒，不产生毒素，基因工程操作简便，大规模发酵工艺简单，成本低廉。毕赤酵母表达系统的另一优越性就是系统表达产物直接分泌到培养基中，不需复杂的破菌过程，且上清中杂蛋白含量很低，这不但使目的蛋白易于纯化，同时也有益于保持目的蛋白的生物学活性。目前已有200多种重组蛋白在该系统中表达。

2、结核病临床诊断中存在的问题

目前我国常规的TB诊断方法仍是结核菌素试验结合抗酸染色和分离培养。结核菌素试验结合抗酸染色的方法准确率较高，但漏检率亦高，其主要原因是人群普遍接种BCG后，结核菌素试验的诊断价值已大大降低，常用的涂片染色镜检法是抗酸染色法，属低敏感性方法，阳性率不到40％。另外，抗酸性是分枝杆菌属的特征，并非结核菌种的特性。因此，涂片染色镜检阳性时，应仅报告抗酸杆菌阳性，但临床上往往是将“抗酸杆菌阳性”等同于“结核菌阳性”，这实际上是临床医生结合其它有关的临床资料的综合诊断，并非细菌学的认定。有报道指出，临床诊断为TB的细菌分离株中，经鉴定后发现有2％～5％为非结核分枝杆菌。分离培养的检出率也很低，尤其对于持留菌、休眠菌及代谢异质菌无法成功培养。

国内外近年来尝试建立了几种新的诊断方法，如通过检测抗MTB抗体或通过PCR法检测MTB的核酸等来辅助诊断结核病，这些方法的敏感性较前述方法高，但检出率一般也仅在70％左右，而且假阳性率亦较高。同时由于耐药菌株的大量出现，治疗需要药物敏感实验的指导，虽然利用基因芯片、单链构象多态性等方法可以进行快速耐药菌株鉴定，但由于一些引起耐药的基因突变位点尚不清楚、一些突变位点为无意义突变、新抗生素使用等，使其敏感性不足80％，且试验结果必须用表型方法验证。所以常规药物敏感实验仍是临床上最常采用的方法。

目前国内尚无适用于临床TB病人的简便、敏感、特异的检验方法。一些新的检验方法虽然敏感性提高，但特异性下降，同时这些方法多针对结核分枝杆菌的，因此仅适用于开放性活动性结核，而不适用于非开放感染。目前MTB感染诊断的金标准仍是细菌培养和痰涂片直接镜检。分离培养是较敏感的方法，可检出菌量为100菌落形成单位/毫升(cfu/mL)的细菌，MTB的培养检查常常作为TB诊断的参照方法或金标准。

因此，无论是要进行TB诊断还是有关的药物敏感实验，都首先要分离到MTB。临床检验上常规MTB的分离培养存在的主要问题是敏感性低和所需时间太长。MTB生长缓慢，普通细菌约20分钟分裂一次，MTB则需20小时才繁殖一代，MTB培养要4～6周时间，很多临床分离株、特别是耐药株原代培养结束、观察报告最后为阴性结果的时间延长到8周。所以，有必要建立MTB简便、快速、特异性高的检测方法，尤其是缩短检出时间和提高敏感性。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种分泌型Rpf因子的制备方法及其应用，通过构建毕赤酵母表达系统制备分泌型的Rpf因子，该蛋白能够促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和MTB减毒株H37Ra的生长，能够促进临床TB病人痰标本中MTB的生长，缩短临床TB诊断的时间。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于酵母表达系统的分泌型Rpf因子的制备方法，包括以下步骤：

1)以藤黄微球菌(M，luteus)基因组为模板，以引物对P为引物，PCR扩增Rpf基因；所述的引物对P为：

上游引物P1：gcctcgagaa acgagaggct gacaccatga ctctcttcac    ；

下游引物P2：tagcggccgc tcaggcctga ggcaggacga gctcc         ；

2)将PCR扩增的Rpf基因用XhoI和NotI双酶切得到线性化的片段；并将该线性化片段与被XhoI和NotI双酶切的pPIC9K载体片段连接得到重组酵母表达载体pPIC-Rpf；将重组酵母表达载体pPIC-Rpf转化到感受态的毕赤酵母，筛选得到整合了目的基因的阳性转化子；

3)将阳性转化子在BMGY培养基中30℃、200r/min条件下培养，当OD600达到2.0～6.0时，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬进行诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度为0.5％，30℃、200r/min条件下继续培养96～120h后收集培养上清液；

4)将收集的培养上清液通过层析分离纯化得到Rpf因子。

所述的重组酵母表达载体pPIC-Rpf包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

重组酵母表达载体pPIC-Rpf转染感受态毕赤酵母为：

将酶切线性化的重组酵母表达载体pPIC-Rpf与感受态毕赤酵母混合后，滴加于0.1cm电转杯中，冰水浴5min，于电压1800V，电容25uF，电阻200Ω条件下电击转化；

电击后，立即加入1mL浓度为1M预冷的山梨醇，混匀，30℃条件下静置2h，涂布于MD平板，30℃培养2～3天，直至出现菌落。

所述的培养上清液通过凝胶层析分离纯化为：

将收集的培养上清液浓缩后洗脱除盐，收集包含Rpf因子主峰的粗纯化洗脱液；将收集的粗纯化洗脱液经浓缩、透析后上样于阴离子交换层析柱，用含0～1mol/L NaCl的pH 8.0、20mmol/L Tris-HCl洗脱分离，收集包含纯化Rpf因子主峰的洗脱液。

一种转化体，宿主细胞为毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含Rpf基因的重组酵母表达载体pPIC-Rpf。

所述的重组酵母表达载体pPIC-Rpf是以包含Rpf基因的载体为模板，以引物对P为引物，PCR扩增Rpf基因，然后将Rpf基因用XhoI和NotI双酶切得到线性化的片段，并将该线性化片段与XhoI和NotI双酶切的pPIC9K载体片段连接而得到。

分泌型的Rpf因子应用于结核分枝杆菌(M. tuberculosis)的复苏和促生长。

所述的结核分枝杆菌是临床痰标本中的结核分枝杆菌。

分泌型的Rpf因子的浓度为10～1000pM。

分泌型的Rpf因子应用于耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和结核减毒株H37Ra的促生长。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明通过构建包含Rpf因子的毕赤酵母表达体系，成功表达出分泌型Rpf因子；该Rpf因子能够在pM水平促进结核减毒株的生长。

在已完成的40例病人痰标本中，当培养基中加入Rpf因子后其培养时间比常规方法平均缩短一周以上，而且细菌数量明显增加；Rpf因子对结核减毒株和TB病人痰标本最适作用浓度在100pM范围内。

本发明提供的分泌型Rpf因子有利于建立结核分枝杆菌快速、敏感的检测方法，解决结核菌生长缓慢和敏感性低的问题，有利于改进临床检验上常规MTB的分离培养和药物敏感实验方法，缩短结核菌检测所需时间。

2、Rpf因子在大肠杆菌表达体系中往往以包涵体形式存在，纯化过程必须先变性再复性才能得到该蛋白，这样剧烈的条件难以保证Rpf因子的生物活性。本发明通过构建持续分泌Rpf因子的毕赤酵母表达体系，并对表达产物进行了凝胶层析分离纯化，整个过程没有使蛋白变性，保证了Rpf完整的生物活性；

本发明制备的Rpf可以在pM水平促进耻垢休眠菌的复苏和生长；Rpf对耻垢休眠菌作用的最适浓度在100pM范围内。

3、利用本发明能够筛选到高表达的重组酵母菌，重组pPIC-Rpf酵母转化子表达的Rpf因子约占总分泌蛋白量的35％；目的蛋白的经过两次凝胶层析能够分离到纯度在90％以上的Rpf因子；

而且将筛选得到的高表达菌株通过5L贝朗发酵罐诱导表达，能够获得大量的具有较高生物活性的Rpf因子。

附图说明

图1是PCR扩增Rpf基因片段的电泳检测结果图；

图2是pPIC9K载体的质粒图谱；

图3是pPIC-Rpf载体经XhoI/NotI双酶切结果图；

图4是pPIC-Rpf载体经PCR扩增鉴定结果图；

图5是pPIC-Rpf转染阳性的酵母转化子的PCR鉴定结果；

图6是pPIC-Rpf酵母转化子培养上清的SDS-PAGE电泳；

图7是pPIC-Rpf酵母转化子培养上清的Western-blot分析结果；

图8是Rpf因子作用下耻垢分枝杆菌的生长曲线；

图9是Rpf因子作用下MTB H37Ra的生长曲线；

图10是痰涂片阳性的TB患者标本在Rpf因子作用下的生长曲线。

具体实施方式

本发明提供一种分泌Rpf因子(Rpf蛋白)的毕赤酵母表达体系，在构建外源性表达载体pPIC-Rpf的基础上，将其转化毕赤酵母制备重组子，经过抗性筛选得到分泌Rpf蛋白的毕赤酵母重组子；并对目的基因的表达和Rpf促MTB复苏和生长的效果进行验证。下面结合附图对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、Rpf基因的克隆及表达载体pPIC-Rpf的构建

根据GenBank中的Rpf基因序列(NC_012803.1，GeneID：7985360)设计并人工合成引物对P：

上游引物P1：gcctcgagaa acgagaggct gacaccatga ctctcttcac    40；

下游引物P2：tagcggccgc tcaggcctga ggcaggacga gctcc         35；

其中，上游引物P1包含XhoI酶切位点(ctcgag)和分泌表达所需的序列，下游引物P2包含NotI酶切位点(gcggccgc)和终止子，由宝生物工程(大连)有限公司合成。

以藤黄微球菌(M，luteus)基因组为模板(来自第四军医大学附属西京医院临床检验科)为模板，以引物对P为引物扩增目的基因Rpf。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30s，55℃40s，72℃50s，共30个循环；再于72℃延伸5min。回收PCR产物后，进行10g/L的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，泳道M为Marker，泳道1为扩增的Rpf基因片段，可以看出PCR扩增的Rpf基因片段约为672bp。

将Rpf基因片段克隆入pMD18-T载体，送宝生物工程(大连)有限公司测序，Rpf基因的测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，经过比较与GenBank报道的完全一致；将测序正确的载体命名为pMD18-T-Rpf。

将pMD18-T-Rpf质粒经XhoI/NotI双酶切回收后用连接试剂盒连接入同样经过XhoI/NotI双酶切的pPIC9K(Invitrogen.，Catalog no.V175-20；pPIC9K载体质粒图谱如图2所示)载体回收连接后的片段，并电转化大肠杆菌JM109感受态细胞。

将转染后的大肠杆菌涂布于含氨苄青霉素100mg/L的LB平板，37℃培养，在同一平板上随机筛选4个菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，收菌后提取质粒DNA；

将提取的质粒DNA用XhoI和NotI双酶切，37℃反应两小时，然后进行10g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图3所示，泳道M为Marker，泳道1～2为阳性克隆提取质粒的双酶切，可以看到出现了672bp的目的基因片段；

以提取的质粒DNA为模板，以引物对P为引物，按照Rpf基因扩增程序进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行凝胶电泳鉴定，结果如图4所示，泳道M为Marker，泳道1～2为阳性克隆提取质粒的PCR结果，可以看到出现了672bp的目的基因片段；将构建正确的包含目的基因片段的载体命名为重组酵母表达载体pPIC-Rpf。

2、酵母宿主菌的转化及阳性转化子的筛选

毕赤酵母(Pichia pastoris)基因表达系统是近年来发展起来的一种新型外源基因表达系统，它既具有原核表达系统易于遗传操作和培养的优点，又具有对重组蛋白进行正确的折叠和翻译后加工修饰(如糖基化)等特点，而且毕赤酵母自身分泌的蛋白质较少，有利于外源蛋白的分离纯化，蛋白表达水平高，适宜高密度培养，且具有分泌型表达的优势，为工业化生产和纯化提供了极大便利。因此，本发明采用毕赤酵母作为宿主细胞。Rpf因子的毕赤酵母高效真核表达系统的建立具体为：

本发明首先将重组酵母表达载体pPIC-Rpf经Sal I酶切(pPIC9K载体中的一个酶切位点)线性化，并应用乙醇沉淀法浓缩线性化的pPIC-Rpf载体，使之浓度达到1μg/μL；

然后取80μL酵母菌感受态细胞(His营养缺陷株)与10μg线性化的重组酵母表达载体pPIC-Rpf混合，用加样器将其滴加于0.1cm电转杯中，冰水浴5min，用Bio-Rad Gene

II电转仪于电压1500V，电容25μF，电阻200Ω条件下电转化，将pPIC-Rpf转化到Pichiapastoris SMD1168的基因组中；

电击后，立即加入1mL浓度为1M冰预冷的山梨醇，混匀，转移至15mL离心管中，30℃，静置2h；分别取重组的酵母菌液涂布于MD平板，30℃培养2～3天，直至出现菌落，筛选得到His⁺重组克隆(由于毕赤酵母菌在组氨酸脱氢酶位点His4有突变，因而不能合成组氨酸，不能在不含组氨酸的MD平板上生长，而pPIC9K载体上含有His4基因可与宿主进行互补，使重组转化子获得合成组基酸的能力，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子)。

将筛选得到His⁺重组克隆分别涂布于G418浓度逐渐升高(0.25～2.0mg/ml)的YPD(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)平板上，涂布0.25的浓度后再划线涂布于更高浓度的平板上，每次涂布30℃培养2～3天，挑取具有G418抗性的菌落，在YPD(含G418)平板上划线进行纯化，筛选得到阳性转化子，作为诱导表达的候选菌株。

挑取G418抗性的菌落，以P1和P2为引物，PCR检测G418抗性的菌落中是否含有重组的表达载体，验证阳性转化子。PCR扩展产物的电泳结果如图5所示，泳道M为Marker，泳道1～2为阳性酵母转化子的PCR结果，可以看到泳道1～2均出现了672bp的目的基因片段。

本发明中外源基因是以整合的方式插到酵母的染色体上，pPIC9K含有卡那霉素抗性基因，在酵母中则抗G418，有文献报道在大多数情况下外源基因表达量与拷贝数成线性关系，故用其筛选导入酵母的多拷贝的重组质粒。若多拷贝的表达单元整合入酵母基因组中，其对G418的抗性能力就会加强，筛选多拷贝的转化菌株是期望其分泌的目的蛋白量增加。本发明通过提高培养基中G418的浓度来筛选多拷贝的转化菌株，最终在4mg/mLG418的平板筛选到工程菌株。

3、目的蛋白的诱导表达与高表达菌株的筛选

将筛选出的酵母转化子接种于250ml BMGY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/L磷酸钾，p H 6.0，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)中，30℃、200r/min培养至OD₆₀₀＝2.0～6.0，在室温下于1500～3000×g离心5min收集菌体；

将收集的菌体用BMMY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/L磷酸钾，pH 6.0，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甘油)悬浮，30℃、200r/min诱导培养(BMMY中含有甲醇，可以启动AOX1从而诱导蛋白表达)，每24h取样并补加甲醇至终浓度为0.5％，诱导96～120h后收集培养上清液；

不同的重组pPIC-Rpf酵母转化子培养上清经SDS-PAGE电泳检测，挑选目的蛋白Rpf因子(20kDa)表达量大的重组转化子，重组表达的Rpf因子大于总分泌蛋白量的35％作为生产菌株。

重组pPIC-Rpf酵母转化子培养上清的SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，其中，泳道M为蛋白标准分子量Maker，泳道1～2为正常酵母发酵液上清；泳道3为BMMY中的甲醇诱导前发酵液上清；泳道4为BMMY中的甲醇诱导后的发酵液上清；经过对比可以发现，重组转化子在被诱导表达后，目的蛋白Rpf因子以分泌的形式被表达，而且其分子量约为20kDa，同预计的目的蛋白大小相吻合。经凝胶薄层扫描检测蛋白含量，结果表明重组pPIC-Rpf酵母转化子表达的Rpf因子约占总分泌蛋白量的35％。

为了得到大量的Rpf因子，将筛选得到的高表达菌株通过5L贝朗发酵罐诱导表达，能够获得大量的具有较高生物活性的Rpf因子。

4、表达产物Rpf因子的分离纯化

发酵结束后，将发酵液4000r/min离心30min，收集上清液。上清液用300K超滤膜超滤，收集滤过液，300K滤膜可以除去发酵液中的大分子的核酸和蛋白。收集滤过液再用5K滤膜将滤过液，体积浓缩至发酵液体积的1/5。发酵过程中培养基加入了部分无机盐，为了对下一步纯化减少影响，使用G25除掉发酵液中残留的金属离子。

将浓缩后的发酵液进行Sephadex-G25柱除盐：用10倍柱体积的10mmol/L、pH8.0的磷酸缓冲液平衡Sephadex-G25柱后上样，上样量为柱体积的1/3，然后用相同缓冲液淋洗，收集包含Rpf因子主峰的粗纯化洗脱液(第一个洗脱峰)；

将粗纯化洗脱液用PEG20000进一步浓缩，透析后上样于平衡的DEAESepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用含0～1mol/L NaCl的pH 8.0、20mmol/L Tris-HCl洗脱目的蛋白，收集主蛋白峰。

5、表达产物Rpf因子的Western-blot鉴定

将收集纯化的Rpf蛋白与抗Rpf的单克隆抗体(由第四军医大学附属西京医院临床检验科樊爱林博士馈赠)做免疫印迹检测，化学发光法显色。结果如图7所示，其中，泳道M为蛋白标准分子量Maker，泳道1在相对分子量为20kDa处有一条带，表明纯化的Rpf因子含有能与Rpf单抗特异性相结合的表位。

6、纯化产物Rpf因子对耻垢休眠菌的复苏和促生长作用

参照Wayne[Wayne LG.Dormancy of Mycobacterium tuberculosis andlatency of disease.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1994，13(11)：908-914.]报道的方法，将乏氧休眠状态的耻垢分支杆菌以1∶100比例接种到含有10pM、100pM、1000pM Rpf因子的LB液体培养基中，同时以不含Rpf因子的培养作为对照；每隔4小时测定培养液的OD₆₀₀值，连续测定44小时，根据测定结果绘制生长曲线，结果如图8所示：

横坐标为检测的时间(h)，纵坐标为表示菌含量的OD₆₀₀检测值，与对照相比，可以看出Rpf蛋白能够促进耻垢休眠菌的复苏和生长，浓度在100pM时复苏作用明显，且与1000pM无显著差别。

7、Rpf对MTB H37Ra的复苏和促生长作用

取罗氏培养基中保存的MTB H37Ra株接种到Sauton’S培养基中，37℃密封培养2个月备后，取100μL转接到5mL 7H9培养基中，加入不同浓度(10pM、100pM、1000pM)Rpf，37℃条件下培养40天，同时以添加PBS的7H9培养基培养作为对照，每5天测定培养液的OD600值，根据测定结果绘制生长曲线，结果如图9所示：

横坐标为检测的时间(d)，纵坐标为表示细菌含量的OD600检测值，与对照相比，很明显可以看出Rpf因子能够促进MTB H37Ra的复苏和生长；当Rpf因子浓度为100pmol/L时，刺激的MTB复苏和生长作用明显，且与1000pmol/L无显著差别。

8、Rpf因子对临床痰标本中MTB促生长作用

收集痰涂片阳性的TB临床患者标本，用2％NaOH和N-乙酰-L-半胱氨酸消化去污法处理；加入不同浓度(10pM、100pM、1000pM)Rpf，37℃条件下在Sauton’S培养基中培养，同时以添加PBS的Sauton’S培养基培养作为对照，每5天测定培养液的OD600值(连续观察40天)，绘制生长曲线，观察Rpf因子对临床标本分离的MTB促生长作用；结果如图10所示：

横坐标为检测的时间(d)，纵坐标为表示菌含量的OD600检测值，与对照相比，可以看出Rpf因子能够促进临床标本中MTB的生长；当Rpf因子浓度为100pmol/L时，刺激MTB临床标本复苏和生长作用明显，且与1000pM无显著差别。在已完成的40例病人标本检测中，当培养基中加入Rpf因子后其培养时间比常规方法平均缩短一周以上，这样就缩短了TB诊断中分离、培养MTB的时间，有利于TB的简便、快速鉴定。

核苷酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种基于酵母表达系统的分泌型Rpf因子的制备方法及其应用

<160>1

<210>1

<211>672

<212>DNA

<213>藤黄微球菌(M.luteus)

<400>1

atggacacca tgactctctt caccacttcc gccacccgct cccgccgtgc caccgcctcg     60

atcgtcgcgg gcatgaccct cgccggcgcc gccgccgtgg gcttctccgc cccggcccag    120

gccgccaccg tggacacctg ggaccgcctc gccgagtgcg agtccaacgg cacctgggac    180

atcaacaccg gcaacggctt ctacggcggc gtgcagttca ccctgtcctc ctggcaggcc    240

gtcggcggcg aaggctaccc gcaccaggcc tcgaaggccg agcagatcaa gcgcgccgag    300

atcctccagg acctgcaggg ctggggcgcg tggccgctgt gctcgcagaa gctgggcctg    360

acccaggctg acgcggacgc cggtgacgtg gacgccaccg aggccgcccc ggtcgccgtg    420

gagcgcacgg ccaccgtgca gcgccagtcc gccgcggacg aggctgccgc cgagcaggcc    480

gctgccgcgg agcaggccgt cgtcgccgag gccgagacca tcgtcgtcaa gtccggtgac    540

tccctctgga cgctcgccaa cgagtacgag gtggagggtg gctggaccgc cctctacgag    600

gccaacaagg gcgccgtctc cgacgccgcc gtgatctacg tcggccagga gctcgtcctg    660

ccgcaggcct ga                                                        672

Claims (9)

1.一种基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以包含Rpf基因的载体或基因组为模板，以引物对P为引物，PCR扩增Rpf基因；所述的引物对P为：

上游引物P1：gcctcgagaa acgagaggct gacaccatga ctctcttcac    40；

下游引物P2：tagcggccgc tcaggcctga ggcaggacga gctcc         35；

2)将PCR扩增的Rpf基因用XhoI和NotI双酶切得到线性化片段；并将该线性化片段与被XhoI和NotI双酶切的pPIC9K载体片段连接得到重组酵母表达载体pPIC-Rpf；将重组酵母表达载体pPIC-Rpf转化到感受态的毕赤酵母，筛选得到整合了目的基因的阳性转化子；

3)将阳性转化子在BMGY培养基中30℃、200r/min条件下培养，当OD₆₀₀达到2.0～6.0时，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬进行诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度为0.5％，30℃、200r/min条件下继续培养96～120h后收集培养上清液；

4)将收集的培养上清液通过层析分离纯化得到Rpf因子。

2.如权利要求1所述的基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法，其特征在于，重组酵母表达载体pPIC-Rpf包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法，其特征在于，重组酵母表达载体pPIC-Rpf转染感受态毕赤酵母为：

将酶切线性化的重组酵母表达载体pPIC-Rpf与感受态毕赤酵母混合后，滴加于0.1cm电转杯中，冰水浴5min，在电压1800V、电容25uF、电阻200Ω条件下电击转化；

电击后，立即加入1ml浓度为1M预冷的山梨醇，混匀，30℃条件下静置2h，涂布于MD平板，30℃培养2～3天，直至出现菌落。

4.如权利要求1所述的基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法，其特征在于，所述的培养上清液通过凝胶层析分离纯化为：

将收集的培养上清液浓缩后洗脱除盐，收集包含Rpf因子主峰的粗纯化洗脱液；将收集的粗纯化洗脱液经浓缩、透析后上样于阴离子交换层析柱，用含0～1mol/L NaCl的pH8.0、20mmol/L Tris-HCl洗脱分离，收集包含纯化Rpf因子主峰的洗脱液。

5.一种转化体，其特征在于，该转化体的宿主细胞为毕赤酵母Pichia pastorisSMD1168，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含Rpf基因的重组酵母表达载体pPIC-Rpf；

所述的重组酵母表达载体pPIC-Rpf是以包含Rpf基因的载体为模板，以引物对P为引物，PCR扩增Rpf基因，然后将Rpf基因用XhoI和NotI双酶切得到线性化的片段，并将该线性化片段与XhoI和NotI双酶切的pPIC9K载体片段连接而得到；

所述的引物对P为：

上游引物P1：gcctcgagaa acgagaggct gacaccatga ctctcttcac    40；

下游引物P2：tagcggccgc tcaggcctga ggcaggacga gctcc         35。

6.权利要求1所制备的分泌型的Rpf因子用于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的复苏和促生长的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌是临床痰标本中的结核分枝杆菌。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，分泌型的Rpf因子的浓度为10～1000pM。

9.权利要求1所制备的分泌型的Rpf因子用于耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和结核休眠菌的复苏与促生长的应用。

Images