CN109265553A

CN109265553A - 一种细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白

Info

Publication number: CN109265553A
Application number: CN201810968815.7A
Authority: CN
Inventors: 许瑞安; 李招发; 陈磊; 肖玲慧; 马国兴; 崔秀灵
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-08-23
Also published as: CN109265553B

Abstract

本发明公开了一种细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白，本发明进一步提供融合蛋白的制备方法以及相关菌株构建，本发明通过菌株培养扩增，分离上清，硫酸沉淀，Sephadex G‑25脱盐，DEAE分步洗脱纯化得到了该融合蛋白，本发明的融合蛋白的最适pH范围是在40℃以下pH 5.0～9.0，酶活力保持相对稳定，PMSF与Cu2+对该融合蛋白酶的活性影响较大。该融合蛋白具有靶向降解纤维蛋白原的特性，其降解先后顺序为α链>β链>γ链。本发明的融合蛋白在血栓实验中，较尿激酶有更好的溶栓作用。

Description

一种细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白,它们的制备方法及其功效。

背景技术

血栓栓塞性疾病是一种常见的心脑血管疾病，其发病率高居各种疾病之首。全球每年所需溶栓剂的潜在市场约20亿美元。而海洋活性物质因为其结构新颖、药理活性高等优势逐渐成为近年来研究的热点还有越来越多的纤溶活性物质从海洋中鉴定出来，其中很多不仅能激活纤溶酶原还能直接溶解纤维蛋白。在临床的应用过程中，如果在外加纤溶酶激活剂激活纤溶酶原的同时,使用外源的、能直接降解纤维蛋白的酶类，就可以额外地加强血浆纤溶活性,就可以达到更理想的溶栓效果。虽然当前可应用于临床的海洋心血管药物还很少，关于海洋生物来源纤溶酶的基因克隆表达的研究工作也鲜有报道，但是这一个值得开拓前景广阔的领域。

发明内容

细胞珠蛋白(Cytoglobin,Cygb)是一种新近发现的含血红素辅基的六配位球蛋白。

海洋方格星虫纤溶酶(简称：PL)是从海洋方格星虫消化腺体液经匀浆，过滤除脂，冻干，盐析，脱盐，DEAE层析和凝胶过滤层析得到的蛋白，其N端部分氨基酸序列为Seq.2，分子量15KDa，方格星虫纤溶酶在抗血栓和中风防治方面有很好的效果。

本发明的目的在于提供一种高效表达细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白以及方格星虫纤溶酶的基因工程菌菌株。

本发明的另一目的是提供胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白，以及通过该融合蛋白，裂解制备方格星虫纤溶酶的方法，并验证胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白和方格星虫纤溶酶的药物疗效。

本发明的具体技术方案如下：

一种细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白，名称为CYGB-PL，该融合蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明所述的融合蛋白，其特征在于，方格星虫纤溶酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明所述的融合蛋白，其特征在于，细胞珠蛋白具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

本发明所述的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白含有柔性多肽，柔性多肽具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明所述的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白含有凝血酶五肽，凝血酶五肽具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

一种工程菌，名称为pPIC-9-CYGB-PL-GS115，其表达为本发明所述的融合蛋白CYGB-PL。

一种重组载体，名称为pPIC-9-CYGB-PL，其中pPIC9载体含有AOX1启动子，需经甲醇诱导。所述重组载体，其制备过程包括经BglII单酶切，电转入酵母GS115。

本发明所述融合蛋白的制备方法，包括工程菌的培养，融合蛋白的分离，纯化步骤，具体通过硫酸沉淀，Sephadex G-25脱盐，DEAE分步洗脱纯化得到。

本发明还包括，含有融合蛋白的药物组合物。以及本发明融合蛋白在制备抗血栓药物中的应用。

本发明进一步提供所述编码细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白的编码基因，具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

其中编码方格星虫纤溶酶的编码基因，具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

其中编码细胞珠蛋白的编码基因，具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

其中编码柔性多肽的编码基因，具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

其中编码凝血酶五肽的编码基因，具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：构建重组质粒pPIC9-CYGB-PL，并进行菌落PCR和双酶切验证。如图1、2、3所示。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括如下步骤：构建pPIC9-CYGB-PL-GS115酵母菌株，如图4所示。

在本发明的一个优选实施方案中，CYGB-PL蛋白SDS-PAGE检测步骤如下：将不同时间段的发酵上清液进行SDS-PAGE电泳，并对CYGB-PL蛋白的表达量进行分析，如图5所示。

在本发明的一个优选实施方案中，为pPIC9-CYGB-PL-GS115酵母菌株扩增培养，随后提取发酵上清液并进行硫酸铵沉淀、G-25脱盐、DEAE梯度洗脱，纯化得到融合蛋白，并进行活性验证和纯度分析。如图6、7、8、9所示。

在本发明的一个优选实施方案中，为对本发明融合蛋白进行物理化学性质检测，包括：将该酶置于不同的pH和不同温度下，测定其最适pH和最适反应温度。加入不同的抑制剂和金属离子，测定不同抑制剂和金属离子对该酶活性的影响，如图10、11、12所示。

在本发明的一个优选实施方案中，对本发明融合蛋白采用加热平板法测定该酶的直接纤溶活力，并加入尿激酶作为阴性对照。如图13所示。

在本发明的一个优选实施方案中，对本发明融合蛋白与纤维蛋白原进行孵育，取不同时间段样品进行SDS-PAGE电泳。如图14所示。

在本发明的一个优选实施方案中，对本发明融合蛋白采用小鼠全血凝块用于体外溶栓实验，加入尿激酶作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，计算血块的溶解率并观察不同时间段溶液中的细胞的释放量和细胞形态。如图15、16、17所示。

在本发明的一个优选实施方案中，将本发明融合蛋白溶液腹腔注射入血栓模型小鼠中，并加入尿激酶作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，统计小鼠尾部血栓的长度变化。如图19、20所示。

本发明的有益效果是：所得基因工程菌菌株具有较高的融合蛋白表达量，所得融合蛋白具有较方格星虫纤溶酶更高的生物学活性，具有良好的溶栓效果，并且具有靶向溶解纤维蛋白原的作用。

附图说明

图1为菌落PCR鉴定图(M:2000DNA Marker 1：随机挑取的单菌落2：随机挑取得单菌落)

图2为XholI和EcoRI双酶切质粒pPIC9-CYGB-PL图(M:2000DNA Marker 1:质粒pPIC9-CYGB-PL 2:质粒pPIC9-CYGB-PL)

图3为质粒pPIC9-CYGB-PL的部分测序结果图

图4为PCR鉴定pPIC9-CYGB-PL转入GS115图(M:2000DNA Marker 1:阳性对照(质粒pET22b-CYGB-PL)2-19：随机挑选的单菌落)

图5 SDS-PAGE检测CYGB-PL蛋白(M:蛋白Marker 1:诱导前2:诱导12h 3:24h 4:36h 5:48h 6:60h 7:72h 8:83h)

图6为硫酸铵盐析曲线图

图7为硫酸铵盐析的上清液和沉淀的纤溶活性图

图8为DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析图

图9为CYGB-PL SDS-PAGE凝胶电泳图谱。

图10为pH值对CYGB-PL稳定性的影响。

图11为1h内温度对酶活力的影响。

图12为酶的热稳定性研究。

图13为不同金属离子和酶抑制剂对酶活的影响。

图14为纤维平板活性检测CYGB-PL活性图(1：未诱导；2：诱导12h；3：诱导24h；4：诱导36h；5：诱导48h；6：诱导60h；7：诱导72h；8：诱导77h；9：1000U/mL UK)。

图15为CYGB-PL为对纤维蛋白原的作用方式图。

图16为体外溶栓实验(血块湿重100mg，0h、1h、2h、3h后血栓溶解情况)。

图17为体外溶栓实验红细胞镜检结果图(200X)。

图18小鼠全血凝块溶解率图。

图19给药72h后小鼠尾部血栓长度。

图20不同给药组小鼠尾部血栓长度统计图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1重组质粒pPIC9-CYGB-PL的构建

(1)质粒pET22b-CYGB-PL为模板PCR扩增出CYGB-PL序列，体系如下：

反应条件：94℃预变性4min；94℃变性45s，53℃退火30s，72℃延伸1min10sec，循环5次；最后72℃，10min，于4℃保存。取PCR产物50μL与10μL 6×loading buffer混和均匀；90V电泳25min，电泳结束取出凝胶至凝胶成像分析仪下观察拍照，胶回收目的片段。胶回收；

(2)pPIC9质粒及胶回收CYGB-PL DNA片段的双酶切

双酶切体系如下:

反应条件：37℃水浴过夜(12h)，待反应完毕凝胶电泳回收酶切产物，-20℃短时间保存。胶回收；

(3)质粒pPIC9与目的基因CYGB-PL的连接反应

连接体系如下:

反应条件：16℃连接过夜(12h)，通过热激方法将其转入至E.coli DH5α感受态细胞，使pPIC9-CYGB-PL重组质粒能够得到大量的扩增。

实施例2重组pPIC9-CYGB-PL的菌落PCR验证

鉴定体系如下:

反应条件：94℃预变性，4min循环94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸1min10s，循环25次；最后72℃，10min，4℃保存。取PCR产物5μL与1μL 6×loading buffer缓冲液混匀上样，90V电泳25min，电泳结束取出凝胶至凝胶成像分析仪下观察拍照。

实施例3重组质粒pPIC9-CYGB-PL的双酶切及PCR验证

将鉴定结果为阳性的单菌落接种于5mL含Amp的LB培养基中，37℃,250rpm摇床培养13h左右后提取质粒。质粒双酶切体系如下:

反应条件:37℃水浴7h，然后进行凝胶电泳并拍照记录结果。

质粒PCR体系如下:

将质粒双酶切及质粒PCR鉴定均为阳性结果的单菌落送至南京金斯瑞有限公司进行序列测定。

实施例4毕赤酵母工程菌株GS115-CYGB-PL的构建

酵母感受态的制备：

(1)将毕赤酵母GS115平板划线与YPD固体培养基中，培养2天左右。

(2)挑取状态比较好的GS115单菌落，接种于5mL YPD液体培养基，于28℃，250rpm振荡培养18小时左右。

(3)取500μL菌液接种至50mL YPD液体培养基的中，于28℃，250rpm摇床振动培养，直到OD600＝1.0～1.3。

(4)菌液转入50ml离心管，1500g，4℃离心5min，弃上清。

(5)50mL冰无菌水重悬菌体，1500g，4℃离心5min，弃上清。25ml冰无菌水重悬菌体，1500g，4℃离心5min，弃上清。

(6)5ml冰1M山梨醇重新悬浮菌体，1500g，4℃离心5min，弃上清。

(7)500μl 1M山梨醇重新悬浮菌体，每管分装80-100μl，保存在-80℃冰箱，大约2周内可用。

重组质粒pPIC9-CYGB-PL的线性化

反应体系如下：

反应条件：37℃水浴过夜(12h)，核酸电泳回收较大的凝胶片段。

线性化质粒电转进入GS115细胞

电击转化步骤如下：

(1)取10μL线性化质粒与GS115毕赤酵母感受态细胞混匀后转至提前取冰预冷的0.2cm电击转化杯中。

(2)将电转化杯冰浴15min左右。

(3)电转条件为电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。

(4)电击完毕后，立即向杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，混匀后将其转至1.5mL的灭菌离心管中。

(5)28℃,150rpm条件下振荡培养约1h。

(6)将菌体悬液涂布于MD平板上，每200μL左右涂布一块平板。

(7)待菌液被完全吸收后，将平板倒置培养于28℃培养箱中培养2-3天，直至单个菌落出现。

提取酵母基因组DNA鉴定阳性转化子(GS115-pPIC9-CYGB-PL)

酵母基因组DNA的提取步骤如下：

1、取酵母细胞(不超过5×10⁷ce l1s)，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。

2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入470ul山梨醇Buffer。充分悬浮菌体，加入25ul酵母破壁酶和5ulβ-巯基乙醇，充分混匀。30℃处理1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。

3、12000rpm离心lmin，弃上清，收集沉淀。

4、向沉淀中加入200ul溶液A，充分悬浮沉淀，向悬浮液中加入20ul的RNase A(10mg/ml)，充分颠倒混匀，室温放置10min。

5、加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分颠倒混匀。65℃水浴消化15-30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。

6、加入200ul溶液B，再加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，室温放置2min。

7、12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

9、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心lmin，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

10、12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。

11、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心lmin。

12、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。

取提取的基因组DNA为模板PCR鉴定，体系如下：

反应条件：94℃预变性，4min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃，10min，于4℃保存。取5μl PCR产物与1μl 6×loading buffer混匀上样，90V电泳25min，取出凝胶置于凝胶成像分析仪下拍照观察结果。

菌种的保存方法

将鉴定结果为阳性的菌种进行保种，挑取单菌落接至5mL YPD液体培养基中，28℃，250rpm条件下培养至OD₆₀₀值为2～6，每800μl菌液加200μl 80％的甘油至1.5mL灭菌离心管中，密封后保存在-80℃冰箱中。

实施例5发酵罐技术制备融合蛋白

发酵种子液的准备

接种环挑取含有pPIC9-CYGB-PL质粒的酵母工程菌，平板划线于MD平板，倒置于28℃的恒温培养箱内培养。恒温培养48小时后，再从MD平板上挑取生长状态良好的阳性单克隆菌落，接种于含5mlYPD培养基的试管中，28℃，250r/min培养14-18小时，至A₆₀₀为2-6时，按体积分数1％接种至200mlBMG培养基中。28℃，250r/min摇床培养16-24h，至A₆₀₀为2-6时，且镜检无染菌才可作为发酵罐种子液备用。

发酵罐的准备

配制2L基础盐培养基(BSM)倒入发酵罐体中，安装并密封外通管路后整个罐体灭菌。灭菌结束后，待罐体冷却至室温，将其与可调节温度的循环水连接以调节温度，同时，连接通气装置、冷凝管、搅拌转子等。然后校正pH电极，在淋洗酒精后安装至指定位置，接着将搅拌转速升至500r/min，搅拌30min后，校正溶氧电极并安装。其后，通过滴加氨水将培养基pH调至5.0，并调整通气量5L/min，滴加已灭菌消泡剂，待罐体温度降至28℃即可通过火焰接种的方法将发酵种子液倒入发酵罐中，并加入15mL生物素和15mL微量元素。

甲醇诱导蛋白表达

酵母在发酵罐中一开始呈指数生长，导致溶氧值(DO，Dissolved oxygen)开始不停的下降。开始阶段为了维持DO值在20％到40％左右，因为在此条件下利于酵母以较合适的速度进行生长，因此需要根据溶氧值得变化情况不断调节转速。当酵母生长到24h左右时，DO值会突然上升并保持在100％左右，这是因为培养基中的甘油已经被消耗完全，酵母没有可以利用的碳源，呼吸代谢减慢，导致溶氧值上升。此时应保持通氧和转速不变，使酵母处于饥饿状态2小时左右将培养基中的甘油利用完毕，避免甘油对甲醇诱导表达的干扰。接着开始补加甲醇，随着甲醇的加入DO值会开始慢慢下降，并且甲醇流速越高，DO下降的会越来越大。在甲醇流速不变的情况下，DO值就会停留在一个保持在一个比较稳定的范围内保。在甲醇诱导过程中需要进行敏感性检测，就是通过停止补加甲醇，如果DO值会快速的上升则说明甲醇没有补加过量，若DO值没有变化发生明显的变化则说明甲醇补给过量，此时需要立即停止甲醇的补给或降低甲醇的流速。在这个时候，也要注意甲醇不能补加过量。切记在整个甲醇诱导的过程中，甲醇不能补加过量防止酵母中毒。发酵罐的pH值设定在6.5左右，通过自动补加氨水进行调节。在整个发酵过程中，每过24小时就要补加15mL的微量元素和15mL的生物素，维持酵母处于比较良好的生长状态。整个发酵过程大概在96小时左右，在没有进行诱导前需要取一次样以及甲醇诱导过程中每过12小时需要取一次样，对酵母的生长状态进行以及蛋白的表达情况进行分析。

实施例6菌体诱导过程中相关指标的检测

(1)菌体湿重和A₆₀₀

菌体湿重的测定：取样前称取离心管的重量，之后取1ml菌液于离心管中，4℃，5000r/min离心5min。取上清备用，离心管吸干残余液体后再次称量其重，前后两次管重差值即为菌体湿重。湿重计算公式为：

菌体湿重(g/L)＝(离心后除去上清管重-离心前管重)/菌液体积

OD₆₀₀值的测定：将紫外分光光度计的波长调节到600nm处进行吸光值测定，以该时段菌液上清作为对照，重复测定3次以平均值作为OD₆₀₀测定结果。

(2)BCA测定总蛋白浓度

①在测定前，将BCA试剂A和B按体积比50:1配制适量BCA工作液，并充分混匀。

②用完全溶解蛋白标准品(5mg/ml)，并将其稀释至终浓度为0.5mg/ml备用。

③将标准品按0，1，2，4，6，8，12，16，20μl加入96孔板中，并用PBS将每孔标准品补足至20μl。

④将稀释后的样品取20μl加入96板孔中

⑤每孔加入200μlBCA工作液，于37℃放置30min后，在562nm处测定吸光值。

⑥根据标准品吸光值绘制标准曲线，计算样品总蛋白浓度

实施例7本发明融合蛋白CYGB-PL的纯化

样品总蛋白的提取

将工程菌培养发酵，提取发酵液，6000rpm离心25min，除去菌体和残渣，取上清液备用。

硫酸铵盐析

取6等份离心后总蛋白上清液，每份10m1，向液体中缓慢加入不同质量的固体硫酸铵，分别至10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％和80％的饱和度，缓慢搅拌均匀，4℃冰箱静置6h进行盐析。4℃下12000rpm离心30min，分别收集上清液和沉淀，沉淀用10mL的5mMTris-HCl(pH 8.8)缓冲液溶解，采用纤维蛋白平板法检测各自上清液和沉淀的纤溶活性，测量溶圈直径大小，并绘制硫酸铵分级盐析曲线。

根据上清液和沉淀的纤溶活性确定分级盐析纯化纤溶酶的最佳硫酸铵饱和度。发酵液中缓慢加入固体硫酸铵(最好在加入前将其研磨，加入过程中不停搅拌)至30％饱和度，搅拌均匀，4℃冰箱静置6h，12000rpm，4℃离心30min，去除沉淀，收集上清液，继续加入固体硫酸按至80％饱和度，4℃冰箱静置6h，12000rpm，4℃离心30min，收集沉淀。沉淀用缓冲液5mM Tris-HCl(pH 8.8)充分溶解，进行下一步脱盐。

G-25琼脂糖凝胶脱盐

采用Sephadex G-25装填层析柱，先用3倍于柱床体积的平衡缓冲液5mM Tris-HCl(pH 8.8)充分平衡凝胶柱，然后将盐析后的蛋白样品溶解平衡缓冲液5mM Tris-HCl(pH8.8)中，经0.22μm滤膜过滤后以2mL/min通过层析柱，再用5mM Tris-HCl(pH 8.8)洗脱蛋白，流速为2mL/min，收集第一个峰。

离子交换层析

利用DEAE Sepharose Fast Flow装填层析柱，先用5倍于柱床体积的平衡缓冲液5mM Tris-HCl(pH 8.8)平衡，然后将上步脱盐收集的活性峰以2mL/min上样，上样后以相同缓冲液5mM Tris-HCl(pH 8.8)洗脱未被吸附的蛋白质。再以5mM Tris-HCl(pH 8.8)～125mM NaCl–5mM Tris-HCl(pH 8.8)进行梯度洗脱，流速为2mL/min，5min每管收集。紫外检测仪检测280nm波长处的紫外吸收值，并由记录仪记录吸光值的变化情况。测定每一收集管的蛋白质浓度和酶活力，并根据酶活力收集组分。

实施例8 pH对酶稳定性的影响

采用pH 2.2～pH 10.9的广泛缓冲液，配制方法如下：

配制50mM柠檬酸200mL，用NaOH调pH至3.0、4.0、5.0和6.0时，分别取出2mL缓冲液装入试管中。

配制50mM Tris 200mL，用HCl调节pH为7.0、8.0和9.0时，分别取出2mL缓冲液装入试管中。

配制50mM甘氨酸200mL，用NaOH调pH至10.0和11.0时，分别取出2mL缓冲液装入试管中。

用不同pH值的缓冲液配制终浓度为1mg/mL的酶溶液，同时置于37℃放置，1h后将缓冲液pH调至7.4，用纤维蛋白平板法测定酶活力的变化，37℃恒温培养箱放置18h，以最高酶活为相对酶活100％，每组数据设三个平行样取平均值。

实施例9温度对酶稳定性的影响

用PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)配制PL溶液，浓度为1mg/mL，分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下保温1h、2h、4h和8h，分别取样，37℃恒温培养箱放置18h，在纤维蛋白平板测定酶活力的变化。以最高酶活为相对酶活100％，每组数据设三个平行样取平均值

实施例10金属离子及酶抑制剂对酶活的影响

将含有不同的金属离子Mg²⁺(MgSO₄·7H₂O)、Cu²⁺(CuCl₂)、Ca²⁺(CaCl₂)、K⁺(KCl)、Na⁺(NaCl)的试剂和酶抑制剂PMSF和EDTA，用10mM PBS缓冲液配制成为2mM的溶液。将PL与溶液混合，使PL的终浓度为1mg/mL，在37℃保温30min后，用纤维蛋白平板法测定酶活力的变化，平板37℃恒温培养箱放置18h，以未加金属离子或者酶抑制剂的酶液活力为100％，每组数据设三个平行样取平均值。

实施例11对纤维蛋白溶解酶原的激活作用

配制的标准纤维蛋白平板含有纤维蛋白溶解酶原，称为阳性平板。将标准平板于85℃烘箱中放置30min，冷凝后即成不含纤溶酶原活性的平板，称为阴性平板^[77]。加入800U/mL的尿激酶100μL作为阳性对照，以验证平板中是否有残余的纤溶酶原。纯化好的蛋白(浓度为1mg/mL)100μL放入阴性平板和阳性平板上，37℃保温18h后观察水解圈直径大小。

实施例12对纤维蛋白原的作用方式

取400μL酶液(1mg/mL)与100μL牛血纤维蛋白原溶液(6mg/mL)充分混合后，放置于37℃孵育反应，分别于0、1min、3min、5min、10min、30min、60min、120min、180min和240min快速取样，冰浴终止反应。向样品加入等体积的2-巯基乙醇，沸水浴5min，对变性后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度为12％，浓缩胶5％，观察纤维蛋白原Aα、Bβ、γ链的降解情况。

实施例13体外溶栓实验

(1)从小鼠的眼球取血5mL置于血清管中，4℃放置自然凝固，用滤纸吸干血块表面，分别称取100mg天然小鼠全血凝血块，加入三支试管中。

(2)实验设阴性对照生理盐水组、阳性对照尿激酶组(1000U/mL)、实验组CYGB-PL(1000U/mL)和实验组PL(1000U/mL)，样品效价均按尿激酶活力单位标准曲线标定。

(3)在已加入血块的试管中分别加入2mL对应的溶液，置于37℃恒温摇床慢摇(60r/min)。每隔1h吸取试管上层溶液涂片，显微镜下观察红细胞形态和数量并拍照记录。慢摇3h后称量各试管内剩余血凝块的质量，并计算血凝块溶解率。血凝块溶解率＝(溶解前血凝块质量-溶解后血凝块质量)/溶解前血凝块质量。

实施例14体内溶栓实验

采用角叉菜胶致小鼠尾部血栓模型。选用临床常用的注射用尿激酶作为阳性对照，阴性对照为生理盐水组，实验组为PL酶液与CYGB-PL酶液。各受试组酶活力单位统一用尿激酶标准品纤溶活力标准曲线进行标定。

注射用尿激酶临床治疗急性脑血栓及外周动静脉栓塞每天2万～4万单位，一次给药，根据人与动物药量换算表(60kg/人)小鼠的用药量为人的9倍，计算可得25g小鼠的用药剂量范围为75～150U。因此，实验阳性对照选择为注射尿激酶剂量为4000U/kg；低剂量给药组，注射剂量为4000U/kg；高剂量给药组，注射剂量为8000U/kg；血栓模型组及正常对照组，注射生理盐水的量为8mL/kg，以上溶液均用0.9％NaCl配制，样品效价均按尿激酶活力单位标准曲线标定。

(1)雄性昆明种小鼠32只，鼠龄为5周，体重30±2g，由福州大学吴氏动物中心提供。小鼠饲养环境为饲养温度23±2℃，湿度50～60％，光照12h。随机分为7组，即正常对照组(5只)、高剂量PL给药组(5只)、低剂量PL给药组(5只)、高剂量CYGB-PL给药组(5只)、低剂量CYGB-PL给药组(5只)、尿激酶阳性对照组(5只)和血栓模型组(5只)，适应性喂养1周；

(2)24h后腹腔注射1％角叉菜胶160mg/kg，24h后观察尾部血栓形成情况。

(3)角叉菜胶注射24h后，低剂量给药组，注射剂量为4000U/kg；高剂量给药组，注射剂量为8000U/kg；尿激酶阳性对照组，注射尿激酶的剂量为4000U/kg；血栓模型组与正常组，注射生理盐水的量为8mL/kg。腹腔注射一次，连续注射三天。实验结果用GraphPadPrism软件进行统计，用表示。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 许瑞安

<120> 一种细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白

<160> 10

<210> 1

<211> 453

<212>

<213>

<220>

<221> PRO

<222>

<223>

<400> 1

Met Glu Lys Val Pro Gly Glu Met Glu Ile Glu Arg Arg Glu Arg

5 10 15

Ser Glu Glu Leu Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Val Gln Ala Met

20 25 30

Trp Ala Arg Leu Tyr Ala Asn Cys Glu Asp Val Gly Val Ala Ile

35 40 45

Leu Val Arg Phe Phe Val Asn Phe Pro Ser Ala Lys Gln Tyr Phe

50 55 60

Ser Gln Phe Lys His Met Glu Asp Pro Leu Glu Met Glu Arg Ser

65 70 75

Pro Gln Leu Arg Lys His Arg Cys Arg Val Met Gly Ala Leu Asn

80 85 90

Thr Val Val Glu Asn Leu His Asp Pro Asp Lys Val Ser Ser Val

95 100 105

Leu Ala Leu Val Gly Lys Ala His Ala Leu lys His Lys Val Glu

110 115 120

Pro Val Tyr Phe Lys Ile Leu Ser Gly Val Ile Leu Glu Val Val

125 130 135

Ala Glu Glu Phe Ala Ser Asp Phe Pro Pro Glu Thr Gln Arg Ala

140 145 150

Trp Ala lys Leu Arg Gly Leu Ile Tyr Ser His Val Thr Ala Ala

155 160 165

Tyr Lys Glu Val Gly Trp Val Gln Gln Val Pro Asn Ala Thr Thr

170 175 180

Pro Pro Ala Thr Leu Pro Ser Ser Gly Pro Arg Ser Lys lys Arg

185 190 195

Gly Gly Gly Gly Ser lys Arg Arg Lys Ile Glu Gly Arg Arg Pro

200 205 210

Pro Gly Phe Ile Val Gly Gly Arg Pro Ala Gly Lys Gly Arg Trp

215 220 225

Pro Trp Gln Leu Ser Leu Gln Ile Glu Gly Ile Gly Trp Gly Trp

230 235 240

His Thr Cys Gly Ala Ile Leu Leu Gly Ala Asn Arg Ala Leu Thr

245 250 255

Ala Ala His Cys Thr Glu Gly Arg Ser Gly Phe Arg Ile Leu Ala

260 265 270

Gly Ala Ser Asn Ile Gly Ala Ser Pro Asp His Glu Ala Glu Ser

275 280 285

Leu Val Ser Ser Thr Thr Glu His Pro Gly Phe Asp Arg Phe Ala

290 295 300

Pro Gly Ile Pro Asn Asp Val Gly Thr Leu Ala Leu Ala Thr Ala

305 310 315

Val Asn Ala Gly Gly Ala Ile Ala Tyr Ala Ser Leu Ala Pro Thr

320 325 330

Gly Gly Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Glu Cys Trp Ala Ser Gly Trp

335 340 345

Gly Arg Leu His Gly Asp Asn Gly Pro Leu Pro Asp Gln Leu Gln

350 355 360

Glu Val Arg Ile Asp Ala Leu Thr Asn Ala Glu Cys Arg Ser Arg

365 370 375

Met Pro Ile Asn Leu Gln Glu Asn Val Leu Asp Gln His Ile Cys

380 385 390

Ile His Gly Asn Gly Asn Gln Gly Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly

395 400 405

Gly Pro Leu Asn Cys Arg Asp Gly Ser Phe Met Val Val Gly Val

410 415 420

Thr Ser Trp Val Val Gly Ser Met Asp Ser Ser Cys Met Thr Glu

425 430 435

Tyr Pro Asn Val Tyr Ala Arg Val Ser His Phe Arg Ser Trp Ile

440 445 450

Asp Ser Asn

451 452 453

<210> 2

<211> 240

<212>

<213>

<220>

<221> PRO

<222>

<223>

<400> 2

Ile Val Gly Gly Arg Pro Ala Gly Lys Gly Arg Trp Pro Trp Gln

5 10 15

Leu Ser Leu Gln Ile Glu Gly Ile Gly Trp Gly Trp His Thr Cys

20 25 30

Gly Ala Ile Leu Leu Gly Ala Asn Arg Ala Leu Thr Ala Ala His

35 40 45

Cys Thr Glu Gly Arg Ser Gly Phe Arg Ile Leu Ala Gly Ala Ser

50 55 60

Asn Ile Gly Ala Ser Pro Asp His Glu Ala Glu Ser Leu Val Ser

65 70 75

Ser Thr Thr Glu His Pro Gly Phe Asp Arg Phe Ala Pro Gly Ile

80 85 90

Pro Asn Asp Val Gly Thr Leu Ala Leu Ala Thr Ala Val Asn Ala

95 100 105

Gly Gly Ala Ile Ala Tyr Ala Ser Leu Ala Pro Thr Gly Gly Pro

110 115 120

Asn Tyr Ala Gly Asn Glu Cys Trp Ala Ser Gly Trp Gly Arg Leu

125 130 135

His Gly Asp Asn Gly Pro Leu Pro Asp Gln Leu Gln Glu Val Arg

140 145 150

Ile Asp Ala Leu Thr Asn Ala Glu Cys Arg Ser Arg Met Pro Ile

155 160 165

Asn Leu Gln Glu Asn Val Leu Asp Gln His Ile Cys Ile His Gly

170 175 180

Asn Gly Asn Gln Gly Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

185 190 195

Asn Cys Arg Asp Gly Ser Phe Met Val Val Gly Val Thr Ser Trp

200 205 210

Val Val Gly Ser Met Asp Ser Ser Cys Met Thr Glu Tyr Pro Asn

215 220 225

Val Tyr Ala Arg Val Ser His Phe Arg Ser Trp Ile Asp Ser Asn

230 235 240

<210> 3

<211> 192

<212>

<213>

<220>

<221> PRO

<222>

<223>

<400> 3

Met Glu Lys Val Pro Gly Glu Met Glu Ile Glu Arg Arg Glu Arg

5 10 15

Ser Glu Glu Leu Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Val Gln Ala Met

20 25 30

Trp Ala Arg Leu Tyr Ala Asn Cys Glu Asp Val Gly Val Ala Ile

35 40 45

Leu Val Arg Phe Phe Val Asn Phe Pro Ser Ala Lys Gln Tyr Phe

50 55 60

Ser Gln Phe Lys His Met Glu Asp Pro Leu Glu Met Glu Arg Ser

65 70 75

Pro Gln Leu Arg Lys His Arg Cys Arg Val Met Gly Ala Leu Asn

80 85 90

Thr Val Val Glu Asn Leu His Asp Pro Asp Lys Val Ser Ser Val

95 100 105

Leu Ala Leu Val Gly Lys Ala His Ala Leu lys His Lys Val Glu

110 115 120

Pro Val Tyr Phe Lys Ile Leu Ser Gly Val Ile Leu Glu Val Val

125 130 135

Ala Glu Glu Phe Ala Ser Asp Phe Pro Pro Glu Thr Gln Arg Ala

140 145 150

Trp Ala lys Leu Arg Gly Leu Ile Tyr Ser His Val Thr Ala Ala

155 160 165

Tyr Lys Glu Val Gly Trp Val Gln Gln Val Pro Asn Ala Thr Thr

170 175 180

Pro Pro Ala Thr Leu Pro Ser Ser Gly Pro Arg Ser

185 190

<210> 4

<211> 16

<212>

<213>

<220>

<221> PRO

<222>

<223>

<400> 4

Lys lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser lys Arg Arg Lys Ile Glu Gly Arg

5 10 15

<210> 5

<211> 5

<212>

<213>

<220>

<221> PRO

<222>

<223>

<400> 5

Arg Pro Pro Gly Phe

1 2 3 4 5

<210> 6

<211> 1376

<212>

<213>

<220>

<221> DNA

<222>

<223>

<400> 6

ctcgagaaga gaatggagaa agtgccaggc gagatggaga tcgagcgcag ggagcggagc 60

gaggagctgt ccgaggcgga gaggaaggcg gtgcaggcta tgtgggcccg gctctatgcc 120

aactgcgagg acgtgggggt ggccatcctg gtgaggttct ttgtgaactt cccctcggcc 180

aagcagtact tcagccagtt caagcacatg gaggatcccc tggagatgga gcggagcccc 240

cagctgcgga agcacgcctg ccgagtcatg ggggccctca acactgtcgt ggagaacctg 300

catgaccccg acaaggtgtc ctctgtgctc gcccttgtgg ggaaagccca cgccctcaag 360

cacaaggtgg aaccggtgta cttcaagatc ctctctgggg tcattctgga ggtggtcgcc 420

gaggaatttg ccagtgactt cccacctgag acgcagagag cctgggccaa gctgcgtggc 480

ctcatctaca gccacgtgac cgctgcctac aaggaagtgg gctgggtgca gcaggtcccc 540

aacgccacca ccccaccggc cacactgccc tcttcggggc cgggatccaa gaagagaggt 600

ggtggaggtt ccaagagaaa gagaattgaa ggtagacgtc cacctggttt catcgtgggt 660

ggacgtccag caggaaaggt cgttggccat ggcagctgtc cctgcagatc gaaggaattg 720

gttggggtca tacctgcgga gctatcctgc tgggagcaaa cagagctctg accgcagctc 780

attgcaccga aggtcgttcc ggtttcagaa tcctggcagg agcttccaac attggtgcat 840

cccctgatca tgaagctgaa tccctggtgt cctccaccac cgaacatcca ggatttgatc 900

gtttcgcacc aggtatccca aacgatgttg gtactctggc tctggcaacc gctgttaacg 960

caggaggtgc aatcgcttac gcatccctgg cacctaccgg aggtccagat tacgctggta 1020

acgaatgctg ggcttccgga tggggtagac tgcatggaga taacggtcca ctgccagatc 1080

agctgcagga agtgcgtatt gatgcactga ccaacgctga atgcagatcc cgtatgccta 1140

tcaacctgca ggaaaacgtg ctggatcagc atatctgcat tcatggaaac ggtaaccagg 1200

gtgcatgcca gggagattcc ggaggtccac tgaactgcag agatggttcc ttcatggttg 1260

tgggagttac ctcctgggtg gttggttcca tggattcctc ctgcatgacc gaatacccaa 1320

acgtgtacgc tcgtgtgtcc cattttagat cctggatcga ttccaactaa gaattc 1376

<210> 7

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

atcgtgggtg gacgtccagc aggaaaaggt cgttggccat ggcagctgtc cctgcagatc 60

gaaggaattg gttggggtca tacctgcgga gctatcctgc tgggagcaaa cagagctctg 120

accgcagctc attgcaccga aggtcgttcc ggtttcagaa tcctggcagg agcttccaac 180

attggtgcat cccctgatca tgaagctgaa tccctggtgt cctccaccac cgaacatcca 240

ggatttgatc gtttcgcacc aggtatccca aacgatgttg gtactctggc tctggcaacc 300

gctgttaacg caggaggtgc aatcgcttac gcatccctgg cacctaccgg aggtccagat 360

tacgctggta acgaatgctg ggcttccgga tggggtagac tgcatggaga taacggtcca 420

ctgccagatc agctgcagga agtgcgtatt gatgcactga ccaacgctga atgcagatcc 480

cgtatgccta tcaacctgca ggaaaacgtg ctggatcagc atatctgcat tcatggaaac 540

ggtaaccagg gtgcatgcca gggagattcc ggaggtccac tgaactgcag agatggttcc 600

ttcatggttg tgggagttac ctcctgggtg gttggttcca tggattcctc ctgcatgacc 660

gaatacccaa acgtgtacgc tcgtgtgtcc cattttagat cctggatcga ttccaactaa 720

gaattc 726

<210> 8

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

ctcgagaaga gaatggagaa agtgccaggc gagatggaga tcgagcgcag ggagcggagc 60

gaggagctgt ccgaggcgga gaggaaggcg gtgcaggcta tgtgggcccg gctctatgcc 120

aactgcgagg acgtgggggt ggccatcctg gtgaggttct ttgtgaactt cccctcggcc 240

aagcagtact tcagccagtt caagcacatg gaggatcccc tggagatgga gcggagcccc 300

cagctgcgga agcacgcctg ccgagtcatg ggggccctca acactgtcgt ggagaacctg 360

catgaccccg acaaggtgtc ctctgtgctc gcccttgtgg ggaaagccca cgccctcaag 420

cacaaggtgg aaccggtgta cttcaagatc ctctctgggg tcattctgga ggtggtcgcc 480

gaggaatttg ccagtgactt cccacctgag acgcagagag cctgggccaa gctgcgtggc 540

ctcatctaca gccacgtgac cgctgcctac aaggaagtgg gctgggtgca gcaggtcccc 600

aacgccacca ccccaccggc cacactgccc tcttcggggc cg 642

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

ggatccaaga agagaggtgg tggaggttcc aagagaaaga gaattgaagg taga 54

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

cgtccacctg gtttc 15

Claims

1.一种细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白，名称为CYGB-PL，该融合蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，方格星虫纤溶酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，细胞珠蛋白具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白含有柔性多肽，柔性多肽具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白含有凝血酶五肽，凝血酶五肽具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

6.一种工程菌，名称为pPIC-9-CYGB-PL-GS115，其表达权利要求1所述的融合蛋白CYGB-PL。

7.一种重组载体，名称为pPIC-9-CYGB-PL。

8.如权利要求7所述重组载体，其特征在于，其制备过程包括：经BglII单酶切，电转入酵母GS115。

9.含有权利要求1所述融合蛋白的药物组合物。

10.权利要求1所述融合蛋白在制备抗血栓药物中的应用。