CN106929496A - 一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达重组人激肽原酶‑1的重组菌株及其发酵和纯化工艺，以及一种针对上述重组菌株优化的BSM发酵培养基。本发明的发酵工艺诱导剂甲醇的添加量较低，发酵液中目的蛋白产量高且易于纯化，获得的激肽原酶主要是低糖基化产物，免疫原性低并便于药物质量控制；与已有激肽原酶发酵技术相比，克服了发酵体系中甲醇加入量过大，制备的激肽原酶活性较低，糖基化修饰较高等缺陷。除此之外，与现有激肽原酶发酵技术相比，发酵时间明显缩短，有效降低了生产成本，活性、产量均有50％以上的提高。

Description

一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种重组人激肽原酶-1(Recombinant humanKallikrein-1，以下简称rhKLK1)基因的重组菌株及其生产和纯化工艺。

背景技术

激肽释放酶－激肽系统(kallikreinkinin system，KKS)又称激肽系统，广泛存在于动物体内的多个系统，尤其是在心血管系统内分布更为密集。其主要成分为：激肽原(活性因子前体)、激肽原酶(活性因子前体的激活物，又称为激肽释放酶)、激肽(主要活性因子)、激肽酶(活性因子的灭活物)。正常情况下激肽生成后迅速被循环中的激肽酶灭活。

激肽原酶，又称激肽释放酶，是一种丝氨酸蛋白酶，能使激肽原释放出激肽，它具有很高的生理活性，在人体组织中起着十分重要的生理作用。目前分为两类：血浆激肽原酶(PK)和组织激肽原酶(TK)。两种酶在分子量大小、底物特异性、免疫学特征和释放出的激肽方面都不同。血浆激肽原酶参与血凝块的表面激活、纤维蛋白溶解、激肽生成和炎症过程。组织激肽原酶广泛存在于肾、胰腺、胃肠道黏膜及中枢神经系统等许多组织中，它以激肽原酶原的形式在组织中合成，再经胰蛋白酶激活形成组织激肽原酶，并可释放至血液循环。组织激肽原酶基因是一类大的多基因家族，目前证明人组织激肽原酶基因家族至少由15个基因(KLK1-KLK15)组成。共分为五个亚系：第一组KLK4、KLK5、KLK14；第二组KLK9、KLK11、KLK15；第三组KLK10、KLK12；第四组KLK6、KLK13；最后一组KLK8和KLK1、KLK2、KLK3。而这15个基因中迄今为止只有KLKl、KLK2和KLK3具有特异性生物学功能，与疾病的研究较为深刻，其他基因的研究报道极少。

KLK1主要是通过低分子激肽原释放赖氨酰缓激肽即胰激肽原发挥其生物学功能。然而，KLK1不同的表达形式提示在不同类型细胞中该酶表现不同的专一性。KLK1除发挥其激肽原酶功能外，根据它在垂体和胰腺等组织的存在表明它能对肽类激素和生长素进行加工处理。KLK1能降解胰岛素原、LDL、心房尿钠素前体、凝乳酶原、血管肠肽、前胶元酶、血管紧张素原等。在每一类型细胞中KLK1都可能有单一的或多重的或常见的或独特的功能。但是，研究表明激肽释放才是最主要的生理功能，起到扩张毛细血管，改善微循环的作用，产生舒张毛细血管和扩张小动脉等药理作用。KLK2，KLK3和KLK1的天然底物不同，与KLK1相比，具有非常低的活性，而其他激肽原酶有的与生理过程有关，有的与疾病的病理过程有关，但无一具有特异性基质水解作用。

激肽原酶KLK1临床用于糖尿病并发症、高血压及急性缺血性脑卒中等疾病的治疗。较为常见的产品主要有两类：一类是从猪胰脏提取的激肽原酶(例如常州千红制药的“怡开”)，另一类是人尿激肽原酶(例如广州天普的“尤瑞克林”)，其主要由人尿中提取，上述产品均存在来源有限，生产工艺难以稳定可控，病毒污染风险，从而导致最终产品生产工艺复杂，批次生产一致性较差，成本较高。

迄今为止，国内外采用基因工程的方法利用酵母表达系统生产重组人激肽原酶(rhKLK1)蛋白进行了不少研究，但由于种属差异，rhKLK1天然序列很难直接在酵母中表达，表达产物常出现序列不正确、糖基化修饰均一度差、生物活性低、产量低或生产工艺复杂、难以产业化应用等问题。例如，1998年Chan等得到的rhKLK1蛋白电泳时明显有差不多的两条带，且无法证明产品均一性(Protein Expression and Purification 12,361–370，1998)。另外根据中国专利申请200610027754.1可知，2006年上海万兴生物研发的毕赤酵母表达rhKLK1蛋白工艺，宿主內源蛋白表达量高，rhKLK1分离纯化困难；而且，同样的通过其专利中的文字描述，以及申请人后期对其工艺的验证，发现所表达产物为高低糖基化修饰激肽原酶在蛋白电泳时显示仍然有相差无几的两条带产生。为了在一定程度上克服上述问题，申请人在先申请201310737079.1中，虽然对其编码基因进行了优化，使其更适合于毕赤酵母表达系统表达，虽然表达量有所上升，但所表达的产物仍然存在有高低不同分子量的两个蛋白，且表达量也是接近的。根据已有文献分析可知，之所以有这两个高低分子量的rhKLK1蛋白产生，主要是因为糖基化修饰的不同，并且毕赤酵母表达的高糖基化rhKLK1具有高甘露糖型结构，这种糖链结构不仅能改变重组糖蛋白的功能和特点，而且高甘露糖型糖链在人体内可以与甘露糖受体结合，导致药动学性质不良和产生免疫反应，而低糖基化rhKLK1具有低甘露糖型结构，可以很好的克服上述毕赤酵母表达rhKLK1的缺点。而且，若能将所表达的rhKLK1较集中于低糖基化部分，不仅对后续的纯化工艺，同时对工业化生产时的质量控制都无疑有较大的帮助。

发明内容

为克服上述技术问题，发明人在没有现有技术能给出成功预期的情况下，经过长期的实验摸索，在组合多样的发酵控制参数和纯化工艺中，摸索出了最佳的发酵工艺，不仅是采用优化过的无机培养基，在提高产量和活性的同时使得生产成本大大降低，而且可以使获得的产物均以低糖基化条带为主，为工业化生产时的质量控制提供了有效支持。

同时，本发明提供的一种重组毕赤酵母高效发酵制备激肽原酶的生产工艺，也克服了现有激肽原酶发酵制备技术中存在的甲醇加入量过大，激肽释放原酶活性较低，糖基化修饰较高的不足。

本发明的第一个目的，是提供一种rhKLK1的毕赤酵母发酵方法，其发酵过程中：诱导阶段的甲醇流加速度为：5～11mL/h^-1L^-1，诱导温度为：25～28℃，所用BSM发酵培养基各组成成分及其配比分别为：K₂SO₄ 3.64～14.56g/L，MgSO₄ 5.96～11.92g/L，KOH 0.372～0.744g/L，CaSO₄ 1.652～3.304g/L，H₃PO₄ 10.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。

优选的，所述毕赤酵母表达方法，其中菌体增殖阶段、限速生长阶段以及rhKLK1诱导表达阶段中的培养基均采用上述所述BSM发酵培养基。

作为优选的，所述方法包含下述步骤：

步骤1)将rhKLK1毕赤酵母工程菌株划线YPD平板，30℃培养3-5天。

步骤2)将此复苏后的rhKLK1工程菌株单克隆接种于YPD液体培养基30℃培养至OD₆₀₀＝6～8，即得到上罐种子液。

步骤3)将此种子液接种于发酵罐的BSM发酵培养基中，发酵40～72h即得到rhKLK1发酵液，其中诱导阶段的甲醇流加速度：5～11mL/h^-1L^-1，诱导温度为：25～28℃，所述BSM发酵培养基各组成成分及其配比分别为：K₂SO₄ 3.64～14.56g/L，MgSO₄ 5.96～11.92g/L，KOH0.372～0.744g/L，CaSO₄ 1.652～3.304g/L，H₃PO₄ 10.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。

更优选的，上述步骤3)中增殖阶段发酵温度为30℃，pH＝6.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM1(2ml/L)，发酵20h；限速生长阶段，先以30ml/h^-1L^-1的速率补加50％甘油，2h，然后以60ml/h^-1L^-1的速率补加50％甘油，4h；诱导阶段，调节pH＝6.0±0.2，诱导温度：25～28℃，甲醇流加速度：5～11mL/h^-1L^-1，并维持DO不高于30％，继续发酵40～72h。

本发明的另一个目的是提供一种rhKLK1发酵液的纯化方法，所述纯化方法包含以下步骤：

步骤1)rhKLK1发酵液预处理：收集rhKLK1发酵液低温高速离心收集上清，加入硫酸铵，终浓度为1.5M，0.22μm滤膜过滤；

步骤2)疏水层析法纯化：平衡缓冲液平衡层析柱，预处理的发酵液上清上样，洗脱液梯度洗脱，收集低糖基化rhKLK1洗脱峰；

步骤3)阴离子交换层析法纯化：平衡缓冲液平衡层析柱，预处理后上样，洗脱液梯度洗脱，收集低糖基化rhKLK1洗脱峰。

优选的，上述重组rhKLK1纯化方法步骤2)中，填料优选为Phenyl Sepharose 6FF(HS)，平衡缓冲液Buffer A为：20mM NaH₂PO₄，1.5M(NH₄)₂SO₄，pH＝7.5；洗脱缓冲液Buffer B为：20mM NaH₂PO₄，pH＝7.5，按照洗脱缓冲液Buffer B50％，70％，100％等度洗脱，主要收集70％洗脱峰。

上述rhKLK1纯化方法步骤3)中，填料优选为Q Sepharose FF，平衡缓冲液BufferB为：20mM NaH₂PO₄，pH＝7.5，洗脱缓冲液Buffer C为：20mM NaH₂PO₄，1.5M NaCl，按照洗脱缓冲液Buffer C17％，35％，100％等度洗脱，主要收集35％洗脱峰。

本发明还提供一种优化的BSM发酵培养基，其各组成成分及其配比分别为：K₂SO₄3.64～14.56g/L，MgSO₄ 5.96～11.92g/L，KOH 0.372～0.744g/L，CaSO₄ 1.652～3.304g/L，H₃PO₄ 10.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。所述优化的BSM发酵培养基，更适于rhKLK1在毕赤酵母中表达。

根据多次试验可以确定，本发明在rhKLK1不同规模的高密度发酵中，rhKLK1比活均大于1000IU/mg，药用级别低糖基化rhKLK1蛋白纯品产量达到300mg/L以上。

本发明采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点：通过菌株活化、种子培养和关键发酵工艺参数优化，制备的发酵液活性更高、产量更高、纯化步骤更简单，所采用的发酵培养基成分简单、成本低廉，降低了发酵工艺的成本；发酵工艺中采用特定的培养和发酵控制条件，与未经优化的发酵工艺条件相比，发酵时间明显缩短，有效降低了生产成本，活性、产量均有50％以上的提高。

附图说明

图1-a为传代第40代后，PCR扩增YPD平板中挑取的不同的rhKLK1毕赤酵母单菌落中基因组中目的基因琼脂糖凝胶电泳图

其中，图1-a为传代第40代后，PCR扩增YPD平板中挑取的第1-14个rhKLK1毕赤酵母单菌落中基因组中目的基因琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为500bp DNA Ladder，泳道2-15为YPD平板中挑取的第1-14个rhKLK1毕赤酵母单菌落。

图1-b为传代第40代后，PCR扩增YPD平板中挑取的第15-28个rhKLK1毕赤酵母单菌落中基因组中目的基因琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为500bp DNA Ladder，泳道2-15为YPD平板中挑取的第15-28个rhKLK1毕赤酵母单菌落。

图1-c为传代第40代后，PCR扩增YPD平板中挑取的第29-42个rhKLK1毕赤酵母单菌落中基因组中目的基因琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为500bp DNA Ladder，泳道2-15为YPD平板中挑取的第29-42个rhKLK1毕赤酵母单菌落。

图1-d为传代第40代后，PCR扩增YPD平板中挑取的第43-50个rhKLK1毕赤酵母单菌落中基因组中目的基因琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为500bp DNA Ladder，泳道2-9为YPD平板中挑取的第43-50个rhKLK1毕赤酵母单菌落，泳道10为PCR扩增rhKLK1表达载体中目的基因。

图2传代第40代后rhKLK1毕赤酵母单菌落的表达鉴定图。其中箭头所指即为rhKLK1条带。

其中，泳道1为第一代rhKLK1毕赤酵母单菌落中rhKLK1的表达条带，泳道2为传代第5代rhKLK1毕赤酵母单菌落中rhKLK1的表达条带，泳道3为传代第10代rhKLK1毕赤酵母单菌落中rhKLK1的表达条带，泳道4为传代第15代rhKLK1毕赤酵母单菌落中rhKLK1的表达条带，泳道5为传代第20代rhKLK1毕赤酵母单菌落中rhKLK1的表达条带，泳道6为传代第25代rhKLK1毕赤酵母单菌落中rhKLK1的表达条带，泳道7为传代第30代rhKLK1毕赤酵母单菌落中rhKLK1的表达条带，泳道8为传代第35代rhKLK1毕赤酵母单菌落中rhKLK1的表达条带，泳道9为传代第40代rhKLK1毕赤酵母单菌落中rhKLK1的表达条带。

图3 rhKLK1毕赤酵母菌株不同批次小规模高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图

其中，图3-a为rhKLK1毕赤酵母菌株第一批次小规模高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图，图3-b为rhKLK1毕赤酵母菌株第二批次小规模高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图，图3-c为rhKLK1毕赤酵母菌株第三批次小规模高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

图4 rhKLK1毕赤酵母菌株不同批次小规模高密度发酵液SDS-PAGE电泳图

其中，图4-a为rhKLK1毕赤酵母菌株第一批次小规模高密度发酵液SDS-PAGE电泳图，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇0h发酵上清液，泳道3为流加甲醇4h发酵上清液，泳道4为流加甲醇8h发酵上清液，泳道5为流加甲醇16h发酵上清液，泳道6为流加甲醇24h发酵上清液，泳道7为流加甲醇32h发酵上清液，泳道8为流加甲醇40h发酵上清液，其中箭头所指即为低分子量rhKLK1条带。

图4-b为rhKLK1毕赤酵母菌株第二批次小规模高密度发酵液SDS-PAGE电泳图，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇0h发酵上清液，泳道3为流加甲醇4h发酵上清液，泳道4为流加甲醇8h发酵上清液，泳道5为流加甲醇16h发酵上清液，泳道6为流加甲醇24h发酵上清液，泳道7为流加甲醇32h发酵上清液，泳道8为流加甲醇40h发酵上清液，其中箭头所指即为低分子量rhKLK1条带。

图4-c为rhKLK1毕赤酵母菌株第三批次小规模高密度发酵液SDS-PAGE电泳图，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇0h发酵上清液，泳道3为流加甲醇4h发酵上清液，泳道4为流加甲醇8h发酵上清液，泳道5为流加甲醇16h发酵上清液，泳道6为流加甲醇24h发酵上清液，泳道7为流加甲醇32h发酵上清液，泳道8为流加甲醇40h发酵上清液，中箭头所指即为低分子量rhKLK1条带。

图5为rhKLK1发酵液疏水层析色谱图，图中三个峰依次为50％，70％，100％BufferB洗脱样品。其中前两个分别为高分子量rhKLK1、低分子量rhKLK1的峰。

图6为rhKLK1发酵液疏水层析收集样品SDS-PAGE凝胶电泳分析图

其中，图6-a为rhKLK1发酵液疏水层析收集样品SDS-PAGE凝胶电泳分析图，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2-12为50％Buffer B洗脱时不同的收集管样品，泳道13-15为70％BufferB洗脱时不同的收集管样品，箭头所指即为低糖基化rhKLK1条带。

图6-b为rhKLK1发酵液疏水层析收集样品SDS-PAGE凝胶电泳分析图，

泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道1-12为70％Buffer B洗脱洗脱时不同的收集管样品，泳道13-15为100％Buffer B洗脱时不同的收集管样品，箭头所指即为低糖基化rhKLK1条带。

图7为rhKLK1疏水收集样品经过阴离子交换层析色谱图。

图8为rhKLK1疏水收集样品经过阴离子交换层析收集样品SDS-PAGE凝胶电泳分析图，其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2-8为Buffer C洗脱时不同的收集管样品。箭头所指即为低糖基化rhKLK1条带。

图9为rhKLK1毕赤酵母菌株不同批次小规模高密度发酵液经两步纯化后，SEC柱分析rhKLK1聚集体HPLC色谱图，其中图a，b，c分别为rhKLK1毕赤酵母菌株第一、二、三批次小规模高密度发酵液低糖基化rhKLK1精纯样品，d为空白对照。

图10为rhKLK1毕赤酵母菌株不同批次小规模高密度发酵液经两步纯化后，IEC柱分析rhKLK1纯度HPLC色谱图，其中图a，b，c分别为rhKLK1毕赤酵母菌株第一、二、三批次小规模高密度发酵液低糖基化rhKLK1精纯样品，d为空白对照。

图11为rhKLK1毕赤酵母菌株工艺参数范围内外不同批次小规模高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图

其中，图11-a为rhKLK1毕赤酵母菌株工艺范围内验证第一批次小规模高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图，图11-b为rhKLK1毕赤酵母菌株工艺范围内验证第二批次小规模高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图，图11-c为rhKLK1毕赤酵母菌株工艺范围外验证对照一批次小规模高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图，图11-d为rhKLK1毕赤酵母菌株工艺范围外验证对照二批次小规模高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

图12 rhKLK1毕赤酵母菌株工艺参数范围内外不同批次小规模高密度发酵液SDS-PAGE电泳图

其中，图12-a为rhKLK1毕赤酵母菌株工艺范围内验证第一批次小规模高密度发酵液SDS-PAGE电泳图，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇0h发酵上清液，泳道3为流加甲醇4h发酵上清液，泳道4为流加甲醇8h发酵上清液，泳道5为流加甲醇16h发酵上清液，泳道6为流加甲醇24h发酵上清液，泳道7为流加甲醇32h发酵上清液，泳道8为流加甲醇40h发酵上清液，其中箭头所指即为rhKLK1条带。

图12-b为rhKLK1毕赤酵母菌株工艺范围内验证第二批次小规模高密度发酵液SDS-PAGE电泳图，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇0h发酵上清液，泳道3为流加甲醇4h发酵上清液，泳道4为流加甲醇8h发酵上清液，泳道5为流加甲醇16h发酵上清液，泳道6为流加甲醇24h发酵上清液，泳道7为流加甲醇32h发酵上清液，泳道8为流加甲醇40h发酵上清液，其中箭头所指即为rhKLK1条带。

图12-c为rhKLK1毕赤酵母菌株工艺范围外验证对照一批次小规模高密度发酵液SDS-PAGE电泳图，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇0h发酵上清液，泳道3为流加甲醇4h发酵上清液，泳道4为流加甲醇8h发酵上清液，泳道5为流加甲醇16h发酵上清液，泳道6为流加甲醇24h发酵上清液，泳道7为流加甲醇32h发酵上清液，泳道8为流加甲醇40h发酵上清液，其中箭头所指即为rhKLK1条带。

图12-d为rhKLK1毕赤酵母菌株工艺范围外验证对照二批次小规模高密度发酵液SDS-PAGE电泳图，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇0h发酵上清液，泳道3为流加甲醇4h发酵上清液，泳道4为流加甲醇8h发酵上清液，泳道5为流加甲醇16h发酵上清液，泳道6为流加甲醇24h发酵上清液，泳道7为流加甲醇32h发酵上清液，泳道8为流加甲醇40h发酵上清液，其中箭头所指即为rhKLK1条带。

图13为rhKLK1毕赤酵母菌株大规模生产高密度发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图

图14为rhKLK1毕赤酵母菌株大规模生产高密度发酵液SDS-PAGE电泳图

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇0h发酵上清液，泳道3为流加甲醇4h发酵上清液，泳道4为流加甲醇8h发酵上清液，泳道5为流加甲醇16h发酵上清液，泳道6为流加甲醇24h发酵上清液，泳道7为流加甲醇32h发酵上清液，泳道8为流加甲醇40h发酵上清液，其中箭头所指即为rhKLK1条带。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本申请重组菌株种子根据先申请201310737079.1的方法制备获得。

实施例1 rhKLK1种子库建立及基因遗传稳定性

方案1：rhKLK1种子库建立

根据“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定，对专利中201310737079.1rhKLK1毕赤酵母菌株X33建立原始种子库、主种子库和工作种子库。

方案2：rhKLK1遗传稳定性

步骤1：重组菌株活化

取冻存于-80℃的工作种子库中rhKLK1甘油菌种子于YPD固体培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂糖15g/L)划线，30℃恒温恒湿箱培养3-5天。

步骤2：PCR鉴定基因稳定性

挑YPD平板上50个单克隆菌落接种于5mL YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)中，30℃，220rpm培养过夜。

离心收集上述不同克隆的菌体，分别在液氮和沸水中进行反复冻融破碎菌体。并以上述冻融液为模板，5-AOX和3-AOX为引物进行PCR扩增rhKLK1毕赤酵母菌株基因组中目的基因，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆率。

步骤3：传代稳定性

挑取步骤2中任一管PCR鉴定为阳性rhKLK1毕赤酵母克隆菌液，连续在YPD液体培养基中传代40次，并每传代5次重复步骤2进行PCR扩增rhKLK1毕赤酵母菌株基因组中目的基因，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆率。图1所示为传代第40代后，PCR扩增rhKLK1毕赤酵母菌株基因组中目的基因，琼脂糖凝胶电泳显示阳性克隆率为100％，说明该重组菌株能够在大规模生产中，稳定遗传rhKLK1基因。

步骤4：表达稳定性

将步骤1中任一单克隆菌落稳定传代，第1-40代单克隆菌落均按1％接种量转接于BSM培养液，浓氨水调节培养液至不同的pH，30℃，220rpm培养，每24h补加甲醇至终浓度为1.0％，一周后，对诱导培养液进行SDS-PAGE分析，各代单克隆菌落中rhKLK1的表达情况如图2所示。根据鉴定结果可知rhKLK1毕赤酵母菌株经40代传代后仍可稳定表达目的蛋白rhKLK1。

实施例2 rhKLK1小规模高密度发酵工艺

步骤1：重组菌株活化

取冻存于-80℃的工作种子库中rhKLK1甘油菌种子于YPD固体培养基划线，30℃恒温恒湿箱培养3-5天。

步骤2：种子液培养

挑取平板上单克隆菌落于YPD液体培养基，30℃，220rpm培养至OD₆₀₀≈6.0，并在显微镜下观察无杂菌污染，即得到发酵用种子液。

步骤3：发酵过程

洗净赛多利斯B-plus生物反应器，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，然后按照表1中rhKLK1小规模高密度发酵工艺条件优化表中不同批次的发酵培养基配方配置3L发酵培养基，并倒入发酵罐中，121℃高压灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝6.0±0.2。

将步骤2中得到的种子液按照1:15(V/V，种子液/发酵培养基)比例接入生物反应器中。初期重组毕赤酵母菌体增殖阶段发酵温度为30℃，pH＝6.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM1(2mL/L)。此阶段大约20h，期间DO值持续下降，通过增加搅拌转速、通气量以及通氧气将DO值维持在20％，当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体湿重达到100g/L，此时进入限速生长阶段，此阶段的开始的2h以30mL/h^-1L^-1的速率补加50％甘油，2h后补料速度上调为60mL/h^-1L^-1。补加4h，菌体湿重约200g/L，停止补料，DO值上升，表明碳源耗尽，进入诱导阶段。调节pH＝6.0±0.2，按照表1中设计的方案，不同批次不同的甲醇流加速度进行诱导表达，并维持DO值不高于30％，进行发酵表达。诱导开始后，每隔一段时间开始取样，同时在诱导初期中，短暂停止甲醇补料观察DO值变化判断罐内甲醇浓度是否过高，保证罐内甲醇无积累，并测发酵液OD₆₀₀吸收值以及菌体湿重，图3-a，图3-b，图3-c为第一批次-第三批次发酵液OD₆₀₀吸收值以及菌体湿重发酵期间变化趋势图，由图可知，在rhKLK1小规模发酵期间，发酵液OD₆₀₀均能达到250以上，且菌体湿重均能达到400g/L，确保每批次发酵的稳定性。诱导40h发酵结束后，离心收集上清，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定甲醇诱导表达不同时间的rhKLK1产量和高低糖基化修饰程度(图4-a，4-b，4-c)。附图4中也能明显可以看出，整体而言rhKLK1产量是较高的，而所表达的低糖基化修饰的rhKLK1要明显高于高糖基化修饰的rhKLK1。详细发酵工艺条件如下表1所示：

表1重组hKLK1小规模高密度发酵工艺条件优化

其中，不同百分比的BSM发酵培养基是指在Invitrogen公司的发酵说明书(pichiaFermentation Process Guidelines)上确定的BSM(Basal Salts Medium)培养基中各成分标准浓度的基础上对各成分浓度进行的优化，100％的BSM发酵培养基即是指Invitrogen公司的发酵说明书上确定的BSM培养基中各成分标准浓度，即指K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄ 14.9g/L，KOH 0.93g/L，CaSO₄ 4.13g/L，H₃PO₄ 26.7mL/L，甘油40g/L，40％的BSM发酵培养基即是指Invitrogen公司的发酵说明书上确定的BSM培养基中各成分标准浓度基础上各成分浓度都降为40％，即K₂SO₄3.64g/L，MgSO₄5.96g/L，KOH 0.372g/L，CaSO₄1.652g/L，H₃PO₄ 10.68mL/L，甘油16g/L。

实施例3 重组hKLK1蛋白的纯化

本专利主要采用两步法对rhKLK1进行纯化，第一步采用疏水层析对rhKLK1进行富集和分离糖基化修饰程度不同的rhKLK1蛋白，第二步采用阴离子交换层析分离低糖基化的rhKLK1和杂蛋白。具体步骤如下：

步骤1：发酵液的预处理

将上述实施例1得到的三个不同批次的发酵液离心获得上清液，并通过台式超滤系统浓缩至500mL，加入高浓度磷酸二氢钠和硫酸铵，使其终浓度分别为20mM和1.5M，用NaOH调pH＝7.5，0.22μm滤膜过滤即得处理后发酵液上清，可进行层析纯化。

步骤2：疏水层析纯化

将上述处理后的发酵液上清上Phenyl Sepharose 6FF(HS)层析填料，平衡缓冲液BufferA为：20mM NaH₂PO₄，1.5M(NH₄)₂SO₄，pH＝7.5，洗脱缓冲液Buffer B为：20mM NaH₂PO₄，pH＝7.5，按照洗脱缓冲液Buffer B50％，70％，100％等度洗脱，高糖基化rhKLK1主要集中在50％洗脱峰，低糖基化rhKLK1主要集中在70％洗脱峰，图5为重组hKLK1疏水层析纯化色谱图，图6为重组hKLK1疏水层析后SDS-PAGE分析图。从图5、图6的结果中均可以明显看出低糖基化rhKLK1的量要远高于高糖基化rhKLK1。

步骤3：阴离子交换层析

将疏水层析洗脱收集的rhKLK1样品稀释电导≤8.0mS/cm，上Q Sepharose FF阴离子交换层析柱，平衡缓冲液BufferB为：20mM NaH₂PO₄，pH＝7.5，洗脱缓冲液Buffer C为：20mM NaH₂PO₄，1.5M NaCl，按照洗脱缓冲液Buffer C17％，35％，100％等度洗脱，样品峰主要集中在35％洗脱峰，过滤除菌即得到rhKLK1原液。图7为rhKLK1离子交换纯化色谱图，说明该色谱峰蛋白均为低糖基化rhKLK1，没有其他蛋白色谱峰产生，图8为rhKLK1离子交换层析后SDS-PAGE分析图，说明通过两步纯化，目的条带均为低糖基化rhKLK1，没有高糖基化rhKLK1产生。

实施例4 rhKLK1 HPLC纯度分析

方案1：rhKLK1聚集体分析

将实施例2得到的样品，并将其余两个批次也实施例2纯化得到的样品稀释至1mg/mL，0.22μm滤膜过滤，即得到样品。流动相BufferB为20mM NaH₂PO₄，pH＝7.5，流速1mL/min，进样体积为10μL，SEC柱分析聚体(BEH200，SEC1.7μm)，HPLC仪器型号(Waters，e2695)，图9为SEC检测结果，其中图9中a图为第一批次、b图为第二批次、c图为第三批次，d图为溶剂峰，说明发酵液经两步纯化的获得的rhKLK1成分单一，符合药用级别质量标准。

方案2：rhKLK1纯度分析

将实施例2步骤3中纯化得到的rhKLK1样品稀释至1mg/mL，0.22μm滤膜过滤，即得到用于HPLC分析样品。流动相Buffer D为20mM NaH₂PO₄，pH＝9.0，流速1mL/min，进样体积为10μL，IEC柱分析纯度(Protein Pak Hi Res Q柱)，仪器型号(Waters，e2695)，图10为纯度检测结果，图10中a图为第一批次、b图为第二批次、c图为第三批次、d图为溶剂峰，说明发酵液经两步纯化的rhKLK1纯度均大于95％，符合药用级别纯度要求，该纯化样品可用于下述实施例中的比活评价。

实施例5 rhKLK1比活测定

反应缓冲液为(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.0)，将标准品“怡开”原料液(购于千红制药，生产批号：NO.3712030700)，稀释5个浓度梯度10IU/mL，5IU/mL，2.5IU/mL，1.25IU/mL，0.625IU/mL，底物为S2266(D-Val-Leu-Arg p-nitroanilide，购自Sigma-Aldrich公司)，使用时用反应缓冲液稀释至0.2mM，对照品尤瑞克林(购自广州天普，生产批号：311506061)。样品用反应缓冲液稀释适当倍数，于96孔板中先每孔加稀释好的底物80μL，然后立即加入稀释好的标准品80μL及各样品，Synergy H1GEN酶标仪(购自BioTek公司)37℃，405nm处进行吸光度检测，1min检测一次，连续检测15min。

根据实施例1中表1顺序进行的多批次小规模高密度发酵实验，将每批次得出的关键质量属性rhKLK1比活值依次填入到表2中的rhKLK1比活一列，同时并以市售药品或半成品尤瑞克林和怡开作对照，由表2可知，rhKLK1毕赤酵母菌株在以优化后的发酵培养基、诱导温度和甲醇流加速度进行生产重组激肽原酶，其关键质量属性hKLK1比活和市售药品或半成品尤瑞克林或怡开具有相同比活，完全可以替代类似的产品。

表2不同批次rhKLK1小规模高密度发酵比活测定表

实施例6 rhKLK1小规模高密度发酵工艺验证

rhKLK1小规模高密度发酵工艺参数范围内外验证不同批次发酵培养基、诱导温度以及甲醇流加速度详见表3，其中验证第一批次、第二批次中关键工艺参数同时满足发酵培养基在40～80％、诱导温度25～28℃以及甲醇流加速度5～11mL/h^-1L^-1范围内，而对照一、对照二批次均不能同时满足发酵培养基在40～80％、诱导温度25～28℃以及甲醇流加速度5～11mL/h^-1L^-1范围内，发酵过程详见实施例1。诱导开始后，每隔一段时间取样，测发酵液OD₆₀₀吸收值以及菌体湿重，以及对发酵样品进行SDS-PAGE凝胶分析。图11-a，图11-b，图11-c，图11-d分别为rhKLK1小规模工艺验证第一批次、第二批次、对照一、对照二发酵液OD₆₀₀吸收值以及菌体湿重发酵期间变化趋势图，图11-a和图11-b发酵液OD₆₀₀均达到250以上，菌体湿重均达到400g/L，且两组OD₆₀₀和菌体湿重完全保持一致，图12-a，图12-b的SDS-PAGE电泳结果表明发酵产物产量和糖基化修饰程度完全一致，说明关键工艺参数甲醇流加速度、发酵培养基以及诱导温度工艺参数同时满足设计区间的参数时，每批次之间是高度稳定一致的，也说明rhKLK1药用蛋白的发酵工艺高度稳健的；而图11-c在发酵30h后，发酵液OD₆₀₀达到最高值350后就开始下降至150，菌体湿重也一直保持在200g/L，图11-d在发酵30h后，发酵液OD₆₀₀达到最高值300就保持稳定不变，菌体湿重一直保持在200g/L，图12-c为对照一发酵产物SDS-PAGE电泳结果，图12-d为对照二发酵产物SDS-PAGE电泳结果，结果表明这两批次发酵产物产量很低，或者高糖基化重组hKLK1占比例相对较高，充分说明这二者的工艺不适合重组hKLK1进行高密度发酵的。

表3重组hKLK1小规模高密度发酵工艺参数范围内外验证表

最终将这四批次发酵液分别通过两步纯化，获得低糖基化rhKLK1纯品，并通过S2266底物测定，由表3可知，该两批次工艺验证获得的rhKLK1比活均在1000IU/mg以上，而对照一和对照二均低于300IU/mg以下。

实施例7 rhKLK1放大规模发酵工艺验证

步骤1：重组菌株活化

取冻存于-80℃的工作种子库中甘油菌种子于YPD固体培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂糖15g/L)划线，30℃恒温恒湿箱培养3-5天。

步骤2：一级种子液培养

挑取步骤1中平板上单克隆菌落于YPD液体培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30℃，220rpm培养至OD₆₀₀≈6.0，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用一级种子液。

步骤3：二级种子液培养

将步骤2中获得的一级种子液接种至赛多利斯B-plus发酵罐中，并以50％BSM，pH＝6.0±0.2，30℃，300rpm值培养，通过通气和转速条件是溶氧保持在25％，最终至OD₆₀₀≈40，湿重达到约80g/L，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用二级种子液。

步骤4：发酵过程

洗净赛多利斯C plus生物反应器，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，然后按照实施例6中关键工艺参数的设计区间，确定发酵培养基为50％BSM进行配置发酵培养基20L，并倒入发酵罐中，121℃在线灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝6.0±0.2。

将方案3中得到的种子液按照1:15(V/V，种子液/发酵培养基)比例接入发酵罐中。初期重组毕赤酵母菌体增殖阶段发酵温度为30℃，pH＝6.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM1(2mL/L)。此阶段大约20h，当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体湿重达到100g/L，此时进入限速生长阶段，此阶段的开始的2h以30mL/h^-1L^-1的速率补加50％甘油，2h后补料速度上调为60mL/h^-1L^-。补加4h，菌体湿重约200g/L，停止补料，DO上升，表明碳源耗尽，进入诱导阶段。调节pH＝6.0±0.2，以甲醇流加速度为10ml/h^-1L^-1进行诱导表达rhKLK1；维持DO不高于50％，诱导温度为27℃，pH＝6.0±0.2，进行发酵表达，发酵开始后每隔一段时间取样一次，测发酵液OD₆₀₀吸收值以及菌体湿重，图13为rhKLK1放大规模发酵液OD₆₀₀吸收值以及菌体湿重发酵期间变化趋势图，由图可知，在重组毕赤酵母发酵期间，发酵液OD₆₀₀均能达到300以上，且菌体湿重均能达到400g/L。诱导40h发酵结束后，离心收集上清，SDS-PAGE电泳鉴定甲醇诱导不同时间的rhKLK1产量和糖基化修饰程度(图14)，说明发酵液OD₆₀₀吸收值、菌体湿重变化趋势以及发酵产物均与3L小规模高密度发酵保持一致。最终将低糖基化rhKLK1纯品通过S2266底物测定，该放大发酵得到的rhKLK1激肽原酶的比活保持在1000IU/mg以上，产品质量也符合药用级别标准。申请人因此确定，本发明的发酵工艺，完全能够进行产业化放大生产。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种rhKLK1的毕赤酵母高密度发酵方法，其特征在于：其发酵过程中：诱导阶段的甲醇流加速度为：5～11mL/h^-1L^-1，诱导温度为：25～28℃，所用BSM发酵培养基各组成成分及其配比分别为：K₂SO₄ 3.64～14.56g/L，MgSO₄ 5.96～11.92g/L，KOH 0.372～0.744g/L，CaSO₄ 1.652～3.304g/L，H₃PO₄ 10.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。

2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述方法包含下述步骤：

步骤1)将rhKLK1毕赤酵母工程菌株划线YPD平板，30℃培养3-5天；

步骤2)将此复苏后的rhKLK1工程菌株单克隆接种于YPD液体培养基30℃培养至OD₆₀₀＝6～8，即得到上罐种子液；

步骤3)将此种子液接种于发酵罐的BSM发酵培养基中，发酵40～72h即得到rhKLK1发酵液，其中诱导阶段的甲醇流加速度：5～11mL/h^-1L^-1，诱导温度为：25～28℃，所述BSM发酵培养基各组成成分及其配比分别为：K₂SO₄ 3.64～14.56g/L，MgSO₄ 5.96～11.92g/L，KOH0.372～0.744g/L，CaSO₄ 1.652～3.304g/L，H₃PO₄ 10.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。

3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：上述步骤3)中增殖阶段发酵温度为30℃，pH＝6.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM1(2mL/L)，发酵20h；限速生长阶段，先以30ml/h^-1L^-1的速率补加50％甘油，2h，然后以60mL/h^-1L^-1的速率补加50％甘油，4h；诱导阶段，调节pH＝6.0±0.2，诱导温度：25～28℃，甲醇流加速度：5～11mL/h^-1L^-1，并维持DO值不高于30％，继续发酵40～72h。

4.一种rhKLK1发酵液的纯化方法，所述纯化方法包含以下步骤：

步骤1)rhKLK1发酵液预处理：收集如权利要求1至3任一项所得到的rhKLK1发酵液低温高速离心收集上清，加入硫酸铵，终浓度为1.5M，0.22μm滤膜过滤；

步骤2)疏水层析法纯化：平衡缓冲液平衡层析柱，预处理的发酵液上清上样，洗脱液梯度洗脱，收集低糖基化hK1洗脱峰；

步骤3)阴离子交换层析法纯化：平衡缓冲液平衡层析柱，预处理后上样，洗脱液梯度洗脱，收集低糖基化hK1洗脱峰。

5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：所述方法的步骤2)中，填料优选为Phenyl Sepharose 6FF(HS)，平衡缓冲液Buffer A为：20mM NaH₂PO₄，1.5M(NH₄)₂SO₄，pH＝7.5；洗脱缓冲液Buffer B为：20mM NaH₂PO₄，pH＝7.5，按照洗脱缓冲液Buffer B50％，70％，100％等度洗脱，主要收集70％洗脱峰。

6.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：所述方法的步骤3)中，填料优选为QSepharose FF，平衡缓冲液Buffer B为：20mM NaH₂PO₄，pH＝7.5，洗脱缓冲液Buffer C为：20mM NaH₂PO₄，1.5M NaCl，按照洗脱缓冲液Buffer C 17％，35％，100％等度洗脱，主要收集35％洗脱峰。

7.一种BSM发酵培养基，其各组成成分及其配比分别为：K₂SO₄ 3.64～14.56g/L，MgSO₄5.96～11.92g/L，KOH 0.372～0.744g/L，CaSO₄ 1.652～3.304g/L，H₃PO₄ 10.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。