CN101717430A - 一种重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的纯化方法 - Google Patents
一种重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的在于提供一种重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)的纯化方法，该方法包括的步骤依次为：上清液过滤处理、第一步层析纯化处理、第二步层析纯化处理、第三步层析纯化处理、第四步超滤浓缩处理。该方法对生物反应器中的重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)进行三步层析纯化处理，得到rhM-tPA成品。第一步层析纯化处理采用Blue SepharoseTM 6 Fast Flow亲和层析柱阶梯状洗脱；第二步层析纯化处理采用Zn2+-POROS 20MC螯和柱层析；第三步层析纯化处理采用Biosepra Lysin Hyperd亲和柱层析。所述的三步层析纯化处理均采用亲和层析法，过滤处理得到的上清液仅经过简单的处理可得到所需的高纯度活性的rhM-tPA成品；该方法操作简便，成本低廉，具有较大的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，特别涉及一种重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)的纯化方法，该方法包括的步骤依次为：上清液过滤处理、第一步层析纯化处理、第二步层析纯化处理、第三步层析纯化处理、第四步超滤浓缩处理。
技术背景
血栓性疾病，尤其是急性心肌梗塞、肺栓塞、缺血性脑卒中等是死亡率很高、后遗症重的疾病，已越来越引起人们的重视。溶栓是目前最有效的治疗方法，人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)是近十几年发展起来的新一代溶栓药物，它能激活纤溶酶原转变为纤溶酶，启动溶栓过程。天然t-PA是由血管内皮细胞合成并分泌的一种糖蛋白，属丝氨酸蛋白酶家族，对纤维蛋白有很高的亲和性，故血栓形成时，能特异与血栓中的纤维蛋白结合，纤溶酶原也通过其赖氨酸残基与纤维蛋白结合形成三元复合物，在血栓位点激活纤溶酶原，达到局部溶栓目的。这种机理决定t-PA可选择性地溶解血栓中的纤维蛋白，而对血液中的纤维蛋白原、凝血因子等没有破坏作用，克服了早期溶栓药物SK、UK等由于激活全身纤溶系统所带来的潜在的出血危险。
以美国为首的GUSTO研究组于1990年至1993年进行了一项大规模的治疗心肌梗塞的研究计划，结果表明，早期应用t-PA溶解血栓是治疗心肌梗塞的最佳方案，t-PA在自然界中含量甚微，难以大量制备，自Pennica首先发表t-PA序列以来，通过基因工程重组技术在哺乳类动物细胞中表达t-PA成为热门，美国Genentech公司于1987年推出CHO细胞表达的重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)，并应用于临床。第一代rht-PA虽然在急性心肌梗塞、肺栓塞、急性脑栓塞等疾病治疗过程中得到肯定疗效，但由于其半衰期短，血浆清除速度快，在体内很快被肝脏清除，使临床应用受到很大限制。为了更好地发挥t-PA的药理活性，人们对t-PA分子进行改造，获得各种突变体，以延长半衰期，提高对纤维蛋白的专一性，增强其溶栓活性。
我国有关t-PA及其突变体的研究报道很多，但至今仍在实验室研究阶段，没有进入临床，rht-PA的应用依赖进口，而rht-PA价格昂贵，给临床研究和血栓患者的治疗带来极大困难，市场上急需本土自主生产的rht-PA溶栓药品。在此类溶栓药品的制备中，有效成分的分离纯化是关键的环节，急需一种经济、高效的蛋白质纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)的纯化方法，该方法包括的步骤依次为：上清液过滤处理、第一步层析纯化处理、第二步层析纯化处理、第三步层析纯化处理、第四步超滤浓缩置换缓冲液。该方法对生物反应器中的重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)进行四步层析纯化处理，得到高产量、高纯度的rhM-tPA成品。
本发明是由以下技术方案实现的：
I.重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)制备：
A.工程细胞构建：本发明中，细胞株名称为CHO-D8株，由北京世贸东瑞医药科技有限公司构建；构建方法为：将人组织型纤溶酶原激活剂氨基酸序列(NCBI中编号为P00750)中的103位氨基酸N取代为T，117位Q取代为N，296-299位的KHRR取代为AAAA，得到人工合成含突变位点的人组织型纤溶酶原激活剂的基因全序列；将该序列酶切、转染至二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-)，克隆并筛选出可高效表达rhM-tPA的细胞株，作为工程细胞株；
B.细胞培养：将该工程细胞依次构建成为工作细胞库，将工作细胞库中的细胞株检定合格后，在生物反应器中进行培养，得到含重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)上清液；该上清液将用于分离纯化；
II.分离纯化：
该纯化处理包括的步骤依次为：上清液过滤、第一步层析纯化处理、第二步层析纯化处理、第三步层析纯化处理、第四步超滤浓缩置换缓冲液；
A.流动相组成：
a.所述的第一步层析纯化处理的流动相为A液、B液、C液：
所述的A液中包括：磷酸盐缓冲液(磷酸缓冲液(PB)S)20mM，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的B液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.5～5.0M，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的C液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.2～3.0M，尿素(Urea)0.5～5M，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
b.所述的第二步层析纯化处理的流动相为D液、E液、F液：
所述的D液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.1-20M，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的E液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.15～2.0M，咪唑0.1-5mM，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的F液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.15～2.0M，咪唑20～200mM，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
c.所述的第三步层析纯化处理的流动相为G液、H液、I液：
所述的G液中包括：磷酸盐缓冲液(磷酸缓冲液(PB)S)20mM，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的H液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.3～2.0M，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的I液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，L-精氨酸(L-Arginine)0.5M，6-氨基己酸(EACA)0.05～0.5M，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液的溶剂均为注射用水；所述的A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液的pH值均为7.2-7.4。
B.分离纯化的步骤：
a.上清液过滤处理：
无菌收集的所述的含重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)上清液，经0.45μm膜过滤，除去细胞碎片，得到过滤处理的上清液；
b.第一步层析纯化处理：采用Blue SepharoseTM 6Fast Flow亲和层析柱阶梯状洗脱；
所述的第一步层析纯化处理的步骤为：
将经过所述的过滤处理的上清液300～400升上已平衡好的BlueSepharoseTM6 Fast Flow亲和层析柱，该上柱的流速为50～100cm/hr；然后用所述的A液5～15升洗脱，再用所述的B液5～15升洗脱；最后用所述的C液4～15升洗脱，收集rhMt-PA活性峰4～10升，得到第一步层析液；
c.第二步层析纯化处理：采用Zn2+-POROS 20MC螯和柱层析；
所述的第二步层析纯化处理的步骤为：
将所述的第一步层析液上已平衡好的Zn 2+-POROS 20MC螯和层析柱，该上柱的流速为50～250cm/hr；然后用所述的D液0.5～1.5升洗脱，再用所述的E液0.5～1升洗脱；最后用所述的F液0.5～1.0升洗脱，收集rhMt-PA活性峰0.5～0.8升，得到第二步层析液；
d.第三步层析纯化处理：采用Biosepra Lysin Hyperd亲和柱层析；
所述的第二步层析纯化处理的步骤为：
将所述的第二步层析液用所述的G液稀释至3～15倍体积，上已平衡好的Biosepra Lysin Hyperd亲和层析柱，该上柱的流速为50～200cm/hr；然后用所述的G液0.5～1.5升洗脱，再用所述的H液0.5～1.5升洗脱；最后用I液0.5～1.5升洗脱，收集rhMt-PA活性峰0.5～0.8升，得到第三步层析液；
e.第四步超滤浓缩处理：
将所述的第三步层析液进行超滤浓缩处理，置换缓冲体系，收集膜上液体，即为rhM-tPA原液；将该原液进行检测、分装冻干后即得成品。
本发明的有益效果为：
1.该方法对生物反应器中的重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)进行四步层析纯化处理，得到的rhM-tPA成品产量高、纯度高。
2.该方法的前三步层析纯化处理均采用亲和层析法，过滤处理得到的上清液仅经过简单的处理可得到所需的高纯度活性的rhM-tPA成品。
3.该方法操作简便，成本低廉，具有较大的经济效益。
具体实施方式
实施例1：
本实施例进一步说明重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)的制备方法；
A.工程细胞构建：
本发明中，细胞株名称为CHO-D8株，由北京世贸东瑞医药科技有限公司构建；构建方法为：将人组织型纤溶酶原激活剂氨基酸序列(NCBI中编号为P00750)中的103位氨基酸N取代为T，117位Q取代为N，296-299位的KHRR取代为AAAA，得到人工合成含突变位点的人组织型纤溶酶原激活剂的基因全序列；将该序列酶切、转染至二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-)，克隆并加压筛选出可高效表达rhM-tPA的细胞株，作为工程细胞；该类似的构建方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美〕J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)。
B.细胞库建立：
a.原始细胞库建立：
(a)将所述的工程细胞CHO-D8经检定合格后确定为原始细胞，进行扩增、传代处理后，进行离心处理，去掉上清层，得到沉淀层；所述的离心处理的转速为1000rpm，时间为5分钟；所述的细胞扩增、传代处理的方法记载于《现代微生物学实验技术及其应用》(严杰，罗海波，陆德源主编，人民卫生出版社，1997年出版)。
所述的原始细胞采用原始细胞培养液进行培养，该培养液中含有：CHO-S-SFMII(美国Invitrogen公司生产的无血清培养基)10L，碳酸氢钠(NaHCO3)24.6g，胎牛血清(DFBS)300ml，牛血清白蛋白第五组份(BSAV)5g；将该原始细胞培养液用0.2μm膜过滤除菌；
(b)扩增传代后离心去掉原培养液，加入含10％二甲基亚砜(DMSO)和20％透析胎牛血清(DFBS)的CHO-S-SFM II(美国Invitrogen公司生产的无血清培养基)培养液悬浮，计数，稀释至每毫升大于2×106个细胞，并转移至冻存管中冻存；
(c)将所述的冻存管4℃放置2h，-20℃放置1h，-70℃放置2h，然后移入液氮中保存，即为原始细胞库；该原始细胞传代次数不超过16代；
b.主细胞库建立
从所述的原始细胞库中取出细胞，经复苏、扩增培养、检定合格后分装保存于液氮中，作为主细胞库；主细胞库细胞传代次数不应超过25代；所述的操作方法与原始细胞库建立中采用的操作方法相同；
c.工作细胞库
从主细胞库中取出细胞，经复苏、扩增培养(传代次数不应超过5代次)、检定合格后分装、于液氮中保存，作为工作细胞库，用于重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)的生产；所述的操作方法与原始细胞库建立中采用的操作方法相同。
d.细胞株的检定：
在上述的各个细胞库的构建过程中，细胞冻存前，复苏后及使用过程中应定期进行检定；
(a)细菌、真菌的检查：按《中华人民共和国药典》(2005年版)三部附录XIIA进行；
(b)支原体的检查：按《中华人民共和国药典》(2005年版)三部附录XIIB进行；
(c)细胞内、外源病毒因子的检查：
(i)红细胞吸附试验：取混合瓶细胞，接种于小瓶或小管中，长成单层后更换维持液，观察两周，镜检细胞，应保持细胞正常形态特征；培养14天，分别取1/3细胞培养瓶，用0.2-0.5％豚鼠红血球悬液进行红细胞吸附试验，加入红细胞后，先置于4-8℃30分钟，后置于20-25℃30分钟，结果应阴性；
(ii)细胞培养检查：细胞培养上清液混合样品，接种原代人肾、Vero、CHO-D8细胞(不同批)；接种的样品量占维持液的25％以上，培养14天作上述的红细胞吸附试验；培养7天的上清在同种细胞上盲传一代，共观察14天，应无细胞病变，红细胞吸附试验应阴性；
(d)rhM-tPA稳定性检查：
将细胞在含0.2μM甲氨蝶呤(MTX)的DMEM培养基中，传代50次，细胞的形态、染色体数、上清中rhM-tPA表达水平与原代细胞相同；
(e)表达水平检查：
工程细胞加压方瓶培养24小时的表达量应大于10μg/mL；
(f)细胞鉴别检查：
从同一代不同细胞瓶中取出细胞混合再培养，并做染色体标本片，染色体为20条，应无断裂、环状、微小体和四倍体；
(g)形态检查：
在含3％透析胎牛血清(DFBS)的CHO-S-SFM II(美国Invitrogen公司生产的无血清培养基)中，37℃培养，显微镜检查，应呈典型CHO细胞形态，呈多角型；类上皮细胞；
C.原液制备：
a.细胞的复苏：从上述的工作细胞库中取出冻存的细胞，立即置37℃水浴，边摇动边融化，直至全部融化；再1400rpm离心8-10分钟，去掉上清层，向沉淀层中加入含有3％胎牛血清(DFBS)、0.5mg/ml小牛血清白蛋白(BSA)、0.2μM甲氨蝶呤(MTX)的CHO-S-SFMII(美国Invitrogen公司生产的无血清培养基)培养液；
b.传代扩增：
将经上述复苏成活的细胞在含3％胎牛血清(FBS)、0.5mg/ml小牛血清白蛋白(BSA)、0.2μM甲氨蝶呤(MTX)的细胞扩增用培养液中进行扩增培养，在规定的代次内逐步达到所需细胞量；
该细胞扩增用培养液中含有：CHO-S-SFMII(美国Invitrogen公司生产的无血清培养基)10L，碳酸氢钠(NaHCO3)24.6g，胎牛血清(DFBS)300ml，牛血清白蛋白第五组份(BSAV)5g；将该细胞扩增用培养液用0.2μm膜过滤除菌；
D.细胞在反应器中的培养及含rhM-tPA的上清液的收获：
a.反应器的处理：采用美国NBS公司的30升堆积床生物反应器，按该反应器的使用说明书进行填装载体和灭菌处理；
b.培养液：生产用培养液为CHO-S-SFM II(美国Invitrogen公司生产的无血清培养基)，经0.2μm囊式滤芯(PALL公司生产)过滤，于4℃贮存；
c.细胞接种：将培养好的细胞用0.25％胰蛋白酶消化后转种于生物反应器，接种细胞总量不低于8.0×109；
d.在所述的生物反应器中，培养条件为：
溶氧：不低于50％；转速：接种后转速为45～60rpm，细胞贴附于聚酯片后转速根据细胞生长状况提高或降低，但必需低于80rpm；pH值：自动调节pH，使其维持在7.0-7.3之间；温度：设定为37.0℃
f.含rhM-tPA的上清液的收获：
每日测定葡萄糖含量一次，并根据耗糖状况调节培养基灌注速度，无菌收集含rhM-tPA的上清，标记后冷藏，用于纯化处理；所述的葡萄糖含量的测定方法，按德赛诊断系统(上海)有限公司生产的《葡萄糖液体试剂盒》的方法进行；所述的rhM-tPA表达水平的测定方法，按上海西唐生物科技有限公司生产的《人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)定量EIA试剂盒》的方法进行。
本实施例中，设施与生产质量管理均按中国《药品生产质量管理规范》要求实施；
本实施例中，所用的原料及辅料均符合现行《中华人民共和国药典》2005年版的要求和《中国生物制品主要原辅材料质控标准》要求；
本实施例中，生产用水应符合国家饮用水标准(GB5749-85)；纯化水及注射用水应符合现行《中华人民共和国药典》2005年版的规定。
本实施例中，直接用于生产的器具，均经过严格清洗及去热原处理或无菌处理；
本实施例中所述的所有试剂、用具、仪器设备均为常规产品，可以在市场购买得到；
本实施例中，根据t-PA的分子结构及其功能，采用基因重组技术构建CHO-D8细胞株，表达rht-PA的突变体rhM-tPA；rhM-tPA的突变位点及其功能为：
(1)将T103位点突变为N103，使其由非糖基化位点变为糖基化位点，降低了rhM-tPA在血浆中的清除速度，延长了半衰期，但这种突变也降低了rhM-tPA与纤维蛋白的结合能力；
(2)将N117位点突变为Q117，去除117位点的糖基化功能，这种改变修复了N103位点突变对纤维蛋白专一性的不利影响，并且也降低rhM-tPA在血浆中的清除速度；
(3)将K296、H297、R298、R299位点突变为A296、A297、A298、A299，增强了rhM-tPA对纤维蛋白的结合能力，最重要的是使rhM-tPA对其抑制剂PAI-1具有拮抗作用；
这种分子结构的改造使rhM-tPA比第一代rht-PA更为优越：
(1)对抑制剂PAI-1的拮抗能力增强了80倍；
(2)与纤维蛋白结合能力是第一代rht-PA的10-14倍；
(3)血浆清除速度延长4倍；
临床应用的优点为：
(1)降低使用剂量：rht-PA一般应用于急性血栓性疾病的抢救治疗，需大剂量t-PA才能达到溶栓效果，这增加了出血倾向，临床应用存在一定危险。rhM-tPA因其溶栓的高效性，应用低剂量即可达到高剂量第一代rht-PA同样治疗效果；
(2)降低内在血栓形成因素：与其他纤溶酶原激活剂及rht-PA相比，rhM-tPA可以减少血栓形成因素，rhM-tPA给药后血液中凝血酶-抗凝血酶复合物没有增加，rht-PA给药后凝血酶-抗凝血酶复合物增加2倍。
(3)可一次性给药：第一代rht-PA及有的t-PA突变株半衰期很短，在血液中很快被清除，不能很好发挥药效，需延长给药时间。如rht-PA为90分钟静脉滴注给药。rhM-tPA半衰期长，血浆清除速度慢，一次性给药即可很好发挥药效，临床应用方便。
综上所述，rhM-tPA具有半衰期长、纤维蛋白专一性强、对其抑制剂PAI-1有拮抗作用等优点，具有高效溶栓活性。国外已应用于临床，并获得令人鼓舞的疗效。据此，我公司构建了rhM-tPA的高效表达株CHO-D8，其表达稳定，用此生产的rhM-tPA理化性质、生物学特性与国外同类产品相同，产品质量符合《中华人民共和国药典》2005年版三部的有关要求。
实施例2：
本实施例进一步说明所述的三步纯化处理中流动相的组成：
a.所述的第一步层析纯化处理的流动相为A液、B液、C液：
所述的A液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的B液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.5～5.0M，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的C液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.2～3.0M，尿素(Urea)0.5～5M，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
b.所述的第二步层析纯化处理的流动相为D液、E液、F液：
所述的D液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.1-20M，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的E液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.15～2.0M，咪唑0.1-5mM，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的F液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.15～2.0M，咪唑20～200mM，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
c.所述的第三步层析纯化处理的流动相为G液、H液、I液：
所述的G液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的H液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.3～2.0M，抑肽酶(Aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的I液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，L-精氨酸(L-Arginine)0.5M，6-氨基己酸(EACA)0.05～0.5M，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液的溶剂均为注射用水；所述的A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液的pH值均为7.2-7.4。
本实施例中，所述的设施与生产质量管理标准、所用的原料及辅料的标准、用水的标准、生产器具的处理要求均与实施例1相同；
本实施例中所述的所有试剂、用具、仪器设备的来源均与实施例1相同；
实施例3：
本实施例是在实施例2基础上的优选方案，所述的流动项中，所述的A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液的组成进一步优化；
a.所述的第一步层析纯化处理的流动相为A液、B液、C液：
所述的A液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的B液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.8M，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的C液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.5M，尿素(Urea)0.8M，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
b.所述的第二步层析纯化处理的流动相为D液、E液、F液：
所述的D液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.3M，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的E液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.3M，咪唑0.5mM，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的F液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.3M，咪唑30mM，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
c.所述的第三步层析纯化处理的流动相为G液、H液、I液：
所述的G液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的H液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.5M，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的I液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，L-精氨酸(L-Arginine)0.5M，6-氨基己酸(EACA)0.1M，吐温20(Tween20)0.043％；
实施例4：
本实施例是在实施例2基础上的优选方案，所述的流动项中，所述的A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液的组成进一步优化；
a.所述的第一步层析纯化处理的流动相为A液、B液、C液：
所述的A液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的B液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)2.5M，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的C液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1.5M，尿素(Urea)2.5M，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
b.所述的第二步层析纯化处理的流动相为D液、E液、F液：
所述的D液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1M，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的E液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1M，咪唑2.5mM，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的F液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1M，咪唑100mM，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
c.所述的第三步层析纯化处理的流动相为G液、H液、I液：
所述的G液中包括：磷酸盐缓冲液(磷酸缓冲液(PB)S)20mM，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的H液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1M，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的I液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，L-精氨酸(L-Arginine)0.5M，6-氨基己酸(EACA)0.25M，吐温20(Tween20)0.043％；
实施例5：
本实施例是在实施例2基础上的优选方案，所述的流动项中，所述的A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液的组成进一步优化；
a.所述的第一步层析纯化处理的流动相为A液、B液、C液：
所述的A液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的B液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)4.5M，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的C液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)2.8M，尿素(Urea)4.5M，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
b.所述的第二步层析纯化处理的流动相为D液、E液、F液：
所述的D液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1.8M，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的E液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1.8M，咪唑4.5mM，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的F液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1.8M，咪唑190mM，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
c.所述的第三步层析纯化处理的流动相为G液、H液、I液：
所述的G液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的H液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1.8M，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的I液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，L-精氨酸(L-Arginine)0.5M，6-氨基己酸(EACA)0.45M，吐温20(Tween20)0.043％；
实施例6：
本实施例为实施例1至实施例5中所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)的纯化方法的工艺流程：
所述的上清液过滤处理、第一步层析纯化处理、第二步层析纯化处理、第三步层析纯化处理、第四步超滤浓缩处理的工艺流程依次为：
a.上清液过滤处理：
无菌收集的所述的含重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)上清液，经0.45μm膜过滤，除去细胞碎片，得到过滤处理的上清液；
b.第一步层析纯化处理：采用Blue SepharoseTM 6Fast Flow亲和层析柱阶梯状洗脱；
所述的第一步层析纯化处理的参数为：
柱型：150×500mm(上海华美)，介质：Blue SepharoseTM 6Fast Flow，介质体积：3000ml，该介质的购于美国GE公司；
该层析纯化处理中，检测波长为280nm，采用北京新技术研究所生产的8823A型紫外检测仪；采用ZT60-600型蠕动泵。
所述的第一步层析纯化处理的步骤为：
将经过所述的过滤处理的上清液300～400升上已平衡好的BlueSepharoseTM 6Fast Flow亲和层析柱，该上柱的流速为50～100cm/hr；然后用所述的A液5～15升洗脱，再用所述的B液5～15升洗脱；最后用所述的C液4～15升洗脱，收集rhMt-PA活性峰4～10升，得到第一步层析液；
将经过第一步层析纯化处理的Blue SepharoseTM 6Fast Flow亲和层析柱重新再生待用，该再生的步骤为：以流速为20～40cm/hr，用0.05～0.1MNaOH反向洗2倍柱体积(CV)，再用1M HAC反向洗1CV，再用注射用水反向洗10CV；最后用所述的A液平衡5CV后，即可重新上样。
c.第二步层析纯化处理：采用Zn 2+-POROS 20MC螯和柱层析；
所述的第二步层析纯化处理的参数为：
柱型：50×300(美国GE)，介质：Zn 2+-POROS 20MC，
介质体积：300ml，该介质的购于美国Applied Biosystems公司；
该层析纯化处理中，采用纯化系统；
所述的第二步层析纯化处理的步骤为：
将所述的第一步层析液上已平衡好的Zn 2+-POROS 20MC螯和层析柱，该上柱的流速为50～250cm/hr；然后用所述的D液0.5～1.5升洗脱，再用所述的E液0.5～1升洗脱；最后用所述的F液0.5～1.0升洗脱，收集rhMt-PA活性峰0.5～0.8升，得到第二步层析液；
将经过第二步层析纯化处理的Zn 2+-POROS 20MC螯和层析柱重新再生待用，该再生步骤为：以流速为100-200cm/hr，用0.05M EDTA、0.5M NaCl洗4CV，再用1.0M NaOH，1.0M NaCl反向洗3CV，再用1.0M HAC反向洗2CV，再用注射用水洗15CV，再用0.1M ZnCl2洗1.5CV，再用注射用水洗5CV；最后用所述的D液平衡5CV后，即可重新上样；
d.第三步层析纯化处理：采用Biosepra Lysin Hyperd亲和柱层析；
所述的第三步层析纯化处理的参数为：
柱型：50×300mm(上海华美)，介质：Biosepra Lysin Hyperd，
介质体积：400ml，该介质的购于美国PaLL公司；
该层析纯化处理中，采用
纯化系统；
所述的第二步层析纯化处理的步骤为：
将所述的第二步层析液用所述的G液稀释至3～15倍体积，上已平衡好的Biosepra Lysin Hyperd亲和层析柱，该上柱的流速为50～200cm/hr；然后用所述的G液0.5～1.5升洗脱，再用所述的H液0.5～1.5升洗脱；最后用I液0.5～1.5升洗脱，收集rhMt-PA活性峰0.5～0.8升，得到第三步层析液；
将经过第三步层析纯化处理的Biosepra Lysin Hyperd亲和层析柱重新再生待用，该再生步骤为：以流速为100-200cm/hr，用0.1M NaOH反向洗2CV，再用注射用水洗10CV，最后用所述的G液平衡5CV后，即可重新上样。
e.第四步超滤浓缩处理：
将所述的第三步层析液进行超滤浓缩处理，置换缓冲体系，收集膜上液体，即为rhM-tPA原液；将该原液进行检测、分装冻干后即得成品。该超滤浓缩处理采用截留10kD的膜包(由美国PALL公司生产)；1000ml该冲洗液中，含有L-精氨酸(L-Arginine)55g，正磷酸17g，吐温20(Tween20)340mg，该冲洗液的溶剂为注射用水；
本实施例中，所述的设施与生产质量管理标准、所用的原料及辅料的标准、用水的标准、生产器具的处理要求均与实施例1相同；
本实施例中所述的所有试剂、用具、仪器设备的来源均与实施例1相同；
本实施例中，所述的三次层析纯化处理均采用亲和层析。亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。亲和层析技术的最大优点在于，利用其可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质。利用亲和层析技术成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品，是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一。近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。对于分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲相层析技术就显示出其独特的优越性。
实施例7：
本实施例在实施例6的基础上，进一步说明所述的rhM-tPA原液的后续的检测、分装流程；
A.原液检定：
见下表检测报告：
B.半成品的配制与分批
a.半成品的配制、除菌：
将所述的rhM-tPA原液用1000ml含L-精氨酸(L-Arginine)55g，正磷酸17g，吐温20(Tween20)340mg的缓冲液稀释至所需体积，再立即用0.8μm，0.2μm双层滤膜除菌过滤，得到半成品；将该半成品一部分留出样品做半成品检定，其余保存于2-8℃；
b.分批：
将所述的保存的半成品按照《中华人民共和国药典》(2005年版)三部的生物制品分批规程进行分批；
c.半成品检定：
无菌检查：按照《中华人民共和国药典》(2005年版)三部附录XIIA进行
细菌内毒素检查：按照《中华人民共和国药典》(2005年版)三部附录XIIE凝胶半定量限量试验测定
d.分装：
将上述检定合格的半成品按规格要求分装；
e.冻干：
将所述的半成品装箱后-45℃预冻1小时，开始抽真空；干燥箱真空度至一定值时，开始对搁板加热升温，每小时升温5℃，至-15℃，维持16小时，继续加热至25℃，保温干燥8小时；真空压盖、出箱，即为成品，抽样做成品检定；
f.包装：
所述的成品检定合格后，按《中华人民共和国药典》(2005年版)三部“生物制品包装规程”之规定进行包装，规格为20mg/支。
Claims (6)
1.一种重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(rhM-tPA)的纯化方法，其特征在于：该方法包括的步骤依次为：上清液过滤处理、第一步层析纯化处理、第二步层析纯化处理、第三步层析纯化处理、第四步超滤浓缩处理。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：
a.所述的第一步层析纯化处理的流动相为A液、B液、C液：
所述的A液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的B液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.5～5.0M，抑肽酶(aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的C液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.2～3.0M，尿素(Urea)0.5～5M，抑肽酶(aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
b.所述的第二步层析纯化处理的流动相为D液、E液、F液：
所述的D液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.1-20M，
抑肽酶(aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的E液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.15～2.0M，咪唑0.1-5mM，抑肽酶(aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的F液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.15～2.0M，咪唑20～200mM，抑肽酶(aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
c.所述的第三步层析纯化处理的流动相为G液、H液、I液：
所述的G液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的H液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.3～2.0M，抑肽酶(aprotinin)0.2～20mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的I液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，L-精氨酸(L-Arginine)0.5M，6-氨基己酸(EAEC)0.05～0.5M，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液的溶剂均为注射用水；所述的A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液的pH值均为7.2-7.4。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：
a.所述的第一步层析纯化处理的流动相为A液、B液、C液：
所述的A液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的B液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.8M，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的C液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.5M，尿素(Urea)0.8M，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
b.所述的第二步层析纯化处理的流动相为D液、E液、F液：
所述的D液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.3M，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的E液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.3M，咪唑0.5mM，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的F液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.3M，咪唑30mM，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
c.所述的第三步层析纯化处理的流动相为G液、H液、I液：
所述的G液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％：
所述的H液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)0.5M，抑肽酶(aprotinin)0.5mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的I液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，L-精氨酸(L-Arginine)0.5M，6-氨基己酸(EAEC)0.1M，吐温20(Tween20)0.043％。
4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：
a.所述的第一步层析纯化处理的流动相为A液、B液、C液：
所述的A液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的B液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)2.5M，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的C液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1.5M，尿素(Urea)2.5M，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
b.所述的第二步层析纯化处理的流动相为D液、E液、F液：
所述的D液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1M，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的E液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1M，咪唑2.5mM，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的F液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1M，咪唑100mM，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
c.所述的第三步层析纯化处理的流动相为G液、H液、I液：
所述的G液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的H液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1M，抑肽酶(aprotinin)10mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的I液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，L-精氨酸(L-Arginine)0.5M，6-氨基己酸(EAEC)0.25M，吐温20(Tween20)0.043％。
5.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：
a.所述的第一步层析纯化处理的流动相为A液、B液、C液：
所述的A液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的B液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)4.5M，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的C液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)2.8M，尿素(Urea)4.5M，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
b.所述的第二步层析纯化处理的流动相为D液、E液、F液：
所述的D液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1.8M，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的E液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1.8M，咪唑4.5mM，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的F液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，氯化钠(NaCl)1.8M，咪唑190mM，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
c.所述的第三步层析纯化处理的流动相为G液、H液、I液：
所述的G液中包括：磷酸盐缓冲液(PBS)20mM，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的H液中包括：PB 20mM，氯化钠(NaCl)1.8M，抑肽酶(aprotinin)18mg/L，吐温20(Tween20)0.043％；
所述的I液中包括：磷酸缓冲液(PB)20mM，L-精氨酸(L-Arginine)0.5M，6-氨基己酸(EAEC)0.45M，吐温20(Tween20)0.043％。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述的第一步层析纯化处理、第二步层析纯化处理、第三步层析纯化处理、第四步超滤浓缩处理的工艺流程依次为：
a.第一步层析纯化处理：采用Blue SepharoseTM6 Fast Flow亲和层析柱阶梯状洗脱；
所述的第一步层析纯化处理的步骤为：
将经过所述的过滤处理的上清液300～400升上已平衡好的BlueSepharoseTM 6 Fast Flow亲和层析柱，该上柱的流速为50～100cm/hr；然后用所述的A液5～15升洗脱，再用所述的B液5～15升洗脱；最后用所述的C液4～15升洗脱，收集rhMt-PA活性峰4～10升，得到第一步层析液；
b.第二步层析纯化处理：采用Zn2+-POROS 20MC螯和柱层析；
所述的第二步层析纯化处理的步骤为：
将所述的第一步层析液上已平衡好的Zn2+-POROS 20MC螯和层析柱，该上柱的流速为50～250cm/hr；然后用所述的D液0.5～1.5升洗脱，再用所述的E液0.5～1升洗脱；最后用所述的F液0.5～1.0升洗脱，收集rhMt-PA活性峰0.5～0.8升，得到第二步层析液；
c.第三步层析纯化处理：采用Biosepra Lysin Hyperd亲和柱层析；
所述的第二步层析纯化处理的步骤为：
将所述的第二步层析液用所述的G液稀释至3～15倍体积，上已平衡好的Biosepra Lysin Hyperd亲和层析柱，该上柱的流速为50～200cm/hr；然后用所述的G液0.5～1.5升洗脱，再用所述的H液0.5～1.5升洗脱；最后用I液0.5～1.5升洗脱，收集rhMt-PA活性峰0.5～0.8升，得到第三步层析液；
d.第四步超滤浓缩处理：
将所述的第三步层析液进行超滤浓缩处理，置换缓冲体系，收集膜上液体，即为rhM-tPA原液；将该原液进行检测、分装冻干后即得成品。
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Cited By (6)
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|---|---|---|---|---|
| CN101942429A (zh) * | 2010-08-25 | 2011-01-12 | 广州铭康生物工程有限公司 | 重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体rhTNK-tPA的纯化方法 |
| CN101942429B (zh) * | 2010-08-25 | 2012-07-04 | 广州铭康生物工程有限公司 | 重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体rhTNK-tPA的纯化方法 |
| CN102408509A (zh) * | 2011-09-07 | 2012-04-11 | 广东工业大学 | 一种纤溶高分子化合物及其合成方法 |
| CN104491858A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-04-08 | 浙江我武生物科技股份有限公司 | 一种稳定的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物 |
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