CN111411049B - 一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111411049B
CN111411049B CN202010295197.1A CN202010295197A CN111411049B CN 111411049 B CN111411049 B CN 111411049B CN 202010295197 A CN202010295197 A CN 202010295197A CN 111411049 B CN111411049 B CN 111411049B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glycerol
culture
fermentation
induction
stage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010295197.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111411049A (zh
Inventor
曹海燕
王洪宇
张世野
王宝泉
王田园
王虹
池营
吴海洋
郭富饶
牟禹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd
Beijing Huizhiheng Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd
Beijing Huizhiheng Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd, Beijing Huizhiheng Biological Technology Co Ltd filed Critical Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN202010295197.1A priority Critical patent/CN111411049B/zh
Publication of CN111411049A publication Critical patent/CN111411049A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111411049B publication Critical patent/CN111411049B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请属于生物制药技术领域，公开了一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵生产胰岛素前体的方法。本发明所述毕赤酵母的发酵培养基采用磷酸盐缓冲体系，添加硫酸铵、硫酸亚铁等无机盐，添加尿素、磷酸二氢铵等氮源，组成成分明确，来源稳定，且诱导阶段无需增加氮源的流加。本发明所述发酵生产胰岛素前体的方法，在初始培养、甘油流加培养后采用甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，在诱导阶段混合流加一定比例的甘油，可加快菌体生长，随培养时间的增加，甘油混合比例逐渐降低，甲醇逐渐增多，大量的菌体在较短时间内进入高速表达期，目的产物获得较高水平的表达，大幅度缩短培养时间，避免过多副产物的产生影响产品质量。

Description

一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵 方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵生产胰岛素前体的方法。
背景技术
糖尿病是全世界最主要的慢性非传染性疾病之一，近些年随着患病率的上升，糖尿病所带来的疾病负担越来越严重，糖尿病及其并发症严重影响了人类的生活质量。
胰岛素是控制血糖最为有效的治疗药物，其制备方法分为化学合成法和基因重组法。胰岛素应用于临床90年共经历了三代里程碑式的进步，基因重组技术的发展使胰岛素制剂从第一代胰岛素-动物胰岛素到第二代胰岛素-人胰岛素，再到第三代胰岛素-胰岛素类似物。这一变化过程显示人们追求生理性降糖，并不断研发更好模拟正常人体生理降糖模式的胰岛素用于糖尿病。微生物发酵生产胰岛素相关产品常用宿主包括：大肠杆菌原核表达体系和酵母真核表达体系。大肠杆菌表达体系用来生产第二代胰岛素-人胰岛素取得了良好的效果，但是目前临床应用最广泛的是第三代胰岛素--胰岛素类似物，包括门冬胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素等，应用较多的是毕赤酵母表达体系。毕赤酵母表达体系遗传稳定，易培养，高密度发酵，有适合真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境，可进行蛋白质翻译后的修饰和加工。
毕赤酵母常规采用BSM培养基及在BSM基础上改进的培养基进行发酵培养。但采用上述培养基生产胰岛素前体，诱导时间过长，表达量不高。为了解决这一问题，专利CN105154500A提供了一种适用于毕赤酵母发酵产胰岛素原的培养基，该培养基配方为：蛋白胨1～20g/L，黄豆粉1～10g/L，85％磷酸13～14ml/L，碳酸钙0.3～0.4g/L，七水硫酸镁7.0～8.0g/L，硫酸铵6～10g/L，氢氧化钾1.5～2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6。基于上述培养基利用毕赤酵母产人胰岛素前体的发酵方法，人胰岛素前体表达量达到3678mg/L，并且大幅缩短发酵时间(发酵90h结束)，获得了比常规方法更高的产率，但是该方法使用蛋白胨和黄豆粉作为氮源补充剂，这种氮源补充剂来源不确定，成分复杂，不同批次间差异大，重复性差，无法保证生产稳定性。
在发酵工艺方面，Invitrogen life technologies公司《Pichia fermentationprocess guidelines》中提供的毕赤酵母常规发酵技术，其发酵工艺可分为一级、二级种子培养、甘油培养阶段、甘油流加阶段及甲醇诱导阶段。采用该方法生产胰岛素前体周期长，表达量一般，因此常采用优化后的方法进行生产。
专利CN 101029323 A提供一种胰岛素前体发酵过程补料优化方法，最终实现外源蛋白表达浓度为1.2g/L。但该方法需要通过计算菌体浓度，确定甲醇的补加速率，操作复杂，不利于实际生产，且表达量偏低。为提高目的蛋白产量，专利CN 107022591A提供了一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法，基于毕赤酵母生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，并在诱导发酵后期以与甲醇相同补加速率连续补加大豆蛋白胨或酵母抽提粉，平衡菌体生长与目的蛋白表达，最终外源蛋白表达浓度5500mg/L左右。虽然该方法实现了目标蛋白产量的提升，但需频繁调整补加速率，操作复杂，且在发酵后期需要依靠氮源补料延长培养周期来增加产量，发酵周期(约130～180h)的延长，同时该方法还存在氮源的添加发酵副产物相应增多，后续纯化增加困难，不利于放大规模生产等问题。谢静莉等采用甘油、甲醇混合流加表达血管生长抑制素时，菌体生长和血管生长抑制素的表达都有所提高，但该方法需要甘油限制性流加，菌体的比生长速率取决于甘油的流加速率。(谢静莉等，表达血管生长抑制素的重组毕赤酵母在诱导阶段混合碳源的流加，生物工程学报，2003,19(4)：467～470。)
由此可见采用上述培养基或方法生产胰岛素前体时，产品的产量与质量难以达到平衡，培养基成分来源的不稳定、延长周期时副产物的增加以及操作过程控制方法过于繁杂。因此，开发一种物料来源明确，成分组成稳定的发酵培养基，以及能够缩短发酵周期，操作简便的控制方法，实现产品生产效率的提高，显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵方法。
本发明的目的通过以下方案实现：
一种毕赤酵母的发酵培养基，配方为尿素5.0～10.0g/L，磷酸二氢钾10.0～20.0g/L，磷酸氢二钾4.0～8.0g/L，碳酸钙0.5～1.0g/L，七水硫酸镁10.0～20.0g/L，硫酸铵4.0～8.0g/L，磷酸二氢铵10.0～15.0g/L，硫酸亚铁0.5～1.0g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4ml/L，溶剂为水，pH为5.0～6.0。
本发明所述毕赤酵母的发酵培养基采用磷酸盐缓冲体系，添加硫酸铵、硫酸亚铁等无机盐，同时添加尿素、磷酸二氢铵等氮源。
在一些实施方案中，本发明所述的毕赤酵母的发酵培养基配方为：尿素6.0～8.0g/L，磷酸二氢钾12.0～15.0g/L，磷酸氢二钾4.5～7.0g/L，碳酸钙0.6～0.9g/L，七水硫酸镁12.0～15.0g/L，硫酸铵5.0～7.0g/L，磷酸二氢铵12.0～14.0g/L，硫酸亚铁0.6～0.8g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
在一些具体实施例中，本发明所述的毕赤酵母的发酵培养基配方为：尿素8.0g/L，磷酸二氢钾12.0g/L，磷酸氢二钾4.5g/L，碳酸钙0.9g/L，七水硫酸镁15.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢铵13.0g/L，硫酸亚铁0.8g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
进一步的，在一些实施方案中，本发明所述的毕赤酵母的发酵培养基中PTM1溶液配方为：五水合硫酸铜6.0g/L，碘化钠0.08g/L，一水合硫酸锰3.0g/L，二水合钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，六水合氯化钴0.5g/L，氯化锌20.0g/L，七水合硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，浓硫酸5.0ml/L，溶剂为水，。
本发明还提供了一种发酵生产胰岛素前体的方法，具体包含以下步骤：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入权利要求1-4任一项发酵培养基中，接种比例5～10v/v％，接种OD600＝8～10，初始培养条件为28～30℃，pH 5.0～6.0，通气量0.5～2.0vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％，当溶氧(DO)值快速回升至70％以上，该阶段结束；
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50v/v％左右甘油溶液，补加速率为10～12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当菌体OD600达到160±20时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至24～28℃，开始补加含有12ml/LPTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％；
(4)每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
在一些实施方案中，所述发酵生产胰岛素前体的方法中步骤(1)所述OD600为8.0。
在一些实施方案中，所述发酵生产胰岛素前体的方法中步骤(2)的饥饿OD600为160～170。
在一些实施方案中，所述发酵生产胰岛素前体的方法中步骤(3)所述诱导培养根据补料的甘油/甲醇比例分为三个阶段：
诱导一阶段：甘油：甲醇＝2：1(v/v)，补料速度3.0～5.0ml/L·h，当OD600达到200时，进入诱导二阶段；
诱导二阶段：甘油：甲醇＝1：2(v/v)，补料速度6.0～9.0ml/L·h，当OD600达到250时，进入诱导三阶段；
诱导三阶段：甘油：甲醇＝1：5(v/v)，补料速度9.0～12.0ml/L·h，诱导35h达到最大补料速度。
相对于现有技术本发明具有以下优点和有益效果之一：
(1)本发明所述毕赤酵母的发酵培养基采用磷酸盐缓冲体系，添加硫酸铵、硫酸亚铁等无机盐，保证了碳源的快速消耗，缩短诱导前培养时间，添加尿素、磷酸二氢铵等氮源，避免发酵后期营养物质缺失。本发明所述发酵培养基组成成分明确，来源稳定，且诱导阶段无需增加氮源的流加。
(2)本发明所述发酵生产胰岛素前体的方法，在初始培养、甘油流加培养后采用甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，在诱导阶段混合流加一定比例的甘油，可加快菌体生长，随培养时间的增加，甘油混合比例逐渐降低，甲醇逐渐增多，大量的菌体在较短时间内进入高速表达期，相当的表达时间内，目的产物获得较高水平的表达，大幅度缩短培养时间，避免过多副产物的产生影响产品质量。
(3)基于本发明所述的发酵培养基以及发酵方法，生产胰岛素前体，在保证胰岛素前体质量的基础之上，实现胰岛素前体产量提高30％以上，发酵周期至少缩短20h。
具体实施方式
本发明公开了一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1
本实施例的毕赤酵母发酵培养基为：尿素8.0g/L，磷酸二氢钾12.0g/L，磷酸氢二钾4.5g/L，碳酸钙0.9g/L，七水硫酸镁15.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢铵13.0g/L，硫酸亚铁0.8g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
使用甘油/甲醇混合流加方法，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例5％，接种OD600＝8，初始培养条件为28℃，pH 5.0，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到165时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至26℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％。
诱导一阶段0～8h；诱导二阶段8～25h；诱导三阶段25h～发酵结束。诱导32h达到最大补料速度。
(4)发酵结束：诱导培养开始后，每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
检测结果表明，发酵108h，胰岛素前体表达量5618mg/L，和对照实验相比，培养时间减少27h，表达量提高42.0％。
实施例2
本实施例的毕赤酵母发酵培养基为：尿素5.0g/L，磷酸二氢钾10.0g/L，磷酸氢二钾4.0g/L，碳酸钙0.9g/L，七水硫酸镁15.0g/L，硫酸铵5.0g/L，磷酸二氢铵14.0g/L，硫酸亚铁1.0g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
使用甘油/甲醇混合流加方法，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例7％，接种OD600＝9，初始培养条件为29℃，pH 5.4，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为10ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到165时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至25℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％。
诱导一阶段0～9h；诱导二阶段9～24h；诱导三阶段24h～发酵结束。诱导33h达到最大补料速度。
(4)发酵结束：诱导培养开始后，每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
检测结果表明，发酵102h，胰岛素前体表达量5418mg/L，和对照实验相比，培养时间减少33h，表达量提高37.0％。
实施例3
本实施例的毕赤酵母发酵培养基为：尿素5.0g/L，磷酸二氢钾15.0g/L，磷酸氢二钾7.0g/L，碳酸钙0.8g/L，七水硫酸镁16.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢铵13.0g/L，硫酸亚铁0.8g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
使用甘油/甲醇混合流加方法，，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例7％，接种OD600＝9，初始培养条件为29℃，pH5.4，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到160时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至25℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％。
诱导一阶段0～9h；诱导二阶段9～25h；诱导三阶段25h～发酵结束。诱导34h达到最大补料速度。
(4)发酵结束：诱导培养开始后，每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
检测结果表明，发酵105h，胰岛素前体表达量5507mg/L，和对照实验相比，培养时间减少30h，表达量提高39.2％。
实施例4
本实施例的毕赤酵母发酵培养基为：尿素6.0g/L，磷酸二氢钾12.0g/L，磷酸氢二钾8.0g/L，碳酸钙0.6g/L，七水硫酸镁12.0g/L，硫酸铵7.0g/L，磷酸二氢铵12.0g/L，硫酸亚铁0.6g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
使用甘油/甲醇混合流加方法，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例8％，接种OD600＝9.5，初始培养条件为29.5℃，pH 5.6，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到140时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至27℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％。
诱导一阶段0～12h；诱导二阶段12～27h；诱导三阶段27h～发酵结束。诱导36h达到最大补料速度。
(4)发酵结束：诱导培养开始后，每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
检测结果表明，发酵115h，胰岛素前体表达量5188mg/L，和对照实验相比，培养时间减少20h，表达量提高31.1％。
实施例5
本实施例的毕赤酵母发酵培养基为：尿素6.0g/L，磷酸二氢钾20.0g/L，磷酸氢二钾4.0g/L，碳酸钙0.5g/L，七水硫酸镁10.0g/L，硫酸铵8.0g/L，磷酸二氢铵15.0g/L，硫酸亚铁0.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
使用甘油/甲醇混合流加方法，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例8％，接种OD600＝9.5，初始培养条件为29.5℃，pH 5.6，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为10ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到145时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至27℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％。
诱导一阶段0～11h；诱导二阶段11～28h；诱导三阶段28h～发酵结束。诱导37h达到最大补料速度。
(4)发酵结束：诱导培养开始后，每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
检测结果表明，发酵112h，胰岛素前体表达量5272mg/L，和对照实验相比，培养时间减少23h，表达量提高33.3％。
实施例6
本实施例的毕赤酵母发酵培养基为：尿素8.0g/L，磷酸二氢钾20.0g/L，磷酸氢二钾7.0g/L，碳酸钙0.7g/L，七水硫酸镁18.0g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢铵10.0g/L，硫酸亚铁0.7g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
使用甘油/甲醇混合流加方法，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例9％，接种OD600＝10，初始培养条件为30℃，pH 5.8，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为11ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到155时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至28℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％。
诱导一阶段0～9h；诱导二阶段9～23h；诱导三阶段23h～发酵结束。诱导35h达到最大补料速度。
(4)发酵结束：诱导培养开始后，每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
检测结果表明，发酵106h，胰岛素前体表达量5472mg/L，和对照实验相比，培养时间减少29h，表达量提高38.3％。
实施例7
本实施例的毕赤酵母发酵培养基为：尿素10.0g/L，磷酸二氢钾15.0g/L，磷酸氢二钾4.5g/L，碳酸钙1.0g/L，七水硫酸镁14.0g/L，硫酸铵7.0g/L，磷酸二氢铵11.0g/L，硫酸亚铁0.8g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
使用甘油/甲醇混合流加方法，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例10％，接种OD600＝10，初始培养条件为30℃，pH 6.0，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到160时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至28℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％。
诱导一阶段0～8h；诱导二阶段8～23h；诱导三阶段23h～发酵结束。诱导34h达到最大补料速度。
(4)发酵结束：诱导培养开始后，每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
检测结果表明，发酵107h，胰岛素前体表达量5574mg/L，和对照实验相比，培养时间减少28h，表达量提高40.9％。
对比例1
本实施例的毕赤酵母发酵培养基为BSM培养基，配方为：85％磷酸26.7ml/L，二水硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，用氢氧化钾和磷酸调节pH为5.5。
使用毕赤酵母发酵的常规技术，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例5％，接种OD600＝8，初始培养条件为28℃，pH 5.0，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600到170时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)甲醇诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至26℃，以3.6ml/L/h的速率流加含12ml/L PTM1溶液的甲醇6h后，增大甲醇补料速率为10ml/L/h，直至发酵结束，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％。
(4)取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每6～8小时取发酵液样品一次，发酵110h后每2～4h取样检测一次，待表达量增加缓慢或减少时，结束发酵。
检测结果表明，发酵135h时，胰岛素前体表达量达到最大值3956mg/L。
对比例2
本实施例的毕赤酵母发酵培养基配方为：尿素8.0g/L，磷酸二氢钾12.0g/L，磷酸氢二钾4.5g/L，碳酸钙0.9g/L，七水硫酸镁15.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢铵13.0g/L，硫酸亚铁0.8g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
使用毕赤酵母发酵的常规技术，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例6％，接种OD600＝8.5，初始培养条件为28.5℃，pH 5.2，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到175时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)甲醇诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至24℃，以3.6ml/L/h的速率流加含12ml/L PTM1溶液的甲醇6h后，增大甲醇补料速率为10ml/L/h，直至发酵结束，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％。
(4)取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每6～8小时取发酵液样品一次，发酵110h后每2～4h取样检测一次，待表达量增加缓慢或减少时，结束发酵。
检测结果表明，发酵118h，胰岛素前体表达量4537mg/L，和对照实验相比，培养时间减少17h，表达量提高14.7％。
对比例3
本实施例的毕赤酵母发酵培养基配方为：尿素8.0g/L，磷酸二氢钾12.0g/L，磷酸氢二钾4.5g/L，碳酸钙0.9g/L，七水硫酸镁15.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢铵13.0g/L，硫酸亚铁0.8g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
使用专利CN 107022591A提供的毕赤酵母发酵方法，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：接种浓度为2.0×105cfu/ml，温度控制在32℃，空气通入比为1.5vvm，通过搅拌控制溶氧值≥50％，当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加含12ml/L PTM1溶液的50％甘油，其初始补加速率为F0＝12g/L/h，基于微生物生长动力学模型Ft+Δt＝(1+μt)Ft实时调整甘油补加速率，控制温度为32℃，空气通入比为1.5vvm，溶氧值≥30％，50％尿素溶液(w/v)控制pH6.0；当实时活细胞浓度X＝19pF/cm时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)甲醇诱导阶段：饥饿结束后补加含有12ml/L PTM1的甲醇溶液进行诱导，设定起始甲醇补加速率F0＝7g/L/h，基于微生物生长动力学模型Ft+Δt＝(1+μt)Ft实时调整甘油补加速率，使得目标蛋白的增加量基本能够维持在每小时增加0.04g/l的速度，控制温度为28℃，空气通入比为2.5vvm，溶氧值≤10％，50％尿素溶液((w/v)控制pH6.0；发酵培养到90h时，以与甲醇相同补加速率连续补加补料培养基，其成分为：CaSO4 0.5g/L，MgSO4 10g/L，KOH 10g/L，H3PO4 20g/L，酵母抽提粉10g/L，至发酵培养结束。
(4)取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每6～8小时取发酵液样品一次，发酵110h后每2～4h取样检测一次，待表达量增加缓慢或减少时，结束发酵。
检测结果表明，发酵175h，胰岛素前体表达量5125mg/L，和对照实验相比，培养时间增加40h，表达量提高29％。
对比例4
本实施例采用专利CN105154500A提供的毕赤酵母发酵培养基：蛋白胨10g/L，黄豆粉5g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.33g/L，七水硫酸镁7.4g/L，硫酸铵10g/L，氢氧化钾2.0g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
使用甘油/甲醇混合流加方法，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例5％，接种OD600＝8.5，初始培养条件为28.5℃，pH 5.0，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到170时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至26℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％。
诱导一阶段0～7h；诱导二阶段7～23h；诱导三阶段23h～发酵结束。诱导31h达到最大补料速度。
(4)发酵结束：诱导培养开始后，每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵80h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
检测结果表明，发酵95h，胰岛素前体表达量3912mg/L，和对照实验相比，培养时间减少40h，表达量减少1.2％。
对比例5
本实施例的毕赤酵母发酵采用BSM培养基，配方为：85％磷酸26.7ml/L，二水硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，用氢氧化钾和磷酸调节pH为5.5。
使用甘油/甲醇混合流加方法，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产胰岛素前体：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例6％，接种OD600＝8.5，初始培养条件为28.5℃，pH 5.2，通气量0.5vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％。当发酵培养基中初始甘油耗尽时，判断依据为DO值快速回升至70％以上，该阶段结束。
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50％甘油溶液，其补加速率为12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当OD600达到180时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h。
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至24℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％。
诱导一阶段0～6h；诱导二阶段6～22h；诱导三阶段22h～发酵结束。诱导30h达到最大补料速度。
(4)发酵结束：诱导培养开始后，每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
检测结果表明，发酵120h，胰岛素前体表达量4873mg/L，和对照实验相比，培养时间减少15h，表达量提高23.2％。
比较各实施例及对比例的表达量，结果见表1。
表1各实施例及对比例的表达量结果对比
培养基 培养方法 结束时间(h) 表达量(mg/L)
对比例1 BSM 常规甲醇诱导 135 3956
对比例2 优化培养基 常规甲醇诱导 118 4537
对比例3 优化培养基 对比甲醇诱导 175 5125
对比例4 对比培养基 甘油/甲醇诱导 95 3912
对比例5 BSM 甘油/甲醇诱导 120 4873
实施例1 优化培养基 甘油/甲醇诱导 108 5618
实施例2 优化培养基 甘油/甲醇诱导 102 5418
实施例3 优化培养基 甘油/甲醇诱导 105 5507
实施例4 优化培养基 甘油/甲醇诱导 115 5188
实施例5 优化培养基 甘油/甲醇诱导 112 5272
实施例6 优化培养基 甘油/甲醇诱导 106 5472
实施例7 优化培养基 甘油/甲醇诱导 107 5574
表1结果显示，本发明中提供的培养基，相对于常规使用的BSM培养基和氮源添加的对比培养基，在表达胰岛素前体过程中相对缩短了发酵周期，既减少了中间过程氮源的添加，又持续的促进蛋白表达。本发明提供的甘油/甲醇诱导方法，相对于常规甲醇诱导和对比甲醇诱导方法，甘油/甲醇的混合流加，菌体短时间内进入高速表达期，大幅缩短了发酵周期，且目的产物获得较高水平表达，提高了生产效率。

Claims (5)

1.一种发酵生产胰岛素前体的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)初始培养阶段：将毕赤酵母种子液接入发酵培养基中，接种比例5～10v/v％，接种OD600＝8～10，初始培养条件为28～30℃，pH 5.0～6.0，通气量0.5～2.0vvm，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧≥30％，当溶氧值快速回升至70％以上，该阶段结束；
所述发酵培养基的配方为尿素5.0～10.0g/L，磷酸二氢钾10.0～20.0g/L，磷酸氢二钾4.0～8.0g/L，碳酸钙0.5～1.0g/L，七水硫酸镁10.0～20.0g/L，硫酸铵4.0～8.0g/L，磷酸二氢铵10.0～15.0g/L，硫酸亚铁0.5～1.0g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4ml/L，溶剂为水，pH为5.0～6.0；
所述PTM1溶液配方为：五水合硫酸铜6.0g/L，碘化钠0.08g/L，一水合硫酸锰3.0g/L，二水合钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，六水合氯化钴0.5g/L，氯化锌20.0g/L，七水合硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，浓硫酸5.0ml/L，溶剂为水；
(2)甘油流加阶段：初始培养结束后，补加50v/v％甘油溶液，补加速率为10～12ml/L/h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％，当菌体OD600达到160±20时，停止补加甘油，饥饿0.5～1h；
(3)混合诱导阶段：饥饿结束后降低培养温度至24～28℃，开始补加含有12ml/L PTM1的甘油/甲醇混合溶液进行诱导培养，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧≥15％；
所述诱导培养根据补料的甘油/甲醇比例分为三个阶段：
诱导一阶段：甘油:甲醇＝2:1(v/v)，补料速度3.0～5.0ml/L·h，当OD600达到200时，进入诱导二阶段；
诱导二阶段：甘油:甲醇＝1:2(v/v)，补料速度6.0～9.0ml/L·h，当OD600达到250时，进入诱导三阶段；
诱导三阶段：甘油:甲醇＝1:5(v/v)，补料速度9.0～12.0ml/L·h，诱导35h达到最大补料速度；
(4)每6～8小时取样检测胰岛素前体表达量，发酵100h后每2～4h取样检测一次，当检测表达量涨幅<20mg/L·h时结束发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述OD600为8.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述饥饿的OD600为160～170。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为尿素6.0～8.0g/L，磷酸二氢钾12.0～15.0g/L，磷酸氢二钾4.5～7.0g/L，碳酸钙0.6～0.9g/L，七水硫酸镁12.0～15.0g/L，硫酸铵5.0～7.0g/L，磷酸二氢铵12.0～14.0g/L，硫酸亚铁0.6～0.8g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：尿素8.0g/L，磷酸二氢钾12.0g/L，磷酸氢二钾4.5g/L，碳酸钙0.9g/L，七水硫酸镁15.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢铵13.0g/L，硫酸亚铁0.8g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.0ml/L，溶剂为水，pH为5.5。
CN202010295197.1A 2020-04-15 2020-04-15 一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵方法 Active CN111411049B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010295197.1A CN111411049B (zh) 2020-04-15 2020-04-15 一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010295197.1A CN111411049B (zh) 2020-04-15 2020-04-15 一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111411049A CN111411049A (zh) 2020-07-14
CN111411049B true CN111411049B (zh) 2022-11-22

Family

ID=71490086

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010295197.1A Active CN111411049B (zh) 2020-04-15 2020-04-15 一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111411049B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113969257B (zh) * 2020-07-25 2024-09-27 鲁南制药集团股份有限公司 一种用于生产甘精胰岛素的培养基
CN114075523A (zh) * 2020-07-27 2022-02-22 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种产甘精胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1446906A (zh) * 2003-03-27 2003-10-08 华东理工大学 一种重组嗜甲醇酵母的发酵方法
WO2009113099A2 (en) * 2008-02-06 2009-09-17 Biocon Limited Fermentation medias and processes thereof
CN105154500A (zh) * 2015-09-30 2015-12-16 济南康和医药科技有限公司 一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基及应用
CN106191181A (zh) * 2016-07-22 2016-12-07 江苏江山聚源生物技术有限公司 一种毕赤酵母表达重组蛋白的发酵工艺
CN106282274A (zh) * 2015-06-29 2017-01-04 广东东阳光药业有限公司 一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法
CN106699872A (zh) * 2016-12-27 2017-05-24 江南大学 一种提高胰岛素前体产量的方法
CN106929496A (zh) * 2015-12-31 2017-07-07 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法
CN107022591A (zh) * 2017-05-11 2017-08-08 宜昌东阳光长江药业股份有限公司 一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法
CN108546637A (zh) * 2018-05-23 2018-09-18 华东理工大学 重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1446906A (zh) * 2003-03-27 2003-10-08 华东理工大学 一种重组嗜甲醇酵母的发酵方法
WO2009113099A2 (en) * 2008-02-06 2009-09-17 Biocon Limited Fermentation medias and processes thereof
CN106282274A (zh) * 2015-06-29 2017-01-04 广东东阳光药业有限公司 一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法
CN105154500A (zh) * 2015-09-30 2015-12-16 济南康和医药科技有限公司 一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基及应用
CN106929496A (zh) * 2015-12-31 2017-07-07 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法
CN106191181A (zh) * 2016-07-22 2016-12-07 江苏江山聚源生物技术有限公司 一种毕赤酵母表达重组蛋白的发酵工艺
CN106699872A (zh) * 2016-12-27 2017-05-24 江南大学 一种提高胰岛素前体产量的方法
CN107022591A (zh) * 2017-05-11 2017-08-08 宜昌东阳光长江药业股份有限公司 一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法
CN108546637A (zh) * 2018-05-23 2018-09-18 华东理工大学 重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Reduced methanol input induces increased protein output by AOX1 promoter in a trans‑acting elements engineered Pichia pastoris》;Jinjia Wang等;《Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology》;20180131;第45卷(第1期);全文 *
表达血管生长抑制素的重组毕赤酵母在诱导阶段混合碳源的流加;谢静莉等;《生物工程学报》;20030423(第04期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111411049A (zh) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111411049B (zh) 一种提高胰岛素前体表达的毕赤酵母的发酵培养基及发酵方法
CN111733101B (zh) 一种聚唾液酸发酵培养基及大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法
CN101570771A (zh) 一种毕赤酵母基因工程菌发酵生产s-腺苷甲硫氨酸的方法
CN116286469A (zh) 一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法
CN108220369B (zh) 一种生产重组水蛭素的方法
CN117701459A (zh) 一种大肠杆菌高密度发酵培养基及发酵工艺
CN101768560A (zh) 一种提高质粒dna在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基
CN1737117A (zh) 一种分批补料培养大肠杆菌的方法
CN112608963A (zh) 半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法
CN113621550B (zh) 用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法
CN112029810B (zh) 一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法
CN112391431B (zh) 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的发酵培养基及发酵方法
CN114686531B (zh) 一种生物转化制备1,3-丙二醇的方法
CN113969257A (zh) 一种用于生产甘精胰岛素的培养基
CN104404113A (zh) 一种万古霉素的补料培养基及生产万古霉素的方法
CN117736962A (zh) 发酵培养基及其在特立帕肽制备中的应用
CN114990178B (zh) 一种提高阿维拉霉素发酵液质量的方法
CN117487722B (zh) 一种用于可溶性蛋白高密度发酵的补料培养基及其应用
CN118813515A (zh) 基于调控代谢合成速度的莫能菌素培养基及其培养工艺
CN115960811A (zh) 一种高效生物转化合成红景天苷的菌株及其用途
CN116622788B (zh) 一种裂殖壶菌发酵生产dha的方法
CN112080533B (zh) 一种提高l-异亮氨酸产量的全营养流加发酵控制工艺
CN117965657A (zh) 一种发酵法高产胞嘧啶的工艺
CN116024102A (zh) 裂殖壶藻发酵方法及发酵产物、应用
CN117106843A (zh) 一种提高夫西地酸发酵液中夫西地酸含量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220707

Address after: 100025 1703, 14th floor, No.97 Sili, Balizhuang, Chaoyang District, Beijing

Applicant after: Beijing huizhiheng Biotechnology Co.,Ltd.

Applicant after: Jilin Huisheng biopharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: NO.666 Kangmei Avenue, Meihekou City, Tonghua City, Jilin Province

Applicant before: Jilin Huisheng biopharmaceutical Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 100025 1703, 14th floor, No.97 Sili, Balizhuang, Chaoyang District, Beijing

Patentee after: Beijing huizhiheng Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee after: Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 100025 1703, 14th floor, No.97 Sili, Balizhuang, Chaoyang District, Beijing

Patentee before: Beijing huizhiheng Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee before: Jilin Huisheng biopharmaceutical Co.,Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A Fermentation Medium and Method for Improving the Expression of Insulin Precursors in Pichia pastoris

Effective date of registration: 20231013

Granted publication date: 20221122

Pledgee: Jilin Bank Co.,Ltd. Tonghua Meihekou Branch

Pledgor: Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co.,Ltd.

Registration number: Y2023220000102

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Granted publication date: 20221122

Pledgee: Jilin Bank Co.,Ltd. Tonghua Meihekou Branch

Pledgor: Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co.,Ltd.

Registration number: Y2023220000102

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A fermentation medium and fermentation method for Pichia pastoris to enhance insulin precursor expression

Granted publication date: 20221122

Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Meihekou Branch

Pledgor: Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co.,Ltd.

Registration number: Y2024220000070