CN114075523A - 一种产甘精胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法 - Google Patents

一种产甘精胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种适于重组大肠杆菌发酵产甘精胰岛素融合蛋白的培养基。具体地，本发明提供了一种包含酵母蛋白胨、酵母浸粉、甘油、Boc‑L‑赖氨酸、缓冲剂和微量元素的培养基。本发明还提供了利用该培养基发酵生产甘精胰岛素融合蛋白的方法。利用本发明的培养基发酵，能获得较高的菌密度和较高的甘精胰岛素融合蛋白产量，且发酵培养时间短，原料易得，无病毒携带风险，成本较低，适用于工业生产。

Description

一种产甘精胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，更具体地涉及一种产甘精胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法。
背景技术
糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。目前全球范围内估计有4.63亿成年人(年龄在20-79岁之间)患有糖尿病，占该年龄段世界总人口的9.3％。到2030年与2045年，预计这一数字将分别达到5.78亿(10.2％)与7亿(10.9％)，我国目前拥有1.164亿(未计入港澳台数据)糖尿病患者，位于世界首位。糖尿病成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重的慢性疾病，糖尿病可以分为1型，2型和妊娠型三类。
胰岛素一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要药物。上世纪70年代，科技人员通过现代基因工程手段成功开发出了重组人胰岛素。后来，又相继开发出了各种胰岛素类似物，如甘精胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、索马鲁肽、利拉鲁肽等。
目前，胰岛素是临床上治疗糖尿病最为有效、最为常用的药物，工业上主要利用基因工程菌发酵生产，该方法首先利用工程菌表达甘精胰岛素融合蛋白，然后对该融合蛋白进行进一步分离纯化获得胰岛素。对于甘精胰岛素融合蛋白，常用表达宿主有大肠杆菌和酵母菌。
大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，它已成为应用最广泛，最成功的表达体系，它已成为多种蛋白的理想表达体系。
采用大肠杆菌表达外源蛋白技术在国内外已经比较成熟，大肠杆菌的大规模高密度发酵工艺在国内外也均已有报道，影响大肠杆菌工程菌培养及重组蛋白表达量的主要因素有培养基，培养条件，诱导条件和补料方式等。重组大肠杆菌培养基一般组成为碳源，氮源和矿物质。常用碳源有葡萄糖、甘油，常用氮源有酵母粉、蛋白胨、铵盐和硝酸盐等，常用矿物质有硫酸盐、钾盐、镁、锰、铁、锌、铜、钼、钙和氯化物等，大肠杆菌高密度发酵常采用半合成培养基，即在合成培养基中加入少量酵母粉，蛋白胨，以及少量无机盐和氨基酸。
然而，现有技术中的甘精胰岛素融合蛋白的发酵方法仍然存在表达量不高、诱导培养时间过长、生产效率不高等问题，本领域迫切需要开发新的产甘精胰岛素融合蛋白的重组菌发酵培养方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产甘精胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养基以及利用该培养基发酵产甘精胰岛素融合蛋白的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种适用于重组大肠杆菌发酵的培养基，，所述培养基包含酵母蛋白胨、酵母浸粉、甘油、Boc-L-赖氨酸、缓冲剂和微量元素；
其中，所述酵母蛋白胨的含量范围为10～25g/L培养基，所述酵母浸粉的含量范围为25～62.5g/L培养基，所述甘油的含量范围为3～11.25g/L培养基，所述Boc-L-赖氨酸的含量范围为0.4～1.3g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述培养基还包含谷氨酸、亮氨酸、和缬氨酸。
在另一优选例中，所述谷氨酸的含量范围为0.5-2g/L，较佳地为0.8～1.5g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述亮氨酸的含量范围为0.5-2g/L，较佳地为0.8～1.5g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述缬氨酸的含量范围为0.5-2g/L，较佳地为0.8～1.5g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述酵母蛋白胨的含量范围为11～15g/L培养基，所述酵母浸粉的含量范围为30～45g/L培养基，所述甘油的含量范围为4～8g/L培养基，所述Boc-L-赖氨酸的含量范围为0.5-1.1g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述酵母蛋白胨的含量范围为12～14g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述酵母浸粉的含量范围为37.5～42g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述甘油的含量范围为5～6g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述Boc-L-赖氨酸的含量范围为0.55～1.25g/L，较佳地为0.55～0.75g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述培养基还包含硫酸铵。
在另一优选例中，所述硫酸铵的含量范围为0.5～2.0g/L，较佳地为0.8～1.5g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述缓冲剂包括磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。
在另一优选例中，所述磷酸二氢钾的含量范围为1～5g/L，较佳地为2.5～3g/L培养基，所述磷酸氢二钾的含量范围为3～10g/L，较佳地为4～8g/L培养基，以培养基体积计。
在另一优选例中，所述培养基的pH为6.8-7.4，较佳地为6.8-7.2。
在另一优选例中，所述微量元素包括：七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、五水合硫酸铜、一水合硫酸锰、无水氯化钙、十水合四硼酸钠、四水合钼酸铵、或其组合。
在另一优选例中，微量元素母液中各组分的含量范围选自下组：
七水合硫酸亚铁10.0g/L，七水合硫酸锌2.3g/L，五水合硫酸铜1.0g/L，一水合硫酸锰0.5g/L，无水氯化钙2.9g/L，十水合四硼酸钠0.1g/L，四水合钼酸铵0.1g/L。
在另一优选例中，所述微量元素母液的溶剂为盐酸。
在另一优选例中，所述培养基含有酵母蛋白胨12～14g/L，酵母浸粉37.5～42g/L，磷酸二氢钾2.5～5g/L，磷酸氢二钾5～10g/L，硫酸铵1.0～2.0g/L，甘油3.75～6g/L，Boc-L-赖氨酸0.55～1.25g/L，微量元素母液3.75～7.5g/L。
在另一优选例中，所述培养基不含葡萄糖。
在本发明的第二方面，提供了一种利用本发明的第一方面所述的培养基进行发酵的方法，包括步骤：
(1)提供一如本发明的第一方面所述的培养基；
(2)将含有重组大肠杆菌的种子液接种到所述培养基中进行分批培养和补料培养；
(3)向培养液中流加阿拉伯糖进行诱导培养，从而获得发酵产物。
在另一优选例中，所述方法用于发酵重组大肠杆菌生产融合蛋白，较佳地，所述融合蛋白为甘精胰岛素融合蛋白。
在另一优选例中，所述阿拉伯糖的浓度为150-250g/L，添加量为25-30mL。
在另一优选例中，在菌体的对数生长阶段开始诱导培养。
在另一优选例中，所述分批培养的培养温度为30-35℃，较佳地为32-34℃。
在另一优选例中，所述分批培养的培养时间为4-5h。
在另一优选例中，在分批培养发酵液的溶氧、pH快速上升时，开始补料培养。
在另一优选例中，所述补料培养的培养温度为36-38℃。
在另一优选例中，所述补料培养的培养时间为14-17h。
在另一优选例中，所述补料培养的碳源为甘油，较佳地，所述甘油的浓度为750.0mL/L(v/v)。
在另一优选例中，所述补料培养的氮源为酵母蛋白胨和酵母浸粉组成的复合氮源。
在另一优选例中，所述氮源的浓度为20％-30％(m/v)。
在另一优选例中，所述复合氮源中酵母蛋白胨和酵母浸粉的比例为1：(1-2)。
在另一优选例中，所述种子液的OD600为2.0-12.5，较佳地为4.0～5.0。
在另一优选例中，所述发酵液的OD600达到250-260时，结束发酵。
在另一优选例中，所述大肠杆菌包括：大肠杆菌TOP10、大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL-21。
在另一优选例中，所述的重组大肠杆菌中包含或整合有表达甘精胰岛素融合蛋白的表达盒，并且所述的甘精胰岛素融合蛋白具有式I所示的结构：
A-FP-TEV-R-G (I)
式中，
“-”代表肽键；
A为无或前导肽，
FP为绿色荧光蛋白折叠单元，
TEV为酶切位点，较佳地为TEV酶酶切位点；
R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸；
G为甘精胰岛素或其活性片段；
其中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个，较佳地2-3个选自下组的β-折叠单元：
Figure BDA0002604022450000041
Figure BDA0002604022450000051
在另一优选例中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u2-u3、u4-u5、u1-u2-u3、u3-u4-u5或u4-u5-u6。
在另一优选例中，所述的G为Boc修饰的甘精胰岛素前体，具有式II所示的结构:
GB-X-GA (II)
式中，
GB为Boc修饰的甘精胰岛素B链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第1-32位所示，
X为无或连接肽，较佳地，连接肽的氨基酸序列为R，或如SEQ ID NO:6-9所示(GSKR，AAKR，YPGDVKR或EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR)；
GA为甘精胰岛素A链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第33-53位所示。
在另一优选例中，所述的R用于胰蛋白酶酶切。
在另一优选例中，G为序列如SEQ ID NO:5所示的Boc修饰的甘精胰岛素。
在另一优选例中，GB-X-GA之间存在链内二硫键。
在另一优选例中，X为无。
在另一优选例中，所述的G为Boc修饰的双链甘精胰岛素，具有下式III具有下式IV的结构；
Figure BDA0002604022450000052
Figure BDA0002604022450000061
式中，
“║”代表二硫键；
GA为甘精胰岛素A链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第33-53位所示，
X为无或为连接肽；
GB为第29位为Boc修饰的甘精胰岛素B链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第1-32位所示。
在另一优选例中，所述的重组甘精胰岛素融合蛋白的序列如SEQ ID NO:1所述。
在另一优选例中，所述甘精胰岛素B链第7位与A链第7位(A7-B7)、B链第19位与A链第20位(A20-B19)之间形成链间二硫键。
在另一优选例中，所述甘精胰岛素A链第6位与A链第11位(A6-A11)之间形成链内二硫键。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了实施例1、3、4甘精胰岛素融合蛋白表达情况的电泳图，图中，M：标准蛋白(KD)，从上到下条带分子量依次为100，30，25，20，15，10KD；泳道1：未诱导全细胞；泳道2：实施例1发酵终点；泳道3：实施例3发酵终点；泳道4：实施例4发酵终点。
图2显示了实施例6、7甘精胰岛素融合蛋白表达情况的电泳图，图中，M:标准蛋白(KD)，从上到下条带分子量依次为100，30，25，20，15，10KD，泳道1：实施例7(Boc-L-赖氨酸添加量为0.65g/L，诱导前37℃)发酵终点；泳道2：实施例6(Boc-L-赖氨酸添加量为0.65g/L，诱导前33℃)发酵终点。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种适于重组大肠杆菌发酵产甘精胰岛素融合蛋白的培养基。在此基础上，本发明还提供了一种进行重组大肠杆菌发酵产甘精胰岛素融合蛋白的方法。实验表明，本发明发酵能获得较高的菌密度，OD600最高达到230，菌体湿重达到180g/L，发酵所得甘精胰岛素融合蛋白产量较高，经后续酶切纯化后得到BOC-甘精胰岛素产量可达到1.8g/L，高于目前已报道的发酵水平，且本发明发酵培养时间短，原料易得，所涉及有机氮源是微生物来源的，对于甘精胰岛素等生物制品，无病毒携带风险，且相对于产品的附加值，有机氮源的成本很低。发酵过程不消耗氨水，解决了刺激性及防爆的问题，发酵泡沫较少，发酵过程不需添加泡敌。基于上述优势，本发明的方法可以用于甘精胰岛素的工业生产，且本方法可用于德谷胰岛素、索玛鲁肽、利拉鲁肽的发酵生产，实现一个工厂多种胰岛素品种的生产，提高了设备利用率。
本发明提供了一种产甘精胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养基，该培养基配方为：酵母蛋白胨12.5～25g/L，酵母浸粉25～62.5g/L，谷氨酸0.5～2.0g/L，亮氨酸0.5～2.0g/L，缬氨酸0.5～2.0g/L，磷酸二氢钾2.5～5g/L，磷酸氢二钾5～10g/L，硫酸铵1.0～2.0g/L，甘油3.75～11.25g/L，Boc-L-赖氨酸0.325～1.3g/L，微量元素母液3.75～7.5g/L，pH为6.8～7.4；
优选地，培养基配方为：酵母蛋白胨12.5g/L，酵母浸粉25g/L，谷氨酸0.5～1.5g/L，亮氨酸0.5～1.5g/L，缬氨酸0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二钾10g/L，硫酸铵2.0g/L，甘油3.75g/L，Boc-L-赖氨酸0.65～1.3g/L，微量元素母液3.75g/L，pH为6.8～7.4；
优选地，培养基配方为：酵母蛋白胨12.5.0g/L，酵母浸粉37.5g/L，谷氨酸0.5～1.0g/L，亮氨酸0.5～1.0g/L，缬氨酸0.5～1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵1.0g/L，甘油5.63g/L，Boc-L-赖氨酸0.65～0.975g/L，微量元素母液3.75g/L，pH为6.8～7.2；
本发明所述的重组大肠杆菌指以重组TOP10大肠杆菌作为表达宿主的基因重组菌，所述的发酵为在发酵罐中利用L-阿拉伯糖诱导表达甘精胰岛素融合蛋白。
本发明还提供了一种基于本发明所述培养基进行重组大肠杆菌发酵产甘精胰岛素融合蛋白的方法，具体包含以下步骤：
种子液的制备：将保存的重组大肠杆菌甘油管菌种接于含100mL LB种子复苏培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养8.5-10.5h，OD600达到1.25-5.0后作为种子复苏液；将1mL种子复苏液接于含100mL种子适应性生长培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养5.5-6.5h，OD600达到2.0-12.5作为发酵用种子液。
分批培养：0.1L种子液接入含2.0L发酵培养基的5L发酵罐中，起始培养条件为33℃，pH 7.0，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03mPa。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，使得溶氧控制在5～40％，培养4-5h，待溶氧、pH快速回升，进入补料发酵阶段。
补料培养：补料碳源为甘油，浓度为750.0mL/L，补料氮源为酵母蛋白胨和酵母浸粉组成的复合氮源，比例为1:1.5，氮源浓度为20％-30％。补料碳氮比为1～2:1，溶氧：20-40％，pH：通过补料使pH保持7.00-7.20。补料阶段温度控制在37±0.5℃，pH6.8-7.2。
诱导培养：菌体在对数生长阶段流加26.25mL浓度为200g/L阿拉伯糖进行诱导，诱导持续时间14-16h，诱导后溶氧控制在10～30％，温度37±0.5℃，pH 6.8-7.2。
取样及发酵终点判断：开始培养后，每2小时取发酵液样品一次，采用紫外-可见分光光度法测吸光值，OD600达到220-230，结束发酵。
本发明具有以下优点：
本发明提供的培养基可以用于重组大肠杆菌发酵产甘精胰岛素融合蛋白，相对于现有技术提供的其他培养基，能够更有效地进行重组大肠杆菌发酵生产甘精胰岛素融合蛋白。基于本发明提供的培养基，使用本发明提供的重组大肠杆菌发酵产甘精胰岛素融合蛋白的方法，甘精胰岛素融合蛋白表达量大大提高，BOC-甘精胰岛素表达量可达到1.8g/L，培养时间为18～22h，提高了生产效率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用材料
实施例中涉及的部分培养基配方如下所示：
种子复苏培养基：酵母蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L
种子适应性生长培养基：酵母蛋白胨12.5g/L，酵母浸粉25.0g/L，硫酸铵1.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾5.0g/L，甘油3.75g/L，消泡剂0.375mL/L。
实施例1
种子液的制备：将保存的重组大肠杆菌甘油管菌种接于含100mL LB种子复苏培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养8.5-10.5h，OD600达到1.25-5.0后作为种子复苏液；将1mL种子复苏液接于含100mL种子适应性生长培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养5.5-6.5h，OD600达到2.0-12.5作为发酵用种子液。
分批培养：0.1L种子液接入含2.0L发酵培养基的5L发酵罐中，起始培养条件为33℃，pH 7.0，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03mPa。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，使得溶氧控制在5-40％，培养4-5h，待溶氧、pH快速回升，进入补料发酵阶段。
其中，发酵培养基的配方为：酵母蛋白胨12.5g/L，酵母浸粉37.5g/L，谷氨酸1.0g/L，亮氨酸1.0g/L，缬氨酸1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵1.0g/L，甘油5.63g/L，Boc-L-赖氨酸0.65g/L，微量元素母液3.75g/L，pH为6.8～7.2。
补料培养：补料碳源为甘油，浓度为750.0mL/L，补料氮源为酵母蛋白胨和酵母浸粉组成的复合氮源，比例为1:1.5，氮源浓度为20％-30％。补料碳氮比为1～2:1，溶氧：20-40％，pH：通过补料使pH保持7.00-7.20。补料阶段温度控制在37±0.5℃，pH6.8-7.2。
诱导培养：菌体在对数生长阶段流加26.25mL浓度为200g/L阿拉伯糖进行诱导，诱导持续时间14-16h，诱导后溶氧控制在10-30％，温度37±0.5℃，pH 6.8-7.2。
OD600达到220-230时，结束发酵，对发酵液进行离心，收集菌体，随后加入破碎缓冲液，利用高压均质机破菌，得到包涵体，包涵体经洗涤、溶解、复性和酶切后，得到BOC-甘精胰岛素。采用SDS-PAGE电泳检测酶切前的甘精胰岛素融合蛋白的表达情况，并对酶切后的BOC-甘精胰岛素表达量进行定量检测。
甘精胰岛素融合蛋白的表达情况如图1所示。发酵结束后，经菌体破碎、包涵体洗涤、复性、酶切所得的BOC-甘精胰岛素表达量为1.8g/L。
实施例2
种子液的制备：将保存的重组大肠杆菌甘油管菌种接于含100mL LB种子复苏培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养8.5-10.5h，OD600达到1.25-5.0后作为种子复苏液；将1mL种子复苏液接于含100mL种子适应性生长培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养5.5-6.5h，OD600达到2.0-12.5作为发酵用种子液。
分批培养：0.1L种子液接入含2.0L发酵培养基的5L发酵罐中，起始培养条件为33℃，pH 7.0，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03mPa。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，使得溶氧控制在5-40％，培养4-5h，待溶氧、pH快速回升，进入补料发酵阶段。
其中，发酵培养基的配方为：酵母蛋白胨12.5g/L，酵母浸粉37.5g/L，谷氨酸1.0g/L，亮氨酸1.0g/L，缬氨酸1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵1.0g/L，葡萄糖3.75g/L，Boc-L-赖氨酸0.65g/L，微量元素母液3.75g/L，pH为6.8～7.2。
补料培养：补料碳源为葡萄糖，浓度为750.0mL/L，补料氮源为酵母蛋白胨和酵母浸粉组成的复合氮源，比例为1:1.5，氮源浓度为20％-30％。补料碳氮比为1～2:1，溶氧：20-40％，pH：通过补料使pH保持7.00-7.20。补料阶段温度控制在37±0.5℃，pH6.8-7.2。
诱导培养：菌体在对数生长阶段流加26.25mL浓度为200g/L阿拉伯糖进行诱导，诱导持续时间14-16h，诱导后溶氧控制在10-30％，温度37±0.5℃，pH 6.8-7.2。
发酵结束后，对发酵液进行离心，收集菌体，随后加入破碎缓冲液，利用高压均质机破菌，得到包涵体，包涵体经洗涤、溶解、复性和酶切后，得到BOC-甘精胰岛素。
本实施例是实施例1的对比实验，发酵培养所用碳源为葡萄糖，随培养时间的增加，虽然菌体生长良好，最高密度(OD600)能达到110，但是诱导生产的目的蛋白非常少，Boc-甘精胰岛素的表达量＜0.1g/L。
实施例3
种子液的制备：将保存的重组大肠杆菌甘油管菌种接于含100mL LB种子复苏培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养8.5-10.5h，OD600达到1.25-5.0后作为种子复苏液；将1mL种子复苏液接于含100mL种子适应性生长培养基的500mL摇瓶，接两瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养5.5-6.5h，OD600达到2.0-12.5作为发酵用种子液。
分批培养：0.6L种子液接入含12L发酵培养基的30L发酵罐中，起始培养条件为33℃，pH 7.0，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03mPa。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，使得溶氧控制在5-40％，培养4-5h，待溶氧、pH快速回升，进入补料发酵阶段。
其中，发酵培养基的配方为：酵母蛋白胨12.5g/L，酵母浸粉37.5g/L，谷氨酸1.0g/L，亮氨酸1.0g/L，缬氨酸1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵1.0g/L，甘油5.63g/L，Boc-L-赖氨酸0.65g/L，微量元素母液3.75g/L，pH为6.8～7.2。
补料培养：补料碳源为甘油，浓度为750.0mL/L，补料氮源为酵母蛋白胨和酵母浸粉组成的复合氮源，比例为1:1.5，氮源浓度为20％-30％。补料碳氮比为1～2:1，溶氧：20-40％，pH：通过补料使pH保持7.00-7.20。补料阶段温度控制在37±0.5℃，pH6.8-7.2。
诱导培养：菌体在对数生长阶段流加157.5mL浓度为200g/L阿拉伯糖进行诱导，诱导持续时间14-16h，诱导后溶氧控制在10-30％，温度37±0.5℃，pH6.8-7.2。
发酵结束后，对发酵液进行离心，收集菌体，随后加入破碎缓冲液，利用高压均质机破菌，得到包涵体，包涵体经洗涤、溶解、复性和酶切后，得到BOC-甘精胰岛素。采用SDS-PAGE电泳检测酶切前的甘精胰岛素融合蛋白的表达情况，并对酶切后的BOC-甘精胰岛素表达量进行定量检测。
本实施例是实施例1的放大实验，在30L发酵罐中进行发酵，其余实验条件基本相同。甘精胰岛素融合蛋白的表达情况如图1所示。发酵结束后，经菌体破碎、包涵体洗涤、复性、酶切所得的BOC-甘精胰岛素表达量为1.85g/L。
实施例4
种子液的制备：将保存的重组大肠杆菌甘油管菌种接于含100mL LB种子复苏培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养8.5-10.5h，OD600达到1.25-5.0后作为种子复苏液；将100mL种子复苏液接于含10L种子适应性生长培养基的种子罐，起始培养条件为33℃，pH 7.0，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03mPa，溶氧控制在20-40％，培养5.5-6.5h，OD600达到2.0-12.5作为发酵用种子液。
分批培养：将10L种子液接入含200L发酵培养基的500L发酵罐中，起始培养条件为33℃，pH 7.0，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03mPa。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，使得溶氧控制在5-40％，培养4-5h，待溶氧、pH快速回升，进入补料发酵阶段。
其中，发酵培养基的配方为：酵母蛋白胨12.5g/L，酵母浸粉37.5g/L，谷氨酸1.0g/L，亮氨酸1.0g/L，缬氨酸1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵1.0g/L，甘油5.63g/L，Boc-L-赖氨酸0.65g/L，微量元素母液3.75g/L，pH为6.8～7.2。
补料培养：补料碳源为甘油，浓度为750.0mL/L，补料氮源为酵母蛋白胨和酵母浸粉组成的复合氮源，比例为1:1.5，氮源浓度为20％-30％。补料碳氮比为1～2:1，溶氧：20-40％，pH：通过补料使pH保持7.00-7.20。补料阶段温度控制在37±0.5℃，pH6.8-7.2。
诱导培养：菌体在对数生长阶段流加2.625L浓度为200g/L阿拉伯糖进行诱导，诱导持续时间14-16h，诱导后溶氧控制在10-30％，温度37±0.5℃，pH 6.8-7.2。
发酵结束后，对发酵液进行离心，收集菌体，随后加入破碎缓冲液，利用高压均质机破菌，得到包涵体，包涵体经洗涤、溶解、复性和酶切后，得到BOC-甘精胰岛素。采用SDS-PAGE电泳检测酶切前的甘精胰岛素融合蛋白的表达情况，并对酶切后的BOC-甘精胰岛素表达量进行定量检测。
本实施例是实施例1的放大实验，在500L发酵罐中进行发酵，其余实验条件基本相同。甘精胰岛素融合蛋白的表达情况如图1所示。发酵结束后，经菌体破碎、包涵体洗涤、复性、酶切所得的BOC-甘精胰岛素表达量为1.8g/L。
实施例5
种子液的制备：将保存的重组大肠杆菌甘油管菌种接于含100mL LB种子复苏培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养8.5-10.5h，OD600达到1.25-5.0后作为种子复苏液；将1mL种子复苏液接于含100mL种子适应性生长培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养5.5-6.5h，OD600达到2.0-12.5作为发酵用种子液。
分批培养：0.1L种子液接入含2.0L发酵培养基的5L发酵罐中，起始培养条件为33℃，pH 7.0，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03mPa。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，使得溶氧控制在5-40％，培养4-5h，待溶氧、pH快速回升，进入补料发酵阶段。
其中，发酵培养基的配方为：谷氨酸1.0g/L，亮氨酸1.0g/L，缬氨酸1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵1.0g/L，Boc-L-赖氨酸0.65g/L，微量元素母液3.75g/L，pH为6.8～7.2，其中的酵母浸粉、酵母蛋白胨及甘油按不同比例加入培养基，具体比例如表1所示。
表1发酵培养基的配方
Figure BDA0002604022450000131
补料培养：补料碳源为甘油，浓度为750.0mL/L，补料氮源为酵母蛋白胨和酵母浸粉组成的复合氮源，比例为1:1.5，氮源浓度为20％-30％。补料碳氮比为1～2:1，，溶氧：20-40％，pH：通过补料使pH保持7.00-7.20。补料阶段温度控制在37±0.5℃，pH 6.8-7.2。
诱导培养：菌体在对数生长阶段流加26.25mL浓度为200g/L阿拉伯糖进行诱导，诱导持续时间14-16h，诱导后溶氧控制在10-30％，温度37±0.5℃，pH 6.8-7.2。
发酵结束后，对发酵液进行离心，收集菌体，随后加入破碎缓冲液，利用高压均质机破菌，得到包涵体，包涵体经洗涤、溶解、复性和酶切后，得到BOC-甘精胰岛素。对酶切后的BOC-甘精胰岛素表达量进行定量检测。
结果如表2所示，配方2的BOC-甘精胰岛素表达量最高，达到1.85g/L，配方5次之，因此得出：发酵培养基中酵母浸粉、酵母蛋白胨及甘油较适宜浓度依次为37.5±1g/L、12.5±1g/L及5.63±1g/L。
表2 BOC-甘精胰岛素的表达量
Figure BDA0002604022450000141
实施例6
种子液的制备：将保存的重组大肠杆菌甘油管菌种接于含100mL LB种子复苏培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养8.5-10.5h，OD600达到1.25-5.0后作为种子复苏液；将1mL种子复苏液接于含100mL种子适应性生长培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养5.5-6.5h，OD600达到2.0-12.5作为发酵用种子液。
分批培养：0.1L种子液接入含2.0L发酵培养基的5L发酵罐中，起始培养条件为33℃，pH 7.0，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03mPa。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，使得溶氧控制在5-40％，培养4-5h，待溶氧、pH快速回升，进入补料发酵阶段。
其中，发酵培养基的配方为：酵母蛋白胨12.5g/L，酵母浸粉37.5g/L，谷氨酸1.0g/L，亮氨酸1.0g/L，缬氨酸1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵1.0g/L，甘油5.63g/L，微量元素母液3.75g/L，pH为6.8～7.2，其中的Boc-L-赖氨酸添加量分别为1.3g/L、0.975g/L、0.65g/L及0.325g/L。
补料培养：补料碳源为甘油，浓度为750.0mL/L，补料氮源为酵母蛋白胨和酵母浸粉组成的复合氮源，比例为1:1.5，氮源浓度为20％-30％。补料碳氮比为1～2:1，溶氧：20-40％，pH：通过补料使pH保持7.00-7.20。补料阶段温度控制在37±0.5℃，pH6.8-7.2。
诱导培养：菌体在对数生长阶段流加26.25mL浓度为200g/L阿拉伯糖进行诱导，诱导持续时间14-16h，诱导后溶氧控制在10-30％，温度37±0.5℃，pH 6.8-7.2。
发酵结束后，对发酵液进行离心，收集菌体，随后加入破碎缓冲液，利用高压均质机破菌，得到包涵体，包涵体经洗涤、溶解、复性和酶切后，得到BOC-甘精胰岛素。采用SDS-PAGE电泳检测酶切前的甘精胰岛素融合蛋白的表达情况，并对酶切后的BOC-甘精胰岛素表达量进行定量检测。
BOC-甘精胰岛素表达量如表3所示，培养基中Boc-L-赖氨酸添加量为0.65～0.975g/L可以获得较高的表达量，发酵结束后的甘精胰岛素融合蛋白表达情况如图2所示。
表3 BOC-甘精胰岛素的表达量
Figure BDA0002604022450000151
实施例7
种子液的制备：将保存的重组大肠杆菌甘油管菌种接于含100mL LB种子复苏培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养8.5-10.5h，OD600达到1.25-5.0后作为种子复苏液；将1mL种子复苏液接于含100mL种子适应性生长培养基的500mL摇瓶，37±0.5℃，220±20rpm摇床培养5.5-6.5h，OD600达到2.0-12.5作为发酵用种子液。
分批培养：0.1L种子液接入含2.0L发酵培养基的5L发酵罐中，起始培养条件为37℃，pH 7.0，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03mPa。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，使得溶氧控制在5-40％，培养4-5h，待溶氧、pH快速回升，进入补料发酵阶段。
其中，发酵培养基的配方为：酵母蛋白胨12.5g/L，酵母浸粉37.5g/L，谷氨酸1.0g/L，亮氨酸1.0g/L，缬氨酸1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸铵1.0g/L，甘油5.63g/L，Boc-L-赖氨酸0.65g/L，微量元素母液3.75g/L，pH为6.8～7.2。
补料培养：补料碳源为甘油，浓度为750.0mL/L，补料氮源为酵母蛋白胨和酵母浸粉组成的复合氮源，比例为1:1.5，氮源浓度为20％-30％。补料碳氮比为1～2:1，，溶氧：20-40％，pH：通过补料使pH保持7.00-7.20。补料阶段温度控制在37±0.5℃，pH6.8-7.2。
诱导培养：菌体在对数生长阶段流加26.25mL浓度为200g/L阿拉伯糖进行诱导，诱导持续时间14-16h，诱导后溶氧控制在10-30％，温度37±0.5℃，pH6.8-7.2。
发酵结束后，对发酵液进行离心，收集菌体，随后加入破碎缓冲液，利用高压均质机破菌，得到包涵体，包涵体经洗涤、溶解、复性和酶切后，得到BOC-甘精胰岛素。采用SDS-PAGE电泳检测酶切前的甘精胰岛素融合蛋白的表达情况，并对酶切后的BOC-甘精胰岛素表达量进行定量检测。
本实施例是实施例6对比实验，诱导前培养温度为37℃，Boc-L-赖氨酸添加量为0.65g/L，其余实验条件与实施例6基本相同。培养22小时后进行菌体破碎、包涵体洗涤、复性、酶切后测得BOC-甘精胰岛素表达量为1.50g/L，低于实施例6，表明诱导前培养温度为37℃不能获得较高的表达量。
实施例8甘精胰岛素表达菌株的构建及表达
甘精胰岛素表达菌株的构建及表达参照中国专利申请2020105263206进行。其中，甘精胰岛素表达质粒的构建方法可以参照专利申请号201910210102.9中实施例的记载。将融合蛋白FP-TEV-R-G的DNA片段，克隆至表达载体质粒pBAD/His A(购自NTCC公司，卡那霉素抗性)的araBAD启动子下游NcoI-XhoI位点，得到质粒pBAD-FP-TEV-R-G。
再将pylRs的DNA序列，克隆至表达载体质粒pEvol-pBpF(购自NTCC公司，氯霉素抗性)的araBAD启动子下游SpeI-SalI位点，同时在proK启动子下游，以PCR方法插入赖氨酰-tRNA合成酶的tRNA(pylTcua)的DNA序列。该质粒命名为pEvol-pylRs-pylT。
将构建的甘精胰岛素表达载体转化大肠杆菌菌株，筛选获得表达重组甘精胰岛素前体的重组菌株。其中，重组甘精胰岛素前体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，前体序列第73位(甘精胰岛素第29位)为Boc保护的赖氨酸。
MVSKGEELFTGVKLTLKFICTTYVQERTISFKDTYKTRAEVKFEGDENLYFQGRFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(Boc)TRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG(SEQ ID NO:1)
前述的重组的甘精胰岛素前体的结构如下：
A-FP-TEV-R-G
式中，
“-”代表肽键；
A为前导肽序列，序列为MVSKGEELFTGV(SEQ ID NO:2)
FP为绿色荧光蛋白折叠单元，序列为
KLTLKFICTTYVQERTISFKDTYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO:3)；
TEV为TEV酶酶切位点，序列为ENLYFQG(SEQ ID NO:4)；
R为用于胰蛋白酶酶切的精氨酸或赖氨酸；
G为第29位被Boc修饰的甘精胰岛素，序列为
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(Boc)TRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG(SEQ ID NO:5)。
利用本实施例构建的重组大肠杆菌菌株进行实施例1-7的发酵。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 宁波鲲鹏生物科技有限公司
<120> 一种产甘精胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法
<130> P2020-0790
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Lys Leu Thr Leu
1 5 10 15
Lys Phe Ile Cys Thr Thr Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys
20 25 30
Asp Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Glu Asn
35 40 45
Leu Tyr Phe Gln Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
50 55 60
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
65 70 75 80
Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile
85 90 95
Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
100 105
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val
1 5 10
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Tyr Val Gln Glu Arg Thr
1 5 10 15
Ile Ser Phe Lys Asp Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu
20 25 30
Gly Asp
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 5
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
35 40 45
Glu Asn Tyr Cys Gly
50
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Ser Lys Arg
1
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Ala Lys Arg
1
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Tyr Pro Gly Asp Val Lys Arg
1 5
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
1 5 10 15
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
20 25 30
Arg
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp
1 5 10
<210> 15
<211> 13
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln
1 5 10
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp
1 5 10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp
1 5 10

Claims (10)

1.一种适用于重组大肠杆菌发酵的培养基，其特征在于，所述培养基包含酵母蛋白胨、酵母浸粉、甘油、Boc-L-赖氨酸、缓冲剂和微量元素；
其中，所述酵母蛋白胨的含量范围为10～25g/L培养基，所述酵母浸粉的含量范围为25～62.5g/L培养基，所述甘油的含量范围为3～11.25g/L培养基，所述Boc-L-赖氨酸的含量范围为0.4～1.3g/L培养基，以培养基体积计。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包含谷氨酸、亮氨酸、和缬氨酸。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包含硫酸铵。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述缓冲剂包括磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。
5.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的pH为6.8-7.4，较佳地为6.8-7.2。
6.一种利用权利要求1所述的培养基进行发酵的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供一如权利要求1所述的培养基；
(2)将含有重组大肠杆菌的种子液接种到所述培养基中进行分批培养和补料培养；
(3)向培养液中流加阿拉伯糖进行诱导培养，从而获得发酵产物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分批培养的培养温度为30-35℃，较佳地为32-34℃。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述补料培养的培养温度为36-38℃。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述补料培养的碳源为甘油，较佳地，所述甘油的浓度为750.0mL/L(v/v)。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌中包含或整合有表达甘精胰岛素融合蛋白的表达盒，并且所述的甘精胰岛素融合蛋白具有式I所示的结构：
A-FP-TEV-R-G(I)
式中，
“-”代表肽键；
A为无或前导肽，
FP为绿色荧光蛋白折叠单元，
TEV为酶切位点，较佳地为TEV酶酶切位点；
R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸；
G为甘精胰岛素或其活性片段；
其中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个，较佳地2-3个选自下组的β-折叠单元：
β-折叠单元 氨基酸序列 u1 VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO:11) u2 HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO:12) u3 KLTLKFICTT(SEQ ID NO:13) u4 YVQERTISFKD(SEQ ID NO:14) u5 TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO:15) u6 TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO:16) u7 HNVYITADKQ(SEQ ID NO:17) u8 GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO:18) u9 VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO:19) u10 HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO:20) u11 HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO:10)。
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