CN113621550B - 用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法 - Google Patents

用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法。上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基，包括：5g/L‑15g/L的葡萄糖、10g/L‑20g/L的蛋白胨、3g/L‑10g/L的酵母粉、2g/L‑7g/L的NaCl、2.5g/L‑7.5g/L的(NH4)2SO4、3g/L‑4g/L的KH2PO4、5g/L‑6g/L的K2HPO4、0.3mg/L‑4.5mg/L的MnCl2·4H2O、0.1mg/L‑0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、1mg/L‑5mg/L的FeCl3·6H2O、3mM‑10mM的Mg2+、0.05mM‑0.5mM的Zn2+。上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基能够提高碱性磷酸酶单位酶活和表达量。

Description

用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法。
背景技术
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)可去除DNA、RNA的5’端磷酸基团，在分子克隆中，常用于阻止载体的自连作用，提高目的片段插入率。碱性磷酸酶还可制备用于5’端标记的DNA模板。此外，碱性磷酸酶可催化磷酸盐化合物水解，被广泛应用于免疫标记和化学发光；在临床定位诊断，病因分析以及肿瘤诊断和治疗方面具有十分重要的应用。
目前，研究的最多的是大肠杆菌碱性磷酸酶，商品化的碱性磷酸酶包括大肠杆菌磷酸酶、牛小肠碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶。但仍普遍存在不易大规模生产，酶产量低；在发酵工业中，工程菌往往由于表达载体、表达宿主、表达条件等，使菌体高密度生长和重组蛋白的高水平表达受限，从而致使工程菌无法真正适用于工业化生产中。如何提高碱性磷酸酶的单位酶活和表达量是一个亟需解决的问题，对碱性磷酸酶的生产和应用具有十分重要的意义。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够提高碱性磷酸酶单位酶活和表达量的培养基和碱性磷酸酶的制备方法。
一种用于发酵产碱性磷酸酶的培养基，包括：包括：5g/L-15g/L的葡萄糖、10g/L-20g/L的蛋白胨、3g/L-10g/L的酵母粉、2g/L-7g/L的NaCl、2.5g/L-7.5g/L的(NH4)2SO4、3g/L-4g/L的KH2PO4、5g/L-6g/L的K2HPO4、0.3mg/L-4.5mg/L的MnCl2·4H2O、0.1mg/L-0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、1mg/L-5mg/L的FeCl3·6H2O、3mM-10mM的Mg2+、0.05mM-0.5mM的Zn2+。
上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基中，各组分配比合理，用于发酵产碱性磷酸酶的单位酶活和表达量均较高。经试验验证，采用上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基对重组大肠杆菌进行发酵培养，重组大肠杆菌的生物量达到25.7gDCW/g，发酵液所含碱性磷酸酶达到8901U/mL。
其中一个实施例中，包括：10g/L的葡萄糖、15g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、5g/L的NaCl、5g/L的(NH4)2SO4、3.25g/L的KH2PO4、5.75g/L的K2HPO4、4mg/L的MnCl2·4H2O、0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、5mg/L的FeCl3·6H2O、5mM的MgSO4·7H2O、0.1mM的ZnCl2。
其中一个实施例中，所述Mg2+选自MgSO4及MgCl2中的至少一种，所述Zn2+选自ZnSO4及ZnCl2中的至少一种。
其中一个实施例中，还包括溶剂，所述溶剂选自去离子水及蒸馏水中的至少一种。
其中一个实施例中，还含有余量的所述溶剂。
一种碱性磷酸酶的制备方法，包括如下步骤：
采用上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌，得到碱性磷酸酶，其中，所述重组大肠杆菌携带有碱性磷酸酶基因片段。
其中一个实施例中，所述采用上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌的步骤包括：
将对数期的所述重组大肠杆菌的种子液以1％-8％的接种量接入装有所述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基的发酵罐中进行发酵，当葡萄糖耗尽、溶氧开始回升时进行补料发酵，补料过程中维持溶氧为30％±10％，其中，发酵pH为7.0±0.05；
当所述发酵液的OD600至30以上时，向所述发酵液中加入诱导剂后继续发酵，直至OD600维持恒定或开始下降时停止发酵，得到所述碱性磷酸酶。
其中一个实施例中，补料发酵过程中所用的补料培养基包括：500g/L的葡萄糖、80mM的MgSO4、1.5mM的ZnCl2及溶剂，其中，所述Mg2+选自MgSO4及MgCl2中的至少一种，所述Zn2+选自ZnSO4及ZnCl2中的至少一种，所述溶剂选自去离子水及蒸馏水中的至少一种。
其中一个实施例中，将对数期的所述重组大肠杆菌的种子液以1％-8％的接种量接入装有所述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基的发酵罐中进行发酵的步骤之前，还包括如下步骤：
将所述重组大肠杆菌保藏菌种以体积浓度为0.1％-1％接种至种子培养基中在37℃、200rpm下培养10小时-20小时，得到一级种子液，其中，所述种子培养基含有LB培养基；
将所述一级种子液以体积浓度为0.05％-0.5％接种至所述种子培养基中在37℃、200rpm下培养5小时-15小时，得到对数期的所述重组大肠杆菌的种子液。
其中一个实施例中，发酵条件包括：200rpm-750rpm的转速、0.5vvm-2vvm的通气量、37℃的发酵温度、0.03MPa-0.07MPa的罐压。
其中一个实施例中，在发酵过程中，开始发酵的转速为200rpm；每当溶氧低于30％时将转速提高50rpm；当转速达到750rpm时维持恒定，继续发酵至溶氧开始回升时进行所述补料发酵。
其中一个实施例中，所述诱导剂为终浓度0.1mM-1.5mM的异丙基硫代半乳糖苷。
其中一个实施例中，向所述发酵液中加入所述诱导剂后继续发酵的温度为20℃-37℃。
上述碱性磷酸酶的制备方法，采用特定发酵培养基及补料培养基配方，通过采用DO-STAT偶联控制流加补料，通过添加诱导剂高效诱导，有效控制了菌体的生长速率，预防了菌体生长过快引起的产酸积累，反馈抑制，培养基浪费等弊端，极大的提高了菌体浓度，达到高密度发酵的目的。优化的诱导剂和诱导条件，极大的提高了单位发酵液碱性磷酸酶的活力。利用上述制备方法，重组大肠杆菌的生物量达到25.7gDCW/g，发酵液所含碱性磷酸酶达到8901U/mL。
附图说明
图1为实施例8的发酵曲线；
图2为实施例8发酵过程中碱性磷酸酶的SDS-PAGE图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究一实施方式提供一种用于发酵产碱性磷酸酶的培养基，包括：5g/L-15g/L的葡萄糖、10g/L-20g/L的蛋白胨、3g/L-10g/L的酵母粉、2g/L-7g/L的NaCl、2.5g/L-7.5g/L的(NH4)2SO4、3g/L-4g/L的KH2PO4、5g/L-6g/L的K2HPO4、0.3mg/L-4.5mg/L的MnCl2·4H2O、0.1mg/L-0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、1mg/L-5mg/L的FeCl3·6H2O、3mM-10mM的Mg2+、0.05mM-0.5mM的Zn2+。
上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基中，各组分配比合理，用于发酵产碱性磷酸酶的单位酶活和表达量均较高。经试验验证，采用上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基对重组大肠杆菌进行发酵培养，重组大肠杆菌的生物量达到25.7gDCW/g，发酵液所含碱性磷酸酶达到8901U/mL。
其中一个实施例中，Mg2+选自MgSO4及MgCl2中的至少一种，Zn2+选自ZnSO4及ZnCl2中的至少一种。
其中一个实施例中，用于发酵产碱性磷酸酶的培养基包括：10g/L的葡萄糖、15g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、5g/L的NaCl、5g/L的(NH4)2SO4、3.25g/L的KH2PO4、5.75g/L的K2HPO4、4mg/L的MnCl2·4H2O、0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、5mg/L的FeCl3·6H2O、5mM的Mg2+、0.1mM的Zn2+。上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基中，各组分配比合理，用于发酵产碱性磷酸酶的单位酶活和表达量均较高。
其中一个实施例中，包括：10g/L的葡萄糖、15g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、5g/L的NaCl、5g/L的(NH4)2SO4、3.25g/L的KH2PO4、5.75g/L的K2HPO4、4mg/L的MnCl2·4H2O、0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、5mg/L的FeCl3·6H2O、5mM的MgSO4·7H2O、0.1mM的ZnCl2。上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基中，各组分配比合理，用于发酵产碱性磷酸酶的单位酶活和表达量均较高。
其中一个实施例中，用于发酵产碱性磷酸酶的培养基还包括溶剂。溶剂选自去离子水及蒸馏水中的至少一种。其中一个实施例中，用于发酵产碱性磷酸酶的培养基还含有余量的溶剂。
本研究一实施方式还提供一种碱性磷酸酶的制备方法，包括如下步骤：采用上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌，得到碱性磷酸酶。其中，重组大肠杆菌携带有碱性磷酸酶基因片段。
需要说明的是，重组大肠杆菌可以为市售的携带有碱性磷酸酶基因片段的重组大肠杆菌，也可以自主构建的携带有碱性磷酸酶基因片段的重组大肠杆菌。
具体地，重组大肠杆菌是以大肠杆菌为宿主，根据本领域常规方法构建，表达了来源于牛小肠的碱性磷酸酶。碱性磷酸酶基因编码氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
其中，SEQ ID No.1所示的序列如下：
MQGACVLLLL GLQLQLSLGL IPVEEEDPAF WNCQAAQALD VAKKLQPIQT AAKNVILFLGDGMGVPTVTA TRILKGQMNG KLGPETPLAM DQFPYVALSK TYNVDRQVPD SAGTATAYLC GVKGNYKTIGVSAAARYNQC NTTSGNEVTS VMNRAKKAGK AVGVVTTSRV QHASPAGAYA HTVNRNWYSD ADLPADAQMNGCQDIATQLV YNMDIDVILG GGRMYMFPEG TPDPEYPYDV NQTGVRKDKR NLVQEWQAKH QGAQYVWNRTALLQAADDSS VTHLMGLFEP ADMKYNVQQD HTKDPTLQEM TEVALRVLSR NPRGFYLFVE GGRIDHGHHEGKAYMALTDT VMFDNAIAKA NELTSELDTL ILVTADHSHV FSFGGYTLRG TSIFGLAPSK ALDSKSYTSILYGNGPGYAL GGGSRPDVND STSEDPSYQQ QAAVPLASET HGGEDVAVFA RGPQAHLVHG VQEETFVAHIMAFAGCVEPY TDCNLPAPTT ATSIPDAAHL AASPPPLALL AGAMLLLLAP TLY。
其中一个实施例中，采用上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌的步骤包括S111-S112：
S111、将对数期的重组大肠杆菌的种子液以1％-8％的接种量接入装有用于发酵产碱性磷酸酶的培养基的发酵罐中进行发酵，当葡萄糖耗尽、溶氧开始回升时进行补料发酵，补料过程中维持溶氧为30％±10％，其中，发酵pH为7.0±0.05。进一步地，对数期的重组大肠杆菌的种子液的接种量为5％。
其中一个实施例中，发酵条件包括：200rpm-750rpm的转速、0.5vvm-2vvm的通气量、37℃的发酵温度、0.03MPa-0.07MPa的罐压。进一步地，通气量为1.5vvm。
S112、当发酵液的OD600至20-40时，向发酵液中加入诱导剂后继续发酵，直至OD600维持恒定或开始下降时停止发酵，得到碱性磷酸酶。进一步地，当发酵液的OD600至30以上时，向发酵液中加入诱导剂后继续发酵10小时-16小时，直至OD600达60以上停止发酵，检测碱性磷酸酶酶活，获得含碱性磷酸酶的发酵液，收集菌体。
其中一个实施例中，诱导剂为终浓度0.1mM-1.5mM的异丙基硫代半乳糖苷。进一步地，诱导剂的终浓度为0.5mM。
其中一个实施例中，向发酵液中加入诱导剂后继续发酵的温度为20℃-37℃。进一步地，加入诱导剂后的发酵温度为25℃。
其中一个实施例中，补料发酵过程中所用的补料培养基包括：50g/L-500g/L的葡萄糖、50mM-100mM的Mg2+、0mM-2mM的Zn2+及溶剂，其中，Mg2+选自MgSO4及MgCl2中的至少一种，Zn2+选自ZnSO4及ZnCl2中的至少一种，溶剂选自去离子水及蒸馏水中的至少一种。进一步地，补料培养基包括：500g/L的葡萄糖、85mM的Mg2+、1.2mM的Zn2+及溶剂。进一步地，补料培养基包括：500g/L的葡萄糖、85mM的Mg2+、1.2mM的Zn2+及余量的溶剂。
其中一个实施例中，将对数期的重组大肠杆菌的种子液以1％-8％的接种量接入装有所述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基的发酵罐中进行发酵的步骤之前，还包括如下步骤S210-S220：
S210、将重组大肠杆菌保藏菌种以体积浓度为0.1％-1％接种至种子培养基中在37℃、200rpm下培养10小时-20小时，得到一级种子液。进一步地，接种量为0.1％，培养时间为15h。
其中，重组大肠杆菌保藏菌种为携带碱性磷酸酶基因的重组大肠杆菌-80℃甘油保藏菌种。
其中，携带碱性磷酸酶基因的重组大肠杆菌-80℃甘油保藏菌种的制备和保藏方法为：将挑取含相应抗生素的LB固体培养基平板上生长良好的单克隆，接种至装有10mL含相应抗生素的LB液体培养基的具塞试管中，摇床上37℃、200rpm震荡培养至OD600为1.0-1.5，镜检无杂菌后，按30％甘油：种子液＝1：1(V/V)比例加入无菌甘油，充分混合，分装于无菌菌种保藏管，-80℃冰箱冷冻保藏，保藏有效期2-4年。
S220、将一级种子液以体积浓度为0.05％-0.5％接种至种子培养基中在37℃、200rpm下培养5小时-15小时，得到对数期的重组大肠杆菌的种子液。进一步地，接种量为0.05％，培养时间为6h。
其中，种子培养基含有LB培养基。种子培养基为含有抗生素的LB培养基。
其中一个实施例中，在发酵过程中，开始发酵的转速为200rpm；每当溶氧低于30％时将转速提高50rpm；当转速达到750rpm时维持恒定，继续发酵至溶氧开始回升时进行补料发酵。
在其中一个实施例中，发酵过程，全程通过自动加流加体积含量为20％-50％氨水控制pH为7.00±0.05。
在其中一个实施例中，碱性磷酸酶检测方法为：
底物：称取10.58g二乙醇胺(DEA)置于100mL烧杯中，加入约50mL去离子水混溶、用浓HCl调pH至10.3，将溶液用容量瓶定容至100mL，加入371mg PNPP·6H2O，配成20mM的底物。
取900μL底物37℃预热l min，加入100μL,20mM,pH8.0的Tris-HCl，2min内测定405nm的吸光度值；作为对照组。
取900μL底物37℃预热l min，加入100μL,OD600为1左右的待测发酵液，2min内测定405nm的吸光度值，作为实验组。
碱性磷酸酶的一个标准酶活单位(1U)定义为：在上述条件下，lmin反应时间内消耗lμmol底物(PNPP)生成产物所需的酶量。
碱性磷酸酶酶活计算公式为：
单位体积酶活(U/mL)＝ΔOD405×1.676×发酵液样品稀释倍数；其中，1.676为计算系数。
上述碱性磷酸酶的制备方法，采用特定发酵培养基及补料培养基配方，通过采用DO-STAT偶联控制流加补料，通过添加诱导剂高效诱导，有效控制了菌体的生长速率，预防了菌体生长过快引起的产酸积累，反馈抑制，培养基浪费等弊端，极大的提高了菌体浓度，达到高密度发酵的目的。优化的诱导剂和诱导条件，极大的单位发酵液碱性磷酸酶的活力。利用上述制备方法，方法在短时间内(16h-26h)不仅实现了工程菌高密度培养，生物量可以达到25gDCW/L以上，而且得到高催化活性的发酵液，所得重组碱性磷酸酶酶活可以达到8000U/mL以上，大大增加了单位发酵液的细胞酶量。上述制备方法，有利于降低发酵成本，使得生物反应体系得到高效利用，提高生物质资源的利用率。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
如无特别说明，以下实施例中，所述重组大肠杆菌是携带有牛小肠碱性磷酸酶基因的大肠杆菌，牛小肠碱性磷酸酶基因编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例1
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：将携带碱性磷酸酶基因的重组大肠杆菌-80℃甘油保藏菌种，以体积浓度0.1％接种量接种至装有10mL的LB培养基的具塞试管，并加入相应的抗生素，摇床37℃、200rpm培养过夜，培养好一级种子液以体积浓度0.05％接种量接种至装有150mL的LB培养基的500mL三角瓶中，终浓度50μg/mL相应抗生素，摇床37℃、200rpm培养6h。
步骤2：装有3L发酵培养基的5L发酵罐，加入终浓度50μg/mL相应抗生素，流加50％氨水，调节pH为7.00±0.05。按5％接种量接入步骤1培养好的种子液，于37℃、200rpm、通气比1.5vvm，条件下发酵，发酵全程通过50％氨水和10％磷酸溶液，自动控制pH为7.00±0.05。发酵培养基(3L)：5g/L的葡萄糖，10g/L的蛋白胨，3g/L的酵母粉，2g/L的NaCl，2.5g/L的(NH4)2SO4，3g/L的KH2PO4，5g/L的K2HPO4，0.3mg/L的MnCl2·4H2O、0.1mg/L的Na2MoO4·2H2O、1mg/L的FeCl3·6H2O、3mM的MgSO4·7H2O、0.05mM的ZnCl2，余量溶剂，溶剂为纯化水。
步骤3：发酵至溶氧下降至低于30％时，逐步升高搅拌转速，当搅拌升至750rpm后，继续培养至OD600为30时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导，保持37℃继续发酵至OD600不上升时，终止发酵，放罐，获得发酵液，发酵液离心收集菌体。
结果显示：生物量为：13.1g DCW/L，体积酶活为3815.7/mL。
实施例2
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例1。
步骤2：装有3L发酵培养基的5L发酵罐，加入终浓度50μg/mL相应抗生素，流加50％氨水，调节pH为7.00±0.05。按5％接种量接入步骤1培养好的种子液，于37℃、200rpm、通气比1.5vvm，条件下发酵。发酵全程通过50％氨水和10％磷酸溶液，自动控制pH为7.00±0.05。发酵培养基(3L)为：15g/L的葡萄糖，20g/L的蛋白胨，10g/L的酵母粉，7g/L的NaCl，7.5g/L的(NH4)2SO4，4g/L的KH2PO4，6g/L的K2HPO4，4.5mg/L的MnCl2·4H2O，0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O，5mg/L的FeCl3·6H2O，10mM的MgSO4·7H2O，0.5mM的ZnCl2，余量溶剂，溶剂为纯化水。
步骤3：同实施例1。
结果显示:生物量为：14.0g DCW/L，体积酶活为4011.3U/mL。
实施例3
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例2。
步骤2：装有3L发酵培养基的5L发酵罐，加入终浓度50μg/mL相应抗生素，流加50％氨水，调节pH为7.00±0.05。按5％接种量接入步骤1培养好的种子液，于37℃、200rpm、通气比1.5vvm，条件下发酵。发酵全程通过50％氨水和10％磷酸溶液，自动控制pH为7.00±0.05。发酵培养基(3L)为：10g/L的葡萄糖、15g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、5g/L的NaCl、5g/L的(NH4)2SO4、3.25g/L的KH2PO4、5.75g/L的K2HPO4、4mg/L的MnCl2·4H2O、0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、5mg/L的FeCl3·6H2O、5mM的MgSO4·7H2O、0.1mM的ZnCl2。余量溶剂，溶剂为纯化水。
步骤3：同实施例2。
结果显示:生物量为：13.1g DCW/L，体积酶活为4021.7U/mL。
实施例4
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例3。
步骤2：装有3L发酵培养基的5L发酵罐，加入终浓度50μg/mL相应抗生素，流加50％氨水，调节pH为7.00±0.05。按5％接种量接入步骤1培养好的种子液，于37℃、200rpm、通气比1.5vvm，条件下发酵。发酵全程通过50％氨水和10％磷酸溶液，自动控制pH为7.00±0.05。发酵培养基(3L)为：10g/L的葡萄糖、15g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、5g/L的NaCl、5g/L的(NH4)2SO4、3.25g/L的KH2PO4、5.75g/L的K2HPO4、4mg/L的MnCl2·4H2O、0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、5mg/L的FeCl3·6H2O、5mM的MgCl2·6H2O、0.5mM的ZnSO4·7H2O。余量溶剂，溶剂为纯化水。
步骤3：同实施例3。
结果显示:生物量为：13.7g DCW/L，体积酶活为3971U/mL。
实施例5基于DO-STAT反馈流加的分批补料发酵
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例4。
步骤2：同实施例4。
步骤3：发酵至溶氧下降至低于30％时，逐步升高搅拌转速，当搅拌升至750rpm后，继续培养至溶氧开始回升，以DO-STAT方式溶氧反向关联反馈补料，溶氧≥30％，间隔15秒，补料2秒，发酵过程调整补料参数，控制溶氧在20％-40％。待发酵液OD600为30时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导，保持37℃继续发酵至OD600不上升时，终止发酵，放罐，获得发酵液，发酵液离心收集菌体。补料培养基为：葡萄糖500g/L，MgSO4·7H2O 50mM，ZnCl2 0.5mM；溶剂为纯化水。
结果显示：生物量为：28.7g DCW/L，体积酶活为6437.2U/mL。
实施例6
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例5。
步骤2：同实施例5。
步骤3：发酵至溶氧下降至低于30％时，逐步升高搅拌转速，当搅拌升至750rpm后，继续培养至溶氧开始回升，以DO-STAT方式溶氧反向关联反馈补料，溶氧≥30％，间隔15秒，补料2秒，发酵过程调整补料参数，控制溶氧在20％-40％。待发酵液OD600为30时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导，保持37℃继续发酵至OD600不上升时，终止发酵，放罐，获得发酵液，发酵液离心收集菌体。补料培养基为：葡萄糖500g/L，MgSO4·7H2O 85mM，ZnCl21.2mM，溶剂为纯化水。
结果显示：生物量为：28.3g DCW/L，体积酶活为8121.6U/mL。
实施例7
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例6。
步骤2：同实施例6。
步骤3：发酵至溶氧下降至低于30％时，逐步升高搅拌转速，当搅拌升至750rpm后，继续培养至溶氧开始回升，以DO-STAT方式溶氧反向关联反馈补料，溶氧≥30％，间隔15秒，补料2秒，发酵过程调整补料参数，控制溶氧在20％-40％。待发酵液OD600为30时，调节温度至30℃，加入终浓度0.5mM IPTG诱导，继续发酵至OD600不上升时，终止发酵，放罐，获得发酵液，发酵液离心收集菌体。补料培养基同实施例6。
结果显示：生物量为：27g DCW/L，体积酶活为8311.7U/mL。
实施例8
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例7。
步骤2：同实施例7。
步骤3：发酵至溶氧下降至低于30％时，逐步升高搅拌转速，当搅拌升至750rpm后，继续培养至溶氧开始回升，以DO-STAT方式溶氧反向关联反馈补料，溶氧≥30％，间隔15秒，补料2秒，发酵过程调整补料参数，控制溶氧在20％-40％。待发酵液OD600为30时，调节温度至25℃，加入终浓度0.5mM IPTG诱导，继续发酵至OD600不上升时，终止发酵，放罐，获得发酵液，发酵液离心收集菌体。补料培养基同实施例6。
其中，实施例8的发酵曲线详见图1。实施例8得到的SDS-PAGE图详见图2，其中，泳道1：发酵24h；；泳道2：发酵20h；泳道3:发酵16h；泳道4：发酵12h；泳道5：发酵10h；泳道6：发酵8h；泳道7:Marker。
结果显示：生物量为：25.7g DCW/L，体积酶活为8901U/mL。
实施例9
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例8。
步骤2：同实施例8。
步骤3：发酵至溶氧下降至低于30％时，逐步升高搅拌转速，当搅拌升至750rpm后，继续培养至溶氧开始回升，以DO-STAT方式溶氧反向关联反馈补料，溶氧≥30％，间隔15秒，补料2秒，发酵过程调整补料参数，控制溶氧在20％-40％。待发酵液OD600为30时，调节温度至20℃，加入终浓度0.5mM IPTG诱导，继续发酵至OD600不上升时，终止发酵，放罐，获得发酵液，发酵液离心收集菌体。补料培养基同实施例6。
结果显示：生物量为23.8g DCW/L，体积酶活为8810.1U/mL。
对比例1
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：将携带碱性磷酸酶基因的重组大肠杆菌-80℃甘油保藏菌种，以体积浓度0.1％接种量接种至装有10mL的LB培养基的具塞试管，并加入相应的抗生素，摇床37℃、200rpm培养过夜，培养好一级种子液以体积浓度0.05％接种量接种至装有150mL的LB培养基的500mL三角瓶中，终浓度50μg/mL相应抗生素，摇床37℃、200rpm培养6h。
步骤2：装有3L发酵培养基的5L发酵罐，加入终浓度50μg/mL相应抗生素，流加50％氨水，调节pH为7.00±0.05。按5％接种量接入步骤1培养好的种子液，于37℃、200rpm、通气比1.5vvm，条件下发酵，发酵全程通过50％氨水和10％磷酸溶液，自动控制pH为7.00±0.05。发酵培养基(3L)：葡萄糖50g/L，酵母粉20g/L，NaCl 10g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO4 5g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1mM。
步骤3：发酵至溶氧下降至低于30％时，逐步升高搅拌转速，当搅拌升至750rpm后，继续培养至OD600为30时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导，保持37℃继续发酵至OD600不上升时，终止发酵，放罐，获得发酵液，发酵液离心收集菌体。
结果显示：生物量为：11.1g DCW/L，体积酶活为3365.2U/mL。
对比例2
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例8。
步骤2：同实施例8。
步骤3：发酵至溶氧下降至低于30％时，逐步升高搅拌转速，当搅拌升至750rpm后，继续培养至溶氧回升，开始采用间歇递减补料方式，补加补料培养基，每隔3小时补料一次，分别补加250mL、150mL、50mL待发酵液OD600为30时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导，保持37℃继续发酵至OD600不上升时，终止发酵，放罐，获得发酵液，发酵液离心收集菌体。补料培养基为：葡萄糖500g/L，MgS04·7H2O 50mM，溶剂为水。
结果显示：生物量为：21.1g DCW/L，体积酶活为5335.5U/mL。
对比例3
本实施例提供的产碱性磷酸酶的重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：同实施例8。
步骤2：同实施例8。
步骤3：发酵至溶氧下降至低于30％时，逐步升高搅拌转速，当搅拌升至750rpm后，继续培养至溶氧开始回升，以0.3L/min恒速流加补料培养基，待发酵液OD600为30时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导，保持37℃继续发酵至OD600不上升时，终止发酵，放罐，获得发酵液，发酵液离心收集菌体。补料培养基为：葡萄糖500g/L，MgSO4·7H2O 50mM，溶剂为水。
结果显示：生物量为：25.1g DCW/L，体积酶活为6272.8U/mL。
对实施例1-实施例9及对比例1-对比例3的结果进行统计，得到表1的统计表。
表1实施例1-实施例9及对比例1-对比例3的结果统计表
Figure BDA0003275149330000171
Figure BDA0003275149330000181
综上所述，上述碱性磷酸酶的制备方法，采用特定发酵培养基及补料培养基配方，通过采用DO-STAT偶联控制流加补料，通过添加诱导剂高效诱导，有效控制了菌体的生长速率，预防了菌体生长过快引起的产酸积累，反馈抑制，培养基浪费等弊端，极大的提高了菌体浓度，达到高密度发酵的目的。优化的诱导剂和诱导条件，极大的单位发酵液碱性磷酸酶的活力。利用上述制备方法，方法在短时间内(16-26h)不仅实现了工程菌高密度培养，生物量可以达到25gDCW/L以上，而且得到高催化活性的发酵液，所得重组碱性磷酸酶酶活可以达到8000U/mL以上，大大增加了单位发酵液的细胞酶量。上述制备方法，有利于降低发酵成本，使得生物反应体系得到高效利用，提高生物质资源的利用率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 武汉瀚海新酶生物科技有限公司
<120> 用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gln Gly Ala Cys Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gln Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ser Leu Gly Leu Ile Pro Val Glu Glu Glu Asp Pro Ala Phe Trp Asn
20 25 30
Cys Gln Ala Ala Gln Ala Leu Asp Val Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile
35 40 45
Gln Thr Ala Ala Lys Asn Val Ile Leu Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly
50 55 60
Val Pro Thr Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Met Asn Gly
65 70 75 80
Lys Leu Gly Pro Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Gln Phe Pro Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Arg Gln Val Pro Asp Ser Ala
100 105 110
Gly Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Tyr Lys Thr
115 120 125
Ile Gly Val Ser Ala Ala Ala Arg Tyr Asn Gln Cys Asn Thr Thr Ser
130 135 140
Gly Asn Glu Val Thr Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys
145 150 155 160
Ala Val Gly Val Val Thr Thr Ser Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala
165 170 175
Gly Ala Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp
180 185 190
Leu Pro Ala Asp Ala Gln Met Asn Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln
195 200 205
Leu Val Tyr Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Met
210 215 220
Tyr Met Phe Pro Glu Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Tyr Asp Val
225 230 235 240
Asn Gln Thr Gly Val Arg Lys Asp Lys Arg Asn Leu Val Gln Glu Trp
245 250 255
Gln Ala Lys His Gln Gly Ala Gln Tyr Val Trp Asn Arg Thr Ala Leu
260 265 270
Leu Gln Ala Ala Asp Asp Ser Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe
275 280 285
Glu Pro Ala Asp Met Lys Tyr Asn Val Gln Gln Asp His Thr Lys Asp
290 295 300
Pro Thr Leu Gln Glu Met Thr Glu Val Ala Leu Arg Val Leu Ser Arg
305 310 315 320
Asn Pro Arg Gly Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His
325 330 335
Gly His His Glu Gly Lys Ala Tyr Met Ala Leu Thr Asp Thr Val Met
340 345 350
Phe Asp Asn Ala Ile Ala Lys Ala Asn Glu Leu Thr Ser Glu Leu Asp
355 360 365
Thr Leu Ile Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly
370 375 380
Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Thr Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Ser Lys
385 390 395 400
Ala Leu Asp Ser Lys Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro
405 410 415
Gly Tyr Ala Leu Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Val Asn Asp Ser Thr
420 425 430
Ser Glu Asp Pro Ser Tyr Gln Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu Ala Ser
435 440 445
Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln
450 455 460
Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Glu Thr Phe Val Ala His Ile
465 470 475 480
Met Ala Phe Ala Gly Cys Val Glu Pro Tyr Thr Asp Cys Asn Leu Pro
485 490 495
Ala Pro Thr Thr Ala Thr Ser Ile Pro Asp Ala Ala His Leu Ala Ala
500 505 510
Ser Pro Pro Pro Leu Ala Leu Leu Ala Gly Ala Met Leu Leu Leu Leu
515 520 525
Ala Pro Thr Leu Tyr
530

Claims (6)

1.一种碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，
采用发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌，得到碱性磷酸酶，其中，所述重组大肠杆菌携带有碱性磷酸酶基因片段；
所述发酵产碱性磷酸酶的培养基包括：5g/L-15g/L的葡萄糖、10g/L-20g/L的蛋白胨、3g/L-10g/L的酵母粉、2g/L-7g/L的NaCl、2.5g/L-7.5g/L的(NH4)2SO4、3g/L-4g/L的KH2PO4、5g/L-6g/L的K2HPO4、0.3mg/L-4.5mg/L的MnCl2·4H2O、0.1mg/L-0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、1mg/L-5mg/L的FeCl3·6H2O、3mM-10mM的Mg2+、0.05mM-0.5mM的Zn2+；
所述采用发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌的步骤包括：
将对数期的所述重组大肠杆菌的种子液以1%-8%的接种量接入装有所述发酵产碱性磷酸酶的培养基的发酵罐中进行发酵，当葡萄糖耗尽、溶氧开始回升时进行补料发酵，补料过程中维持溶氧为30%±10%，其中，发酵pH为7.0±0.05；
补料发酵过程中所用的补料培养基包括：500g/L的葡萄糖、50mM-100mM的Mg2+、0.5mM-2mM的Zn2+及溶剂，其中，所述Mg2+选自MgSO4及MgCl2中的至少一种，所述Zn2+选自ZnSO4及ZnCl2中的至少一种，所述溶剂选自去离子水及蒸馏水中的至少一种；
在发酵过程中，开始发酵的转速为200rpm，每当溶氧低于30%时将转速提高50rpm；当转速达到750rpm时维持恒定，继续发酵至溶氧开始回升时进行所述补料发酵；
当发酵液的OD600至30以上时，向所述发酵液中加入诱导剂后继续发酵，直至OD600维持恒定或开始下降时停止发酵，得到所述碱性磷酸酶。
2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，所述发酵产碱性磷酸酶的培养基包括：10g/L的葡萄糖、15g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、5g/L的NaCl、5g/L的(NH4)2SO4、3.25g/L的KH2PO4、5.75g/L的K2HPO4、4mg/L的MnCl2·4H2O、0.5mg/L的Na2MoO4·2H2O、5mg/L的FeCl3·6H2O、5mM的Mg2+、0.1mM的Zn2+。
3.根据权利要求1或2所述的碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，
所述发酵产碱性磷酸酶的培养基还含有余量的溶剂，所述溶剂选自去离子水及蒸馏水中的至少一种；
及/或，所述Mg2+选自MgSO4及MgCl2中的至少一种，所述Zn2+选自ZnSO4及ZnCl2中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，将对数期的所述重组大肠杆菌的种子液以1%-8%的的接种量接入装有所述发酵产碱性磷酸酶的培养基的发酵罐中进行发酵的步骤之前，还包括如下步骤：
将所述重组大肠杆菌保藏菌种以体积浓度为0.1%-1%接种至种子培养基中在37℃、200rpm下培养10小时-20小时，得到一级种子液，其中，所述种子培养基含有LB培养基；
将所述一级种子液以体积浓度为0.05%-0.5%接种至所述种子培养基中在37℃、200rpm下培养5小时-15小时，得到对数期的所述重组大肠杆菌的种子液。
5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，发酵条件包括：200rpm-750rpm的转速、0.5vvm-2vvm的通气量、37℃的发酵温度、0.03MPa-0.07MPa的罐压。
6.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为终浓度0.1mM-1.5mM的异丙基硫代半乳糖苷；
及/或，向所述发酵液中加入所述诱导剂后继续发酵的温度为20℃-37℃。
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