CN112522226B

CN112522226B - 磷排放限制下重组草铵膦脱氢酶工程菌的高密度发酵方法

Info

Publication number: CN112522226B
Application number: CN202011519991.6A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 程峰; 李举谋; 曹成浩; 徐建妙; 沈其; 邹树平; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112522226A

Abstract

本发明公开了一种磷排放限制下重组草铵膦脱氢酶工程菌的高密度发酵方法，将重组草铵膦脱氢酶工程菌接种至发酵培养基中，在初始通气量为5L/min、初始搅拌转速300rpm、初始溶氧为100％的条件下，37℃发酵培养至OD₆₀₀值为8‑10，向发酵液中加入终浓度5‑15g/L乳糖，通过补料培养基和甘油调节pH，发酵培养至OD₆₀₀在100‑120之间，将发酵液离心，获得含重组草铵膦脱氢酶的湿菌体；本发明不需要添加磷酸调节pH值，对环境污染小，废水处理更容易，发酵液中磷浓度1.15×10³mg/L，OD₆₀₀达到100‑120之间，菌体在60℃稳定性相对于磷酸调pH值提高了1.6倍。

Description

磷排放限制下重组草铵膦脱氢酶工程菌的高密度发酵方法

(一)技术领域

本发明涉及一种磷限制下重组草铵膦脱氢酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵方法。

(二)背景技术

草铵膦(phosphinothricin，也叫glufosinate)的化学名称为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂是谷氨酰胺合成酶抑制剂。自2016年7月起，国内百草枯水剂的全面禁用，仅国内替代空间就达2万吨，使得作为替代品的草铵膦需求大幅增长，早在2018年，全球主要草铵膦生产企业前三名拜耳，利尔化学，浙江永农的年产能已经分别达到了6000吨，5000吨，3000吨，预计到2020年，草铵膦的需求量达到4.1万吨。利尔化学更是于2017年8月就宣布了建设年产10000吨草铵膦原药生产线及配套设施建设项目。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的制备方法主要有三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点,是生产L-草铵膦的优势方法。

其中目前研究最广泛，效果最好的是以α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，通过草铵膦脱氢酶的不对称合成获得L-草铵膦。

草铵膦脱氢酶是一类能将氨基酸可逆的脱氨生成对应酮酸的氨基酸脱氢酶，其反应需要核苷类辅酶的参与(NAD(P)+)。根据其底物特异性，可分为谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶等。因其表现出的优良催化效率与选择性，草铵膦脱氢酶被广泛的应用于天然与非天然α-氨基酸的合成。

草铵膦脱氢酶法催化的工业化应用，其关键在于高效的酶生产技术。而高密度发酵为实现这一目标提供了方向。高密度发酵指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。与常规培养技术相比，高密度培养技术具有诸多优势。如提高了时空产率；缩小了反应器体积；缩短了培养周期等。目前高密度培养技术已成功用于蛋白质药物、酶制剂、氨基酸、生物添加剂等高附加值产品的大规模生产中。在大肠杆菌的发酵过程中需要保持pH的恒定，所以会在发酵的不同周期补加酸或碱来控制pH，通常会选择氨水和磷酸来作为补加原料。但是在发酵中磷的含量过高，会造成环境的污染，废水难以处理，不利于工业化应用。针对环保的需要和实际工业对发酵密度的需求，本发明提供了一种在磷限制下，通过甘油替代磷酸控制pH的发酵方式，并同时实现重组大肠杆菌的高密度发酵。原理在于甘油可作为碳源进入菌体代谢，在甘油激酶的条件下生产甘油-3-磷酸，一部分甘油在甘油脱氢酶催化下实现NAD(H)辅酶循环，而且在大肠杆菌中代谢产生了磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、乳酸、苹果酸、延胡索酸、甲酸、乙酸、异柠檬酸，乙醛酸、琥珀酸等多种酸性物质，可以有效的控制pH值，同时，由于甘油与水互溶,相关酶的合成速度快,生物表面活性剂可以在较短的时间内合成,因此甘油也被认为是一种有效碳源，使菌体密度大幅增加。

影响高密度培养的因素很多，如：溶氧、温度、pH、CO₂、培养基成分、代谢副产物、发酵液粘度、传热、传质、消泡等。而对于重组大肠杆菌的高密度培养，其最关键的问题是在发酵过程中，磷酸盐在通过影响微生物生长代谢的糖酵解途径和戊糖磷酸途径，对微生物的生长代谢繁殖具有重要的作用，所以对重组草铵膦脱氢酶大肠杆菌的生长和产酶过程的影响关系非常大，一般通过调控限制磷酸盐浓度提高产酶水平，大肠杆菌中常用的磷酸盐为磷酸氢二铵、磷酸二氢钾。本发明正是针对这些问题展开的研究。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种磷排放限制下重组草铵膦脱氢酶工程菌的高密度发酵方法，通过在发酵过程中添加甘油(替换磷酸)并在此基础上提供一种针对重组草铵膦脱氢酶工程菌的高密度发酵方法，解决了在发酵过程中单一用磷酸调pH值，导致发酵过程中磷的含量过高，造成的废水难以处理，不利于工业化应用等问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种磷排放限制下重组草铵膦脱氢酶工程菌的高密度发酵方法，所述方法为：将重组草铵膦脱氢酶工程菌接种至发酵培养基中，在初始通气量为5L/min、初始搅拌转速300rpm、初始溶氧(DO)为100％的条件下，37℃发酵培养至OD₆₀₀值为8-10，向发酵液中加入终浓度5-15g/L(优选10g/L)乳糖，在20-30℃(优选25℃)下进行诱导培养至OD₆₀₀值为30～40后，通过溶氧值的高低进行脉冲控制：即当溶氧不超过25％，采用恒速流加模式流加补料培养基，当溶氧高于25％时采用反馈流加模式流加补料培养基；诱导培养16h至OD₆₀₀为70-80(优选76)、溶氧低于10％，停止补加，继续发酵培养至OD₆₀₀在100-120之间，发酵结束；将发酵液离心(优选4℃、8000rpm下离心10min)，获得含重组草铵膦脱氢酶的湿菌体；整个发酵过程中通过流加体积浓度20-60％氨水或体积浓度20-60％甘油水溶液控制pH值为7.0；所述发酵培养基组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为蒸馏水，pH7.4；所述补料培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为蒸馏水。

进一步，本发明发酵前期(0-3h)菌体主要产酸，发酵中期(4-5小时，OD₆₀₀在15-20之间)后，菌体开始产碱，培养过程通过流加体积浓度50％(v/v)氨水或体积浓度50％甘油水溶液使发酵液稳定pH在7，所述控制pH值为7.0的方法为：当pH高于7.1时，流加体积浓度50％甘油水溶液至pH低于7.0时停止流加；当pH低于6.7，则流加体积浓度50％氨水至pH高于7时停止流加。

进一步，氨水的流加速度为5L/h；OD₆₀₀不高于40且pH高于7.1，甘油流加速度为2L/h；OD₆₀₀大于40且pH高于7.1，甘油流加速度为1L/h。

进一步，恒速流加模式流加补料培养基的速度为10-30mL/h，优选20mL/h。

进一步，反馈流加模式流加补料培养基的速度为1-10L/h，优选5L/h。

进一步，所述重组草铵膦脱氢酶工程菌在接种前先进行活化培养，再将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，所述活化培养方法为：

(1)斜面培养：将重组草铵膦脱氢酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lvPDH接种至含50μg/mL氨苄青霉素的斜面培养基，37℃培养10-16h，获得菌体斜面；所述斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH7.4；

(2)种子培养：取菌体斜面上草铵膦脱氢酶菌体接种到装有100mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养(约10h)，获得种子液；所述LB培养基组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为蒸馏水，pH 7.4。

本发明所述重组草铵膦脱氢酶工程菌的构建参照专利ZL201811585674.7，具体是将来源于白鳍豚的草铵膦脱氢酶基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQID NO.1所示)构建表达载体pETDuet-1-lvPDH，转化大肠杆菌，获得出发菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lvPDH。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：在发酵过程中，和传统发酵不同，不需要添加磷酸调节pH值，对环境污染小，废水处理更容易，发酵后测得发酵液中磷浓度为1.15×10³mg/L，相比磷酸调节pH显著下降；使用甘油进行pH调节后意外发现菌体密度也大幅提高，OD₆₀₀达到100-120之间，提示甘油既可以调节发酵液pH,又可以充当碳源增加菌浓；使用甘油进行pH调节最意想不到的效果是菌体在60℃稳定性相对于磷酸调pH值提高了1.6倍。结合甘油调节pH以及溶氧控制下恒速/反馈流加补加培养基，能够很好地实现重组草铵膦脱氢酶工程菌的高密度发酵。

(四)附图说明

图1为高密度发酵菌体催化合成L-草铵膦进程曲线图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒等购自上海生工；DNA marker、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)，D,L-草铵膦(D,L-PPT)、L-草铵膦(L-PPT)标准品购自Sigma-Aldrich公司；NADPH购于邦泰生物工程(深圳)有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

高效液相色谱(HPLC)检测L-PPT方法

高效液相色谱(HPLC)检测底物浓度，分析方法为：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：将50mM磷酸二氢胺溶于800mL超纯水中，加入10mL四丁基氢氧化铵用水稀释并定容至1000mL，用磷酸调pH到3.8，与乙腈以体积比88:12混合。检测波长为232nm，流速：1.0mL/min。柱温：40℃，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸出峰时间为：9.7分钟。

产物的手性分析及浓度分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：

(1)色谱条件：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：50mM乙酸铵溶液：甲醇＝10:1。荧光检测波长：λ_ex＝340nm，λ_em＝455nm。流速：1mL/min。柱温：30℃，L-草铵膦出峰时间为8.5min，D-草铵膦出峰时间为10.2min。

(2)衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12g N-乙酰-L-半胱氨酸，用10mL乙醇助溶，再加入40mL 0.1moL/L硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。

(3)衍生化反应与测定：取100μL样品加入400μL衍生化试剂，在振荡器上500rpm，30℃震荡5min，再加入400μL超纯水混匀，进样10μL进行HPLC分析。

本发明发酵液中磷浓度采用磷钼酸比色法测定，原理：磷酸盐在酸性溶液中与钼酸铵相作用，生成磷钼酸铵，水溶性游离磷钼酸(磷钼黄)遇还原剂产生磷钼蓝，其色泽的深浅与含磷量呈正比。具体实验时，取发酵液送杭州谱尼检测科技有限公司用磷钼酸比色法测定发酵液中磷浓度。

实施例1、重组草铵膦脱氢酶工程菌的构建

参照专利ZL201811585674.7“一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用”构建，具体为：将来源于白鳍豚的草铵膦脱氢酶基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQID NO.1所示)构建表达载体pETDuet-1-lvPDH，转化大肠杆菌，获得出发菌株重组草铵膦脱氢酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lvPDH。

实施例2、在磷限制下通过甘油(部分充当碳源)控制pH的重组草铵膦脱氢酶工程菌高密度发酵的方法

1、斜面培养：将实施例1构建的重组草铵膦脱氢酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lvPDH接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃过夜培养(约10h)，获得斜面菌体；所述LB培养基组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，琼脂粉20g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.4。

2、种子培养：挑取斜面菌体接种到装有100mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养(约10h)，获得种子液，备用。所述LB培养基组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为蒸馏水，pH 7.4。

3、发酵培养：发酵罐需要先灭菌(空消)，罐内加入少量水(防止玻璃壁灭菌过程中爆裂)，后将配好的3L发酵培养基加入5L发酵罐中，再加入3ml消泡剂(二甲基硅油)，将使用pH电极校准液校准之后的pH电极插入发酵罐中，将进气口，出气口的橡胶管等包扎好再灭菌(实消)。实消结束后，罐体与控制器间先连通水管路，通气管路，再连pH、温度、溶氧电极(需校正)，再装好搅拌装置，调节温度，pH，转速和通气量到预设状态，备用。所述发酵培养基为LB培养基，组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH 7.4。

发酵罐参数设置：温度为37℃，初始通气量为5L/min，初始搅拌转速300rpm，初始溶氧(DO)为100％。

(1)按体积浓度5％(v/v)的接种量将种子液接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐。37℃培养至OD₆₀₀值为9.1，pH 7，溶氧1％；向发酵液中加入终浓度10g/L乳糖，在25℃下诱导培养；在诱导后的0-3小时，OD₆₀₀为0-15，通过流加体积浓度50％氨水控制发酵液pH值为7.0，氨水流加速度为5L/h；诱导后的3-7小时，OD₆₀₀为15-40，通过流加体积浓度50％甘油水溶液控制发酵液pH值为7.0，甘油水溶液流加速度为2L/h；诱导后的7-12小时，OD₆₀₀为40-55，通过流加体积浓度50％甘油水溶液控制pH值为7.0，甘油水溶液流加速度为1L/h。诱导12小时，OD₆₀₀为55，溶氧缓慢下降至25％。

(2)在溶氧缓慢下降至25％后，以20mL/h的速度采用恒速流加模式流加补料培养基110mL，当溶氧高于25％时以5L/h的速度采用反馈流滴加模式流加补料培养基90mL；诱导培养16h至OD₆₀₀为76、溶氧8％(低于10％)，停止补加；同步骤(1)通过流加体积浓度50％(v/v)氨水或体积浓度50％甘油水溶液使发酵液稳定pH在7，即当pH高于7.1则开始流加体积浓度50％甘油水溶液，pH低于7.0停止流加甘油水溶液，OD₆₀₀不高于40且pH高于7.1，甘油水溶液流加速度为2L/h；OD₆₀₀大于40且pH高于7.1，甘油水溶液流加速度为1L/h；若pH低于6.7，则流加体积浓度50％(v/v)氨水，若pH高于7，停止流加氨水，氨水的流加速度为5L/h。

甘油可作为碳源进入菌体代谢，在控制pH的同时也可作为碳源，同时恒速流加模式补料碳氮源，使菌体密度大幅增加。所述补料培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为蒸馏水。

(3)同步骤(2)方法使发酵液稳定pH在7，在步骤(1)条件下继续发酵4h至OD₆₀₀为110，发酵结束。

采用磷钼酸比色法测得发酵液中磷浓度为1.15×10³mg/L。发酵液在4℃、转速8000rpm下离心10min，收集菌体细胞。甘油可作为碳源进入菌体代谢，在控制pH的同时也可作为碳源，同时反馈流加模式补料碳氮源，使菌体密度大幅增加，OD₆₀₀在100-120之间。

(4)以步骤(3)获得的菌体细胞为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以500mL、pH 7、200mM磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，其中底物加入浓度以缓冲液体积计为400mM，催化剂加入浓度以缓冲液体积计为30g/L，通过流加氨水使反应体系pH值稳定在7，在30℃条件下转化反应12h后，底物转化完全，采用高效液相色谱(HPLC)检测L-PPT，生成398mM L-PPT，反应进程见图1所示。

实施例3、通过甘油(部分充当碳源)控制pH的重组草铵膦脱氢酶和通过磷酸控制pH的重组草铵膦脱氢酶稳定性的测定

将实施例2用甘油调pH值高密度发酵得到的草铵膦脱氢酶菌体用pH 7磷酸缓冲液进行重悬，然后分别于在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃水浴中保温30min后，再测定酶的活性，定义酶活性最高一组的相对酶活为100％，结果表明草铵膦脱氢酶在35和40℃的热稳定性最好，在保温30min后，活性仍能保持在99％以上，随后缓慢下降；而在60℃时保温30min后，相对活力剩余仍有40％，进一步说明通过这种策略获得的草铵膦脱氢酶稳定性好。

对比例1、通过磷酸控制pH的重组草铵膦脱氢酶工程菌高密度发酵的方法

将实施例2中调节pH的甘油和氨水改为磷酸，其他操作相同，取10ml发酵液，用磷钼酸比色法测得发酵液中磷浓度为2.30×10³mg/L，磷浓度是用甘油调pH的发酵液的2倍。

对比例2、通过磷酸控制pH，恒速流加模式补料碳氮源的重组草铵膦脱氢酶工程菌高密度发酵的方法

将实施例2中调节pH的甘油和氨水改为磷酸，同时补料培养基中蛋白胨改为尿素，其他操作相同，用磷钼酸比色法测磷浓度，发酵后测得发酵液中磷浓度为2.35×10³mg/L。

对比例3、通过磷酸控制pH，反馈流加模式补料碳氮源重组草铵膦脱氢酶工程菌高密度发酵的方法

将实施例2中调节pH的甘油和氨水改为磷酸，同时补料培养基中蛋白胨和酵母粉分别改为葡萄糖和硫酸铵，其他操作相同。发酵后用磷钼酸比色法测得发酵液中磷浓度为2.32×10³mg/L。

对比例4通过氨水和硫酸控制pH进行重组草铵膦脱氢酶工程菌高密度发酵

实施例2步骤(1)，按体积浓度5％(v/v)的接种量将种子液接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐。37℃培养至OD₆₀₀值为9.1，加入终浓度10g/L乳糖，在25℃下诱导5小时至OD₆₀₀为18，pH菌体开始产碱，将实施例2中调节pH的甘油和氨水改为体积浓度10％(v/v)硫酸水溶液，补料培养基改为浓度为600g/L的葡萄糖水溶液，每次补加200mL，补加3次，以维持发酵过程中发酵液残糖浓度高于10g/L，其他操作相同。发酵结束，测得发酵液中磷浓度为1.80×10³mg/L。

对比例5盐酸控制pH进行重组草铵膦脱氢酶工程菌高密度发酵

将实施例2中调节pH的甘油和氨水改为6％(v/v)盐酸溶液，其他操作相同。发酵后测得发酵液中磷浓度为1.9×10³mg/L。

对比例6稀硫酸控制pH进行重组草铵膦脱氢酶工程菌高密度发酵

将实施例2中调节pH的甘油和氨水改为8％(v/v)稀硫酸水溶液，其他操作相同。发酵后测得发酵液中磷浓度为1.85×10³mg/L。

对比例7通过磷酸控制pH的重组草铵膦脱氢酶稳定性的测定

将实施例2中调节pH的甘油换成磷酸进行高密度发酵得到的草铵膦脱氢酶，采用实施例3方法测酶活稳定性。结果表明草铵膦脱氢酶在35和40℃的热稳定性最好，在保温30min后，活性保持在80％以上，随后缓慢下降；而在60℃时保温30min后，相对活力仅剩余15％。

对比例8通过甘油(部分充当碳源)控制pH和始终恒速补加培养基

将实施例2中补料培养基改为始终采用0.01L/h的速度流加，其他操作相同，发酵结束后取10ml发酵液，用磷钼酸比色法测得发酵液中磷浓度为1.15×10³mg/L(与实施例2类似)。但是在发酵结束时OD₆₀₀仅为50-60，是实施例2发酵结束时菌体密度的一半(OD₆₀₀在100-120之间)。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 磷排放限制下重组草铵膦脱氢酶工程菌的高密度发酵方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgattgaga gtgtggacaa cttcctggcc cgcctgcagc agcgtgatcc aggccagccg 60

gagtttcacc aggcagtgga ggaagtttta cgcacgttat ggccgttctt ggaggcaaac 120

ccacactatt tgcaggccgg gatcttggaa cgtatggtag aacccgagcg tgcggtactt 180

tttcgcgttt cttgggtaga cgatcatggc aaggtacagg taaaccgtgg ctaccgcatt 240

cagatgaata gcgcaatcgg tccttactcg agcggtcttc gttttcaccc ttcggtcaac 300

ttgtccgtct tgaagttcct ggcgttcgag caagtcttca agaattcatt aacctccctg 360

ccaatgggtg gagggaaagg cggatctgac ttcgacccta aggggaaatc ggatgccgag 420

gtcatgcgtt tctgtcaggc atttatgtct gaactgtatc gtcacattgg tgcggactgt 480

gacgtcccgg caggcgacat tggggtaggt gcgcgcgaga ttggttatat gttcggacaa 540

tacaagcgcc tggcaaacca gttcaccagt gtactgacgg gaaaaggcat gacctatggc 600

ggcttccgcc ccgaggctac cggttatggt tgtgtatatt ttgcggagga aatgctgaag 660

cgccaagggc agcgtatcga tggtcgtcgc gtggcaatta gtggttccgg aaatgtcgca 720

cagtatgcag cacgcaaagt aatggactta ggcgggaagg tcatcagtct ttcggatagt 780

gaggggacgc tgtatgctga ggcagggctg accgatgcac agtgggaagc tgtgatgacg 840

ctgaagaatg ttaagcgcgg acgcatctct gaattagccg ggcaatttgg gttagaattt 900

cgtaaaggtc agacgccatg gagtctggca tgtgacattg ctttgccctg cgctacccaa 960

aacgaacttg atgtagagga tgcaaaagcc ttattggcaa atgggtgtat ttgcgtggcg 1020

gagggcgcca acatgccaac cactttagct gcggtagata tcttcttaga agccggaatt 1080

ttgtacgcgc ccggtaaagc gtcaaatgca ggaggggtcg ctgtgagggg attggaaatg 1140

tctcaaaacg caatgcgctt actgtggact gccggcgagg tagactcgaa attacacggc 1200

attatgcaat ctattcatca tgcctgcgtc cactacggtg aagagggcga tggtcgtgta 1260

aattacgtta aaggcgccaa catcgccggg tttgttaagg tagctgatgc tatgctggct 1320

cagggcgtcg tttaa 1335

<210> 2

<211> 444

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Ile Glu Ser Val Asp Asn Phe Leu Ala Arg Leu Gln Gln Arg Asp

1 5 10 15

Pro Gly Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Thr

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro His Tyr Leu Gln Ala Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Met Val Glu Pro Glu Arg Ala Val Leu Phe Arg Val Ser

50 55 60

Trp Val Asp Asp His Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Ser Ser Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Cys

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr

165 170 175

Met Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Met Thr Tyr Gly Gly Phe Arg Pro Glu Ala Thr Gly

195 200 205

Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Gln Gly Gln

210 215 220

Arg Ile Asp Gly Arg Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala

225 230 235 240

Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val Ile Ser

245 250 255

Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Glu Ala Gly Leu Thr Asp

260 265 270

Ala Gln Trp Glu Ala Val Met Thr Leu Lys Asn Val Lys Arg Gly Arg

275 280 285

Ile Ser Glu Leu Ala Gly Gln Phe Gly Leu Glu Phe Arg Lys Gly Gln

290 295 300

Thr Pro Trp Ser Leu Ala Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala Thr Gln

305 310 315 320

Asn Glu Leu Asp Val Glu Asp Ala Lys Ala Leu Leu Ala Asn Gly Cys

325 330 335

Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Ala Ala Val

340 345 350

Asp Ile Phe Leu Glu Ala Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Gly Lys Ala Ser

355 360 365

Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Arg Gly Leu Glu Met Ser Gln Asn Ala

370 375 380

Met Arg Leu Leu Trp Thr Ala Gly Glu Val Asp Ser Lys Leu His Gly

385 390 395 400

Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val His Tyr Gly Glu Glu Gly

405 410 415

Asp Gly Arg Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Val

420 425 430

Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val

435 440

Claims

1.一种磷排放限制下重组草铵膦脱氢酶工程菌的高密度发酵方法，其特征在于所述方法为：将重组草铵膦脱氢酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lvPDH接种至发酵培养基中，在初始通气量为5L/min、初始搅拌转速300rpm、初始溶氧为100％的条件下，37℃发酵培养至OD₆₀₀值为8-10，向发酵液中加入终浓度5-15g/L乳糖，在20-30℃下诱导培养至OD₆₀₀值为30~40后，当溶氧不超过25%时，采用恒速流加模式流加补料培养基，当溶氧高于25%时采用反馈流加模式流加补料培养基；诱导培养至OD₆₀₀为70-80、溶氧低于10%，停止补加；继续发酵培养至OD₆₀₀在100-120之间，发酵结束；将发酵液离心，获得含重组草铵膦脱氢酶的湿菌体；发酵过程中通过体积浓度20-60%甘油水溶液控制pH值为7.0；所述发酵培养基组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为蒸馏水，pH 7.4；所述补料培养基组成：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L，溶剂为蒸馏水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述控制pH值为7.0的方法为：当pH高于7.1时，流加体积浓度50%甘油水溶液至pH低于7.0时停止流加；当pH低于6.7，则流加体积浓度50％氨水至pH高于7时停止流加。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，氨水的流加速度为5L/h。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，OD₆₀₀ 不高于40且pH高于7.1，甘油水溶液流加速度为2 L/h；OD₆₀₀大于40且pH高于7.1，甘油水溶液流加速度为1 L/h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于恒速流加模式流加补料培养基的速度为10-30mL/h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于反馈流加模式流加补料培养基的速度为1-10L/h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组草铵膦脱氢酶工程菌在接种前先进行活化培养，再将种子液以体积浓度5%的接种量接种至发酵培养基，所述活化培养方法为：

（1）斜面培养：将重组草铵膦脱氢酶工程菌接种至含50μg/mL氨苄青霉素的斜面培养基，37℃培养10-16h，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 7.4；

（2）种子培养：取斜面菌体接种到含50μg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，获得种子液；所述LB培养基组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为蒸馏水，pH 7.4。