CN106635847A - 一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌及其制备方法 - Google Patents

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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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Abstract

本发明公开了一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌及其制备方法，将黑曲霉的低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌；所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的表达受Pgas启动子调控。本发明获得的黑曲霉具有耐高温、耐酸、发酵时间短的特性，同时柠檬酸转化率、纯度较高，产量比现有菌株有较大幅度的提高。

Description

一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种通过基因重组制得可以提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌。
背景技术
柠檬酸作为目前生产量最大的有机酸，全球产量已经达到170万吨，并且其需求正以每年3.5～4.0％的速度增长，我国虽然是柠檬酸的主要生产国和出口国，年产量占世界总产量的53％，但由于柠檬酸国际市场竞争激烈，整个柠檬酸行业处于非常困难的状况。国际上有大量的研究在不断推进柠檬酸发酵的生产工艺，同时作为发酵的基础，柠檬酸生产菌种黑曲霉的改良也一直是研究人员所关注的焦点，获得更优质的生产菌株对巩固我国柠檬酸生产大国的地位和促进柠檬酸行业的发展有重要的现实意义。柠檬酸发酵对碳源的吸收实际上就是对葡萄糖的吸收。Torres测定了黑曲霉吸收葡萄糖存在2个Km值，分别为260μM和3.67mM，说明存在高亲和力和低亲和力两套转运系统，而且由低亲和力的转运系统提供柠檬酸发酵所需的代谢流，但该系统仅在葡萄糖浓度>50g·L-1时起作用。葡萄糖的转运是柠檬酸发酵的第一个步骤，葡萄糖转运系统对柠檬酸发酵有直接的影响，因此尝试对葡萄糖转运系统进行调整可能可以增强柠檬酸的生产。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌及其制备方法。本发明获得的黑曲霉具有耐高温、耐酸、发酵时间短的特性，同时柠檬酸转化率、纯度较高，产量比现有菌株有较大幅度的提高。
本发明的技术方案如下：
一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌，所述重组黑曲霉菌为将黑曲霉的低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌；所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的表达受Pgas启动子调控。
所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述Pgas启动子为低pH诱导型启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因表达框，所述表达框包含Pgas启动子、低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因和trp终止子，按照Pgas-LGT1-trp的顺序排布。
所述Pgas启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述trp终止子的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
所述重组黑曲霉菌的制备方法包括如下步骤：
(1)构建低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因表达框Pgas-LGT1-trp；
(2)构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp；
(3)将步骤(1)和步骤(2)制得的基因表达框转化黑曲霉，经抗性筛选和PCR鉴定获得所述重组黑曲霉菌。
所述步骤(2)中所述抗性基因表达框中gpdA为启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述步骤(2)中所述抗性表达框中hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明有益的技术效果在于：
本发明利用低pH诱导型启动子启动LGT1蛋白在黑曲霉中表达，通过增强产酸阶段葡萄糖的摄取，从而提高柠檬酸的产量。本发明方法利用Aspergillus niger H915-1作为宿主，柠檬酸产量提高了6.5％；在42℃下发酵，产量提高40.3％，时间缩短10h；利用更偏酸的初始培养基，产量提高6.9％。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
实施例
(1)黑曲霉RNA的提取：将黑曲霉孢子接种到柠檬酸发酵培养基中，在温度为35℃转速为250r/min的条件下培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司RNeasy PlantMini Kit提取黑曲霉总RNA，用TAKARA公司PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser将RNA反转录成cDNA。
(2)黑曲霉基因组DNA的提取：将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基(3％麦芽提取物，0.5％胰蛋白胨)中，35℃ 250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasyPlant Mini Kit提取丝状真菌基因组。
(3)LGT1蛋白表达框的构建：
①利用引物trp-F(序列如SEQ ID NO.7所示)和trp-R(序列如SEQ ID NO.8所示)以pAN7-1为模板扩增trp终止子(序列如SEQ ID NO.6)，序列上下游含Pst I和Hin dIII位点，连接到pMD19上测序，用这两个限制性内切酶酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19上，得到pUC19-trp；
②利用引物Pgas-F(序列如SEQ ID NO.9所示)和Pgas-R(序列如SEQ ID NO.10所示)从黑曲霉基因组中扩增Pgas启动子(序列如SEQ ID NO.3)，序列两头含Eco RI和Kpn I酶切位点，酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19-trp，得到pUC-Pgas-trp；
③利用引物gas-LGT1-F(序列如SEQ ID NO.11所示)以及Trp-LGT1-R(序列如SEQID NO.12所示)进行RT-PCR扩增得到LGT1CDS的基因序列(序列如SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2)，序列两端分别含有pUC-Pgas-trp约20bp同源序列，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行同源重组，形成gas-LGT1-trp表达框，得到pGTH表达载体。
用到的引物如下：
trp-F：ctgcagGATCCACTTAAACGTTACTGAAATC
trp-R：aagcttCTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG
Pgas-F：gaattcCTGCTCTCTCTCTGCTCTCTTTCT
Pgas-R：ggtaccGTGAGGAGGTGAACGAAAGAAGAC
Gas-LGT1-F：gttcacctcctcacGGTACCATGGGTGTCTCTAATATGATGTC
Trp-LGT1-R：TAACGTTTAAGTGGATCGGATCCTTACTCGCGGAGCTCAGTGG
(4)黑曲霉原生质体的制备和转化：
①按3×105/ml的浓度接种黑曲霉孢子至PDA液体培养基，30℃、200r/min培养过夜，再用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球；
②称0.5g/L的lysing enzyme，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌，称取0.5g菌球，加入到酶解液中，37℃、100r/min震荡培养3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μL STC，混匀，制得黑曲霉原生质体；
③在100μL黑曲霉原生质体中加入10μL线性化核酸片段和330μL PEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mL PEG，室温放置10min，依次加入4mL STC和4mL于48℃预热的上层培养基，铺板于含有180mg/L潮霉素的下层培养基上，平板在35℃倒置培养4-7天，直至出现菌落，挑取单菌落继代，每个菌落进行3次单孢子继代。
(5)黑曲霉基因组DNA的提取：将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基(3％麦芽提取物，0.5％胰蛋白胨)中，35℃ 250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，再用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit提取丝状真菌基因组，以基因组为模板，以Gas-LGT1-F和Trp-LGT1-R为引物，PCR鉴定外源基因在基因组上的整合。
对比例
(1)潮霉素抗性表达框的获取：通过引物gpd-F(序列如SEQ ID NO.13所示)和Ttrp-R-2(序列如SEQ ID NO.14所示)从质粒pAN7-1(序列号Z32698.1)中扩增得到，该表达框序列包含PgpdA(序列如SEQ ID NO.4)、hph(序列如SEQ ID NO.5)和trp终止子(序列如SEQ ID NO.6)。
gpd-F：CAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG
Ttrp-R-2：CTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG
(2)黑曲霉原生质体的制备和转化：
①按3×105/ml的浓度接种黑曲霉孢子至PDA液体培养基，30℃、200r/mi好好韩n培养过夜，再用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球；
②称0.5g/L的lysing enzyme，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌，称取0.5g菌球，加入到酶解液中，37℃、100r/min震荡培养3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μL STC，混匀，制得黑曲霉原生质体；
③在100μL黑曲霉原生质体中加入10μL线性化核酸片段和330μL PEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mL PEG，室温放置10min，依次加入4mL STC和4mL于48℃预热的上层培养基，铺板于含有180mg/L潮霉素的下层培养基上，平板在35℃倒置培养4-7天，直至出现菌落，挑取单菌落继代，每个菌落进行3次单孢子继代。
测试例：
(1)将实施例、对比例所得黑曲霉、现有技术常用黑曲霉Co82、黑曲霉TN-A09分别接种于ME培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L)上35℃生孢培养7天，刮取孢子，以106/mL的接种量接种于种子培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量10％，总氮含量0.2％)，37℃、250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基，35℃、250r/min发酵72h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。测试结果如表1所示。
表1
柠檬酸含量(g/100mL) 转化率(％) 发酵周期(小时)
实施例 18.2 98 55
对比例 13.4 92 60
黑曲霉Co82 13 92 60
黑曲霉TN-A09 12.5 92 60
注：柠檬酸含量检测采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差检测器和工作站)；色谱条件：HPX87H色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为5mM硫酸溶液，流量为0.6mL/min，进样量为10μL，柱温为30℃，210nm波长紫外光检测。
结果表明，本发明实施例制得菌株的柠檬酸产量和转化率优于现有黑曲霉深层有氧发酵柠檬酸技术水平。
(2)将实施例、对比例所得黑曲霉、现有技术常用黑曲霉zjs-8分别接种于ME培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L)上35℃生孢培养7天，刮取孢子，以106/mL的接种量接种于种子培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量10％，总氮含量0.2％)，37℃、250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基，42℃、250r/min发酵72h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。测试结果如表2所示。
表2
柠檬酸含量(g/100mL) 转化率(％) 发酵周期(小时)
实施例 17.9 94 60
对比例 10.7 66.8 70
黑曲霉zjs-8 10 61.83 60
由表2数据可以看出，本发明实施例制得黑曲霉菌株具有很好的耐高温性，在温度提高的情况下柠檬酸产量和转化率仍高于现有的黑曲霉zjs-8。
(3)将实施例、对比例所得黑曲霉及黑曲霉Co82分别接种于ME培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L)上35℃生孢培养7天，刮取孢子，以106/mL的接种量接种于种子培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量10％，总氮含量0.2％，pH 3.5)，37℃、250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基(pH 2.0)，42℃、250r/min发酵72h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。测试结果如表3所示。
表3
柠檬酸含量(g/100mL) 转化率(％) 发酵周期(小时)
实施例 18.9 99.5 60
对比例 14 93 60
黑曲霉Co82 13 93 65
由表3可以看出，本发明实施例所得菌种在较为苛刻的酸性条件下，仍具有较好的柠檬酸产量和转化率，相对较短的发酵周期，本发明重组菌种具有更好的耐酸性。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌及其制备方法
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1683
<212> DNA
<213> LGT1基因的核苷酸序列
<400> 1
atgggtgtct ctaatatgat gtcccggttc aagcctcagg cggaccactc tgagtcctcc 60
actgaggctc ctactcctgc tcgctccaac tccgccgtcg agaaggacaa tgtcttgctc 120
gatgacagtc ccgtcaagta cttgacctgg cgctccttca tcctgggtat cgtcgtgtcc 180
atgggtggtt tcatcttcgg ttactctact ggtcaaatct ctggtttcga gactatggat 240
gacttcctcc aacgtttcgg tcaggaacag gcggatggat cctatgcttt cagcaacgtc 300
cgtagtggtc tcattgtcgg tctgctgtgt atcggtacta tgatcggtgc cctggttgct 360
gctcctatcg cagaccgcat gggccgcaag ctctccatct gtctctggtc tgtcatccac 420
atcgtcggta tcatcattca gattgccacc gactccaact gggtccaggt cgctatgggt 480
cgttgggttg ccggtctggg tgttggtgcc ctctccagca ttgtccccat gtaccagagt 540
gaatctgctc cccgtcaggt ccgtggtgcc atggtcagtg ccttccagct gttcgttgcc 600
ttcggtatct tcatctccta catcatcaac ttcggtaccg agagaatcca gtcgactgct 660
tcctggcgta tcaccatggg cattggcttc gcctggccct tgattctggc tgttggctct 720
ctcttcctgc ccgagtctcc tcgtttcgcc taccgtcagg gtcgtatcga tgaggcccgt 780
gaggttatgt gcaagctgta cggtgtcagc ccgaaccacc gcgtcatcgc ccaggagatg 840
aaggacatga aggacaagct cgacgaggag aaggccgccg gtcaggctgc ctggcacgag 900
ctgttcaccg gccctcgcat gctctaccgt accctgctcg gtattgctct gcagtccctc 960
cagcagctga ccggtgccaa ctttatcttc tactacggaa acagtatctt cacctccact 1020
ggtctgagca acagctacgt cactcagatc attctgggtg ctgtcaactt cggtatgacc 1080
ctgcccggtc tgtacgtcgt cgagcacttc ggtcgtcgta acagtctgat ggttggtgct 1140
gcctggatgt tcatttgctt catgatctgg gcttccgttg gtcacttcgc tctggatctt 1200
gccgaccctc aggccactcc tgccgctggt aaggccatga tcatcttcac ttgcttcttc 1260
attgtcggtt tcgccaccac ctggggtcct atcgtctggg ccatctgtgg tgagatgtac 1320
cccgcccgct accgtgctct ctgcattggt attgccaccg ctgccaactg gacctggaac 1380
ttcctcatct ccttcttcac ccccttcatc tctagctcca ttgacttcgc ctacggctac 1440
gtctttgctg gatgctgttt cgccgccatc ttcgttgtct tcttcttcgt caatgagacc 1500
cagggtcgca ctcttgagga ggttgacacc atgtacgtgc tccacgtcaa gccctggcag 1560
agtgccagct gggttccccc ggagggcatt gtccaggaca tgcaccgccc cccttcctct 1620
tccaagcagg agggtcaggc tgagatggct gagcacaccg agcccactga gctccgcgag 1680
taa 1683
<210> 2
<211> 560
<212> PRT
<213> LGT1基因的氨基酸序列
<400> 2
Met Gly Val Ser Asn Met Met Ser Arg Phe Lys Pro Gln Ala Asp His
1 5 10 15
Ser Glu Ser Ser Thr Glu Ala Pro Thr Pro Ala Arg Ser Asn Ser Ala
20 25 30
Val Glu Lys Asp Asn Val Leu Leu Asp Asp Ser Pro Val Lys Tyr Leu
35 40 45
Thr Trp Arg Ser Phe Ile Leu Gly Ile Val Val Ser Met Gly Gly Phe
50 55 60
Ile Phe Gly Tyr Ser Thr Gly Gln Ile Ser Gly Phe Glu Thr Met Asp
65 70 75 80
Asp Phe Leu Gln Arg Phe Gly Gln Glu Gln Ala Asp Gly Ser Tyr Ala
85 90 95
Phe Ser Asn Val Arg Ser Gly Leu Ile Val Gly Leu Leu Cys Ile Gly
100 105 110
Thr Met Ile Gly Ala Leu Val Ala Ala Pro Ile Ala Asp Arg Met Gly
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Ile Cys Leu Trp Ser Val Ile His Ile Val Gly Ile
130 135 140
Ile Ile Gln Ile Ala Thr Asp Ser Asn Trp Val Gln Val Ala Met Gly
145 150 155 160
Arg Trp Val Ala Gly Leu Gly Val Gly Ala Leu Ser Ser Ile Val Pro
165 170 175
Met Tyr Gln Ser Glu Ser Ala Pro Arg Gln Val Arg Gly Ala Met Val
180 185 190
Ser Ala Phe Gln Leu Phe Val Ala Phe Gly Ile Phe Ile Ser Tyr Ile
195 200 205
Ile Asn Phe Gly Thr Glu Arg Ile Gln Ser Thr Ala Ser Trp Arg Ile
210 215 220
Thr Met Gly Ile Gly Phe Ala Trp Pro Leu Ile Leu Ala Val Gly Ser
225 230 235 240
Leu Phe Leu Pro Glu Ser Pro Arg Phe Ala Tyr Arg Gln Gly Arg Ile
245 250 255
Asp Glu Ala Arg Glu Val Met Cys Lys Leu Tyr Gly Val Ser Pro Asn
260 265 270
His Arg Val Ile Ala Gln Glu Met Lys Asp Met Lys Asp Lys Leu Asp
275 280 285
Glu Glu Lys Ala Ala Gly Gln Ala Ala Trp His Glu Leu Phe Thr Gly
290 295 300
Pro Arg Met Leu Tyr Arg Thr Leu Leu Gly Ile Ala Leu Gln Ser Leu
305 310 315 320
Gln Gln Leu Thr Gly Ala Asn Phe Ile Phe Tyr Tyr Gly Asn Ser Ile
325 330 335
Phe Thr Ser Thr Gly Leu Ser Asn Ser Tyr Val Thr Gln Ile Ile Leu
340 345 350
Gly Ala Val Asn Phe Gly Met Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Val Val Glu
355 360 365
His Phe Gly Arg Arg Asn Ser Leu Met Val Gly Ala Ala Trp Met Phe
370 375 380
Ile Cys Phe Met Ile Trp Ala Ser Val Gly His Phe Ala Leu Asp Leu
385 390 395 400
Ala Asp Pro Gln Ala Thr Pro Ala Ala Gly Lys Ala Met Ile Ile Phe
405 410 415
Thr Cys Phe Phe Ile Val Gly Phe Ala Thr Thr Trp Gly Pro Ile Val
420 425 430
Trp Ala Ile Cys Gly Glu Met Tyr Pro Ala Arg Tyr Arg Ala Leu Cys
435 440 445
Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Asn Trp Thr Trp Asn Phe Leu Ile Ser
450 455 460
Phe Phe Thr Pro Phe Ile Ser Ser Ser Ile Asp Phe Ala Tyr Gly Tyr
465 470 475 480
Val Phe Ala Gly Cys Cys Phe Ala Ala Ile Phe Val Val Phe Phe Phe
485 490 495
Val Asn Glu Thr Gln Gly Arg Thr Leu Glu Glu Val Asp Thr Met Tyr
500 505 510
Val Leu His Val Lys Pro Trp Gln Ser Ala Ser Trp Val Pro Pro Glu
515 520 525
Gly Ile Val Gln Asp Met His Arg Pro Pro Ser Ser Ser Lys Gln Glu
530 535 540
Gly Gln Ala Glu Met Ala Glu His Thr Glu Pro Thr Glu Leu Arg Glu
545 550 555 560
<210> 3
<211> 1493
<212> DNA
<213> Pgas启动子的核苷酸序列
<400> 3
ctgctctctc tctgctctct ttctgcgctc tctgtgtcgg cactaacccc gaatggggcg 60
ggtatcggca gtccgacgga tctccggggg ccgcacgtcc agcgccgatc gttactcaac 120
cgagcagagg agagagagca gtgagcagtg gtgtcaccga ccataaaaat gcttgcttct 180
gcccatccag ccatcagttg tccagtctgc tccattgtgt gccagtctcg cccccaaggc 240
cgcgcatctg aaaccaaccg gttgggtgaa atcagccggc gggtggcacc cgagcggcca 300
ctggctggga tcatcgcccg caacgcgtca acagcaatca aacgaaggat gcgaaattat 360
tcagcgggcg gttcctttcc aatttttccc cgttcctgtc agcatgtcta ctctatcata 420
ctgtaacatt attatattgt gattattttt attctgggtg atgtgtccac tggaccgcac 480
gtggaatgaa gattttcctt ccctcgggac gagaaaccat ggcgcagttg gtgttgtgtg 540
cgtgtgtgtg cgtgtcggtt gtccgaaaat cgccctaaac tccgaggcac gcaccatttg 600
ccattaattc ccttgcgatt gatttctgcc tgtccctgcg accctttgtg accctttgtg 660
accctttgac cctggattca ggggcttggt ggactcatag cgatggggat agggactttt 720
gacccttttg accctttgac cctcccattt tccctggcct aagtacgctg tagtcgtaat 780
tatagaaaga atcttgcgtg gactggggca aaaggggaac agaacttatc catgtccgag 840
cagcgatcgg ccagtcacca agccggctgg atccgagacc cgctacgtgg gaactcccaa 900
gagtcgttaa gcaaagccaa gagatcagcc aagatgtcgc tcacgagcct aattgctgga 960
ttgccatatc gcttgtcgtt gtaccatcgc gtaagatttt atcattgttt ctgggggctg 1020
tcagctagtc taaaacgtac tcctcaaacc agagaggctg atgatgctga tgatgggcct 1080
ccacccccca aattggtagc gccgttccat gagaggccca gtctctctct gcccgtcctc 1140
gaccattgtt tggcccagca ctgacacaac cttcaggggg ggccaatgga cgtattccgt 1200
aggcagcagg caaatgcggc cctaagaact ccccaactaa taagagtcca gactagcaaa 1260
ggttcgcctc gccggtctcc atctcttcct tcttagtcct cccatttcct ccctcccact 1320
tggtctctcg ctccagattt cctttcttct ttcatccatc ccatcttgta tccttttgct 1380
tagccttttt gtttggtttt cttcctctcg ttaaccacca cattcgctct atcttaatac 1440
aaaccaccca cactcgttct atagcatctg tcttctttcg ttcacctcct cac 1493
<210> 4
<211> 2310
<212> DNA
<213> gpdA启动子的核苷酸序列
<400> 4
caattccctt gtatctctac acacaggctc aaatcaataa gaagaacggt tcgtcttttt 60
cgtttatatc ttgcatcgtc ccaaagctat tggcgggata ttctgtttgc agttggctga 120
cttgaagtaa tctctgcaga tctttcgaca ctgaaatacg tcgagcctgc tccgcttgga 180
agcggcgagg agcctcgtcc tgtcacaact accaacatgg agtacgataa gggccagttc 240
cgccagctca ttaagagcca gttcatgggc gttggcatga tggccgtcat gcatctgtac 300
ttcaagtaca ccaaccctct tctgatccag tcgatcatcc cgctgaaggg cgctttcgaa 360
tcgaatctgg ttaagatcca cgtcttcggg aagccagcga ctggtgacct ccagcgtccc 420
tttaaggctg ccaacagctt tctcagccag ggccagccca agaccgacaa ggcctccctc 480
cagaacgccg agaagaactg gaggggtggt gtcaaggagg agtaagctcc ttattgaagt 540
cggaggacgg agcggtgtca agaggatatt cttcgctctg tattatagat aagatgatga 600
ggaattggag gtagcatagc ttcatttgga tttgctttcc aggctgagac tctagcttgg 660
agcatagagg gtccctttgg ctttcaatat tctcaagtat ctcgagtttg aacttattcc 720
cgtgaacctt ttattcacca atgagcattg gaatgaacat gaatctgagg actgcaatcg 780
ccatgaggtt ttcgaaatac atccggatgt cgaaggcttg gggcacctgc gttggttgaa 840
tttagaacgt ggcactattg atcatccgat agctctgcaa agggcgttgc acaatgcaag 900
tcaaacgttg ctagcagttc caggtggaat gttatgatga gcattgtatt aaatcaggag 960
atatagcatg atctctagtt agctcaccac aaaagtcaga cggcgtaacc aaaagtcaca 1020
caacacaagc tgtaaggatt tcggcacggc tacggaagac ggagaagccc accttcagtg 1080
gactcgagta ccatttaatt ctatttgtgt ttgatcgaga cctaatacag cccctacaac 1140
gaccatcaaa gtcgtatagc taccagtgag gaagtggact caaatcgact tcagcaacat 1200
ctcctggata aactttaagc ctaaactata cagaataaga tggtggagag cttataccga 1260
gctcccaaat ctgtccagat catggttgac cggtgcctgg atcttcctat agaatcatcc 1320
ttattcgttg acctagctga ttctggagtg acccagaggg tcatgacttg agcctaaaat 1380
ccgccgcctc caccatttgt agaaaaatgt gacgaactcg tgagctctgt acagtgaccg 1440
gtgactcttt ctggcatgcg gagagacgga cggacgcaga gagaagggct gagtaataag 1500
cgccactgcg ccagacagct ctggcggctc tgaggtgcag tggatgatta ttaatccggg 1560
accggccgcc cctccgcccc gaagtggaaa ggctggtgtg cccctcgttg accaagaatc 1620
tattgcatca tcggagaata tggagcttca tcgaatcacc ggcagtaagc gaaggagaat 1680
gtgaagccag gggtgtatag ccgtcggcga aatagcatgc cattaaccta ggtacagaag 1740
tccaattgct tccgatctgg taaaagattc acgagatagt accttctccg aagtaggtag 1800
agcgagtacc cggcgcgtaa gctccctaat tggcccatcc ggcatctgta gggcgtccaa 1860
atatcgtgcc tctcctgctt tgcccggtgt atgaaaccgg aaaggccgct caggagctgg 1920
ccagcggcgc agaccgggaa cacaagctgg cagtcgaccc atccggtgct ctgcactcga 1980
cctgctgagg tccctcagtc cctggtaggc agctttgccc cgtctgtccg cccggtgtgt 2040
cggcggggtt gacaaggtcg ttgcgtcagt ccaacatttg ttgccatatt ttcctgctct 2100
ccccaccagc tgctcttttc ttttctcttt cttttcccat cttcagtata ttcatcttcc 2160
catccaagaa cctttatttc ccctaagtaa gtactttgct acatccatac tccatccttc 2220
ccatccctta ttcctttgaa cctttcagtt cgagctttcc cacttcatcg cagcttgact 2280
aacagctacc ccgcttgagc agacatcacc 2310
<210> 5
<211> 1020
<212> DNA
<213> hph基因的核苷酸序列
<400> 5
atgcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc 60
tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga 120
gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat 180
gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa 240
ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac 300
ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc 360
gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt 420
caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg 480
caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg 540
ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac 600
aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc 660
ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg 720
gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc 780
cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat 840
ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg 900
actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta 960
gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag 1020
<210> 6
<211> 771
<212> DNA
<213> trp终止子的核苷酸序列
<400> 6
gatccactta acgttactga aatcatcaaa cagcttgacg aatctggata taagatcgtt 60
ggtgtcgatg tcagctccgg agttgagaca aatggtgttc aggatctcga taagatacgt 120
tcatttgtcc aagcagcaaa gagtgccttc tagtgattta atagctccat gtcaacaaga 180
ataaaacgcg tttcgggttt acctcttcca gatacagctc atctgcaatg cattaatgca 240
ttggacctcg caaccctagt acgcccttca ggctccggcg aagcagaaga atagcttagc 300
agagtctatt ttcattttcg ggagacgaga tcaagcagat caacggtcgt caagagacct 360
acgagactga ggaatccgct cttggctcca cgcgactata tatttgtctc taattgtact 420
ttgacatgct cctcttcttt actctgatag cttgactatg aaaattccgt caccagcccc 480
tgggttcgca aagataattg cactgtttct tccttgaact ctcaagccta caggacacac 540
attcatcgta ggtataaacc tcgaaaatca ttcctactaa gatgggtata caatagtaac 600
catggttgcc tagtgaatgc tccgtaacac ccaatacgcc ggccgaaact tttttacaac 660
tctcctatga gtcgtttacc cagaatgcac aggtacactt gtttagaggt aatccttctt 720
tctagaagtc ctcgtgtact gtgtaagcgc ccactccaca tctccactcg a 771

Claims (8)

1.一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌，其特征在于所述重组黑曲霉菌为将黑曲霉的低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌；所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的表达受Pgas启动子调控。
2.根据权利要求1所述的重组黑曲霉菌，其特征在于所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的重组黑曲霉菌，其特征在于所述Pgas启动子为低pH诱导型启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因表达框，其特征在于所述表达框包含Pgas启动子、低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因和trp终止子，按照Pgas-LGT1-trp的顺序排布。
5.根据权利要求4所述的基因表达框，其特征在于所述Pgas启动子的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述trp终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求1所述的重组黑曲霉菌，其特征在于所述重组黑曲霉菌的制备方法包括如下步骤：
(1)构建低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因表达框Pgas-LGT1-trp；
(2)构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp；
(3)将步骤(1)和步骤(2)制得的基因表达框转化黑曲霉，经抗性筛选和PCR鉴定获得所述重组黑曲霉菌。
7.根据权利要求6所述的重组黑曲霉菌，其特征在于所述步骤(2)中所述抗性基因表达框中gpdA为启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.根据权利要求6所述的重组黑曲霉菌，其特征在于所述步骤(2)中所述抗性表达框中hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
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