CN106755138A

CN106755138A - 一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法

Info

Publication number: CN106755138A
Application number: CN201710022534.8A
Authority: CN
Inventors: 金赛; 胡志杰; 彭艳红; 蒋小东; 孙福新; 苗茂栋; 周东姣; 李江华; 刘龙
Original assignee: Joint Ltd Energy Co Of Jiangsu China Telecom
Current assignee: Joint Ltd Energy Co Of Jiangsu China Telecom
Priority date: 2017-01-12
Filing date: 2017-01-12
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2037-01-12
Also published as: US10612007B2; CN106755138B; US20180195052A1

Abstract

本发明公开了一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法，所述方法将黑曲霉的GABA通路琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌株，利用重组黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的表达受Pgas启动子的调控。本发明方法实现了琥珀酸半醛脱氢酶SSD在黑曲霉中的表达，以增强GABA通路，从而加强TCA循环，促进柠檬酸的合成。

Description

一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种通过重组黑曲霉菌株提高柠檬酸产量的方法。

背景技术

柠檬酸具有广阔的应用前景和市场需求。出于经济层面考虑，一部分研究在现有菌种的基础上利用价格更低廉的粗糖原料以及农业废渣来生产柠檬酸，而另一部分研究则致力于改良菌种。生产菌种的改造和选育是柠檬酸发酵工业的基础，决定了发酵过程的成败和发酵产品工业化生产的价值。我国是柠檬酸生产大国，虽然柠檬酸转化率已经接近理论水平，产量可以达到170g·L^-1，但发酵周期偏长，工业生产发酵周期普遍为72h，工业发酵水平还有待提高，现在整个行业处于非常困难的状况，而根据Alvarez-Vasquez的模型，黑曲霉的柠檬酸生产仍然有巨大的提高空间，所以几十年来黑曲霉柠檬酸生产菌种的改良一直是关注的焦点。

目前，黑曲霉的柠檬酸工业生产菌株均通过诱变获得，大量研究依然集中于对工业生产菌株利用甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、Co-射线、紫外线等进行单一或复合诱变来选育更高产的菌株。近年来，黑曲霉基因组测序数据被公布，可以构建黑曲霉全面的代谢网络，利用代谢工程改造黑曲霉可以有目的地修饰细胞代谢途径，减少诱变育种筛选所面临的庞大工作量。基于现有转录组学数据，发现GABA通路对柠檬酸合成有巨大影响，一方面补充TCA循环所需的琥珀酸，另一方面提高细胞耐酸性，通过代谢改造加强GABA通路有望进一步提升柠檬酸产量。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法。本发明方法实现了琥珀酸半醛脱氢酶SSD在黑曲霉中的表达，以增强GABA通路，从而加强TCA循环，促进柠檬酸的合成。

本发明的技术方案如下：

一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法，其特征在于所述方法将黑曲霉的GABA通路琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌株，利用重组黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的表达受Pgas启动子的调控。

所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列上发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入而得到的序列。

所述Pgas启动子为低pH诱导型启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因表达框，所述表达框包括Pgas启动子、琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因和trp终止子，按照Pgas-SSD-trp的顺序排布。

所述Pgas启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述trp终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述重组黑曲霉菌株的构建方法为：

(1)构建琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因表达框Pgas-SSD-trp；

(2)构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp；

(3)将步骤(1)和步骤(2)制得的基因表达框转化到黑曲霉基因中，经抗性筛选和PCR鉴定获得所述重组黑曲霉菌。

所述抗性基因表达框gpdA-hph-trp中gpdA为启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述抗性基因表达框gpdA-hph-trp中hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明有益的技术效果在于：

本发明利用低pH诱导型启动子启动SSD蛋白在黑曲霉中表达，通过增强GABA通路，从而提高柠檬酸的产量。本发明方法，利用Aspergillus niger H915-1作为宿主，柠檬酸产量提高了10％；在42℃下发酵，产量提高45.2％，时间缩短10h；利用更偏酸的初始培养基，产量提高6.4％。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行具体描述。

实施例

(1)黑曲霉RNA的提取：将黑曲霉孢子接种到柠檬酸发酵培养基中，35℃250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司RNeasy Plant Mini Kit提取黑曲霉总RNA，用TAKARA公司PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser将RNA反转录成cDNA；

(2)黑曲霉基因组DNA的提取：将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基(3％麦芽提取物，0.5％胰蛋白胨)中，35℃ 250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasyPlant Mini Kit提取丝状真菌基因组；

(3)SSD蛋白表达框的构建：

①利用引物trp-F(序列如SEQ ID NO.7所示)和trp-R(序列如SEQ ID NO.8所示)以pAN7-1为模板扩增trp终止子(序列如SEQ ID NO.6)，序列上下游含Pst I和Hin dIII位点，连接到pMD19上测序，用这两个限制性内切酶酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19上，得到pUC19-trp；

②利用引物Pgas-F(序列如SEQ ID NO.9所示)和Pgas-R(序列如SEQ ID NO.10所示)从黑曲霉基因组中扩增Pgas启动子(序列如SEQ ID NO.3)，序列两头含Eco RI和Kpn I酶切位点，酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19-trp，得到pUC-Pgas-trp；

③利用引物gas-SSD-F(序列如SEQ ID NO.11所示)以及Trp-SSD-R(序列如SEQ IDNO.12所示)进行RT-PCR扩增得到SSD CDS的基因序列(序列如SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2)，序列两端分别含有pUC-Pgas-trp约20bp同源序列，利用Vazyme One StepClone Kit进行同源重组，形成gas-SSD-trp表达框，得到pGSH表达载体；

用到的引物如下：

trp-F：ctgcagGATCCACTTAAACGTTACTGAAATC

trp-R：aagcttCTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG

Pgas-F：gaattcCTGCTCTCTCTCTGCTCTCTTTCT

Pgas-R：ggtaccGTGAGGAGGTGAACGAAAGAAGAC

Gas-SSD-F：gttcacctcctcacGGTACCATGGGTTACACTGTCCCTCCGC

Trp-SSD-R：

TAACGTTTAAGTGGATCGGATCCCTACTGAAGAGGCTCAATTCC

(4)黑曲霉原生质体的制备和转化：

①按3×10⁵/ml的浓度接种黑曲霉孢子至PDA液体培养基，30℃、200r/min培养过夜，用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球；

②称取0.5g/L的lysing enzyme，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌，称取0.5g菌球，加入到酶解液中，37℃、100r/min震荡培养约3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μL STC，混匀，制得黑曲霉原生质；

③在100μL黑曲霉原生质体中加入10μL线性化核酸片段和330μL PEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mL PEG，室温放置10min，依次加入4mL STC和4mL于48℃预热的上层培养基，铺板于含有180mg/L潮霉素的下层培养基上。平板在35℃倒置培养4-7天，直至出现菌落，挑取单菌落继代。每个菌落进行3次单孢子继代。

对比例

(1)潮霉素抗性表达框的获取：通过引物gpd-F(序列如SEQ ID NO.13所示)和Ttrp-R-2(序列如SEQ ID NO.14所示)从质粒pAN7-1中扩增得到，该表达框序列包含PgpdA(序列如SEQ ID NO.4)、hph(序列如SEQ ID NO.5)和trp终止子(序列如SEQ ID NO.6)。

gpd-F：CAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG

Ttrp-R-2：CTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG

(2)黑曲霉原生质体的制备和转化：

①按3×10⁵/ml的浓度接种黑曲霉孢子至PDA液体培养基，30℃、200r/min培养过夜，再用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球；

②称0.5g/L的lysing enzyme，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌，称取0.5g菌球，加入到酶解液中，37℃、100r/min震荡培养3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μL STC，混匀，制得黑曲霉原生质体；

③在100μL黑曲霉原生质体中加入10μL线性化核酸片段和330μL PEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mL PEG，室温放置10min，依次加入4mL STC和4mL于48℃预热的上层培养基，铺板于含有180mg/L潮霉素的下层培养基上，平板在35℃倒置培养4-7天，直至出现菌落，挑取单菌落继代，每个菌落进行3次单孢子继代。

测试例：

(1)将实施例、对比例所得的黑曲霉、现有技术常用黑曲霉Co82、黑曲霉TN-A09分别接种于PDA培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L)上35℃生孢培养7天，刮取孢子，以10⁶/mL的接种量接种于种子培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量10％，总氮含量0.2％)，37℃、250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基，35℃、250r/min发酵72h，发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。测试数据如表1所示。

表1

	柠檬酸含量(g/100mL)	转化率(％)	发酵周期(小时)
				实施例	17.6	98	55
对比例	13.4	92	60
				黑曲霉Co82	13	92	60
黑曲霉TN-A09	12.5	92	60

注：柠檬酸含量检测采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差检测器和工作站)；色谱条件：HPX87H色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为5mM硫酸溶液，流量为0.6mL/min，进样量为10μL，柱温为30℃，210nm波长紫外光检测。

由表1可以看出，本发明实施例制得菌株发酵时间短，其柠檬酸产量和转化率，均优于对比例及现有黑曲霉菌种。

(2)将实施例、对比例所得黑曲霉、现有技术常用黑曲霉zjs-8分别接种于ME培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L)上35℃生孢培养7天，刮取孢子，以10⁶/mL的接种量接种于种子培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量10％，总氮含量0.2％)，37℃、250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基，42℃、250r/min发酵72h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。测试结果如表2所示。

表2

	柠檬酸含量(g/100mL)	转化率(％)	发酵周期(小时)
				实施例	16.5	97	60
对比例	10.7	66.8	70
				黑曲霉zjs-8	10	61.83	60

由表2数据可以看出，本发明实施例制得黑曲霉菌株具有很好的耐高温性，在温度提高的情况下柠檬酸产量和转化率仍高于现有的黑曲霉zjs-8。

(3)将实施例、对比例所得黑曲霉及黑曲霉Co82分别接种于ME培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L)上35℃生孢培养7天，刮取孢子，以10⁶/mL的接种量接种于种子培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量10％，总氮含量0.2％，pH 3.5)，37℃、250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基(pH 2.0)，42℃、250r/min发酵72h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。测试结果如表3所示。

表3

	柠檬酸含量(g/100mL)	转化率(％)	发酵周期(小时)
				实施例	18.3	99	60
对比例	14	93	60
				黑曲霉Co82	13	93	65

由表3可以看出，本发明实施例所得菌种在较为苛刻的酸性条件下，仍具有较好的柠檬酸产量和转化率，相对较短的发酵周期，本发明重组菌种具有更好的耐酸性。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1491

<212> DNA

<213> SSD基因的核苷酸序列

<400> 1

atgggttaca ctgtccctcc gctcaaagac caatccctct tcattcaaaa ggcatacgtc 60

aatggcgagt gggtagatgc tcagtccgga cagaccttcg aagtccacga ccctgcctcc 120

ggaaaactca tcggaacaag tcccgaattc tccgccgcag acaccgagaa ggccatccaa 180

gccgccaaag aagccttccc caaattccgc acaaccctgt cccgcgagcg cgcccgcatg 240

ctgcgcagat ggtaccagct catgatcgac aatgccgacg acctagccac cctgataacc 300

tgggaaaacg gaaagccgct caccgacgcc aaaggcgagg tgaactacgc ggccagcttc 360

ttcgaatggt tcagcgaaga agctccccgc atctacggtg acaccatccc atcctccgtc 420

cccggcaacc gggtcatgac cctgaagcaa cccgtcggcg tctgtggtct catcacaccc 480

tggaacttcc ccgccgccat gatcaccagg aagattggtc ctgccctcgc agccggctgc 540

accgtcgtcg caaagacccc cggtgaaact cccttcacag ccaacgccct cgccgagctg 600

gcccaccgcg ccggcatccc caagggcgtc gtcaacatcg tcaccgcatc ccaaaacacg 660

cccgaggtcg gcgaaaccat caccacccac cccgaggtcc gcaaggtctc cttcaccggc 720

tccaccaacg tcggtaagct cctcatgaag caatcctcgt cgaccatcaa aaaggtgtcc 780

tgggaactag gcggcaacgc ccccttcatc gtcttcgacg acgtcgagga cctcgacgct 840

gctgtcgccg gcgctgtggc ctccaaattc cgtagctctg gacagacctg cgtctgtgca 900

aaccggatct acgtgcagcg cggcatctac gatgaatttg ccaagcgctt cgcagagaag 960

gtcaagggct tcaagctggg tgctggcttc gaagaaggcg ttacccacgg tcctgttatt 1020

cacgaccgcg ccgtcaacaa ggtcgacgaa cacgtccgcg acgctgtatc caagggcgcg 1080

caggtcctga cgggtggtca gaaggccgct caccttggtc ctaacttcta cgatttgact 1140

gtcctcacgg agatgaacaa ggatatgctt gtcgcttcag aggagacatt cggccctgtc 1200

gcgggacttt tccccttcga gacggaacaa gaagttgtcg acctggctaa caaggctgag 1260

gttggtctgg cgggctactt cttcagcagt aatgttaagc gcatcttccg tgttgcggag 1320

gcgttggagg tcggtatggt gggtgttaac acggggctta ttagtgatgt tgcttcgccg 1380

ttcggtggtg tcaagcagag cggctttggc cgcgagggca gcaagtacgg tattgatgaa 1440

ttcttggtgg tcaagagtgt tacttttgga ggaattgagc ctcttcagta g 1491

<210> 2

<211> 496

<212> PRT

<213> SSD基因的氨基酸序列

<400> 2

Met Gly Tyr Thr Val Pro Pro Leu Lys Asp Gln Ser Leu Phe Ile Gln

1 5 10 15

Lys Ala Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Asp Ala Gln Ser Gly Gln Thr

20 25 30

Phe Glu Val His Asp Pro Ala Ser Gly Lys Leu Ile Gly Thr Ser Pro

35 40 45

Glu Phe Ser Ala Ala Asp Thr Glu Lys Ala Ile Gln Ala Ala Lys Glu

50 55 60

Ala Phe Pro Lys Phe Arg Thr Thr Leu Ser Arg Glu Arg Ala Arg Met

65 70 75 80

Leu Arg Arg Trp Tyr Gln Leu Met Ile Asp Asn Ala Asp Asp Leu Ala

85 90 95

Thr Leu Ile Thr Trp Glu Asn Gly Lys Pro Leu Thr Asp Ala Lys Gly

100 105 110

Glu Val Asn Tyr Ala Ala Ser Phe Phe Glu Trp Phe Ser Glu Glu Ala

115 120 125

Pro Arg Ile Tyr Gly Asp Thr Ile Pro Ser Ser Val Pro Gly Asn Arg

130 135 140

Val Met Thr Leu Lys Gln Pro Val Gly Val Cys Gly Leu Ile Thr Pro

145 150 155 160

Trp Asn Phe Pro Ala Ala Met Ile Thr Arg Lys Ile Gly Pro Ala Leu

165 170 175

Ala Ala Gly Cys Thr Val Val Ala Lys Thr Pro Gly Glu Thr Pro Phe

180 185 190

Thr Ala Asn Ala Leu Ala Glu Leu Ala His Arg Ala Gly Ile Pro Lys

195 200 205

Gly Val Val Asn Ile Val Thr Ala Ser Gln Asn Thr Pro Glu Val Gly

210 215 220

Glu Thr Ile Thr Thr His Pro Glu Val Arg Lys Val Ser Phe Thr Gly

225 230 235 240

Ser Thr Asn Val Gly Lys Leu Leu Met Lys Gln Ser Ser Ser Thr Ile

245 250 255

Lys Lys Val Ser Trp Glu Leu Gly Gly Asn Ala Pro Phe Ile Val Phe

260 265 270

Asp Asp Val Glu Asp Leu Asp Ala Ala Val Ala Gly Ala Val Ala Ser

275 280 285

Lys Phe Arg Ser Ser Gly Gln Thr Cys Val Cys Ala Asn Arg Ile Tyr

290 295 300

Val Gln Arg Gly Ile Tyr Asp Glu Phe Ala Lys Arg Phe Ala Glu Lys

305 310 315 320

Val Lys Gly Phe Lys Leu Gly Ala Gly Phe Glu Glu Gly Val Thr His

325 330 335

Gly Pro Val Ile His Asp Arg Ala Val Asn Lys Val Asp Glu His Val

340 345 350

Arg Asp Ala Val Ser Lys Gly Ala Gln Val Leu Thr Gly Gly Gln Lys

355 360 365

Ala Ala His Leu Gly Pro Asn Phe Tyr Asp Leu Thr Val Leu Thr Glu

370 375 380

Met Asn Lys Asp Met Leu Val Ala Ser Glu Glu Thr Phe Gly Pro Val

385 390 395 400

Ala Gly Leu Phe Pro Phe Glu Thr Glu Gln Glu Val Val Asp Leu Ala

405 410 415

Asn Lys Ala Glu Val Gly Leu Ala Gly Tyr Phe Phe Ser Ser Asn Val

420 425 430

Lys Arg Ile Phe Arg Val Ala Glu Ala Leu Glu Val Gly Met Val Gly

435 440 445

Val Asn Thr Gly Leu Ile Ser Asp Val Ala Ser Pro Phe Gly Gly Val

450 455 460

Lys Gln Ser Gly Phe Gly Arg Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ile Asp Glu

465 470 475 480

Phe Leu Val Val Lys Ser Val Thr Phe Gly Gly Ile Glu Pro Leu Gln

485 490 495

<210> 3

<211> 1493

<212> DNA

<213> Pgas启动子的核苷酸序列

<400> 3

ctgctctctc tctgctctct ttctgcgctc tctgtgtcgg cactaacccc gaatggggcg 60

ggtatcggca gtccgacgga tctccggggg ccgcacgtcc agcgccgatc gttactcaac 120

cgagcagagg agagagagca gtgagcagtg gtgtcaccga ccataaaaat gcttgcttct 180

gcccatccag ccatcagttg tccagtctgc tccattgtgt gccagtctcg cccccaaggc 240

cgcgcatctg aaaccaaccg gttgggtgaa atcagccggc gggtggcacc cgagcggcca 300

ctggctggga tcatcgcccg caacgcgtca acagcaatca aacgaaggat gcgaaattat 360

tcagcgggcg gttcctttcc aatttttccc cgttcctgtc agcatgtcta ctctatcata 420

ctgtaacatt attatattgt gattattttt attctgggtg atgtgtccac tggaccgcac 480

gtggaatgaa gattttcctt ccctcgggac gagaaaccat ggcgcagttg gtgttgtgtg 540

cgtgtgtgtg cgtgtcggtt gtccgaaaat cgccctaaac tccgaggcac gcaccatttg 600

ccattaattc ccttgcgatt gatttctgcc tgtccctgcg accctttgtg accctttgtg 660

accctttgac cctggattca ggggcttggt ggactcatag cgatggggat agggactttt 720

gacccttttg accctttgac cctcccattt tccctggcct aagtacgctg tagtcgtaat 780

tatagaaaga atcttgcgtg gactggggca aaaggggaac agaacttatc catgtccgag 840

cagcgatcgg ccagtcacca agccggctgg atccgagacc cgctacgtgg gaactcccaa 900

gagtcgttaa gcaaagccaa gagatcagcc aagatgtcgc tcacgagcct aattgctgga 960

ttgccatatc gcttgtcgtt gtaccatcgc gtaagatttt atcattgttt ctgggggctg 1020

tcagctagtc taaaacgtac tcctcaaacc agagaggctg atgatgctga tgatgggcct 1080

ccacccccca aattggtagc gccgttccat gagaggccca gtctctctct gcccgtcctc 1140

gaccattgtt tggcccagca ctgacacaac cttcaggggg ggccaatgga cgtattccgt 1200

aggcagcagg caaatgcggc cctaagaact ccccaactaa taagagtcca gactagcaaa 1260

ggttcgcctc gccggtctcc atctcttcct tcttagtcct cccatttcct ccctcccact 1320

tggtctctcg ctccagattt cctttcttct ttcatccatc ccatcttgta tccttttgct 1380

tagccttttt gtttggtttt cttcctctcg ttaaccacca cattcgctct atcttaatac 1440

aaaccaccca cactcgttct atagcatctg tcttctttcg ttcacctcct cac 1493

<210> 4

<211> 2310

<212> DNA

<213> gpdA启动子的核苷酸序列

<400> 4

caattccctt gtatctctac acacaggctc aaatcaataa gaagaacggt tcgtcttttt 60

cgtttatatc ttgcatcgtc ccaaagctat tggcgggata ttctgtttgc agttggctga 120

cttgaagtaa tctctgcaga tctttcgaca ctgaaatacg tcgagcctgc tccgcttgga 180

agcggcgagg agcctcgtcc tgtcacaact accaacatgg agtacgataa gggccagttc 240

cgccagctca ttaagagcca gttcatgggc gttggcatga tggccgtcat gcatctgtac 300

ttcaagtaca ccaaccctct tctgatccag tcgatcatcc cgctgaaggg cgctttcgaa 360

tcgaatctgg ttaagatcca cgtcttcggg aagccagcga ctggtgacct ccagcgtccc 420

tttaaggctg ccaacagctt tctcagccag ggccagccca agaccgacaa ggcctccctc 480

cagaacgccg agaagaactg gaggggtggt gtcaaggagg agtaagctcc ttattgaagt 540

cggaggacgg agcggtgtca agaggatatt cttcgctctg tattatagat aagatgatga 600

ggaattggag gtagcatagc ttcatttgga tttgctttcc aggctgagac tctagcttgg 660

agcatagagg gtccctttgg ctttcaatat tctcaagtat ctcgagtttg aacttattcc 720

cgtgaacctt ttattcacca atgagcattg gaatgaacat gaatctgagg actgcaatcg 780

ccatgaggtt ttcgaaatac atccggatgt cgaaggcttg gggcacctgc gttggttgaa 840

tttagaacgt ggcactattg atcatccgat agctctgcaa agggcgttgc acaatgcaag 900

tcaaacgttg ctagcagttc caggtggaat gttatgatga gcattgtatt aaatcaggag 960

atatagcatg atctctagtt agctcaccac aaaagtcaga cggcgtaacc aaaagtcaca 1020

caacacaagc tgtaaggatt tcggcacggc tacggaagac ggagaagccc accttcagtg 1080

gactcgagta ccatttaatt ctatttgtgt ttgatcgaga cctaatacag cccctacaac 1140

gaccatcaaa gtcgtatagc taccagtgag gaagtggact caaatcgact tcagcaacat 1200

ctcctggata aactttaagc ctaaactata cagaataaga tggtggagag cttataccga 1260

gctcccaaat ctgtccagat catggttgac cggtgcctgg atcttcctat agaatcatcc 1320

ttattcgttg acctagctga ttctggagtg acccagaggg tcatgacttg agcctaaaat 1380

ccgccgcctc caccatttgt agaaaaatgt gacgaactcg tgagctctgt acagtgaccg 1440

gtgactcttt ctggcatgcg gagagacgga cggacgcaga gagaagggct gagtaataag 1500

cgccactgcg ccagacagct ctggcggctc tgaggtgcag tggatgatta ttaatccggg 1560

accggccgcc cctccgcccc gaagtggaaa ggctggtgtg cccctcgttg accaagaatc 1620

tattgcatca tcggagaata tggagcttca tcgaatcacc ggcagtaagc gaaggagaat 1680

gtgaagccag gggtgtatag ccgtcggcga aatagcatgc cattaaccta ggtacagaag 1740

tccaattgct tccgatctgg taaaagattc acgagatagt accttctccg aagtaggtag 1800

agcgagtacc cggcgcgtaa gctccctaat tggcccatcc ggcatctgta gggcgtccaa 1860

atatcgtgcc tctcctgctt tgcccggtgt atgaaaccgg aaaggccgct caggagctgg 1920

ccagcggcgc agaccgggaa cacaagctgg cagtcgaccc atccggtgct ctgcactcga 1980

cctgctgagg tccctcagtc cctggtaggc agctttgccc cgtctgtccg cccggtgtgt 2040

cggcggggtt gacaaggtcg ttgcgtcagt ccaacatttg ttgccatatt ttcctgctct 2100

ccccaccagc tgctcttttc ttttctcttt cttttcccat cttcagtata ttcatcttcc 2160

catccaagaa cctttatttc ccctaagtaa gtactttgct acatccatac tccatccttc 2220

ccatccctta ttcctttgaa cctttcagtt cgagctttcc cacttcatcg cagcttgact 2280

aacagctacc ccgcttgagc agacatcacc 2310

<210> 5

<211> 1020

<212> DNA

<213> hph基因的核苷酸序列

<400> 5

atgcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc 60

tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga 120

gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat 180

gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa 240

ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac 300

ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc 360

gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt 420

caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg 480

caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg 540

ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac 600

aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc 660

ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg 720

gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc 780

cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat 840

ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg 900

actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta 960

gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag 1020

<210> 6

<211> 771

<212> DNA

<213> trp终止子的核苷酸序列

<400> 6

gatccactta acgttactga aatcatcaaa cagcttgacg aatctggata taagatcgtt 60

ggtgtcgatg tcagctccgg agttgagaca aatggtgttc aggatctcga taagatacgt 120

tcatttgtcc aagcagcaaa gagtgccttc tagtgattta atagctccat gtcaacaaga 180

ataaaacgcg tttcgggttt acctcttcca gatacagctc atctgcaatg cattaatgca 240

ttggacctcg caaccctagt acgcccttca ggctccggcg aagcagaaga atagcttagc 300

agagtctatt ttcattttcg ggagacgaga tcaagcagat caacggtcgt caagagacct 360

acgagactga ggaatccgct cttggctcca cgcgactata tatttgtctc taattgtact 420

ttgacatgct cctcttcttt actctgatag cttgactatg aaaattccgt caccagcccc 480

tgggttcgca aagataattg cactgtttct tccttgaact ctcaagccta caggacacac 540

attcatcgta ggtataaacc tcgaaaatca ttcctactaa gatgggtata caatagtaac 600

catggttgcc tagtgaatgc tccgtaacac ccaatacgcc ggccgaaact tttttacaac 660

tctcctatga gtcgtttacc cagaatgcac aggtacactt gtttagaggt aatccttctt 720

tctagaagtc ctcgtgtact gtgtaagcgc ccactccaca tctccactcg a 771

Claims

1.一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法，其特征在于所述方法将黑曲霉的GABA通路琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌株，利用重组黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的表达受Pgas启动子的调控。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列上发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入而得到的序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述Pgas启动子为低pH诱导型启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因表达框，其特征在于所述表达框包括Pgas启动子、琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因和trp终止子，按照Pgas-SSD-trp的顺序排布。

6.根据权利要求5所述的表达框，其特征在于所述Pgas启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述trp终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组黑曲霉菌株的构建方法为：

(1)构建琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因表达框Pgas-SSD-trp；

(2)构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述抗性基因表达框gpdA-hph-trp中gpdA为启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述抗性基因表达框gpdA-hph-trp中hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。