CN114276952B - 一种提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法，属于芽胞杆菌芽胞的制备领域。本发明发现柠檬酸具有调控芽胞形成效率的新功能，柠檬酸能缓解细胞的氧化胁迫，并可使芽胞形成过程中阻遏spo0A表达的abrB基因的表达量大幅下降。本发明方法为在发酵培养地衣芽胞杆菌的过程中加入柠檬酸，将柠檬酸作为代谢调控因子来使用，显著促进了芽胞的形成效率。本发明具有补料成分更简单、明确、原料易购、成本低、补加方法明确、操作可控性高、适用于发酵生产等优点。

Description

一种提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法

技术领域

本发明属于芽胞杆菌芽胞的制备领域，具体涉及一种提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法。

背景技术

地衣芽胞杆菌是革兰氏阳性细菌，分泌能力强大，生长快，是重要的工业微生物菌种。芽胞的形成受发酵环境影响，常用的提高芽胞率方法可通过培养基优化和调控温度、通风量等来实现，如：发明专利CN102533579A公开了一种产芽孢培养基及其优化过程与应用，优化的培养基配方：葡萄糖0.5～1.0％，玉米粉0.5～3％，麸皮0.1～1％，黄豆饼粉0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，无水碳酸钙0.05～0.3％，在pH6.5、罐压0.05～0.06Mpa、220～250r/min，35℃～37℃培养。发明专利CN106947715A公开了一种高活菌数、高芽胞形成率的发酵方法，在34-37℃培养4h，35-40℃培养8h，37-40℃至结束；控制通风量0.3-0.6vvm发酵8h，控制通风量0.4-1.0vvm至结束；发酵pH6.0-7.0。CN112831437A公开了一种芽胞杆菌高产吲哚乙酸、高芽胞形成率的发酵方法，具体为发酵期中添加葡萄糖维持其浓度在1％、同时维持pH7.5～8.5直至发酵结束。发酵结束后将发酵液加热至50～80℃，保持15～60min，冷却至室温。

出于有机氮源成分对芽胞杆菌生长代谢影响的复杂性、不确定性和未知性以及发酵条件等对芽胞率的影响，普遍常用或考虑的技术手段多采用有机氮源和葡萄糖来笼统地满足芽胞生成的氮源和碳源需求。但是，这些有机氮源成分复杂、氮源和碳源用量较大，使得生产成本较高。

需氧微生物生长代谢过程会产生超氧阴离子、过氧化氢等氧自由基(ROS)，细胞需要表达一些基因/酶来进行氧化应激，如表达yqjM(编码黄素氧化还原酶)、sodA(编码超氧化物歧化酶)等，而且其表达量与ROS的氧化胁迫呈正相关性。另外，芽胞的形成受到其代谢网络的严密调控，如：调控网络中AbrB通过对Spo0A磷酸传递过程的抑制和阻遏spo0A的表达来抑制芽胞形成。虽然现有技术通过发酵基础培养基调整、控制pH以及葡萄糖补加等可以控制芽胞生成效率，但是显然的，若能基于芽胞形成和氧化应激代谢网络特征，从调控细胞Spo0A代谢网络和缓解氧化胁迫的角度进行优化，则可能使芽胞生成效率进一步地提高。

柠檬酸是微生物代谢重要的产物之一，作为络合/螯合剂广泛应用于有色金属工业；作为酸味剂、增溶剂、风味增进剂、调色剂等用于食品工业。柠檬酸还可以调控中心代谢途径关键酶如：抑制糖酵解途径中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性、促进磷酸戊糖途径6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力(微生物学报，2004(5):627-630)。另外，柠檬酸本身具有一定抗菌作用，还被用作食品防腐剂列入食品添加剂名录，而且柠檬酸与过氧化氢联合使用，可以对杀灭细菌及其芽孢起到显著的协同增效作用(柠檬酸对低浓度过氧化氢杀灭细菌芽孢增效作用的研究，袁国刚，中华预防医学会消毒分会学术年会，2014)。

但是，关于柠檬酸对芽胞形成的作用，或者是柠檬酸在芽胞形成中是否具有新的功能？并没有相关报道。

发明内容

本发明发现了柠檬酸具有调控芽胞形成效率的新功能：柠檬酸能够使细胞氧化应激相关的基因表达量不同程度的下调，有效缓解了细胞的氧化胁迫。进一步研究发现：柠檬酸能够使基因abrB的表达量大幅下调，说明芽胞形成中的磷酸传递过程得到增强(调控蛋白Spo0A的磷酸化水平增强)，进而显著促进了芽胞生成。

本发明的目的在于提供一种提高地衣芽胞杆菌的芽胞形成效率的新方法，其实质性特征是：不将柠檬酸作为常规意义上的络合/螯合剂(有色金属工业)、酸味剂、增溶剂、风味增进剂(食品工业)、食品添加剂-防腐剂、过氧化氢杀灭芽胞增效剂等来使用，而是将柠檬酸作为代谢调控因子来使用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

柠檬酸在缓解微生物氧化胁迫中的应用，所述的微生物包括地衣芽胞杆菌。

柠檬酸在提高芽胞杆菌芽胞形成效率中的应用。所述的芽孢杆菌包括地衣芽胞杆菌。

一种提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法，为在发酵培养地衣芽胞杆菌的过程中加入柠檬酸。

进一步地，所述的提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法，为在地衣芽胞杆菌发酵15h时，开始无菌流加柠檬酸溶液至发酵结束前4-6h，柠檬酸流加质量为发酵液质量的0.5-1.5％。

更进一步地，所述的提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法，包括以下步骤：(1)地衣芽胞杆菌种子扩大培养；(2)将种子接种到发酵罐中进行发酵培养，在发酵15h时，开始无菌流加柠檬酸溶液至发酵结束前4-6h，柠檬酸质量占发酵液质量的0.5-1.5％。地衣芽胞杆菌种子扩大培养和发酵培养按常规操作进行。

本发明方法具有材料易购、操作可控性高、适用于发酵生产的特点。

本发明在地衣芽孢杆菌的发酵过程中加入柠檬酸，使细胞氧化应激相关的基因表达量不同程度的下调，增强了细胞的氧化应激效能。同时芽胞形成过程中阻遏spo0A表达的基因abrB的表达量也大幅下降，这些调控结果显著促进了芽胞的形成效率，产生了极好的技术效果。与现有技术相比本发明具有补料成分更简单、明确、原料易购、成本低、补加方法明确、操作可控性高、适用于发酵生产等优点。

附图说明

图1是柠檬酸对地衣芽胞杆菌yqjM、sodA、abrB基因表达的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)发酵培养基(g/L)：玉米淀粉25，豆粕30，葡萄糖10，蛋白胨5，K₂HPO₄ 2。试管斜面培养基以及茄子瓶斜面培养基：LB培养基，琼脂2％。种子摇瓶培养基(g/L)：玉米淀粉15，豆粕15，葡萄糖5，蛋白胨5，K₂HPO₄ 2。

(2)种子液扩大培养：将-80℃冰箱的甘油管保存的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌种转接试管斜面，37℃培养36h活化。将活化后的菌种转接至新鲜茄子瓶斜面，37℃培养24h，再向茄子瓶中加入50mL无菌水，制备菌悬液后接种种子摇瓶，37℃、200rpm培养24h，合瓶备用。

(3)发酵培养：发酵培养基体积按发酵罐容积的70％(50L)计，121℃，蒸汽灭菌30min。发酵条件：将种子液按10％的接种量接种，在35℃、转速500r/min、通风量1.0m³/h下培养至发酵结束。

对地衣芽胞杆菌发酵过程中的细菌数和芽孢数进行检测。发酵培养24h细胞数为178×10⁸CFU/mL、芽胞数为133×10⁸CFU/mL，芽胞率为74.7％。30h细胞数达到峰值(296×10⁸CFU/mL)，此时芽胞率仅有28％。30h后细胞自溶，细胞数显著下降。

实施例2

(1)培养基：同实施例1。

(2)种子液扩大培养：同实施例1。

(3)发酵培养：发酵条件同实施例1，发酵15h开始补入柠檬酸溶液，使其在发酵液中最终的质量浓度为0.5％。发酵培养24h细胞数为180×10⁸CFU/mL，与实施例1接近；芽胞数为145×10⁸CFU/mL，比实施例1提高9％。30h细胞数为287×10⁸CFU/mL，与实施例1接近；但芽胞数为174×10⁸CFU/mL，芽胞率达到60.6％，比实施例1提高了116％。

实施例3

(1)培养基：同实施例1。

(2)种子液扩大培养：同实施例1。

(3)发酵培养：同实施例1，发酵15h开始补入柠檬酸溶液，使其在发酵液中最终的质量浓度1.5％。发酵培养24h细胞数为225×10⁸CFU/mL，较实施例1提高26.4％；30h细胞数达到307×10⁸CFU/mL，与实施例1接近。30h的芽胞数为289×10⁸CFU/mL，芽胞率94.1％，较实施例1-2分别提高了236％和55.3％。

同时，通过荧光定量PCR检测实施例3和实施例1中发酵27h时细胞中相关基因的表达情况，各基因所用引物序列如表1所示，基因表达差异结果如图1所示。

表1扩增引物列表

出人意料的是：与对照(实施例1)相比，细胞氧化应激相关的基因yqjM(编码黄素氧化还原酶)和sodA(编码超氧化物歧化酶)表达量分别下调10％和41％，说明在加入柠檬酸的条件下氧化胁迫得到有效缓解(图1)。同时芽胞形成过程中阻遏spo0A表达和抑制磷酸传递的基因abrB，其表达量也大幅下降60％(图1)，促进了芽孢形成过程中的磷酸传递效率。这些令人意外的调控结果进而显著促进了芽胞的形成效率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.柠檬酸在缓解微生物氧化胁迫中的应用，其特征在于：所述的应用为使细胞氧化应激相关的基因yqjM和sodA表达量下调，基因yqjM编码黄素氧化还原酶，基因sodA编码超氧化物歧化酶；所述的微生物为地衣芽胞杆菌。