CN107904197A - 一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌 - Google Patents

一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种显著提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸水平的方法及工程菌。本发明采用分子生物学技术，通过基因工程改造增加PEP与E4P合成水平，并切断莽草酸下游代谢途径，提高地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)中莽草酸的产量。本发明构建了地衣芽胞杆菌产莽草酸工程菌WX‑02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY‑aroD。该菌株在优化培养基和培养条件下可以显著提高莽草酸的合成，终产量高达16.78g/L。本发明通过敲除pyk，aroK与pgi和过表达aroD基因的组合以及发酵工艺优化实现了地衣芽胞杆菌高产莽草酸。

Description

一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物代谢工程技术领域，具体涉及一种提高地衣芽 胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌。
背景技术
莽草酸作为一种传统中药具有消炎、镇痛和抗血栓的作用，是许多抗癌药物 的中间体，也是合成预防和治疗禽流感药物神经氨酸酶抑制剂“达菲”的关键 原材料。莽草酸途径仅存在于植物和微生物中，是细菌代谢的支路途径，但其部 分产物是人体所必需的，例如L-苯丙氨酸是人体和动物不能靠自身合成的必需 氨基酸，所以其中间体及产物具有很好的应用前景。
据文献报道，利用细菌生产莽草酸的研究主要集中在E.coli。然而革兰氏 阴性菌产生的脂多糖具有毒性，因此生产的莽草酸需要进行工艺复杂的脱毒处 理。而本发明方法选择公认安全(GRAS)的革兰氏阳性菌株地衣芽胞菌B.lich eniformis WX-02作为莽草酸的生产菌株，该菌株具有生产莽草酸的潜力，并且 具有安全生产能力，能大大降低生产莽草酸的经济成本。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种显著提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方 法及工程菌，以地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02为对象。敲除了PEP 节点处的关键酶丙酮酸激酶的基因，构建pyk缺陷菌株。另一方面以积累莽草酸 为目的，在WX-02Δpyk中敲除莽草酸激酶编码基因aroK，切断莽草酸后续反应， 使中间产物莽草酸得到有效积累。再者，在WX-02ΔpykΔaroK基础上敲除6-磷 酸葡萄糖异构酶基因pgi，增加莽草酸的前体物E4P的含量。在此菌株基础上通 过过表达莽草酸-5-脱氢酶基因aroD解除莽草酸反馈抑制而积累莽草酸。
本发明第一方面提供了一种高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，所述工程 菌是将地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的丙酮酸激酶基因pyk、莽草 酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除，构建 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株，再将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168的P43 启动子、地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD 和淀粉酶基因amyL的终止子连接至表达载体得到重组质粒，再将重组质粒转化 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株得到高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。
积累莽草酸代谢途径中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)， 过表达莽草酸途径基因，致使莽草酸合成的有效碳通量增加，同时，敲除掉丙酮 酸激酶基因pyk，莽草酸下游代谢的第一个基因是莽草酸激酶基因aroK，以及糖 酵解途径中的重要基因6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，过表达莽草酸脱氢酶基因 aroD，增加地衣芽胞杆菌中莽草酸的产量。
具体的，所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的丙酮酸激酶基因pyk序列如SEQ ID NO：1所示；所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02 的莽草酸激酶编码基因aroK序列如SEQ ID NO：2所示；所述地衣芽胞杆菌(B. licheniformis)WX-02的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi序列如SEQ ID NO：3所示； 所述枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)168的P43启动子序列如SEQ ID NO：4 所示；所述地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD 序列如SEQ ID NO：5所示；所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的 淀粉酶基因amyL的终止子序列如SEQ ID NO：6所示。
所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02保存于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M208065， 保藏日期为2008年4月28日。
优选的，所述表达载体为pHY300PLK。
本发明第二方面提供了上述高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建方 法，步骤包括：
S1、将地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02敲除丙酮酸激酶基因pyk、莽草酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，构建 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株；
S2、以枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168的总DNA为模板，采用PCR 的方法扩增出P43启动子；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR 的方法扩增出莽草酸脱氢酶基因aroD；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模 板，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL的终止子序列；
S3、将P43启动子、莽草酸脱氢酶基因aroD及淀粉酶基因amyL的终止子 片段通过SOE-PCR的方法连到一起，然后通过限制性内切酶连接到表达载体 pHY300PLK中，构建重组质粒pHY-aroD；
S4、将pHY-aroD转化至地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi，得高产莽草 酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。
优选的，步骤S1中，敲除丙酮酸激酶基因pyk的方法包括：以地衣芽胞杆 菌(Bacillus licheniformis)WX-02基因组DNA为模板，用引物扩增丙酮酸激酶基 因pyk敲除的上下游同源臂，并连接到质粒构建重组表达质粒T2Δpyk，将T2Δpyk 电转到地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02中后进行单交换，验证正确后 进行双交换传代筛选菌株,pyk缺失菌株构建成功并命名为WX-02Δpyk。
更加优选的，步骤S1中，敲除莽草酸激酶编码基因aroK的方法包括：以地 衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02基因组DNA为模板，用引物扩增莽草 酸激酶编码基因aroK敲除的上下游同源臂，并连接到质粒构建重组表达质粒 T2ΔaroK，将T2ΔaroK电转到WX-02Δpyk中后进行单交换，验证正确后进行双 交换传代筛选菌株,pyk、aroK缺失菌株构建成功并命名为WX-02ΔpykΔaroK。
进一步优选的，步骤S1中，敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的方法包括： 以地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02基因组DNA为模板，用引物扩增 6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除的上下游同源臂，并连接到质粒构建重组表达 质粒T2Δpgi，将T2Δpgi电转到WX-02ΔpykΔaroK中后进行单交换，验证正确后 进行双交换传代筛选菌株,pyk、aroK、pgi缺失菌株构建成功并命名为 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi。
本发明第三方面提供了一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法，步骤 包括：将上述高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD进行种子培养，再进行发酵培养，所述发酵培 养基为：葡萄糖10-80g/L，柠檬酸钠2-20g/L，酵母粉1-25g/L，K2HPO4 1-10g/L， KH2PO4 1-10g/L，MgSO4 0.1-5g/L，MnCl2 0.001-0.01g/L，CaCl2 0.001-0.01g/L， FeSO4.0.001-0.01g/L，pH 7.2。
优选的，所述发酵培养的条件为：发酵温度为36～38℃，摇床转速220～260 r/min，发酵周期94～98h，250mL三角瓶中装液量30-50mL。
具体的，所述种子培养采用的培养基选用LB培养基：10g/L蛋白胨；5g/L 酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂粉15g/L。
种子培养条件为：培养温度为37℃，250mL三角瓶中装液量为50mL，摇 床转速180r/min，培养时间为10h。
本发明的有益效果是：采用本发明通过构建高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程 菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD，显著提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸 的能力，该工程菌在优化培养基中发酵后莽草酸产量显著提高，检测工程菌 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD发酵终点的莽草酸产量，其莽草酸产量高达 16.78g/L。
附图说明
图1为T2Δpyk-spc的PCR电泳检测凝胶图，其中，M:DL5000Marker(5000 bp,3000bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道1：转 化子菌落PCR(以pyk-A-F、pyk-B-R为引物)；
图2为T2Δpyk-spc质粒电泳检测凝胶图，其中，M:Supercoiled DNA LadderMarker(2087bp,3049bp,3997bp,5026bp,6133bp,8023bp,10085bp,11849 bp)；泳道1：质粒T2Δpyk-spc(6.3kb)；
图3为pyk缺失菌株的PCR鉴定电泳检测凝胶图，其中，M:DL5000Marker (5000bp,3000bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳 道1:WX-02Δpyk菌株以pyk-F/pyk-R为引物的PCR产物(2.2kb)；泳道2: WX-02菌株以pyk-F/pyk-R为引物的PCR产物(3.0kb)；
图4为重组质粒T2ΔaroK的PCR电泳检测凝胶图，其中，M:DL2000Marker (2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道1：转化子菌落PCR(以 aroK-A-F和aroK-B-R为引物)；
图5为重组质粒T2ΔaroK酶切鉴定，电泳检测凝胶图，其中，M:DL5000 Marker(5000bp,3000bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100 bp)；泳道1、2：T2(2)-ori用BamH I和Spe I酶切/T2ΔaroK用BamH I和Spe I 酶切；
图6为aroK缺失菌株的PCR鉴定电泳检测凝胶图，其中，M:DL5000Marker (5000bp,3000bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道1:WX-02ΔaroK PCR产物(aroK-F/aroK-R)(1.5kb)；泳道2:WX-02ΔpykΔaroK PCR产物(aroK-F/aroK-R)(1.5kb)；泳道3:WX-02ΔaroK PCR产物 (aroK-A-F/aroK-B-R)(1.0kb)；泳道4:WX-02ΔpykΔaroKPCR产物 (aroK-A-F/aroK-B-R)(1.0kb)；泳道5:WX-02ΔaroK PCR产物(pyk-F/pyk-R) (3.0kb)；泳道6:WX-02ΔpykΔaroK PCR产物(pyk-F/pyk-R)(2.2kb)；
图7为重组质粒T2Δpgi的PCR电泳检测凝胶图，其中，M:DL5000Marker (5000bp,3000bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道 1-3：转化子菌落PCR(以T2-F/T2-R为引物)(1.4kb)；
图8为pgi缺失菌株的PCR鉴定电泳检测凝胶图，其中，M:DL5000Marker (5000bp,3000bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；泳道 1:WX-02ΔpykΔaroKΔpgi PCR产物(pgi-F/pgi-R)(1.5kb)；
图9为aroD基因过表达载体质粒图谱，以表达质粒pHY300PLK为原始质 粒，在其基础上加入来源于枯草芽胞杆菌168的启动子P43，来源于地衣芽胞杆 菌WX-02中莽草酸脱氢酶基因aroD及来源于地衣芽胞杆菌WX-02中淀粉酶基 因amyL的终止子，构建了重组质粒pHY-aroD；
图10为重组载体转化地衣芽胞杆菌WX-02菌落PCR验证图，其中，泳道 1为用验证引物pHY-F/pHY-R进行菌落PCR验证条带(1470bp)，泳道M为 5K marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp， 750bp，500bp，250bp，100bp)；
图11为地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroK，WX-02ΔpykΔaroKΔpgi， WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD菌株在优化培养基中发酵到24h,48h,72h,96h测 定发酵液OD600值；
图12为地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroK，WX-02ΔpykΔaroKΔpgi， WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD菌株在优化培养基中发酵到24h,48h,72h,96h时 测定的发酵液中莽草酸的含量。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明提供的一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽 草酸的方法及工程菌予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解 释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的实验材料，如涉及到的表达载体、各种实验试剂，如无特殊说明均可市场购 买得到。
实施例1
本实施例提供了一种高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，所述工程菌是将 地衣芽胞杆菌(Bacillu.licheniformis)WX-02的丙酮酸激酶基因pyk(SEQ ID NO： 1)、莽草酸激酶编码基因aroK(SEQ ID NO：2)，和6-磷酸葡萄糖异构酶基 因pgi(SEQ ID NO：3)敲除，构建WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株，再将枯草芽胞 杆菌(Bacillus subtilis)168的P43启动子(SEQ ID NO：4)、地衣芽胞杆菌(B. licheniformis)WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD(SEQ ID NO：5)和淀粉酶基因 amyL的终止子(SEQ ID NO：6)连接至表达载体pHY300PLK(市场购得)得 到重组质粒pHY-aroD，再将重组质粒转化WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株得到高产 莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。
上述高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD 的构建方法如下：
1、地衣芽胞杆菌WX-02敲除质粒T2Δpyk,T2ΔaroK,T2Δpgi及菌株 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi的构建。
(1)地衣芽胞杆菌WX-02Δpyk工程菌的构建
根据地衣芽胞杆菌WX-02pyk基因上下游序列设计引物。根据NCBI上公布 的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列，找到丙酮酸激酶基因pyk序列，采用PCR 的方法扩增pyk敲除的上游同源臂和下游同源臂，引物如下：
pyk-A-F：GACTAGTCTAAATACCGTTATCGACGCCATCG
pyk-A-R：ATTTGTTCGTATGTATTCAAATTGCTTCCTCCTCGGGTTTTACAC
pyk-B-F：CGCCTCTTTTCTTTTCCAGATCGCTTATTGAAGAAGAAGG
pyk-B-R：CCGAGCTCCATGCCCCCTATGAACATAC
用上述引物扩增pyk敲除的上下游同源臂，并连接到载体上构建重组表达质 粒，本实施例中采用E.coli-B.licheniformis温敏型穿梭质粒T2(2)-ori，所述 T2(2)-ori是由载体194-ori(可市场购买得到)再加上卡那抗性基因合成得到， 构建重组表达质粒为T2Δpyk。将T2Δpyk电转到WX-02中后进行单交换，验证 正确后进行双交换传代筛选菌株,pyk缺失菌株构建成功，此菌株命名为B. licheniformis WX-02Δpyk。
(2)地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroK工程菌的构建
根据NCBI上公布的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列，找到莽草酸激酶基 因aroK序列，采用PCR的方法扩增pyk敲除的上游同源臂和下游同源臂，再进 行SOE-PCR。引物如下：
aroK-A-F：CGGGATCCCACAAAGGCAATGTAAAAGCGAGAG
aroK-A-R：GACCAAGCTTTAGCATCTCCACAATTCCAGCTTCTACTCCTCCCT GC
aroK-B-F：GCAGGGAGGAGTAGAAGCTGGAATTGTGGAGATGCTAAAGCTT GGTC
aroK-B-R：GGACTAGT TCGTCAATCGGCAGTTCAATCAC
T2ΔaroK的构建中，SOE-PCR产物和质粒T2(2)-ori双酶切采用的酶是BamH I和Spe I，其他方法和T2Δpyk相同。将敲除载体电转入WX-02Δpyk中，进行单 双交换，构建WX-02ΔpykΔaroK菌株。
(3)地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi工程菌的构建
根据NCBI上公布的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列，找到莽草酸激酶基 因pgi序列，采用PCR的方法扩增pgi敲除的上游同源臂和下游同源臂，再进行 SOE-PCR。引物如下：
pgi-A-F：GATCTTTTCTACGAGCTC TCGTCTTGCCGATTATGA
pgi-A-R：TGACGCCGAGCAAGTATCCGTGGTATGGTGGGCGACTT
pgi-B-F：AAGTCGCCCACCATACCACGGATACTTGCTCGGCGTCA
pgi-B-R：GGATCCACTAGTTCTAGAATGACCGAAGGCGAAATA
T2Δpgi的构建中，SOE-PCR产物和质粒T2(2)-ori双酶切采用的酶是BamH I和SacI，其他方法和T2Δpyk相同。将敲除载体电转入WX-02ΔpykΔaroK中， 进行单双交换，构建WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株。
2、地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD高产莽草酸工程菌的构建
(1)重组载体中表达元件的克隆
根据NCBI公布的枯草芽胞杆菌168的基因组序列，采用PCR的方法扩增 出启动子P43的序列(序列见SEQ ID NO:4)。引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGC
P43-R：CCATTTGATCTTTTTTCAATTCATGTGTACATTCCTCTC
根据NCBI上公布的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列，采用PCR的方法扩 增出莽草酸脱氢酶基因aroD序列(序列见SEQ ID NO:5)。引物如下：
aroD-F：GTGCTAAGGGGAGAGAGTT
aroD-R：TTAGCATGATTTTCCTCCT
根据NCBI上公布的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列(序列见SEQ ID NO: 6)，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL终止子的序列。引物如下：
TamyL-F：CATTGGTGGCCGCTTTAAAAGAGCAGAGAGGACGGATTTCC
TamyL-R：GCTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTGG
(2)以P43为启动子强化表达aroD基因的过表达载体的构建
以实验室保存的表达载体pHY300PLK为初始载体构建aroD基因过表达载 体。先将P43启动子、莽草酸脱氢酶基因aroD及淀粉酶基因amyL的终止子片 段通过SOE-PCR的方法连到一起。通过限制性内切酶连接到pHY300PLK中， 构建重组质粒pHY-aroD。
(3)地衣芽胞杆菌高产莽草酸工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD 的构建
将构建好的过表达载体pHY-aroD转化至地衣芽胞杆菌 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi。待长出转化子后挑菌进行菌落PCR验证和抽质粒验证， 验证正确后保存菌种。验证引物为pHY-F/R。所得菌种即为地衣芽胞杆菌高产莽 草酸工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。
实施例2
本实施例提供采用实施例1得到的地衣芽胞杆菌高产莽草酸工程菌株 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD进行发酵产莽草酸的实验，并且，作为平行对 照，同时在相同条件下发酵WX-02ΔpykΔaroK与WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株。
所得发酵液中莽草酸测定方法和定量方法如下：
取2.0mL发酵液，在12000r/min离心5min，取离心上清液。经0.22μm 微孔滤膜过滤。用HPLC法测定滤液中莽草酸浓度。HPLC测定采用Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱，4.6mmID×150mm(5μm)。流动相：5mmol/L H2SO4， pH2.0；流速：0.5mL/min；柱温35℃；紫外检测器波长：210nm；进样量1.0μL。 流速0.5mL/min。以莽草酸标准品作为对照，对发酵液产物进行定量分析。
各菌株发酵实验过程及结果如下：
(1)地衣芽胞杆菌WX-02Δpyk在基础发酵培养基的发酵实验
挑取WX-02Δpyk菌落接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养 过夜。再以2％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时， 以1％的接种量接种到预先准备好的莽草酸基础发酵培养基中，37℃，240r/min， 发酵时间96h。在莽草酸发酵培养基中，菌株WX-02Δpyk的莽草酸最高产量达 到1.23g/L。
(2)地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroK在基础发酵培养基的发酵实验
挑取WX-02ΔpykΔaroK菌落接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡 培养过夜。再以2％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为 1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的莽草酸基础发酵培养基中，37℃， 240r/min，发酵时间96h。在莽草酸发酵培养基中，菌株WX-02ΔpykΔaroK的莽 草酸最高产量达到2.15g/L。
(3)地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi在基础发酵培养基的发酵实验
挑取WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌落接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min 振荡培养过夜。再以2％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的莽草酸基础发酵培养基中，37℃， 240r/min，发酵时间96h。在莽草酸发酵培养基中，菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi 的莽草酸最高产量达到3.12g/L。
实施例3
本实施例对发酵培养基进行了优化，并进行了地衣芽胞杆菌 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD在优化发酵培养基中的发酵实验。
(1)地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD在不同酵母粉浓度下 莽草酸的发酵
挑取菌落WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基 中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的酵母粉浓度为 0-10g/L的优化培养基中，37℃，240r/min，发酵时间96h。在酵母粉浓度为2g/L 时，地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi的莽草酸最高产量达到8.25g/L。
(2)地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD在不同葡萄糖浓度下 莽草酸的发酵
挑取菌落WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基 中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的葡萄糖浓度为 20-70g/L的优化培养基中，37℃，240r/min，发酵时间96h。在葡萄糖浓度为 50g/L时，地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD的莽草酸最高产量达 到12.88g/L。
(3)地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD在不同醋酸钠浓度下 莽草酸的发酵
挑取菌落WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD接种于5mL LB培养基中，37℃，240r/min振荡培养过夜。再以1％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基 中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的醋酸钠浓度为 0.1-1g/L的优化培养基中，37℃，240r/min，发酵时间96h。在醋酸钠浓度为 0.5g/L时，地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroK/pHY-aroD的莽草酸最高产量达到 11.71g/L。
(4)WX-02ΔpykΔaroK，WX-02ΔpykΔaroKΔpgi和WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD菌株在优化发酵培养基的发酵实验。
挑取WX-02ΔpykΔaroK，WX-02ΔpykΔaroKΔpgi和 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD菌落分别接种于5mL LB培养基中，37℃， 240r/min振荡培养过夜。再以2％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直 到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到预先准备好的莽草酸优化发酵培养 基中，37℃，240r/min，发酵时间96h。在莽草酸发酵培养基中，菌株WX-02ΔpykΔaroK，WX-02ΔpykΔaroKΔpgi和WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD 的莽草酸最高产量分别达到2.30g/L，3.24g/L和16.78g/L，最终的工程菌比单基 因敲除菌株与双基因敲除菌株分别提高了630％与418％。
其中，所述莽草酸发酵培养基为：葡萄糖50.00g/L，柠檬酸钠10.00g/L， 酵母粉2.00g/L，K2HPO4 5.32g/L，KH2PO4 6.40g/L，MgSO4 0.60g/L，MnCl2 0.005g/L，CaCl20.003g/L，FeSO4 0.003g/L，pH 7.2。
所述LB培养基为10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂粉15g/L。
实施例4
本实施例进行了WX-02ΔpykΔaroK，WX-02ΔpykΔaroKΔpgi和 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD菌株在优化发酵培养基的发酵实验，具体实验 过程与实施例3中优化发酵培养基的发酵实验过程基本保持一致，区别在于，所 述莽草酸发酵培养基为：葡萄糖20.00g/L，柠檬酸钠20.00g/L，酵母粉25.00g/L， K2HPO4 10g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO4 5g/L，MnCl2 0.01g/L，CaCl2 0.01g/L， FeSO4 0.01g/L，pH 7.2。在该优化培养基下进行的发酵实验结果与实施例3基本 一致。
实施例5
本实施例进行了WX-02ΔpykΔaroK，WX-02ΔpykΔaroKΔpgi和 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD菌株在优化发酵培养基的发酵实验，具体实验 过程与实施例3中优化发酵培养基的发酵实验过程基本保持一致，区别在于，所 述莽草酸发酵培养基为：葡萄糖80.00g/L，柠檬酸钠2.00g/L，酵母粉15.00g/L， K2HPO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 3g/L，MnCl2 0.001g/L，CaCl2 0.005g/L， FeSO4 0.001g/L，pH 7.2。在该优化培养基下进行的发酵实验结果与实施例3基 本一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。

Claims (10)

1.一种高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌株是将地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的丙酮酸激酶基因pyk、莽草酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除，构建WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株，再将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168的P43启动子、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD和淀粉酶基因amyL的终止子连接至表达载体得到重组质粒，再将重组质粒转化WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株所得到的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。
2.如权利要求1所述的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，其特征在于：所述地衣芽胞杆菌WX-02的丙酮酸激酶基因pyk序列如SEQ ID NO：1所示；所述地衣芽胞杆菌WX-02的莽草酸激酶编码基因aroK序列如SEQ ID NO：2所示；所述地衣芽胞杆菌WX-02的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi序列如SEQ ID NO：3所示；所述枯草芽胞杆菌168的P43启动子序列如SEQ IDNO：4所示；所述地衣芽胞杆菌WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD序列如SEQ ID NO：5所示；所述地衣芽胞杆菌WX-02的淀粉酶基因amyL的终止子序列如SEQ ID NO：6所示。
3.如权利要求1所述的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，其特征在于：所述表达载体为pHY300PLK。
4.如权利要求1所述的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，其特征在于：所述地衣芽胞杆菌WX-02保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：M208065。
5.权利要求1所述高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤包括：
S1、将地衣芽胞杆菌WX-02敲除丙酮酸激酶基因pyk、莽草酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，构建WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株；
S2、以枯草芽胞杆菌168的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出P43启动子；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出莽草酸脱氢酶基因aroD；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL的终止子序列；
S3、将P43启动子、莽草酸脱氢酶基因aroD及淀粉酶基因amyL的终止子片段通过SOE-PCR的方法连到一起，然后通过限制性内切酶连接到表达载体pHY300PLK中，构建重组质粒pHY-aroD；
S4、将pHY-aroD转化至地衣芽胞杆菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi，得高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。
6.如权利要求5所述的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤S1中，敲除丙酮酸激酶基因pyk的方法包括：以地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA为模板，用引物扩增丙酮酸激酶基因pyk敲除的上下游同源臂，并连接到质粒构建重组表达质粒T2Δpyk，将T2Δpyk电转到地衣芽胞杆菌WX-02中后进行单交换，验证正确后进行双交换传代筛选菌株,pyk缺失菌株构建成功并命名为WX-02Δpyk。
7.如权利要求6所述的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤S1中，敲除莽草酸激酶编码基因aroK的方法包括：以地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA为模板，用引物扩增莽草酸激酶编码基因aroK敲除的上下游同源臂，并连接到质粒构建重组表达质粒T2ΔaroK，将T2ΔaroK电转到WX-02Δpyk中后进行单交换，验证正确后进行双交换传代筛选菌株,pyk、aroK缺失菌株构建成功并命名为WX-02ΔpykΔaroK。
8.如权利要求7所述的高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤S1中，敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的方法包括：以地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA为模板，用引物扩增6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除的上下游同源臂，并连接到质粒构建重组表达质粒T2Δpgi，将T2Δpgi电转到WX-02ΔpykΔaroK中后进行单交换，验证正确后进行双交换传代筛选菌株,pyk、aroK、pgi缺失菌株构建成功并命名为WX-02ΔpykΔaroKΔpgi。
9.一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法，其特征在于：将高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD进行种子培养，再进行发酵培养，所述发酵培养基为：葡萄糖10-80g/L，柠檬酸钠2-20g/L，酵母粉1-25g/L，K2HPO4 1-10g/L，KH2PO4 1-10g/L，MgSO4 0.1-5g/L，MnCl2 0.001-0.01g/L，CaCl2 0.001-0.01g/L，FeSO4.0.001-0.01g/L，pH 7.2。
10.如权利要求8所述的提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为：发酵温度为36～38℃，摇床转速220～260r/min，发酵周期94～98h。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057672A (zh) * 2019-12-20 2020-04-24 东莞市东阳光生物合成药有限公司 重组菌株及其应用
CN114276952A (zh) * 2021-12-06 2022-04-05 湖北工业大学 一种提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6436664B1 (en) * 1999-03-25 2002-08-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing shikimic acid
CN104630123A (zh) * 2013-11-12 2015-05-20 华中农业大学 地衣芽胞杆菌表达宿主
CN106191092A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 武汉康复得生物科技股份有限公司 一种芽胞杆菌多基因叠加敲除方法
CN106497857A (zh) * 2016-11-11 2017-03-15 湖北大学 一株可以高产聚γ‑谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6436664B1 (en) * 1999-03-25 2002-08-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing shikimic acid
CN104630123A (zh) * 2013-11-12 2015-05-20 华中农业大学 地衣芽胞杆菌表达宿主
CN106191092A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 武汉康复得生物科技股份有限公司 一种芽胞杆菌多基因叠加敲除方法
CN106497857A (zh) * 2016-11-11 2017-03-15 湖北大学 一株可以高产聚γ‑谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHN J等: "NADPH-dependent pgi-gene knockout Escherichia coli metabolism producing shikimate on different carbon sources", 《FEMS MICROBIOL LETT》 *
CHO, S. H.: "Bacillus licheniformis strain SRCM1 00027 chromosome, complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
GHOSH SAPTARSHI等: "Generation of aroE overexpression mutant of Bacillus megaterium for the production of shikimic acid", 《MICROBIAL CELL FACTORIES VOL》 *
GHOSH S等: "Studies on the production of shikimic acid using the aroK knockout strain of Bacillus megaterium", 《WORLD J MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
JEON, S. B.等: "Bacillus licheniformis strain SCDB 34, complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
NASSER D等: "Regulated enzymes of aromatic amino acid synthesis: control, isozymic nature, and aggregation in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis", 《J BACTERIOL》 *
REY, M. W.等: "Bacillus licheniformis ATCC 14580, complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
THUERMER, A.等: "Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168, partial genome", 《GENBANK DATABASE》 *
UHM, T. -B.等: "Bacillus licheniformis strain SCCB 37, complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
李季伦等主编: "《微生物生理学》", 31 December 1993 *
杨雪莲主编: "《必需氨基酸的生物合成研究》", 30 June 2014 *
汪华等: "莽草酸生物合成途径的调控", 《生物技术通报》 *
陈凯等: "利用重组大肠杆菌合成莽草酸的研究进展", 《药物生物技术》 *
陈梅芳等: "代谢工程在芳香化合物生物合成研究中的应用", 《氨基酸和生物资源》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057672A (zh) * 2019-12-20 2020-04-24 东莞市东阳光生物合成药有限公司 重组菌株及其应用
CN111057672B (zh) * 2019-12-20 2022-02-15 宜昌东阳光生化制药有限公司 重组菌株及其应用
CN114276952A (zh) * 2021-12-06 2022-04-05 湖北工业大学 一种提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法
CN114276952B (zh) * 2021-12-06 2023-08-18 湖北工业大学 一种提高地衣芽胞杆菌芽胞形成效率的方法

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