CN115181684B - 一种mk-7的发酵培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)发酵生产MK‑7的培养基，属于微生物发酵领域。本发明利用添加维生素E干粉的培养基进行MK‑7的发酵生产，培养基配方简单，便宜易得安全环保，利用该培养基进行纳豆芽孢杆菌发酵生产MK‑7产量高，且发酵周期短，有利于MK‑7的工业化扩大生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种纳豆芽孢杆菌的液体深层发酵培养基，更具体涉及一种利用纳豆芽孢杆菌进行液体发酵生产MK-7的培养基。
背景技术
维生素K2(Menaquinone，MK，VK2)是一类甲萘醌类化合物的统称，化学结构式为2-甲基-3-烯基-1,4-萘醌，根据C-3侧链上异戊二烯单元的个数，MK可分为14种，以MK-n表示(n＝1-14)，代表性的分子是MK-4和MK-7。已知MK-7是活性最强的维生素K2中的一种，其具备功能广泛、活性强大、半衰期长、安全等特点，主要对细胞的生长代谢及防止心脑血管和肾脏血管的钙化起着非常重要的作用。
维生素K2微生物发酵生产菌株主要包括革兰氏阳性菌中的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)和革兰氏阴性菌中的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)。其中纳豆芽孢杆菌主要产维生素K2，又因其菌体本身为益生菌，所产的维生素K2也具有较高的产量和较好的生物相容性，因此是发酵生产维生素K2的优良菌种。但是现有微生物发酵水平相对较低，从而导致成本过高，这是限制纳豆芽孢杆菌发酵生产维生素K2的一个主要原因。因此，研究发酵菌株特性及发酵行为对于提高发酵生产维生素K2的生产性能具有重要意义。
2016年，牟杰等以香菇菌渣复配蛋白胨为氮源(5％)、甘油为碳源(5％)，采用高转速(600 r/min)、高溶氧量(DO>20％)进行纳豆芽孢杆菌发酵时,VK2收率最高可达35.58mg/L(牟杰等. 纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的连续发酵工艺优化.《食品工业科技》.2016,第19期)。
2019年，汤贵祥等筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，使用优化后培养基(5％甘油、12％大豆蛋白胨、0.07％磷酸氢二钾、0.02％氯化钙、0.05％七水硫酸镁) 进行发酵，VK2产量可达70mg/L以上(汤贵祥，《维生素K2高产菌株的筛选与发酵条件优化》.《食品工业科技》.2019，第24期)。
中国专利ZL201910822357.0：一种维生素k2(MK-7型)的培养基，在使用纳豆芽孢杆菌进行发酵的过程中发酵培养基配方为葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％， NaCl 0.28％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，溶剂为水，pH7.0-7.2。发酵过程中流加葡萄糖，补加磷酸、氨水，分阶段严格控制pH，通过调节转速、空气流量、罐压分阶段控制溶氧，发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％左右，发酵单位可达80mg/L。
中国专利申请CN111549079 A：一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，在纳豆枯草芽孢杆菌发酵过程中，分阶段将OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；在发酵培养5～20h后，往发酵液中加入辅料，所述辅料选自烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸中的至少一种，发酵产量可达139mg/L。
虽然众多研究开展了微生物发酵生产VK2的研究，但发酵技术仍不成熟。针对发酵过程中生物量低、生产速率低等问题，本发明对纳豆芽孢杆菌深层液体发酵生产MK-7的培养基组份及含量进行优化，达到提高最终菌体生物量和目标产物产率的目的，以期实现MK-7的大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的是为了克服采用现有的微生物发酵法制备MK-7存在发酵水平普遍偏低、所得发酵产物中MK-7含量较低的缺陷，提供一种能够有效提高发酵水平、所得发酵产物中 MK-7含量较高的纳豆芽孢杆菌液体发酵培养基。
本发明发酵工艺利用本公司获得的MK-7高产纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)(原始编号为HDCC00023，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.21799)
本发明提供一种MK-7的液体培养基，发酵培养基中包括维生素E。
一种优选技术方案，发酵培养基中维生素E浓度为0.1～1％，优选0.5％。
更优选技术方案，发酵培养基中还包括可同化碳源，可同化氮源，无机盐。
具体而言，发酵培养基中可同化碳源为蔗糖，可同化氮源为胰蛋白胨，无机盐为硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钙之一或任意几种的组合。
最优选技术方案，发酵培养基中包括蔗糖6％，胰蛋白胨2％，维生素E干粉0.5％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.03％，碳酸钙0.3％，pH7.5。
本发明提供的培养基在纳豆芽孢杆菌发酵生产MK-7中的应用。
一种优选技术方案，本发明提供的培养基在纳豆芽孢杆菌HDCC00023发酵生产MK-7 中的应用。
本发明提供一种纳豆芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于包括如下步骤：将纳豆芽孢杆菌 HDCC00023种子液接种到如前所述的培养基进行液体发酵。
本发明提供一种包含MK-7的发酵液，通过前述所述的发酵方法产生。
本发明提供一种制备MK-7的方法，通过前述所得的发酵液，随后进行纯化。
本发明提供一种制备包含MK-7的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料的方法，制备MK-7的方法如前所述。
本发明提供了一种利用纳豆芽孢杆菌液体深层发酵生产MK-7的发酵培养基，其优点主要体现在：(1)发酵所产MK-7效价可达到500mg/L以上，相对于现有技术有了大幅度提高；(2)该纳豆芽孢杆菌培养基配方简单，所用原料便宜易得而且安全环保。
附图说明
图1实施例1发酵效价增长趋势图
图2实施例1放罐发酵液HPLC图谱
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明发酵工艺利用本公司获得的MK-7高产纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)(原始编号为HDCC00023，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为 2021年2月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.21799)。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
以下实施例所使用的培养基中，物料配比所用的百分数(％)计量单位，除特殊说明外均为质量体积百分比。
实施例1
按照本方案所述培养基，发酵罐容量为50升罐，发酵液运行装液量为30L。具体方法如下：
1、菌种复苏活化：
取工作菌种甘油管，在室温下解冻，吸取0.1ml菌悬液接种到LB固体平板，涂布均匀，置于37℃培养箱内培养16h，得到活化好的单菌落。
2、液体种子制备：
取活化好的单菌落，用接种环刮取一环菌落，然后接种到盛有500ml LB液体培养基的 2800ml三角瓶中，包扎好置于37℃、220rpm的摇床上振荡培养8h，控制种子液OD值≥4.0。
LB液体培养基消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
3、发酵罐种子液制备：
将种子液按照0.05～1.0％百分比接入种子罐中，培养温度37℃，溶氧控制大于30％，空气流量1.0VVM，初始搅拌转速200rpm，培养5～15h，控制种子液OD600nm≥10。
LB液体培养基消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～125℃、30min。
4、发酵罐培养：
取培养合格的液体种子，以10％(V/V)的比例移种到装有27L优化液体发酵培养基的50L 罐中，培养温度37℃，提供高纯氧气，控制溶氧大于10％，初始空气流量1.0VVM，初始搅拌转速200rpm，培养6～9天。
液体发酵培养基配方组成为：蔗糖6％，胰蛋白胨2％，VE干粉0.5％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.03％，碳酸钙0.3％，消毒前调pH至7.5，消毒条件为121～125℃、30min。
5、发酵罐补料工艺：
(1)培养过程中，通过补入50％蔗糖，控制发酵液中蔗糖浓度范围为：发酵0-2d，残糖≥1.5％；发酵2-4d，残糖1.0±0.5％；发酵4-6d，残糖≤1.0％；发酵6d-放罐前，残糖≤0.5％。
(2)培养过程中，通过补入NaOH溶液，控pH在以下范围：发酵0-2d，6.6-7.1；发酵2-4d，7.0-7.3；发酵4d-放罐前，7.0-7.5。
(3)培养过程中，在发酵效价达到200mg/L以上，补加大豆油使培养基中大豆油浓度为0.5～2％；在发酵效价达到400mg/L以上，再次补加大豆油使培养基中大豆油浓度为0.5～2％。
6、样品处理：取发酵液1ml，加入等体积分析纯异丙醇浸泡，离心后取上清液，进行液相色谱分析。
7、液相分析方法：
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C8(4.6mm×50mm，1.8μm)
检测波长：270nm
流动相：0.05％三氟乙酸甲醇溶液
流速：1.0mL/min
柱温：60℃
进样体积：5μL
运行时间：3min
8、实验结果：
以已知浓度MK-7对照品作为标准，根据标准浓度、峰面积、样品峰面积进行计算得到样品浓度，结果确认该实施方案所得发酵液中MK-7含量为527mg/L。(效价增长趋势及HPLC 图谱，见附图)
实施例2
1、种子液制备同实施例1。
2、发酵培养：
液体发酵培养基配方组成为：蔗糖6％，胰蛋白胨2％，VE干粉0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.03％，碳酸钙0.3％，消毒前调pH至7.5，消毒条件为121～125℃、30min。
取培养合格的液体种子，以10％(V/V)的比例移种到装有27L优化液体发酵培养基的50L 罐中，培养温度37℃，溶氧控制大于10％，初始空气流量1.0VVM，初始搅拌转速200rpm。发酵过程中分阶段补加大豆油(补加方案同实施例1)，流补蔗糖(控制方案同实施例1)，并用氢氧化钠溶液控制发酵液pH值(控制方案同实施例1)，培养6～9天。
发酵结束，发酵液中的MK-7含量为487mg/L。
实施例3
1、种子液制备同实施例1中的方式
2、发酵培养：
液体发酵培养基配方组成为：蔗糖6％，胰蛋白胨2％，VE干粉1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.03％，碳酸钙0.3％，消毒前调pH至7.5，消毒条件为121～125℃、30min。
取培养合格的液体种子，以10％(V/V)的比例移种到装有27L优化液体发酵培养基的50L 罐中，培养温度37℃，溶氧控制大于10％，初始空气流量1.0VVM，初始搅拌转速200rpm。发酵过程中分阶段补加大豆油(补加方案同实施例1)，流补蔗糖(控制方案同实施例1)，并用氢氧化钠溶液控制发酵液pH值(控制方案同实施例1)，培养6～9天。
发酵结束，发酵液中的MK-7含量为503mg/L。
实施例4
1、种子液制备同实施例1。
2、发酵培养：
液体发酵培养基配方组成为：蔗糖6％，胰蛋白胨2％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾 0.03％，碳酸钙0.3％，消毒前调pH至7.5，消毒条件为121～125℃、30min。
取培养合格的液体种子，以10％(V/V)的比例移种到装有27L优化液体发酵培养基的50L 罐中，培养温度37℃，溶氧控制大于10％，初始空气流量1.0VVM，初始搅拌转速200rpm。发酵过程中分阶段补加大豆油(补加方案同实施例1)，流补蔗糖(控制方案同实施例1)，并用氢氧化钠溶液控制发酵液pH值(控制方案同实施例1)，培养6～9天。
发酵结束，发酵液中的MK-7含量为307mg/L。
综上所述，利用本发明的液体深层发酵培养基对纳豆芽孢杆菌进行发酵，MK-7发酵效价可以维持持续增长，副产物的形成得到有效控制，生长代谢温和，工艺稳定性好，适合产业化放大。从根本上解决了MK-7产业化过程中放大困难(工艺调控重复性差)、底物有效转化率低、生产成本高的关键性难题，以及降低了发酵液的提纯难度。
可以理解的是，获知本发明提供的纳豆芽孢杆菌液体深层发酵培养基后，本领域技术人员可以利用本发明提供的培养基发酵生产MK-7和其它产物(如种子液、发酵液、发酵产物、菌渣)，以及利用本发明提供的培养基发酵生产的MK-7或其它产物生产其它产品，如制造药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料。
Claims (2)
1.一种 MK-7的液体发酵培养基在纳豆芽孢杆菌发酵生产MK-7中的应用，其特征在于：所述发酵培养基由以下组分组成：蔗糖6%，胰蛋白胨2%，维生素E干粉0.1~1%，七水硫酸镁0.02%，磷酸氢二钾0.03%，碳酸钙0.3%，其中百分比为质量体积百分比计，pH7.5；所述的纳豆芽孢杆菌为HDCC00023。
2.一种纳豆芽孢杆菌发酵生产MK-7的发酵方法，其特征在于包括如下步骤：将纳豆芽孢杆菌HDCC00023种子液接种到培养基进行发酵培养，所述发酵培养基由以下组分组成：蔗糖6%，胰蛋白胨2%，维生素E干粉0.1~1%，七水硫酸镁0.02%，磷酸氢二钾0.03%，碳酸钙0.3%，其中百分比为质量体积百分比计，pH7.5。
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