CN106834179A - 一种侧孢芽孢杆菌的新型培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种侧孢芽孢杆菌的新型培养方法，所述方法包括如下步骤：S1：侧孢芽孢杆菌菌株活化，无菌水冲洗，得到种子液；S2：使用第一培养液对种子液进行扩增培养，得到第一扩增培养液；S3：使用第二培养液对第一扩增培养液进行培养，得到第二扩增培养液；S4：第二扩增培养液进行液体发酵培养，得到发酵液；S5：将发酵液淋入固体培养基中进行固体发酵，并进行后处理，得到侧孢芽孢杆菌发酵菌剂，从而完成侧孢芽孢杆菌的所述培养方法。所述方法通过独特的多个技术特征之间的相互组合和协同，从而得到具有优异技术效果的最终侧孢芽孢杆菌的发酵菌剂，能够满足多个领域的广泛需求，具有良好的应用前景和工业化生产潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种活性菌的培养方法，更具体而言，涉及一种侧孢芽孢杆菌的新型培养方法，属于微生物培养和微生物工程技术领域。
背景技术
侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)为革兰氏阳性菌，其芽孢为椭圆形，侧生、中生或近中生，孢囊膨大，游离芽孢一边比另一边厚，呈现独木舟形。
侧孢芽孢杆菌在多个领域具有重要应用，例如：1、其能够分泌大量的几丁质酶，抑制真菌类病害；2、可对弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害细菌具有很强的抑制作用；3、可减少鱼、虾病害发生，提高产量；4、可分解池中残饵、粪便、有机物等，消除蓝藻，净化水质；5、促进植物根系生长，增强根系吸收能力，从而提高作物产量；6、仰制植物体内外病原菌繁殖，减轻病虫害，降低农药残留；7、改良疏松土壤，解决土壤板结现象，从而活化土壤，提高肥料利用率；8、增强植物新陈代谢，促进光合作用和强化叶片保护膜，抵抗病原菌；9、增强光合作用，提高化肥利用率，降低硝酸盐含量；10、固化若干重金属，降低植物体内重金属含量。
正是由于侧孢芽孢杆菌的上述诸多用途，从而在畜牧业、饲料业、农药、肥料、杀菌、园林业、养殖业、农作物种植、苗木培育等多个领域中都具有广泛的应用，且其应用领域和新的用途也一直在研究和拓展中。
也正是由于侧孢芽孢杆菌如此重要的作用，人们对于各种侧孢芽孢杆菌制品以及侧孢芽孢杆菌的培养方法和培养基等进行了大量的深入研究，取得了诸多的研究成果，例如：
CN102399710A公开了一种新的侧孢芽孢杆菌，保藏号为CGMCC No.5090及由该菌株制备的微生物菌种剂和微生物肥料以及它们的制备方法。使用该菌种生产的微生物菌种剂有较高的有效菌数和较长的保质期。
CN103289937A公开了一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，它包括以下步骤：菌种选择、斜面种子培养、一级固体种子培养、二级固体种子培养、固体发酵培养、发酵产物烘干和发酵产物闪蒸。所使用的培养基原料都是采用农副产品，成本低，配方合理，能够满足菌种繁殖营养需要，特别是加入碳酸钙缓冲培养过程中培养基的pH值变化，能大大提高了固体发酵的侧孢芽孢杆菌活菌含量，实验及生产证明利用本发明方法制备的侧孢芽孢杆菌的有效活菌数可达500亿/克，产品杂菌率低于5％，且芽孢率高达90％以上，能大大降低企业的生产成本，满足微生物菌剂生产的需要。
CN103416321A公开了一种侧孢芽孢杆菌发酵床及其制作方法。所示发酵床通过下述方法制作：将垫料原料与鸡粪按体积比3-5:1混合均匀，接种侧孢芽孢杆菌制剂，含水量为40-60％，进行堆积预发酵5-7天；将预发酵垫料铺设在鸡舍内，其上铺设相同厚度的垫料原料，混匀后制成发酵床，所述发酵床含水量为30-60％，所述发酵床的总厚度为8-25cm；所述垫料原料由体积比为2-5:5-8的谷壳和锯末组成。所述侧孢芽孢杆菌发酵床垫料厚度小，垫料的使用量少，极大的减少养殖户的劳动工作量，节约成本；在高温下效果仍然很好，可以抑制及杀灭蚊虫，改善禽类肠道功能，高效降解蛋白、淀粉、脂肪、粪尿，且氨味、臭味较少；使用和扩栏方便，可带鸡消毒。
CN103725626A公开了一种侧孢芽孢杆菌制剂，其制备工艺如下：侧孢芽孢杆菌菌种(安瓿管)-试管斜面菌种培养-摇瓶菌种培养-种子罐深层液体发酵培养-封闭式固体发酵箱培养-侧孢芽孢杆菌制剂。其采用先进的“深层液体发酵+封闭式固体发酵”的连续发酵工艺，利用全封闭自控式固体发酵设备，使固体发酵的整个过程都处于全封闭的自动监控之下，对发酵过程中的培养基成分、配方、温度、湿度、通气、pH值等环境条件进行自动化检测、电子显示、自动控制，不仅大幅度提高产量，而且保证了由该制剂配制的微生物叶面增效剂的质量。
CN105219676A公开了一种侧孢芽孢杆菌的培养方法，该微生物菌种保藏号为CGMCC No.5090，所述培养方法如下：1、将1体积菌悬液接入20倍体积的1号培养基中，30-38℃有氧培养8小时；2、将步骤1得到的培养液加入到约20倍体积的2号培养基中，30-38℃有氧培养8小时；3、将步骤2得到的培养液加入到约20倍体积的3号培养基中，35-38℃培养8小时，即得可生产用的微生物菌种培养物。
CN105272406A公开了一种由侧孢芽孢杆菌制备的微生物肥料及其制备方法，该肥料由保藏号为CGMCC No.5090的微生物菌种经过培养得到培养物，所得培养物和草炭粉混合得到微生物菌种剂，所得微生物菌种剂再与常规肥料混合制备而成，其中所述微生物菌种培养物的培养方如下：1、将1体积菌悬液接入20倍体积的1号培养基中，30-38℃有氧培养8小时；2、将步骤1得到的培养液加入到约20倍体积的2号培养基中，30-38℃有氧培养8小时；3、将步骤2得到的培养液加入到约20倍体积的3号培养基中，35-38℃培养8小时，即得可生产用的培养物。
如上所述，现有技术中公开了侧孢芽孢杆菌的多种培养方法以及多种培养基，但对于新型的侧孢芽孢杆菌培养方法，仍存在继续研究的必要和需求，这正是本发明得以完成的动力所在和基础所倚。
发明内容
为了寻求侧孢芽孢杆菌的新型培养方法，本发明人进行了大量的深入研究，在付出了创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明涉及一种侧孢芽孢杆菌的培养方法，所述方法包括如下步骤：
S1：侧孢芽孢杆菌菌株活化，无菌水冲洗，得到种子液；
S2：使用第一培养液对种子液进行扩增培养，得到第一扩增培养液；
S3：使用第二培养液对第一扩增培养液进行培养，得到第二扩增培养液；
S4：第二扩增培养液进行液体发酵培养，得到发酵液；
S5：将发酵液淋入固体培养基中进行固体发酵，并进行后处理，得到侧孢芽孢杆菌发酵菌剂，从而完成侧孢芽孢杆菌的所述培养方法。
在本发明的侧孢芽孢杆菌的培养方法中，所述步骤S1具体如下：
S1-1：选择侧孢芽孢杆菌菌株，并在无菌条件下接种于斜面培养基上进行活化培养，得到活化菌株；
S1-2：无菌水清洗斜面，得到所述种子液。
其中，步骤S1中的侧孢芽孢杆菌菌株可选择任何已知的孢芽孢杆菌菌株，例如已知的CGMCC No.5090、CGMCC No.1755、孢芽孢杆菌菌株BL-11、孢芽孢杆菌菌株BL-22、孢芽孢杆菌菌株BL-21、孢芽孢杆菌菌株1.864、孢芽孢杆菌菌株BL-1、孢芽孢杆菌菌株2-Q-9等等，这些菌株均可通过多种商业渠道而获得，在此不再一一赘述。
其中，步骤S1中，每100g所述斜面培养基的组成为：琼脂5-6g、蛋白胨3-4g、酵母浸膏0.02-0.03g、黄豆粉2-3g、玉米粉0.8-1.4g、牛肉膏3-4g、氯化钠0.2-0.5g、葡萄糖0.06-0.1g，余量为无菌水，并调节pH值为7-7.2(调节手段是常规技术，不再赘述)。
其中，黄豆粉和玉米粉均过200目筛。
其中，步骤S1中，所述活化培养的温度为30-34℃，例如可为30℃、32℃或34℃。
其中，步骤S1中，所述活化培养的时间为34-40小时，例如可为34小时、36小时、38小时或40小时。
其中，步骤S2中，使用无菌水冲洗斜面，收集冲洗液，并调整菌液浓度为1.3×108-1.4×108个/ml，从而得到所述种子液。
在本发明的侧孢芽孢杆菌的培养方法中，所述步骤S2具体如下：
S2-1：配制第一培养液
分别称取如下的物质：金属元素水溶液25ml、维生素E 1.5g、柠檬酸0.15g、L-脯氨酸0.2mg、蔗糖2.5g、琼脂8g、蛋白胨12g、酵母浸膏1.4g、硫酸铵1g、磷酸钠2.5g、牛肉膏3.5g和硝酸钠4g；
将上述物质加入到去离子水中，充分搅拌完全，并用去离子水定容至1000ml，即得到所述第一培养液。
S2-2：按照1:40-50的体积比，将所述种子液接种于所述第一培养液中，在34-36℃下通风振荡培养20-24小时，从而得到所述第一扩增培养液。
其中，步骤S2-1中，所述金属元素水溶液是将2.5g硫酸锰、3g氯化锌、4g硫酸镁、1.5g氯化钴、2g硝酸铜、3g氯化钙、4g氯化亚铁、3g氯化铁充分溶解于1000ml蒸馏水中而得到的；然后量取其中的20-30ml，即为上述步骤S2-1中所使用的20-30ml金属元素水溶液。
其中，步骤S2-2中，所述种子液接与所述第一培养液的体积比为1:40-50，例如可为1:40、1:45或1:50。
其中，步骤S2-2中，所述通风的通风比为1:0.8-1，例如可为1:0.8、1:0.9或1:1。
其中，步骤S2-2中，所述通风所通入的气体中，氧气体积含量为14-20％，例如可为14％、16％、18％或20％，优选为16-18％，最优选为17％。
发明人发现，所述通风中的氧含量对于最终的结果有着显著的影响，在合适的体积含量下能够取得最好的技术效果。
其中，步骤S2-2中，所述振荡培养的转速为150-170转/分钟。
在本发明的侧孢芽孢杆菌的培养方法中，所述步骤S3具体如下：
S3-1：将第一培养液中的酵母浸膏用量减半(即降低为0.7g)，且金属元素水溶液的用量增大一倍(即增大到50ml)，其它均不变，从而得到所述第二培养液(也就是按照第一培养液的相同方法进行制备，无非是酵母浸膏用量减半和金属元素水溶液用量增大一倍而已)；
S3-2：按照1:30-35的体积比，将所述第一扩增培养液接加入到所述第二培养液中，在34-36℃下通入空气振荡培养14-16小时，从而得到所述第二扩增培养液。
其中，在步骤S3-1中，通过降低酵母浸膏的用量而增大金属元素水溶液的用量，发现可以取得更好的技术效果，应该是此时第一扩增培养液中已经得到了足够数量和活性的活化菌群，从而可降低酵母浸膏的用量但对金属元素的需求量却上升(如果酵母浸膏用量不变，可导致繁殖过快，但活菌数却反而降低，反而导致最后的效果降低)。
其中，在步骤S3-2中，振荡培养时通入正常的空气即可，已经无需如步骤S2-3中要求氧气的含量为14-20％。
其中，在步骤S3-2中，所述通入空气的通风比为1:1。
其中，步骤S3-2中，所述振荡培养的转速为150-170转/分钟。
在本发明的侧孢芽孢杆菌的培养方法中，所述步骤S4具体如下：
将所述第二扩增培养液加入到为其体积20-30倍的液体发酵培养基中进行两段式升温发酵培养，发酵培养总时间为10-12小时，期间一直通入空气，通入空气的通风比为1:0.6-1，例如可为1:0.6、1:0.8或1:1，从而得到所述发酵液。
其中，所述液体发酵培养基以每升(L)(即最终得到的1L混合料，也即1L液体发酵培养基)计，包含酵母浸膏0.5g、蛋白胨2g、麦芽糖4g、葡萄糖1g、硫酸锰0.6g、氯化钠3.8g、黄豆粉7g、硼酸1.5g、硝酸钾2.5g、尿素6g、赖氨酸0.7g和硫酸铵1.5g，余量为无菌水。
其中，黄豆粉过200目筛。
其中，所述两段式升温发酵培养是指在发酵培养总时间的前一半时间(即开始计起的5-6小时)中，发酵温度为32-34℃，然后在10分钟内将温度升高至38-40℃，并在该温度下完成后续剩余时间的发酵。
发明人发现，经过如此的两段式升温发酵培养，可以取得最好的技术效果，应该是经过初始发酵后，继续升温，可进一步改善发酵效率、提高活菌数。
在本发明的侧孢芽孢杆菌的培养方法中，所述步骤S5具体如下：
按照质量比1:10-14的比例，将所述发酵液淋入固体培养基中，再加入适量去离子水，使整体的水分质量含量为32-36％，然后充分翻拌均匀，装入长度为3米、宽度为1.5米和深度为1.5米的发酵槽中，自然堆积发酵60-70小时，期间始终保持整体的水分质量含量为32-36％，并通入无菌风保持发酵槽内部的中心温度为56-60℃；发酵结束后，通热风干燥，直至水分质量含量低于5％，得到发酵菌剂，从而完成所述培养方法。
其中，在发酵期间，如果整体的水分质量含量低于32-36％的区间，则通过淋入去离子水的方法来将其保持在该范围内，这是本领域技术人员在阅读本发明后应具备的常规能力，在此不再进行详细描述。
其中，所述固体培养基是按照如下方法制得的：将3重量份棉粕、4重量份花生壳粉、2重量份麦麸、0.2重量份糖蜜、2重量份花生饼、2.5重量份干蚕沙、10重量份干燥的玉米秸秆粉、0.8重量份草木灰、2重量份鱼骨粉、4重量份干燥的甘蔗渣、0.008重量份纤维素酶、1.8重量份干燥鸡粪、0.1重量份氯化铵，混合均匀后粉碎过50目筛，然后130-140℃的高温水蒸气充分灭菌，即得到所述固体培养基。
如上所述，本发明提供了一种侧孢芽孢杆菌的培养方法，所述方法通过独特的多个技术特征之间的相互组合和协同，从而得到具有优异技术效果的最终侧孢芽孢杆菌发酵菌剂，能够满足多个领域的广泛需求，具有良好的应用前景和工业化生产潜力。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
制备例1：斜面培养基
每100g斜面培养基的组成为：琼脂5.5g、蛋白胨3.5g、酵母浸膏0.025g、黄豆粉2.5g、玉米粉1.1g、牛肉膏3.5g、氯化钠0.35g、葡萄糖0.08g，余量为无菌水，其pH值为7-7.2。
其中，黄豆粉和玉米粉均过200目筛。
制备例2：金属元素水溶液的制备
将2.5g硫酸锰、3g氯化锌、4g硫酸镁、1.5g氯化钴、2g硝酸铜、3g氯化钙、4g氯化亚铁、3g氯化铁充分溶解于1000ml蒸馏水中，从而得到金属元素水溶液。
制备例3：液体发酵培养基
液体发酵培养基以每升(L)计，包含酵母浸膏0.5g、蛋白胨2g、麦芽糖4g、葡萄糖1g、硫酸锰0.6g、氯化钠3.8g、黄豆粉7g、硼酸1.5g、硝酸钾2.5g、尿素6g、赖氨酸0.7g和硫酸铵1.5g，余量为无菌水。
其中，黄豆粉过200目筛。
制备例4：固体培养基的制备(即步骤S5中的固体培养基)
将3重量份棉粕、4重量份花生壳粉、2重量份麦麸、0.2重量份糖蜜、2重量份花生饼、2.5重量份干蚕沙、10重量份干燥的玉米秸秆粉、0.8重量份草木灰、2重量份鱼骨粉、4重量份干燥的甘蔗渣、0.008重量份纤维素酶、1.8重量份干燥鸡粪、0.1重量份氯化铵，混合均匀后粉碎过50目筛，然后130-140℃的高温水蒸气充分灭菌，即得到所述固体培养基。
除非另有说明，否则如下所有的斜面培养基、金属元素水溶液、液体发酵培养基和固体培养基均为相应的上述制备例1-4中的相应物质。
实施例1
S1：侧孢芽孢杆菌菌株活化，无菌水冲洗，得到种子液
S1-1：选择侧孢芽孢杆菌菌株CGMCC No.1755，并在无菌条件下接种于斜面培养基上进行活化培养，所述活化培养的温度为32℃，活化培养的时间为37小时，从而得到活化菌株；
S1-2：无菌水清洗斜面，得到所述种子液
使用无菌水冲洗斜面，收集冲洗液，并调整菌液浓度为1.35×108个/ml，从而得到所述种子液；
S2：使用第一培养液对种子液进行扩增培养，得到第一扩增培养液
S2-1：配制第一培养液
分别称取如下的物质：金属元素水溶液25ml、维生素E 1.5g、柠檬酸0.15g、L-脯氨酸0.2mg、蔗糖2.5g、琼脂8g、蛋白胨12g、酵母浸膏1.4g、硫酸铵1g、磷酸钠2.5g、牛肉膏3.5g和硝酸钠4g；
将上述物质加入到去离子水中，充分搅拌完全，并用去离子水定容至1000ml，即得到第一培养液；
S2-2：按照1:45的体积比，将所述种子液接种于所述第一培养液中，在34-36℃下通风振荡培养22小时(通风比为1:0.9，氧气体积含量为17％，振荡培养的转速为160转/分钟)，从而得到第一扩增培养液；
S3：使用第二培养液对第一扩增培养液进行培养，得到第二扩增培养液
S3-1：将第一培养液中的酵母浸膏用量减半(即降低为0.7g)，且金属元素水溶液的用量增大一倍(即增大到50ml)，其它均不变，从而得到第二培养液；
S3-2：按照1:32.5的体积比，将所述第一扩增培养液接加入到所述第二培养液中，在34-36℃下通入空气振荡培养15小时(通风比为1:1，振荡培养的转速为160转/分钟)，从而得到第二扩增培养液；
S4：第二扩增培养液进行液体发酵培养，得到发酵液
将所述第二扩增培养液加入到为其体积25倍的液体发酵培养基中进行两段式升温发酵培养，发酵培养总时间为11小时，期间一直通入空气，通入空气的通风比为1:0.8，从而得到发酵液；
其中，所述两段式升温发酵培养是指在发酵培养总时间的前一半时间(即前5.5个小时)中，发酵温度为33℃，然后在10分钟内将温度升高至39℃，并在该温度下完成后续剩余时间(即后5.5个小时)的发酵；
S5：将发酵液淋入固体培养基中进行固体发酵，并进行后处理，得到侧孢芽孢杆菌发酵菌剂，从而完成侧孢芽孢杆菌的所述培养方法，具体为：
按照质量比1:12的比例，将所述发酵液淋入固体培养基中，再加入适量去离子水，使整体的水分质量含量为32-36％，然后充分翻拌均匀，装入长度为3米、宽度为1.5米和深度为1.5米的发酵槽中，自然堆积发酵65小时，期间始终保持整体的水分质量含量为32-36％，并通入无菌风保持发酵槽内部的中心温度为56-60℃；发酵结束后，通热风干燥，直至水分质量含量低于5％，得到发酵菌剂，将其命名为F1，从而完成所述培养方法。
实施例2
S1：侧孢芽孢杆菌菌株活化，无菌水冲洗，得到种子液
S1-1：选择侧孢芽孢杆菌菌株CGMCC No.1755，并在无菌条件下接种于斜面培养基上进行活化培养，所述活化培养的温度为30℃，活化培养的时间为40小时，从而得到活化菌株；
S1-2：无菌水清洗斜面，得到所述种子液
使用无菌水冲洗斜面，收集冲洗液，并调整菌液浓度为1.3×108个/ml，从而得到所述种子液；
S2：使用第一培养液对种子液进行扩增培养，得到第一扩增培养液
S2-1：配制第一培养液
分别称取如下的物质：金属元素水溶液25ml、维生素E 1.5g、柠檬酸0.15g、L-脯氨酸0.2mg、蔗糖2.5g、琼脂8g、蛋白胨12g、酵母浸膏1.4g、硫酸铵1g、磷酸钠2.5g、牛肉膏3.5g和硝酸钠4g；
将上述物质加入到去离子水中，充分搅拌完全，并用去离子水定容至1000ml，即得到第一培养液；
S2-2：按照1:40的体积比，将所述种子液接种于所述第一培养液中，在34-36℃下通风振荡培养20小时(通风比为1:0.8，氧气体积含量为17％，振荡培养的转速为150转/分钟)，从而得到第一扩增培养液；
S3：使用第二培养液对第一扩增培养液进行培养，得到第二扩增培养液
S3-1：将第一培养液中的酵母浸膏用量减半(即降低为0.7g)，且金属元素水溶液的用量增大一倍(即增大到50ml)，其它均不变，从而得到第二培养液；
S3-2：按照1:30的体积比，将所述第一扩增培养液接加入到所述第二培养液中，在34-36℃下通入空气振荡培养14小时(通风比为1:1，振荡培养的转速为150转/分钟)，从而得到第二扩增培养液；
S4：第二扩增培养液进行液体发酵培养，得到发酵液
将所述第二扩增培养液加入到为其体积20倍的液体发酵培养基中进行两段式升温发酵培养，发酵培养总时间为10小时，期间一直通入空气，通入空气的通风比为1:0.6，从而得到发酵液；
其中，所述两段式升温发酵培养是指在发酵培养总时间的前一半时间(即前5个小时)中，发酵温度为32℃，然后在10分钟内将温度升高至38℃，并在该温度下完成后续剩余时间(即后5个小时)的发酵；
S5：将发酵液淋入固体培养基中进行固体发酵，并进行后处理，得到侧孢芽孢杆菌发酵菌剂，从而完成侧孢芽孢杆菌的所述培养方法，具体为：
按照质量比1:10的比例，将所述发酵液淋入固体培养基中，再加入适量去离子水，使整体的水分质量含量为32-36％，然后充分翻拌均匀，装入长度为3米、宽度为1.5米和深度为1.5米的发酵槽中，自然堆积发酵60小时，期间始终保持整体的水分质量含量为32-36％，并通入无菌风保持发酵槽内部的中心温度为56-60℃；发酵结束后，通热风干燥，直至水分质量含量低于5％，得到发酵菌剂，将其命名为F2，从而完成所述培养方法。
实施例3
S1：侧孢芽孢杆菌菌株活化，无菌水冲洗，得到种子液
S1-1：选择侧孢芽孢杆菌菌株CGMCC No.1755，并在无菌条件下接种于斜面培养基上进行活化培养，所述活化培养的温度为34℃，活化培养的时间为34小时，从而得到活化菌株；
S1-2：无菌水清洗斜面，得到所述种子液
使用无菌水冲洗斜面，收集冲洗液，并调整菌液浓度为1.4×108个/ml，从而得到所述种子液；
S2：使用第一培养液对种子液进行扩增培养，得到第一扩增培养液
S2-1：配制第一培养液
分别称取如下的物质：金属元素水溶液25ml、维生素E 1.5g、柠檬酸0.15g、L-脯氨酸0.2mg、蔗糖2.5g、琼脂8g、蛋白胨12g、酵母浸膏1.4g、硫酸铵1g、磷酸钠2.5g、牛肉膏3.5g和硝酸钠4g；
将上述物质加入到去离子水中，充分搅拌完全，并用去离子水定容至1000ml，即得到第一培养液；
S2-2：按照1:50的体积比，将所述种子液接种于所述第一培养液中，在34-36℃下通风振荡培养24小时(通风比为1:1，氧气体积含量为17％，振荡培养的转速为170转/分钟)，从而得到第一扩增培养液；
S3：使用第二培养液对第一扩增培养液进行培养，得到第二扩增培养液
S3-1：将第一培养液中的酵母浸膏用量减半(即降低为0.7g)，且金属元素水溶液的用量增大一倍(即增大到50ml)，其它均不变，从而得到第二培养液；
S3-2：按照1:35的体积比，将所述第一扩增培养液接加入到所述第二培养液中，在34-36℃下通入空气振荡培养16小时(通风比为1:1，振荡培养的转速为170转/分钟)，从而得到第二扩增培养液；
S4：第二扩增培养液进行液体发酵培养，得到发酵液
将所述第二扩增培养液加入到为其体积30倍的液体发酵培养基中进行两段式升温发酵培养，发酵培养总时间为12小时，期间一直通入空气，通入空气的通风比为1:1，从而得到发酵液；
其中，所述两段式升温发酵培养是指在发酵培养总时间的前一半时间(即前6个小时)中，发酵温度为34℃，然后在10分钟内将温度升高至40℃，并在该温度下完成后续剩余时间(即后6个小时)的发酵；
S5：将发酵液淋入固体培养基中进行固体发酵，并进行后处理，得到侧孢芽孢杆菌发酵菌剂，从而完成侧孢芽孢杆菌的所述培养方法，具体为：
按照质量比1:14的比例，将所述发酵液淋入固体培养基中，再加入适量去离子水，使整体的水分质量含量为32-36％，然后充分翻拌均匀，装入长度为3米、宽度为1.5米和深度为1.5米的发酵槽中，自然堆积发酵70小时，期间始终保持整体的水分质量含量为32-36％，并通入无菌风保持发酵槽内部的中心温度为56-60℃；发酵结束后，通热风干燥，直至水分质量含量低于5％，得到发酵菌剂，将其命名为F3，从而完成所述培养方法。
对比例1-6：培养液的考察
对比例1-3：除分别将实施例1-3的步骤S3的第二培养液替换为第一培养液外(即在步骤S2-S3中均使用第一液体培养基)，其它操作均不变，从而重复操作了实施例1-3，分别得到对比例1-3，将所得侧孢芽孢杆菌发酵菌剂顺次命名为D1、D2和D3。
对比例4-6：除分别将实施例1-3的步骤S2的第一培养液替换为第二培养液外(即在步骤S2-S3中均使用第二液体培养基)，其它操作均不变，从而重复操作了实施例1-3，分别得到对比例4-6，将所得侧孢芽孢杆菌发酵菌剂顺次命名为D4、D5和D6。
对比例7-10：步骤S2-2中通风中氧含量的考察
分别采用下表所示的步骤S2-2中的氧体积含量(其它操作均不变)，所使用氧体积含量、对应实施例和最终所得侧孢芽孢杆菌发酵菌剂的命名见下表1。
表1
对比例11-16：步骤S4中两段式升温的考察
对比例11-13：除分别将实施例1-3的步骤S4的两段式升温修改为均在各自的第一段温度下全程实施完所有的发酵(相应地无需10分钟的升温操作)，其它操作均不变，从而重复操作了实施例1-3，分别得到对比例11-13(即对比例11、12、13的步骤S3中的全程发酵温度分别为33℃、32℃、34℃)，将所得侧孢芽孢杆菌发酵菌剂顺次命名为D11、D12和D13。
对比例14-16：除分别将实施例1-3的步骤S4的两段式升温修改为均在各自的第二段温度下全程实施完所有的发酵(相应地无需10分钟的升温操作)，其它操作均不变，从而重复操作了实施例1-3，分别得到对比例14-16(即对比例11、12、13的步骤S3中的全程发酵温度分别为39℃、38℃、40℃)，将所得侧孢芽孢杆菌发酵菌剂顺次命名为D14、D15和D16。
性能考察
A、菌落计数的考察
按照本领域中的常规测试方法，对各个实施例和对比例得到的不同侧孢芽孢杆菌发酵菌剂在制备得到后，立刻进行菌落计数考察，分别考察了每克发酵菌剂中的活菌数和芽孢率，结果见下表2。
其中，相同组别的多个发酵菌剂均取其平均数。
表2
由此可见：1、本发明方法得到的F1-F3具有很高的活菌数和芽孢率；2、而当一直使用第一培养液或第二培养液时，活菌数和芽孢率均有显著降低，尤其是第二培养液降低更为明显(见D4-D6)；3、步骤S2-2中通风的氧含量非常重要，当为17％时可以取得最好的技术效果，偏离该值越大，则活菌数和芽孢率降低越明显(见D7-D10)，这证明氧含量的确定具有非显而易见性，且效果不可预料；4、步骤S4中的两段式升温发酵对于最终结果同样有着最为显著的影响，当未进行升温操作，一直在第一阶段温度下发酵时，活菌数和芽孢率最差(见D11-D13)；直在第一阶段温度下发酵时，活菌数和芽孢率也降低显著(见D14-D16)，但要优于D11-D13，这证明了只有采用本发明的两段式升温，才能取得最好的技术效果。
B、耐高温性的考察
各个实施例和对比例在得到不同的侧孢芽孢杆菌发酵菌剂后40分钟，分别在不同的温度(70℃、80℃、90℃和100℃)下恒温保持20分钟，然后再次测量其活菌数，并与初始活菌数进行计算，从而得到高温后的存活率，结果见下表3。
其中，相同组别的多个发酵菌剂均取其平均数。
表3
由此可见：1、本发明方法得到的F1-F3具有优异的抗高温性能，这在发酵制备有机肥时具有更好的高温适应性；2、而对比例的发酵菌剂的耐高温性能，尤其是在高于80℃时具有明显的降低，尤其是D11-D13，此时的菌落耐高温性能显著降低。
C、储存稳定性的考察
将各个实施例和对比例在得到不同的侧孢芽孢杆菌发酵菌剂后，常温下避光保存一定的时间，并分别考察不同时间时的活菌数，并与初始活菌数进行计算，从而得到不同储存时间后的存活率，结果见下表4。
其中，相同组别的多个发酵菌剂均取其平均数。
表4
由此可见：1、本发明方法得到的F1-F3具有优异的储存稳定性，这在饲料和微生物肥料领域具有良好的应用价值，可以储存更长时间；2、而对比例的发酵菌剂的储存稳定性则有明显的降低，尤其是D7-D8、D11-D16降低最为显著，其中D11-D13最差，这证明步骤S3中的氧含量以及步骤S4中的两段式升温发酵可不可预测地影响最终性能。
综上所述，本发明提供了一种侧孢芽孢杆菌的新型培养方法，所述方法通过独特的多个技术特征之间的相互组合和协同，从而得到具有优异技术效果的最终侧孢芽孢杆菌的发酵菌剂，能够满足多个领域的广泛需求，具有良好的应用前景和工业化生产潜力。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种侧孢芽孢杆菌的培养方法，所述方法包括如下步骤：
S1：侧孢芽孢杆菌菌株活化，无菌水冲洗，得到种子液；
S2：使用第一培养液对种子液进行扩增培养，得到第一扩增培养液；
S3：使用第二培养液对第一扩增培养液进行培养，得到第二扩增培养液；
S4：第二扩增培养液进行液体发酵培养，得到发酵液；
S5：将发酵液淋入固体培养基中进行固体发酵，并进行后处理，得到侧孢芽孢杆菌发酵菌剂，从而完成侧孢芽孢杆菌的所述培养方法。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤S1具体如下：
S1-1：选择侧孢芽孢杆菌菌株，并在无菌条件下接种于斜面培养基上进行活化培养，得到活化菌株；
S1-2：无菌水清洗斜面，得到所述种子液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于：步骤S1中，每100g所述斜面培养基的组成为：琼脂5-6g、蛋白胨3-4g、酵母浸膏0.02-0.03g、黄豆粉2-3g、玉米粉0.8-1.4g、牛肉膏3-4g、氯化钠0.2-0.5g、葡萄糖0.06-0.1g，余量为无菌水，并调节pH值为7-7.2。
4.如权利要求1-3任一项所述的培养方法，其特征在于：所述步骤S2具体如下：
S2-1：配制第一培养液
分别称取如下的物质：金属元素水溶液25ml、维生素E 1.5g、柠檬酸0.15g、L-脯氨酸0.2mg、蔗糖2.5g、琼脂8g、蛋白胨12g、酵母浸膏1.4g、硫酸铵1g、磷酸钠2.5g、牛肉膏3.5g和硝酸钠4g；
将上述物质加入到去离子水中，充分搅拌完全，并用去离子水定容至1000ml，即得到所述第一培养液。
S2-2：按照1:40-50的体积比，将所述种子液接种于所述第一培养液中，在34-36℃下通风振荡培养20-24小时，从而得到所述第一扩增培养液。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于：步骤S2-1中，所述金属元素水溶液是将2.5g硫酸锰、3g氯化锌、4g硫酸镁、1.5g氯化钴、2g硝酸铜、3g氯化钙、4g氯化亚铁、3g氯化铁充分溶解于1000ml蒸馏水中而得到的。
6.如权利要求4-5任一项所述的培养方法，其特征在于：步骤S2-2中，所述通风所通入的气体中，氧气体积含量为14-20％，优选为16-18％，最优选为17％。
7.如权利要求1-6任一项所述的培养方法，其特征在于：所述步骤S3具体如下：
S3-1：将第一培养液中的酵母浸膏用量减半，且金属元素水溶液的用量增大一倍，其它均不变，从而得到所述第二培养液；
S3-2：按照1:30-35的体积比，将所述第一扩增培养液接加入到所述第二培养液中，在34-36℃下通入空气振荡培养14-16小时，从而得到所述第二扩增培养液。
8.如权利要求1-7任一项所述的培养方法，其特征在于：所述步骤S4具体如下：
将所述第二扩增培养液加入到为其体积20-30倍的液体发酵培养基中进行两段式升温发酵培养，发酵培养总时间为10-12小时，期间一直通入空气，通入空气的通风比为1:0.6-1，例如可为1:0.6、1:0.8或1:1，从而得到所述发酵液；
其中，所述液体发酵培养基以每升(L)计，包含酵母浸膏0.5g、蛋白胨2g、麦芽糖4g、葡萄糖1g、硫酸锰0.6g、氯化钠3.8g、黄豆粉7g、硼酸1.5g、硝酸钾2.5g、尿素6g、赖氨酸0.7g和硫酸铵1.5g，余量为无菌水。
9.如权利要求8所述的培养方法，其特征在于：其中，所述两段式升温发酵培养是指在发酵培养总时间的前一半时间中，发酵温度为32-34℃，然后在10分钟内将温度升高至38-40℃，并在该温度下完成后续剩余时间的发酵。
10.如权利要求1-9任一项所述的培养方法，其特征在于：所述步骤S5具体如下：
按照质量比1:10-14的比例，将所述发酵液淋入固体培养基中，再加入适量去离子水，使整体的水分质量含量为32-36％，然后充分翻拌均匀，装入长度为3米、宽度为1.5米和深度为1.5米的发酵槽中，自然堆积发酵60-70小时，期间始终保持整体的水分质量含量为32-36％，并通入无菌风保持发酵槽内部的中心温度为56-60℃；发酵结束后，通热风干燥，直至水分质量含量低于5％，得到发酵菌剂，从而完成所述培养方法。
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