CN101063145B - 黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物及其构建制备方法 - Google Patents

Abstract

黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物及其构建制备方法，涉及一种可高效表达黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体的构建与表达。黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体是在含有E.coli Trc启动子、蛋白质工程改造过的CKS基因及组氨酸标签(His-Tag)的原核表达载体pTrc-CKS上连接黑鲷Hepcidin基因所构建成的pTrc-CKS/hepcidin表达质粒，具有P3C酶切割位点，C末端融合6个组氨酸。其融合表达产物CKS-hepcidin可通过C末端His-Tag亲和层析纯化，纯化的融合产物可用P3C酶将融合蛋白中的CKS切除，获得纯化的Hepcidin。

Description

黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物及其构建制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的鱼类基因工程，尤其是具有抗菌活性的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体的构建及其制备方法。

背景技术

Hepcidin是一个在C端保守位点上富含半胱氨酸残基的抗菌肽家族。它们的C末端都保留了半胱氨酸形成的富集区，CD(circular dichroism，圆二色)光谱学特性研究证实，在磷酸缓冲液中hepcidin具有两个稳定的β折叠结构，这一结构与抗菌多肽的胱氨酸(cystin-eknot)结构非常相似。富含半胱氨酸的抗菌肽已在昆虫的脂肪体、软体动物和甲壳动物的血淋巴、哺乳动物的上皮细胞和循环细胞如嗜中性粒细胞、巨噬细胞中分离出来。此类抗菌肽有抗真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性。2000年，Krause et al(Krause A，Neitz S，MagertHJ，Schulz A，Forssmann WG，Knappe PS，Adermann K.LEAP-1，a novel highly disulfide-bonded human peptide，exhibits antimicrobial activity[J].FEBS Lett.，2000，480：147-150)最早从人类血浆中首先发现了LEAP-1(后称为hepcidin)，曾用化学合成该多肽检测了hepcidin的抗菌活性，结果发现hepcidin能够剂量依赖性(Dose-dependent)的抑制革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和革兰氏阴性菌灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)的生长，但是对大肠杆菌(E.coli BL21 G-)和萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens G-)没有活性，此hepcidin对枯草芽孢杆菌的半数抑制浓度(half-maximal inhibitoryactivity，IC50)为40μg/ml(14.4μM)。而Park et al(ParkCB，Lee JH，Park IY，Kim MS，Kim SC.A noval antimicrobial peptide from the loach，Misgurnus anguillicaudatus[J].FEBS Lett.，1997，411：173-178.)从人类尿液中分离的Hep20和Hepc25天然产物，在30μM浓度下对大肠杆菌(E.coli ML35P G-)的生长则具有较强的抑制作用，对金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌的生长抑制作用较弱，对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa G+)没有抑制作用。

鱼类抗菌肽的研究加深了人们对低等脊椎动物免疫防御机制的认识，为日益严重的鱼类病害防治开辟了崭新的途径。抗菌肽药物在海水养殖鱼类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌和治疗药物，因而获得高产量的抗菌肽是其在水产养殖业推广应用的前提，但直接从鱼类提取或利用化学方法人工合成天然的抗菌肽，受动物来源和化学合成方法的局限，很难获得足够量的抗菌肽，且费用昂贵。利用分子生物学技术可以克隆获得海水养殖鱼类的抗菌肽基因，通过建立海水养殖鱼类抗菌肽基因表达工程菌，可以在体外产业化生产抗菌肽；而用抗菌肽产品替代抗生素添加到饲料，饲喂海水养殖鱼类，不仅可以提高鱼体的免疫抗病力，增加其产量，同时还可以避免抗生素在鱼体中的蓄积，提高水产品质量，从而解决目前困扰我国海水养殖生产中的细菌耐药性及水环境和水产品抗生素污染等问题。

由于hepcidin多肽含有8个半胱氨酸，具有特殊的4个二硫键结构，通过化学合成该多肽技术难度很大、费用昂贵，因而不能满足产业化要求，可行有效的途径是在体外通过基因工程菌表达该抗菌肽，但技术上也存在难度和风险，因此目前关于这方面的研究报道很少。Zhang et al(Zhang H，Yuan QP，Zhu YP，Ma Ry.Expression and preparation of recombinanthepcidin in Escherichia coli[J].Protein.Expr.Purif.，2005，41：409-416.)曾经利用合成的人类hepcidin核酸片段重组到pGEX-hpc表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，但其表达产物是以包涵体形式存在，需要经过复性过程才能获得有生物活性的hepcidin，因而利用pGEX-hpc这一类表达载体制备hepcidin的工艺相对复杂，成本较高。

发明内容

本发明的目的旨在通过构建一种含有黑鲷hepcidin(cDNA)的pTrc-CKS/hepcidin表达载体(原核表达载体pTrc-CKS购自晶美生物有限公司)以及在E.coli TOP10F′中的诱导表达可溶性产物和高效纯化可溶性表达产物的方法，从而可大量地体外获得抗菌肽hepcidin的表达产品。

本发明所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体是在含有E.coli Trc启动子、蛋白质工程改造过的CKS基因及组氨酸标签(His-Tag)的原核表达载体pTrc-CKS(购自晶美生物有限公司)上连接黑鲷Hepcidin基因(Genbank登录号：AY669377)所构建成的pTrc-CKS/hepcidin表达质粒，具有P3C酶切割位点，C末端融合6个组氨酸。其可溶性融合表达产物CKS-hepcidin可通过C末端His-Tag亲和层析纯化，纯化的融合产物可用P3C酶将融合蛋白中的CKS切除，从而获得纯化的Hepcidin。通过计算得知，pTrc-CKS空载体诱导表达的蛋白为268aa，理论分子量为29.0kDa；pTrc-CKS/hepcidin重组载体诱导表达的蛋白为328aa，理论分子量为36.3kDa。pTrc-CKS/hepcidin表达质粒的碱基序列如下：

agcatgccag actctctcga agttctgttt cagggtccag caggatctgg ctcattcact 780

gaggtgcaag agccggagga gccaatgaac aatgagagtc cagttgctgc acatgaagag 840

aagtcagagg agtcctggaa gatgccgtat aacaacagac acaagcgcag ccccgctggt 900

tgtcgctttt gctgcggttg ctgtcctaac atgagaggat gtggtgtctg ctgcaggttc 960

tctagccacc atcatcatca tcat                                        984

氨基酸序列如下：

                                          ↓P3C切点

Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser Gly Ser Phe

Thr Glu Val Gln Glu Pro Glu Pro Met Asn Asn Glu Ser Pro Val Ala Ala His Glu

Glu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro

Ala Gly Cys Arg Phe Cys Cys Gly Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys Cys

Arg Phe Ser Ser

所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达产物为含有pTrc-CKS/hepcidin重组质粒的E.coliTOP10F′表达菌株。

所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物的构建制备方法如下：

1.重组表达载体pTrc-CKS/hepcidin的构建

1)根据黑鲷Hepcidin基因(Genbank登录号：AY669377)合成上游引物S1(起始密码子ATG前段序列26个bp(含ATG))：CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，然后3′RACE扩增黑鲷hepcidin基因，回收PCR扩增目的片段，将目的片段与pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接，最后将连接产物用热击法转化大肠杆菌ER1647(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞，得到含有黑鲷hepcidin(cDNA)的重组pPMD18-T阳性质粒。

2)根据pTrc-CKS载体多克隆位点，设计目的基因的上游引物H-H1-63U和下游引物H-H2-D，在上游引物5′端加上BglII酶切位点，与BamH I为同裂酶，上游引物H-H1-63U为：

5′GCCGAGATCTGGCTCATTCACTGAGGTG 3′

在下游引物5′端加上Xba I酶切位点，与Nhe I为同裂酶，下游引物H-H2-D为：

5′GCGTCTAGAGAACCTGCAGCAGACACCAC 3′

3)以包含黑鲷hepcidin(cDNA)重组pMD18-T质粒为扩增模板，以H-H1-63U，H-H2-D为上、下游引物，用pfu高保真Taq酶扩增hepcidin表达序列，得到PCR产物，长度为211bp。

4)将pTrc-CKS原核表达载体转化E.coli TOP10F′(购自晶美生物有限公司)，得到具有BamH I和/Nhe I的粘性末端的载体。

5)将回收的PCR产物用BglII和Xba I进行双酶切，得到具有与处理好的pTrc-CKS线性载体相互配对的粘性末端的预连接cDNA片段。

6)将具有相同粘性末端的pTrc-CKS原核表达载体与含有黑鲷hepcidin基因的预连接DNA片段连接，得到pTrc-CKS/hepcidin重组表达质粒。该表达载体采用E.coli Trc启动子和蛋白质工程改造过CKS基因融合表达，同时选用P3C酶切割位点可将融合蛋白部分切除，并在C端添加6个组氨酸便于采用亲和层析纯化目标蛋白。通过计算得知，pTrc-CKS空载体诱导表达的蛋白为268aa，理论分子量为29.0kDa；pTrc-CKS/hepcidin重组载体诱导表达的蛋白为328aa，理论分子量为36.3kDa。

2.pTrc-CKS/hepcidin重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

用热击法将pTrc-CKS空质粒和pTrc-CKS/hepcidin重组质粒分别转化至E.coliTOP10F′感受态细胞中诱导表达。以pTrc-CKS空质粒转化的E.coli TOP10F′为对照，以pTrc-CKS/hepcidin重组质粒转化的E.coli TOP10F′为实验组，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白表达量，结果显示pTrc-CKS空质粒与pTrc-CKS/hepcidin重组质粒在诱导后较诱导前都具有明显的表达蛋白带；并且重组质粒和空质粒相比，具有明显不同分子量的表达蛋白带，空质粒表达蛋白分子量在31.0kDa左右，重组质粒在43.0kDa左右，与计算的理论分子量相似。

3.pTrc-CKS/hepcidin重组质粒融合表达产物的纯化

1)hepcidin融合表达产物的可溶性分析

将pTrc-CKS/hepcidin重组质粒在大肠杆菌中的表达产物离心收集菌体，用PBS悬浮菌体，超声破碎，加溶菌酶；离心超声液取上清进行SDS-PAGE电泳，确认表达产物的可溶性。

2)亲和层析法纯化hepcidin融合表达产物

将具有较高可溶性表达hepcidin的菌株大量诱导表达后收集菌体，采用金属鏊合层析柱进行亲和层析，金属鏊合层析填料为Super Chelating Resin(购自晶美生物有限公司)，所用层析试剂为：

溶液A：200mM硫酸镍；

溶液B：25mM NaH2PO4+500mM NaCl pH 4.0(用磷酸调)；

溶液C：50mM磷酸缓冲液+200mM NaCl+40mM咪唑pH 8.0；

溶液D：50mM磷酸缓冲液+150mM NaCl+400mM咪唑pH 8.0；

溶液A鏊合Ni2+金属离子，溶液B洗去多余的Ni2+，溶液C平衡层析柱，将过滤后的可溶性上清液全部上柱，溶液C过柱洗去未结合的蛋白，溶液D过柱洗脱目标蛋白，收集洗脱峰，经SDS-PAGE电泳鉴定即为hepcidin融合表达产物，通过凝胶扫描计算得知，扫描凝纯化后的融合表达产物具有90％的纯度。

3)洗脱蛋白的脱盐及酶切反应

以脱盐层析缓冲液为平衡液，将亲和层析洗脱下的hepcidin融合蛋白上脱盐柱，收集先通过层析柱的蛋白峰，抽真空冷冻干燥。以PBS(磷酸盐缓冲液，pH 7.4)溶解融合表达蛋白，加入EDTA(乙二胺四乙酸，pH 8.0)和DTT(二硫苏糖醇，终浓度为1mM)，再加入少量P3C蛋白酶进行酶切反应。所述的脱盐缓冲液为50mM Tris-Cl，0.15mM NaCl(pH8.0)。

4)Hepcidin重组蛋白抗菌活性的测定

通过测定融合表达产物酶切反应前和经过P3C酶切后得到的蛋白产物对4种革兰氏阳性菌(G+)和2种革兰氏阴性菌(G-)的杀伤指数。受试菌有大肠杆菌鉴定株(Escherichia coli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemeolyticus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)。结果显示，原核表达的黑鲷hepcidin蛋白产物能够选择性的对部分革兰氏阳性菌和阴性菌产生杀伤作用。在融合蛋白酶切反应前，该融合表达产物在0.2mg/ml浓度下只能抑制2种细菌的生长；但是经过P3C酶切后，得到的蛋白产物在0.2mg/ml的浓度下能够抑制5种细菌的生长。

本发明借助基因工程技术，应用pTrc-CKS融合表达载体，成功地高效表达出有抗菌活性的可溶性黑鲷hepcidin，从而使抗菌肽hepcidin的药用价值得到开发，以符合产业化开发的要求。其优点如下：

1.Hepcidin多肽的分子量较小，利用大肠杆菌表达的产物太小很可能被自身酶解，而采用融合表达方式，可以增大表达产物分子量，与之相比则会更加稳定；其次，Hepcidin是一种抗菌多肽，其表达产物对宿主菌(大肠杆菌)存在杀伤作用，采用融合表达方式可以消除其对宿主的毒性；另外，Hepcidin具有较复杂的二硫键结构，其表达产物可能不能正确的折叠形成天然空间结构，导致重组产物形成包涵体，而pTrc-CKS表达载体中融合表达经过改造过的CKS蛋白，它是一个非常稳定且高度可溶的理想融合伴侣。

2.pTrc-CKS融合表达载体，采用E.coli Trc启动子，受IPTG诱导表达插入目的基因；由于转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列所控制，因而融合蛋白得到高效表达，且外源序列与大肠杆菌的融合使其融合表达产物比单独表达外源蛋白更稳定。另外，选择低温(28℃)、低浓度诱导剂(IPTG终浓度为100μg/ml)的诱导条件，可增加可溶型重组蛋白的表达。

3.pTrc-CKS载体表达产物C末端融合6×His-tag蛋白，由于空间位阻关系可与Ni2+特异性的结合，因此应用金属鏊合层析可纯化表达的融合蛋白。在上亲和层析柱纯化可溶性产物中的融合蛋白时，在样品中添加40mM左右的咪唑上柱，可以大大降低非6×His-tag蛋白如3个His或4个His等杂蛋白吸附填料，在40mM左右的咪唑条件下这些杂蛋白就挂不上柱，这样可大大提高了吸附6His-tag蛋白载量和提高纯化效果。由于hepcidin中富含半胱氨酸，导致与金属的吸附作用增强而难以洗脱，通过对咪唑的洗脱浓度(浓度大于400mM)进行了优化，从而有效洗脱下hepcidin融合蛋白。

4.所构建的hepcidin的原核表达产物在0.2mg/ml(5.5μM)浓度下能够抑制包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、副溶血弧菌和溶壁微球菌5种细菌的生长，对其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和溶壁微球菌4种细菌的杀伤指数都超过50％。并且，该表达蛋白在稀释后(浓度为50μg/ml)对副溶血弧菌和溶壁微球菌的生长抑制作用也很强，甚至在25μg/ml的浓度下对溶壁微球菌的生长仍然有抑制作用。黑鲷hepcidin表达蛋白与国外报道的人hepcidin选择性的发挥抗菌活性的现象一致，发挥抗菌作用的浓度也基本相当。

5.由于利用直接从黑鲷中获得的基因编码序列(cDNA序列)，经过引物末端加接头改造后连接到pTrc-CKS融合表达载体，并在大肠杆菌中表达出可溶性融合产物。与包涵体蛋白的活性需要复性过程相比，可溶性蛋白经表达后即表现生物活性，因此更便于制备和纯化hepcidin可溶性表达产物，利于产业化。

附图说明

图1为黑鲷3′RACE产物的琼脂糖电泳图。在图1中M为DL2000 Marker；1为黑鲷3′RACE产物；2000、1000、750、500、250、100代表DL2000 Marker中各核酸片段的碱基数目，数目单位为bp，即碱基数。

图2为黑鲷Hepcidin全长cDNA及由此推导出的氨基酸序列示意图。在图2中，小写字母代表5’和3’UTR；大写字母代表编码区；星号显示起始密码子和终止密码子；实心竖直箭头标出SacI酶切位点；空心竖直箭头标出预测的信号肽、优势域和成熟肽的分割位点；横箭头标出引物序列，箭头方向即为引物结合方向；3′非编码区的多腺苷酸化信号用下划线标明；基序(RX(K/R)R用方框标出。

图3中A图为预连接的Hepcidin片段的琼脂糖电泳图。图中M为100bp ladder Marker；1为黑鲷Hepcidin-prodomain回收产物；500、400、300、200、100代表DL2000 Marker中各核酸片段的碱基数目，核酸数目单位为bp，即碱基数。B图为pTrc-CKS载体的琼脂糖电泳图。图中M为λHindIII DNA Marker；2为pTrc-CKS载体；23,130、9,416、6,557、4,361、2,322、2,037代表λHindIII DNA Marker中各核酸片段的碱基数目；bp是核酸数目单位，即碱基数。

图4为阳性单克隆测序结果示意图。在图4中，阿拉伯数目代表核酸碱基数目，核苷酸的开放阅读框(ORF)编码连续；小写字母代表测序获得的核苷酸序列；大写字母代表编码的氨基酸序列；下划线标出目的基因与载体连接处；方框标志出Hepcidin的prodomain片段；椭圆框标出6个串联的组氨酸标签。

图5为构建的pTrc-CKS/Hepcidin融合表达载体结构示意图。在图5中，PTrc代表E.coliTrc启动子；RBS代表核糖体结合位点；ATG代表起始密码子；CKS^mut代表CKS的编码序列；5.2Kb代表载体大小为5.2Kb；p3C cut site代表p3C酶切位点；MCS代表多克隆位点；hepcidin代表连接插入的hepcidin序列；6His代表6个组氨酸标签序列；stop代表终止密码子；Amp代表氨苄抗性基因位点；Ori代表复制起始位点。

图6为将pTrc-CKS空质粒与pTrc-CKS/Hepcidin重组质粒在同样的诱导表达条件下，取总菌体进行的SDS-PAGE电泳图。在图6中，M为SDS-PAGE低分子量标准蛋白质Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量标准蛋白质Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的单位，即千道尔顿；1为pTrc-CKS空载体IPTG诱导3h菌体总蛋白；2为pTrc-CKS空载体未诱导菌体总蛋白；3和5为pTrc-CKS/Hepcidin重组表达载体IPTG诱导3h菌体总蛋白；4和6为pTrc-CKS/Hepcidin重组表达载体未诱导菌体总蛋白；CKS-hepcidin代表融合表达的hepcidin蛋白。

图7为取表达菌体超声波破碎并离心后的上清和沉淀，进行的SDS-PAGE电泳，对诱导表达产物进行可溶性分析图。在图7中，M为SDS-PAGE低分子量标准蛋白质Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量标准蛋白质Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的单位，即千道尔顿；1为pTrc-CKS/Hepcidin未诱导菌体总蛋白；2为pTrc-CKS/Hepcidin诱导菌体总蛋白；3和4为pTrc-CKS/Hepcidin诱导菌体超声破碎后上清；5和6为pTrc-CKS/Hepcidin诱导菌体超声破碎后上清沉淀；CKS-hepcidin代表融合表达的hepcidin蛋白。

图8为亲和层析柱(IMAC)纯化可溶性的目的蛋白图。在图8中，横坐标为流经层析柱的溶液的保留体积，单位为ml；纵坐标为280nm紫外吸收光密度值，单位为mAU；UV1_280nm代表280nm紫外吸收光密度值曲线；conc代表洗脱溶液的浓度百分比例，图中洗脱溶液的浓度从0％瞬间增加到100％；流穿蛋白峰代表未与层析柱结合的蛋白；洗脱蛋白峰代表与层析柱合后又被洗脱下的蛋白峰。

图9为收集洗脱组分进行的SDS-PAGE电泳图。在图9中，M为低分子量标准蛋白质Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量标准蛋白质Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的单位，即千道尔顿；1为未经过纯化的菌体表达蛋白；2和3为IMAC柱纯化后得到的洗脱蛋白；目的蛋白是指融合表达的hepcidin蛋白。

图10为以6-His tag单克隆抗体做Western blot图。在图10中，M为低分子量标准蛋白质Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量标准蛋白质Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的单位，即千道尔顿；1为IMAC柱洗脱蛋白电泳；2为硝酸纤维素杂交膜印迹；目的蛋白是指融合表达的hepcidin蛋白。

图11为IMAC柱洗脱蛋白凝胶电泳图谱以SynGene GeneTools系统光密度扫描所得定量分析图。在图11中，横坐标为蛋白电泳泳道相对感应距离(Rf distance down track)；纵坐标为相对剖面高度(Profile height)；实体部分代表纯化的融合蛋白峰；目的蛋白是指融合表达的hepcidin蛋白。

图12为表达产物的脱盐层析图谱。在图12中，横坐标为保留时间，单位为分钟(min)；纵坐标为280nm紫外吸收光密度值，单位为mAU；UV1_280nm代表280nm紫外吸收光密度值曲线；UV1_215nm代表215nm紫外吸收光密度值曲线；Cond％代表电导值曲线；目标蛋白是指融合表达的hepcidin蛋白洗脱峰；咪唑是指脱盐过程中脱去咪唑的峰

图13为P3C酶切蛋白后SDS-PAGE电泳图。在图13中，M为低分子量标准蛋白质Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量标准蛋白质Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的单位，即千道尔顿；M2为超低分子量标准蛋白质Marker；16.949、14.404KD、10.700DK、8.159KD、6.214KD代表超低标准蛋白质Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的单位，即千道尔顿；1为酶切后蛋白；融合蛋白代表融合表达的hepcidin蛋白，CKS代表CKS蛋白，hepcidin代表hepcidin蛋白。

图14为Bradford法蛋白浓度测定标准曲线。在图14中，横坐标为BSA(蛋白)浓度，单位为mg/ml；纵坐标为595nm可见吸收光密度值A595，单位为A₅₉₅；标准曲线的回归方程为Y＝1.2375X+0.5816，R²＝0.9985。

图15为Hepcidin原核表达蛋白对六种菌的杀伤指数图，测试菌株有大肠杆菌鉴定株(Escherichia coli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemeolyticus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在图15中，横坐标为样品，Sample1(样品1)为表达的融合蛋白，浓度为0.2mg/ml；Sample2(样品2)为酶切后的融合蛋白，浓度为0.2mg/ml；Sample3(样品3)为酶切产物4倍稀释，浓度为50μg/ml；Sample4(样品4)为酶切产物8倍稀释，浓度为25μg/ml；纵坐标为杀伤指数KI，单位为百分比。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例

1.重组表达载体pTrc-CKS/hepcidin的构建

1)含有黑鲷hepcidin(cDNA)的重组pPMD18-T阳性质粒的获得：

(1)利用Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司)提取黑鲷幼鱼肝总RNA。，

(2)根据黑鲷Hepcidin基因(Genbank登录号：AY669377)合成特异引物：S1(上游引物：起始密码子ATG前段序列26个bp(含ATG))：TGAAGCAGTGGAAGCCTCCTAAGATG。

(3)3′RACE扩增黑鲷hepcidin基因：按照TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set说明书进行cDNA第一链合成：取1μl RNA(1～3μg)加入0.2ml薄壁管，70℃温育10min，立即置于冰上。按照顺序依次加入下列试剂配置反应液：10×RNA PCR Buffer 2μl，MgCl2(25mM)4μl，RNAasin(40U/μl)0.5μl，dNTPs(10mM each)2μl，Oligo dT-3sitesAdaptor Primer，(2.5μM)1.5μl 1.5μl，无RNA酶水9μl，AMV反转录酶(10U/μl)1μl，总反应体积20μl，混合均匀，放置于PCR仪上进行反转录反应：30℃ 10min退火，42℃ 50min延伸，95℃ 5min灭活酶，4℃停止，反应结束后，放置于-20℃保存。取1μl第一链反应液作为模板，再依次加入反应组分：无菌MiliQ水73.2μl，10×反应缓冲液(无Mg₂₊)10μl，MgCl₂(25mmol/L)8μl，dNTPs(10mM each)1μl，上游引物S1(20pmol/μl)1μl，3sites Adaptor Primer(10pmol/μl)2μl，Taq酶(5U/μl)0.8μl，总反应体积100μl，混合均匀，在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应：94℃ 2min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min，4℃ Pause。

(4)第三步PCR扩增目的片段的回收：PCR扩增产物用2％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳分离后，无菌切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，按照Qiaquick Gel Extraction Kit(购自QIAGEN)说明书操作回收DNA片断。黑鲷3′RACE产物的电泳图见图1。

(5)目的片段与pMD18-T载体的连接：按照pMD18-T载体试剂盒说明书将纯化后的PCR产物与载体连接，反应体系如下：pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)0.5～1μl，DNA片段4～4.5μl，Ligation Solution I 5μl，总反应体积10μl，16℃孵育过夜。

(6)将连接产物用热击法转化大肠杆菌ER1647(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞，从转化培养的平板中挑取生长良好的单克隆菌落，接种于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的5ml LB液体培养基中，37℃ 200rpm摇床培养过夜，碱裂解法提取质粒DNA。用EcoR I和HindIII双限制性内切酶酶切pMD18-T载体多克隆位点和Sac I单限制性内切酶酶切拟插入hepcidin基因片段以鉴定阳性重组质粒。反应体系为质粒10μl，10×酶反应缓冲液2μl，限制性内切酶1～2μl，无菌MiliQ水Xμl，总反应体积20μl，于37℃水浴反应2h；取3μl反应液进行2％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳鉴定。将能够被酶切的重组阳性克隆送上海博亚生物技术有限公司(现并入Invitrogen公司)进行DNA核苷酸序列测定。结果表明黑鲷hepcidin(cDNA)已经连接到pPMD18-T载体上，得到含有黑鲷hepcidin(cDNA)的重组pPMD18-T阳性质粒(黑鲷hepcidin全长cDNA及由此推导出的氨基酸序列见图2)。

2)根据pTrc-CKS载体多克隆位点，设计目的基因的上游引物H-H1-63U和下游引物H-H2-D。

GGA TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC CAC(TAA)CAT CAT CAT CAT CAT TAA GCTT

  BamHI      EcoRI      NheI    His     His His His His His  HindIII

在上游引物5′端加上BglII酶切位点，与BamH I为同裂酶：

H-H1-63U：5′GCCGAGATCTGGCTCATTCACTGAGGTG 3′

在下游引物5′端加上Xba I酶切位点，与Nhe I为同裂酶：

H-H2-D：5′GCGTCTAGAGAACCTGCAGCAGACACCAC 3′

3)以黑鲷hepcidin(cDNA)重组pPMD18-T阳性质粒为扩增模板，以H-H1-63U，H-H2-D为上、下游引物，用pfu高保真Taq酶扩增目的片段，反应体系为：

无菌MiliQ水                   85.1μl

10×反应缓冲液(含Mg₂₊)        10μl

dNTPs(10mM each)              2μl

pPMD18-T/hepcidin质粒         4μl

H-H1-63U(20pmol/μl)          4μl

H-H2-D(20pmol/μl)            4μl

pfu高保真Taq酶(5U/μl)        0.8μl

总反应体积                    100μl

混合均匀，在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应：

①94℃ 2min

②30个循环：

94℃ 30sec

60℃ 45sec

72℃ 1min

③72℃ 10min

④4℃ Pause

反应结束后，将所有反应液进行2％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，得到PCR产物长度为211bp。

4)预连接DNA片段的制备：

将上步中回收的PCR产物，用BglII和Xba I进行双酶切，反应液置于37℃水浴中反应5h。酶切体系具体为：

PCR回收产物                           20μl

10×T酶反应缓冲液                     5μl

10×BSA                               5μl

BglII和Xba I限制性内切酶              各2.5μl

无菌MiliQ水                           15μl

总反应体积                            50μl

反应结束后，用2％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检查酶切效率；再用Qiagen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，得到具有与处理好的pTrc-CKS线性载体相互配对的粘性末端的预连接cDNA片段(图3-A)。

5)载体的处理

将pTrc-CKS原核表达载体转化E.coli TOP10F′(购自晶美生物有限公司)，大量提取质粒，具体操作方法为：

(1)菌体收集

取1μl pTrc-CKS空载体转化E.coliTOP10F′，涂布在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上培养过夜。次日挑取单菌落，并扩大到200ml大量摇床培养；

(2)用碱裂解法大量提取质粒DNA及聚乙二醇沉淀法纯化质粒。

(3)载体的酶切和去磷酸化处理：取15μl上述纯化的pET-CKS质粒，用Nhe I限制性酶(30U)，37℃孵育5h；反应结束后，用U-gene酶反应产物纯化试剂盒除去酶及核苷酸碎片；1％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检测酶切效率；用BamH I限制性内切酶(30U)，37℃酶切回收过的质粒5h；反应结束后加入碱性磷酸酶(30U)，37℃反应0.5h使线性的载体去磷酸化；将反应液进行1％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳后，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，处理好的载体具有BamH I和Nhe I的粘性末端，存于-20℃待用。大量纯化的pTrc-CKS质粒经过双酶切及回收处理后线性化成为单一的清晰条带(图3-B)。

6)表达载体的构建、转化和鉴定

将经一系列处理后具有相同粘性末端的pTrc-CKS原核表达载体与含有黑鲷hepcidin基因的预连接DNA片段连接，反应体系如下：

pTrc-CKS载体          1μl

Hepcidin片段          4μl

Ligation Solution I   5μl

总反应体积            10μl

16℃孵育过夜；次日，取5μl连接反应液转化至50μl E.coli TOP10F′感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上培养过夜。次日挑取单菌落，以H-H1-63U，H-H2-D为引物，如前所述用PCR法鉴定阳性克隆菌，由上海英俊(Invitrogen)公司进行DNA核苷酸序列测定，结果显示连接正确，核苷酸的开放阅读框(ORF)编码连续(图4)，得到pTrc-CKS/hepcidin重组表达质粒(图5)。该表达载体采用E.coli Trc启动子和蛋白质工程改造过CKS基因融合表达，同时选用P3C酶切割位点可将融合蛋白部分切除，并在C端添加6个组氨酸便于采用亲和层析纯化目标蛋白。通过计算得知，pTrc-CKS空载体诱导表达的蛋白为268aa，理论分子量为29.0kDa；pTrc-CKS/hepcidin重组载体诱导表达的蛋白为328aa，理论分子量为36.3kDa。

2.pTrc-CKS/hepcidin重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

1)诱导表达：用U-gene质粒小量提取试剂盒(购自U-gene公司)提取经鉴定正确的pTrc-CKS/hepcidin重组质粒，用热击法将pTrc-CKS空质粒和pTrc-CKS/hepcidin重组质粒分别转化至E.coli TOP10F′感受态细胞中，涂布于表达用LB琼脂平板(含0.2％葡萄糖，120μg/ml Amp)，37℃培养过夜；在菌落较小时，挑取若干pTrc-CKS空质粒和pTrc-CKS/hepcidin重组质粒转化平板生长的单菌落，分别接种于20ml LB表达用培养基中(含0.2％葡萄糖，120μg/ml Amp)，90～120rpm/min，30℃培养过夜至OD₆₀₀约为0.5，然后加入IPTG至终浓度为100μg/ml，在37℃下180～200rpm/min摇床培养3h诱导表达。

2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白表达量：以pTrc-CKS空质粒转化的E.coli TOP10F′为对照，以pTrc-CKS/hepcidin重组质粒转化的E.coli TOP10F′为实验组，取若干份对照组及实验组IPTG诱导前后的1ml菌液，分别离心收集菌体；用16μ1无菌水溶解，加20μl 2×SDS加样缓冲液和4μl β-巯基乙醇，沸水浴10min后，12000rpm离心1～3min，取上清进行SDS-PAGE电泳。配置SDS-PAGE凝胶。采用5％积层胶和12％分离胶，以8V/cm电压电泳，当溴酚蓝前沿进入分离胶(12％分离胶)后，以12V/cm电压电泳，溴酚蓝电泳至分离胶底部后，取出凝胶，考马斯亮蓝染色、脱色后扫描分析。可见pTrc-CKS空质粒与pTrc-CKS/hepcidin重组质粒在诱导后较诱导前都具有明显的表达蛋白带；并且重组质粒和空质粒相比，具有明显不同分子量的表达蛋白带，空质粒表达蛋白分子量在31.0kDa左右，重组质粒在43.0kDa左右，与计算的理论分子量相似(图6)。

3.pTrc-CKS/hepcidin重组质粒在大肠杆菌中表达产物的可溶性分析

1)按如上所述方法转化、培养20ml过夜种子液，取5ml种子液加至200ml LB中(含0.2％葡萄糖，120μg/mlAmp)，35℃下180～200rpm/min，摇床培养2～3h至OD600＝0.6，加入IPTG至浓度为100μg/ml，28℃诱导3h；

2)离心收集菌体，用PBS约20ml悬浮菌体，超声破碎，适当加少量溶菌酶；

3)12000g，15min离心超声液，取上清，如上所述进行SDS-PAGE电泳，可见菌体上清中可溶性的表达产物(图7)。

4.亲和层析法纯化hepcidin融合表达产物

1)上柱样品的制备

将具有较高可溶性表达hepcidin的菌株，大量诱导表达2～3升，离心收集菌体；用预冷的PBS(15ml/g湿菌)悬浮菌体，添加10mg溶菌酶，冰浴放置30min，不时搅拌；冰浴下超声破碎菌体至菌液较清无粘性(功率360～400W，5秒间隔10秒，约90次)；12,000rpm高速冷冻离心20min，上清用0.45μm膜过滤后，添加1/10样品体积的溶液D，至此准备好了上柱样品。

2)准备金属鏊合层析柱

金属鏊合层析填料为Super Chelating Resin(购自晶美生物有限公司)，亲和层析介质装柱后，先过5ml溶液A鏊合Ni2+金属离子，用5～10个柱体积MiliQ水洗柱；再过5～10个柱体积的溶液B洗去多余的Ni2+，并用5～10个柱体积MiliQ水洗柱；接着过5～10个柱体积溶液C平衡层析柱，等待上样。

层析试剂为：

溶液A：200mM硫酸镍；

溶液B：25mM NaH2PO4+500mM NaCl pH 4.0(用磷酸调)；

溶液C：50mM磷酸缓冲液+200mM NaCl+40mM咪唑pH 8.0；

溶液D：50mM磷酸缓冲液+150mM NaCl+400mM咪唑pH 8.0；

全部溶液用0.45μm滤膜过滤。

3)上柱纯化

将过滤后的可溶性上清液全部上柱，同时用5～10个柱体积的溶液C过柱，洗去未结合的蛋白；再用5个柱体积的溶液D过柱洗脱目标蛋白；收集洗脱峰，可见到明显的洗脱蛋白峰(图8)，取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果见图9，通过凝胶扫描计算得知，扫描凝纯化后的融合表达产物具有90％的纯度(图11)。

4、蛋白免疫印迹(Western-blot)鉴定融合表达产物

取纯化的融合表达产物进行SDS-PAGE电泳，300～400mA下，转移1.5h，将蛋白印迹至NC膜上，一抗(2uL His·Tag单抗稀释至20ml，约200ng)室温结合1～2h；二抗(2uL羊抗鼠IgG-AP稀释至20ml)室温结合1～2h；加入BCIP/NBT底物反应液，显色至出现颜色深度适宜的条带，结果显示为阳性条带(图10)。

5.洗脱蛋白的脱盐及酶切反应

以脱盐层析缓冲液(50mM Tris-Cl，0.15mM NaCl，pH 8.0)为平衡液，将亲和层析洗脱下的hepcidin融合蛋白上脱盐柱，检测UV280nm、UV215nm和系统电导(cond％)曲线的变化，收集先通过层析柱的蛋白峰。经过脱盐层析后，可观察在UV280nm、UV215nm和cond％曲线上蛋白峰和咪唑峰已经完全分开(图12)。抽真空冷冻干燥纯净的黑鲷hepcidin融合蛋白，以PBS(pH7.4)溶解，加入EDTA(pH 8.0)和DTT(终浓度为1mM)，再加入少量P3C蛋白酶，室温下放置5h，置于4℃下继续反应48h，取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定，可见融合蛋白部分CKS和hepcidin-prodomain已经大部分分开，形成大小不同的两条蛋白带(图13)。

6.Hepcidin重组蛋白抗菌活性的测定

1)应用Bradford法测定重组蛋白的浓度

①取BSA储液用1×PBS或0.9％生理盐水稀释10倍，终浓度为0.5mg/ml；

②将0.5mg/ml BSA标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl梯度加到96孔细胞培养板中，用1×PBS分别补足至20μl，每个浓度梯度设置3个平行样；

③分别加20μl、10μl、5μl待测样品到96孔板的样品孔中，用1×PBS分别补足至20μl，每个浓度梯度设置3个平行样；

④每孔加入200μl G250染色液，室温放置3～5min；

⑤用酶标仪测定A595nm波长的吸光度；

⑥根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。

应用Bradford法测定BSA标准品得到蛋白浓度标准曲线(图14)。根据公式可计算出hepcidin融合表达蛋白的浓度。

2)Hepcidin重组蛋白抗菌活性的测定

(1)取被测细菌，在MH平板上划线，倒置培养12～16h；挑取单克隆接种于MH斜面，继续培养12～16h；用溶菌buffer清洗斜面培养物，调整稀释至OD₆₀₀＝0.1备用。其中大肠杆菌鉴定株、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌培养温度为37℃，副溶血弧菌、溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌培养温度为28～30℃。

(2)参照Genthner FJ等(1999)的方法，在96孔细胞培养板上进行，每种被测细菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样：

①空白对照组：加25μl样品和25μl溶菌buffer；

②阴性对照组：加25μl菌悬液和25μl溶菌buffer；

③样品实验组：加25μl待测蛋白样品和25μl菌悬液；

(3)28℃培养3h后，每孔加入50μl MH液体培养基；

(4)28℃培养2h后，每孔加入10μl MTS-PMS混合液；

(5)28℃培养1～12h后，用酶标仪测定A492nm波长的吸光度。

(6)按下列公式计算杀伤指数(KI)：

杀伤指数(％)＝[1-(实验组A492-空白对照A492)/(阴性对照A492-空白对照A492)]×100

分别测定两种蛋白对4种革兰氏阳性菌(G₊)和2种革兰氏阴性菌(G_-)的杀伤指数。结果显示，原核表达的黑鲷hepcidin蛋白产物能够选择性的对部分革兰氏阳性菌和阴性菌产生杀伤作用。在融合蛋白酶切反应前，该融合表达产物在0.2mg/ml浓度下只能抑制2种细菌的生长；但是经过P3C酶切后，得到的蛋白产物在0.2mg/ml的浓度下能够抑制5种细菌的生长；经过稀释后，酶切后蛋白在50μg/ml的浓度下能够抑制其中3种细菌的生长，但在25μg/ml浓度下只能抑制1种细菌的生长。可见酶切后蛋白的抗菌活性较融合蛋白的抗菌活性明显增强，酶切后蛋白对所测4种细菌的杀伤指数都超过50％，但是随浓度降低，杀伤指数普遍下降(副溶血弧菌除外)，甚至没有杀伤能力(图15)。

序列表

<110>厦门大学境科学研究中心近海海洋环境科学国家重点实验室

     State Key Laboratory for Marine Environmental

     Science，Environmental Science Research Center，Xiamen University

     王，克坚

     杨，明

     蔡，晶晶

<120>黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物及其构建制备方法

<130>

<150>Genbank AY669377

<151>2005-08-15

<160>5

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<400>1

gccgagatct ggctcattca ctgaggtg    28

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>引物

<220>

<221>引物

<222>(1)..(29)

<400>2

gcgtctagag aacctgcagc agacaccac                                     29

<210>3

<211>264

<212>DNA

<213>pTrc-CKS/hepcidin表达载体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(264)

<400>3

agc atg cca gac tct ctc gaa gtt ctg ttt cag ggt cca gca gga tct     48

Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser

1               5                   10                  15

ggc tca ttc act gag gtg caa gag ccg gag gag cca atg aac aat gag     96

Gly Ser Phe Thr Glu Val Gln Glu Pro Glu Glu Pro Met Asn Asn Glu

            20                  25                  30

agt cca gtt gct gca cat gaa gag aag tca gag gag tcc tgg aag atg    144

Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met

        35                  40                  45

ccg tat aac aac aga cac aag cgc agc ccc gct ggt tgt cgc ttt tgc    192

Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly Cys Arg Phe Cys

    50                  55                  60

tgc ggt tgc tgt cct aac atg aga gga tgt ggt gtc tgc tgc agg ttc    240

Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe

65                  70                  75                  80

tct agc cac cat cat cat cat cat                                    264

Ser Ser His His His His His His

                85

<210>4

<211>88

<212>PRT

<213>pTrc-CKS/hepcidin表达载体

<400>4

Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser

1               5                   10                  15

Gly Ser Phe Thr Glu Val Gln Glu Pro Glu Glu Pro Met Asn Asn Glu

            20                  25                  30

Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met

        35                  40                  45

Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly Cys Arg Phe Cys

    50                  55                  60

Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe

65                  70                  75                  80

Ser Ser His His His His His His

                85

<210>5

<211>88

<212>PRT

<213>Hepcidin融合表达蛋白

<400>5

Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser

1               5                   10                  15

Gly Ser Phe Thr Glu Val Gln Glu Pro Glu Glu Pro Met Asn Asn Glu

            20                  25                  30

Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met

        35                  40                  45

Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly Cys Arg Phe Cys

    50                  55                  60

Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe

65                  70                  75                  80

Ser Ser His His His His His His

                85

Claims (10)

1.黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体，其特征在于所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体是在含有E.coli Trc启动子、蛋白质工程改造过的CKS基因及组氨酸标签的原核表达载体pTrc-CKS上连接黑鲷Hepcidin基因所构建成的pTrc-CKS/hepcidin表达质粒，具有P3C酶切割位点，C末端融合6个组氨酸，pTrc-CKS/hepcidin重组载体诱导表达的蛋白为328aa，其载体pTrc-CKS/hepcidin中目的基因hepcidin及P3C酶切位点的碱基序列和氨基酸序列如图4所示。

2.黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达菌株，其特征在于所述的表达菌株为含有pTrc-CKS/hepcidin重组质粒的E.coli TOP10F′表达菌株。

3.黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物的构建制备方法，其特征在于所述的构建制备方法如下：

(1)重组表达载体pTrc-CKS/hepcidin的构建

1)根据黑鲷Hepcidin基因合成上游引物S1：CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，起始密码子ATG前段序列26个bp，然后3′RACE扩增黑鲷hepcidin基因，回收PCR扩增目的片段，将目的片段与pMD18-T载体连接，最后将连接产物用热击法转化大肠杆菌ER1647感受态细胞，得到含有黑鲷hepcidin cDNA的重组pPMD18-T阳性质粒；

2)根据pTrc-CKS载体多克隆位点，设计目的基因的上游引物H-H1-63U和下游引物H-H2-D，在上游引物5′端加上Bgl II酶切位点，与BamH I为同裂酶，上游引物H-H1-63U为：

5′GCCGAGATCTGGCTCATTCACTGAGGTG 3′

在下游引物5′端加上Xba I酶切位点，与Nhe I为同裂酶，下游引物H-H2-D为：

5′GCGTCTAGAGAACCTGCAGCAGACACCAC 3′

3)以包含黑鲷hepcidin重组pMD18-T质粒为扩增模板，以H-H1-63U，H-H2-D为上、下游引物，用pfu高保真Taq酶扩增hepcidin表达序列，得到PCR产物长度为211bp；

4)将pTrc-CKS原核表达载体转化E.coli TOP10F′，得到具有BamH I和Nhe I的粘性末端的载体；

5)将回收的PCR产物用Bgl II和Xba I进行双酶切，得到具有与处理好的pTrc-CKS线性载体相互配对的粘性末端的预连接cDNA片段；

6)将具有相同粘性末端的pTrc-CKS原核表达载体与含有黑鲷hepcidin基因的预连接DNA片段连接，得到pTrc-CKS/hepcidin重组表达质粒；该表达载体采用E.coli Trc启动子和蛋白质工程改造过CKS基因融合表达，具有P3C酶切割位点，C末端融合6个组氨酸；

(2)pTrc-CKS/hepcidin重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

用热击法将pTrc-CKS/hepcidin重组质粒转化至E.coli TOP10F′感受态细胞中诱导表达；

(3)pTrc-CKS/hepcidin重组质粒融合表达产物的纯化

1)将pTrc-CKS/hepcidin重组质粒在大肠杆菌中的表达产物离心收集菌体，用PBS悬浮菌体，超声破碎，加溶菌酶；离心超声液，取上清进行SDS-PAGE电泳，确认表达产物的可溶性；

2)亲和层析法纯化hepcidin融合表达产物

将具有可溶性表达hepcidin的菌株大量诱导表达后收集菌体，采用金属鏊合层析柱进行亲和层析；

3)洗脱蛋白的脱盐及酶切反应

以脱盐层析缓冲液为平衡液，将亲和层析洗脱下的hepcidin融合蛋白上脱盐柱，收集先通过层析柱的蛋白峰，抽真空冷冻干燥，以磷酸盐缓冲液溶解融合表达蛋白，加入乙二胺四乙酸和二硫苏糖醇，再加入P3C蛋白酶进行酶切反应；

4)Hepcidin重组蛋白抗菌活性的测定

测定融合表达产物酶切反应前和经过P3C酶切后得到的蛋白产物对大肠杆菌鉴定株、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌的杀伤指数。

4.如权利要求3所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物的构建制备方法，其特征在于亲和层析法纯化hepcidin融合表达产物中金属鏊合层析柱所用的填料为SuperChelating Resin。

5.如权利要求3所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物的构建制备方法，其特征在于亲和层析法纯化hepcidin融合表达产物中亲和层析采用的试剂为：

溶液A：200mM硫酸镍；

溶液B：25mM NaH2PO4+500mM NaCl pH4.0；

溶液C：50mM磷酸缓冲液+200mM NaCl+40mM咪唑pH8.0；

溶液D：50mM磷酸缓冲液+150mM NaCl+400mM咪唑pH8.0；

溶液A鏊合Ni2+金属离子，溶液B洗去多余的Ni2+，溶液C平衡层析柱及洗去未结合的蛋白，溶液D过柱洗脱目标蛋白。

6.如权利要求3所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物的构建制备方法，其特征在于所述的脱盐层析缓冲液为50mM Tris-Cl，0.15mM NaCl。

7.如权利要求6所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物的构建制备方法，其特征在于所述的脱盐层析缓冲液pH8.0。

8.如权利要求3所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物的构建制备方法，其特征在于洗脱蛋白的脱盐及酶切反应中磷酸盐缓冲液的pH为7.4。

9.如权利要求3所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物的构建制备方法，其特征在于洗脱蛋白的脱盐及酶切反应中乙二胺四乙酸的pH为8.0。

10.如权利要求3所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物的构建制备方法，其特征在于洗脱蛋白的脱盐及酶切反应中二硫苏糖醇终浓度为1mM。

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