CN109321544A - 一种提高烟叶提取物中腐胺n-甲基转移酶的提取方法 - Google Patents

一种提高烟叶提取物中腐胺n-甲基转移酶的提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109321544A
CN109321544A CN201811346011.XA CN201811346011A CN109321544A CN 109321544 A CN109321544 A CN 109321544A CN 201811346011 A CN201811346011 A CN 201811346011A CN 109321544 A CN109321544 A CN 109321544A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tobacco
putrescine
methyltransferase
pbs
pmt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811346011.XA
Other languages
English (en)
Inventor
翟妞
周会娜
张慧
徐国云
陈千思
刘萍萍
郑庆霞
许亚龙
王晨
李晶
卢鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Original Assignee
Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC filed Critical Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority to CN201811346011.XA priority Critical patent/CN109321544A/zh
Publication of CN109321544A publication Critical patent/CN109321544A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01053—Putrescine N-methyltransferase (2.1.1.53)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中腐胺N‑甲基转移酶（PMT）酶活提取方法专利申请事宜。该方法针对新鲜烟叶中腐胺N‑甲基转移酶的提取，具体包括：制备提取液（采用裂解液RIPA、缓冲液NEB或PBS）、烟叶预处理、溶液法提取等步骤。初步测定结果表明，经过相关提取工艺参数优化后，提取液中腐胺N‑甲基转移酶（PMT）酶活得到了较好提高，可达9.6×10‑3U/μg全蛋白，较好达到了减少杂质蛋白干扰、提升PMT酶含量的目的。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短（仅1.5 h左右），因此使得本申请具有较好的科研价值，可为PMT活性分析及其它相关蛋白分析和研究奠定技术基础。

Description

一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶的提取方法
技术领域
本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶（PMT）酶活提取方法专利申请事宜。
背景技术
烟草作为一种较为特殊的经济作物，其产量与品质直接关系到我国国民经济的健康发展。为了研究烟草基因功能，创制新的育种材料，对烟草代谢物进行深入研究和分析显然具有十分重要的意义。
烟草中的香气物质是烟草内形成的一类次生代谢产物，目前按照致香功能团可分为酸类、醇类、酮类、醛类、酯类、酚类等，其中对烟草香气贡献最大的3 类物质分别为多酚类化合物、萜类化合物以及生物碱。普通烟草栽培品种中主要有烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱4 种生物碱，其中烟碱的含量最高，这些生物碱分别由不同代谢途径生成，腐胺N-甲基转移酶（PMT）被认为是烟碱合成的限速酶，催化二胺腐胺甲基化生成N-甲基腐胺。由于此生物酶的重要作用，对于该酶的深入研究，对于烟草生理生化的深入研究、以及烟草新材料鉴定、新品种培育都具有十分重要的意义。
现有技术中，植物蛋白（包括生物酶）的提取方法主要有两种：溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取过程中采用了变性剂，会导致部分蛋白酶结构改变并失去活性，因此沉淀法并不适合烟草叶片全蛋白的提取。而在应用溶液法进行提取时，由于不同蛋白（生物酶）特性不同，因此具体提取所选择的提取液及提取工艺也往往缺乏可借鉴性，往往均需重新设计。而现有技术中尚未见到较好的提取腐胺N-甲基转移酶（PMT）提取方法报道。
发明内容
本申请目的在于提供一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶（PMT）酶活提取方法，从而为烟草生长代谢研究奠定一定方法学基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶（PMT）酶活的提取方法，该方法针对新鲜烟叶中腐胺N-甲基转移酶（PMT）的提取，具体包括如下步骤：：
（1）制备提取液，具体可采用裂解液RIPA 、NEB或PBS；配方组成为：
裂解液RIPA ：Tris-Cl（pH 8.0）、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；
缓冲液NEB： Hepes（pH 7.5）、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；
pH 8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 9.5 mM，NaH2PO4、0.5 mM，PMSF、1mM；
pH7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 7.2 mM，NaH2PO4、2.8 mM，PMSF、1 mM；
pH 6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 1.2 mM，NaH2PO4、8.8 mM，PMSF、1mM；
（2）烟叶预处理
将栽培烟草K326（或者NC82）8-12叶期的新鲜烟叶，液氮速冻后，研磨成粉。
（3）溶液法提取
在步骤（2）研磨成粉烟叶样品中加入步骤（1）中制备的提取液（裂解液），震荡混匀后，冰上静置不少于1h；
具体用量方面，研磨成粉烟叶样品100mg，提取液（裂解液）用量为500μl-1mL；
静置完成后，5000~15000rpm离心不少于20min（离心速度具体例如为5000 rpm、9000rpm或13000rpm等），保留上清液，即为含有较高腐胺N-甲基转移酶（PMT）酶活的提取液；
进一步地，利用BCA法可对上清液中蛋白浓度进行检测，可利用ELISA法对上清液中PMT的活性进行检测。
现有技术中，针对所提取全蛋白中腐胺N-甲基转移酶（PMT）酶活进行分析测定时，由于所提取蛋白杂质较多，因而对于准确酶活测定造成了较大影响。本申请中，针对全蛋白提取方式做了部分优化，以期提高PMT酶活。
初步测定结果表明，经过相关提取工艺参数优化后，提取液中腐胺N-甲基转移酶（PMT）酶活得到了较好提高，可达9.6×10-3U/μg全蛋白，较好达到了减少杂质蛋白干扰、提升PMT酶含量的目的。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短（仅1.5 h左右），因此使得本申请具有较好的科研价值，可为PMT活性分析及其它相关蛋白分析和研究奠定技术基础。
附图说明
图1 不同提取液不同离心速率获得的PMT活性；
图2不同提取液比例获得的PMT活性；
图3不同品种获得的PMT活性；
各图中：K326、NEB、RIPA分别表示对应的裂解液，P6、P7、P8分别表示pH=6.0、7.2、8.0的PBS，数字5、13分别表示离心速度为5000、13000，1：5、1：10分别表示提取液比例。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分实验材料、实验方法等背景情况简要介绍说明如下。
实验材料：
栽培烟草K326和NC82 ，实验室培育至8-12叶期，采取新鲜烟叶。
实验方法：
1、BCA法检测蛋白浓度时，具体参考如下操作步骤：
（1）取上清液，稀释10倍；根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制BCA工作液，充分混匀；
（2）设置空白孔、标准品孔和样品孔，每个样品三次重复，每空加入20μl蛋白提取液，200μL BCA工作液；
（3）把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下酶标仪检测，以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
根据所测样品的吸光值，依据标准曲线获得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单 位：μg/μL）；
2、ELISA法检测酶活性时，参考如下步骤：
（1）室温平衡20min酶活性检测试剂；
（2）设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加；
除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；
（3）弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）；
每孔加入试剂盒中底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；
每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
实施例
本申请所提供的提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶（PMT）酶活的提取方法，针对新鲜烟叶中腐胺N-甲基转移酶（PMT）的提取，具体步骤简要介绍如下。
（1）制备提取液，具体可采用裂解液RIPA、NEB或PBS；配方组成为：
裂解液RIPA ：Tris-Cl（pH 8.0）、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；
缓冲液NEB： Hepes（pH 7.5）、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；
pH 8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 9.5 mM，NaH2PO4、0.5 mM，PMSF、1mM；
pH7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 7.2 mM，NaH2PO4、2.8 mM，PMSF、1 mM；
pH 6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 1.2 mM，NaH2PO4、8.8 mM，PMSF、1mM；
（2）烟叶预处理
栽培烟草K326和NC82 ，实验室培育至8-12叶期，采集新鲜烟叶。液氮速冻后，研磨成粉。
（3）溶液法提取
在步骤（2）研磨成粉烟叶样品中加入步骤（1）中制备的提取液（裂解液），震荡混匀后，冰上静置不少于1h；
具体用量方面，研磨成粉烟叶样品100mg，提取液（裂解液）用量为500μl-1mL（具体为500μl或者1mL）；
静置完成后，5000~15000rpm离心不少于20min（离心速度具体例如为5000 rpm、9000rpm或13000rpm等），保留上清液，即为含有较高腐胺N-甲基转移酶（PMT）酶活的提取液；
进一步地，利用BCA法对上清液中蛋白浓度进行检测，利用ELISA法对上清液中PMT的活性进行检测。
对不同提取液、不同pH 的PBS、不同离心速度、不同提取液比例处理后上清液中PMT活性进行检测，结果分别如图1、图2、图3所示。分析可以看出：采用PBS（pH 8.0）处理时，高速离心参数（13000 rpm）下获得酶活效果显然较高，也即高速离心情况下可以较好去除杂质蛋白对于酶活测定影响；在不同pH 的PBS处理时，pH 8.0的PBS提取时PMT活性更高；在不同提取液比例处理时，1：10比例时，PMT活性更高。而对于不同的栽培品种NC82，同样处理方法得到的PMT的活性也较高。
总体而言，就PMT酶活测定或提取而言，采用PBS （pH 8.0）、提取液比例1:10、离心速率13000rpm，处理结果最优，主要原因在于，裂解处理后，高速离心情况下可以较好去除杂质蛋白对于酶活测定影响，而合适pH值也使PMT的活性更好。

Claims (4)

1.一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶酶活的提取方法，其特征在于，该方法针对新鲜烟叶中腐胺N-甲基转移酶的提取，具体包括如下步骤：
（1）制备提取液，具体采用裂解液RIPA 、NEB或PBS；配方组成为：
裂解液RIPA：pH 8.0的Tris-Cl、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；
缓冲液NEB： pH 7.5的Hepes、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；
（2）烟叶预处理
将烟草8-12叶期的新鲜烟叶，研磨成粉备用；
（3）溶液法提取
在步骤（2）研磨成粉烟叶样品中加入步骤（1）中制备的提取液，震荡混匀后，冰上静置不少于1h；具体用量方面，研磨成粉烟叶样品100mg，提取液用量为500μl-1mL；
静置完成后，5000~15000rpm离心不少于20min，保留上清液，即为含有较高腐胺N-甲基转移酶酶活的提取液。
2.如权利要求1所述提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶酶活的提取方法，其特征在于，所述栽培烟草为K326或者NC82品种。
3.如权利要求2所述提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶酶活的提取方法，其特征在于，步骤（1）中PBS的pH=8.0、7.2或者6.0，具体组成为：
pH=8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 9.5 mM，NaH2PO4、0.5 mM，PMSF、1 mM；
pH=7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 7.2 mM，NaH2PO4、2.8 mM，PMSF、1 mM；
pH=6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 1.2 mM，NaH2PO4、8.8 mM，PMSF、1 mM。
4.如权利要求3所述提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶酶活的提取方法，其特征在于，步骤（1）中提取时，采用ph=8.0的PBS；步骤（3）中，提取液用量为1mL，13000 rpm离心20min。
CN201811346011.XA 2018-11-13 2018-11-13 一种提高烟叶提取物中腐胺n-甲基转移酶的提取方法 Pending CN109321544A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811346011.XA CN109321544A (zh) 2018-11-13 2018-11-13 一种提高烟叶提取物中腐胺n-甲基转移酶的提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811346011.XA CN109321544A (zh) 2018-11-13 2018-11-13 一种提高烟叶提取物中腐胺n-甲基转移酶的提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109321544A true CN109321544A (zh) 2019-02-12

Family

ID=65261378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811346011.XA Pending CN109321544A (zh) 2018-11-13 2018-11-13 一种提高烟叶提取物中腐胺n-甲基转移酶的提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109321544A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1127530A (zh) * 1993-06-01 1996-07-24 菲利普莫里斯生产公司 腐胺n-甲基转移酶，编码腐胺n-甲基转移酶的重组dna分子，生物碱含量减少的转基因烟草植物
CN101870998A (zh) * 2010-07-13 2010-10-27 四川农业大学 一种植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法
US20110257369A1 (en) * 2008-10-17 2011-10-20 University Of Maryland Methods for removing nicotine and other alkaloids from soluble leaf proteins in solanaceous and other plant species
WO2012088295A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 The Chinese University Of Hong Kong A cost-effictive method for expression and purification of recombinant proteins in plants
CN103145817A (zh) * 2013-02-28 2013-06-12 华南农业大学 黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14及其编码基因和应用
CN104928317A (zh) * 2015-06-09 2015-09-23 昆明理工大学 烟草赤霉素合成转录调控因子基因的植物表达载体及其应用
CN105603047A (zh) * 2015-12-31 2016-05-25 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1127530A (zh) * 1993-06-01 1996-07-24 菲利普莫里斯生产公司 腐胺n-甲基转移酶，编码腐胺n-甲基转移酶的重组dna分子，生物碱含量减少的转基因烟草植物
US20110257369A1 (en) * 2008-10-17 2011-10-20 University Of Maryland Methods for removing nicotine and other alkaloids from soluble leaf proteins in solanaceous and other plant species
CN101870998A (zh) * 2010-07-13 2010-10-27 四川农业大学 一种植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法
WO2012088295A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 The Chinese University Of Hong Kong A cost-effictive method for expression and purification of recombinant proteins in plants
CN103145817A (zh) * 2013-02-28 2013-06-12 华南农业大学 黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14及其编码基因和应用
CN104928317A (zh) * 2015-06-09 2015-09-23 昆明理工大学 烟草赤霉素合成转录调控因子基因的植物表达载体及其应用
CN105603047A (zh) * 2015-12-31 2016-05-25 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘华山等: "外源植物生长调节物质对烟草根中烟碱含量和烟碱合成酶活性变化的生理效应", 《植物生理学通讯》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cook et al. Swainsonine and endophyte relationships in Astragalus mollissimus and Astragalus lentiginosus
Mannini et al. Field performance and wine quality modification in a clone of Vitis vinifera cv. Dolcetto after GLRaV-3 elimination
Orozco et al. Two-carbon metabolites, polyphenols and vitamins influence yeast chronological life span in winemaking conditions
CN104422741B (zh) 一种基于氨基酸的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法
Wang et al. Chemical ingredients characterization basing on 1H NMR and SHS-GC/MS in twelve cultivars of Coffea arabica roasted beans
CN111139214B (zh) 用于提取细胞核的液体及其应用
Salminen et al. Influence of temperature on alkaloid levels and fall armyworm performance in endophytic tall fescue and perennial ryegrass
Ullrich et al. Discrimination of wild types and hybrids of Duboisia myoporoides and Duboisia leichhardtii at different growth stages using 1H NMR-based metabolite profiling and tropane alkaloids-targeted HPLC-MS analysis
Steel et al. Thresholds for Botrytis bunch rot contamination of Chardonnay grapes based on the measurement of the fungal sterol, ergosterol
Marcheafave et al. The main effects of elevated CO2 and soil-water deficiency on 1H NMR-based metabolic fingerprints of Coffea arabica beans by factorial and mixture design
CN109321544A (zh) 一种提高烟叶提取物中腐胺n-甲基转移酶的提取方法
de Melo et al. Screening and identification of tannase-producing fungi isolated from Brazilian caves
Al-Abdalall Assessment of yield loss caused by root rots in wheat and barley
CN109321536A (zh) 一种提高烟叶提取物中氧化酶酶活的提取方法
CN109293733A (zh) 一种适用于新鲜烟草叶片全蛋白的提取方法
CN109321537A (zh) 一种提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活的提取方法
CN109321550A (zh) 一种提高烟叶提取物中淀粉酶酶活的提取方法
Lim et al. Rapid and nondestructive discrimination of Fusarium asiaticum and Fusarium graminearum in hulled barley (Hordeum vulgare L.) using near-infrared spectroscopy
CN109321540A (zh) 一种提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法
CN111398497B (zh) 犬尿喹啉酸在鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的应用
Gamal et al. Trichoderma viride bioactive peptaibol induces apoptosis in Aspergillus niger infecting tilapia in fish farms
Noor et al. Ectopic growth of the Chaetothyriales fungal symbiont on Ipomoea carnea
Najafabadi et al. Quantification of ergovaline using HPLC and mass spectrometry in Iranian Neotyphodium infected tall fescue
Lando et al. Cellular alteration and differential protein profile explain effects of GA3 and ABA and their inhibitor on Trichocline catharinensis (Asteraceae) seed germination
Gasser et al. Fusarium proliferatum secondary metabolite profile in vitro depends on the origin of the isolates and is clearly reduced in stored garlic

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190212