CN104928317A - 烟草赤霉素合成转录调控因子基因的植物表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草赤霉素合成转录调控因子基因的植物表达载体及其应用，属于基因工程领域，本发明用烟草合成转录调控因子基因RSG的cDNA构建植物表达载体pk2-35S-RSG，并通过农杆菌介导转入植物中，使植物提高对铝胁迫的耐受能力，克服植物本身抗铝胁迫能力低的缺点；实验结果表明在烟草中过量表达赤霉素合成转录调控因子RSG基因，增强了烟草对于铝胁迫的抗性，使烟草在较高浓度的铝胁迫下根伸长几乎不受影响；赤霉素的显著性上升能也说明了在高浓度铝胁迫下RSG过表达转基因烟草的耐铝能力强于野生型。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及烟草赤霉素合成转录调控因子基因RSG植物表达载体及其在缓解铝胁迫能力增强的转基因植物中的应用。
背景技术
在自然界中，铝通常以难溶性的硅酸盐或氧化铝的形式存在，对植物的生长是没有毒害的。但在土壤酸化过程中，土壤的pH值会下降，当 pH低于5.0时铝离子就会从硅酸盐或氧化物中释放出来，并且溶解到土壤中，以Al3+的形式存在。在酸性土壤环境中，不溶性的铝化物转变为溶解状态的铝(Al3+)，进入土壤对植物产生毒害作用，甚至微摩尔水平的Al3+就能对植物产生严重的毒害效应。铝对植物的毒害作用主要是:影响细胞内正常信号转导途径等；铝离子与DNA/RNA结合干扰基因的复制和转录；影响细胞质膜上膜脂的流动性；影响细胞核的正常功能；影响植物根系对营养物质的吸收。铝毒对植物最显著的影响就是抑制根的生长，主要表现为根的伸长生长受到抑制，主根和侧根的根冠脱落，并且变粗短，根部颜色也变为褐色并弯曲膨大，表皮细胞也受到一定程度的损害；同时铝毒对植物叶片也有相当大的损害，会导致植物叶片数变少且发黄卷曲，光合作用过程受到抑制，植物碳、氮代谢、矿物质和水份的吸收均受到很大影响。
RSG（REPRESSION OF SHOOT GROWTH）是从烟草中被分离出来的一种转录激活因子，它含有一个碱性亮氨酸拉链结构域（bZIP），含有一个酸性结构域，在蛋白结构靠近N端有一个苯丙氨酸聚集区，在它的C端有一个丝氨酸富集区和一个谷氨酰胺富集区可能是转录激活结构域。在拟南芥基因组序列中包含bZIP家族中75种不同成员，其中有将近50个在文献中没有报道。RSG参与调解内源性GAs的含量，通过结合并激活拟南芥GA3[编码在GA生物合成途径上的内根-贝壳杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO：GA合成代谢的关键酶）启动子，从而参与调控内源性GAs的量。负显性的RSG抑制了转基因烟草中KO基因的表达。这个下调减少了内源性GAs的量，并且严重抑制了茎细胞伸长过程，导致植株矮化。因此，RSG通过控制内源性GAs的量来控制植物的形态。尽管GA的生物合成限于特定区域（包括生长活跃区和伸长组织），但RSG在植物组织中的表达无处不在。这种不一致表明它是一个参与转录后和翻译后修饰的转录因子。一种可能的RSG调节功能的机制是：RSG与辅助蛋白（包括不同的转录活化物，阻遏物，一般转录因子，共激活物或伴侣蛋白）的相互作用。
RSG能调节控制GAs生物合成酶来控制内源性GAs的量。在植物组织中，RSG的普遍表达表明：它是一个参与转录后和翻译后修饰的转录因子。在植物体内只有少数具有活性的GAs分子（如GA1和GA4等）就调控生物体细胞伸长、叶片延展，茎秆延生和开花等形态发生等多方面。在之前的报道中，RSG严格调控KO和GA20ox基因的表达从而控制内源性GAs的合成，而这种调控又受到外界环境及植物发展本身的影响。Atga3突变体拟南芥由于KO基因和功能欠缺，导致植株表型出现矮化。采用自然突变得到的矮化水稻Tan-Ginbozu是赤霉素缺陷型突变体，其GAs合成过程中，由于KO和GA20ox催化的步骤受阻，从而影响了GAs的合成，结果导致植株矮化。目前编码KO的基因在水稻、拟南芥、豌豆、玉米、南瓜、甜叶菊等植物中相继得到克隆，同时，也报道了草莓、桃和苹果多年生果树上得到了的部分cDNA片段。而采用反义抑制表达技术构建的抑制表达RSG或GA20ox的烟草植株同样发现，烟草出现显著的矮化现象，同时叶片呈暗绿色且表面呈现显著的凹凸样，且花朵和种子量均显著低于对照组烟草，对内源性活性的赤霉素GA1的测定结果表明，GA1的量明显低于对照组，约为对照组的七分之一。而过表达35S：RSG的转基因烟草，植物生长的更高，叶片数和花朵种子的数量也都显著高于对照组，茎秆也相对更粗，这说明RSG能通过调节内源性GAs的量来调控植物形态的建成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有烟草赤霉素合成转录调控因子基因（即RSG基因）的植物表达载体pk2-35S-RSG，同时提供该载体的构建方法，以及利用该载体制备耐受铝胁迫的转基因植物的应用。
本发明所提供的载体含有烟草赤霉素合成转录调控因子基因、CaMV35S强启动子，所述的赤霉素合成的转录调控因子基因RSG的cDNA来源于烟草（Nicotiana tabacum），GenBank登录号为AB040471.1。
上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pMD18-T(购于大连TaKaRa生物公司)。
本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的：
1、 植物表达载体的构建
（1）从GenBank中查找烟草RSG基因的cDNA序列，并设计一对序列如下的引物：
上游引物 5' GGATCCATGGACCCGAAGTTCAGCGGAAAGC 3'（含有BamHI位点）；
下游引物 5' CTCGAGTCAACCCCTGTTATTGAAGTTCATG 3'（含有XhoI I位点）；
上游引物5'端加 GGATCC 特征序列，并由此形成BamHI酶切位点；下游引物3'末端加XhoI I酶切位点，以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到RSG基因的全长cDNA。
（2）回收并纯化RSG全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD-18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-T-RSG。
2、构建入门克隆载体pENTR-2B-NtRSG，用BamHI和XhoI酶切pMD18-T-RSG和pENTR-2B，回收RSG的cDNA片段，通过连接酶亚克隆到pENTR，得到入门克隆载体pENTR-RSG；
3、构建植物过表达载体pK2-35S-RSG，通过Gateway技术的LR反应把RSG亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得RSG基因的植物表达载体pK2-35S-RSG。
本发明的植物表达载体对那些能实施转基因操作的植物都适用，如烟草、拟南芥、矮牵牛、非洲菊等，在本发明的实施中以烟草为例说明该表达载体的应用过程。
4、农杆菌浸染烟草
使用叶盘转化法，以根癌农杆菌C58C1为媒介，转染烟草15-20 min，浸染成功后的烟草外植体，放置于MS1培养基（含3%蔗糖）黑暗条件下共培养48 h，再转移至MS4（含3%蔗糖、50μg/ml卡拉霉素和100μg/ml 头孢霉素）发芽培养基上分化愈伤组织并诱导出芽，在培养条件（日间30℃/夜间25℃，12 h光照，200 lx）约25 d 后，转染成功的外植体会分化出转基因小苗，剪取小苗并继代与MS（含2%蔗糖、50 μg/ml卡拉霉素和100μg/ml头孢霉素）琼脂糖培养基中进行传代培养一次，以抑制农杆菌生长，以后传代则可以在无抗性的生根培养基MS琼脂糖培养基中培养。
5、RSG基因插入情况的检测
为了检测目的基因RSG是否插入有卡那霉素抗性和头孢霉素抗性的植株烟草的基因组，以抗性苗的基因组为模板，利用RSG上下游引物做PCR检测，PCR扩增产物片段长度与理论值相符，说明目的基因RSG已插入到烟草基因组中。
6、RSG基因转录水平的检测
为了检测目的基因RSG在转基因烟草中是否转录，提取转基因苗的RNA，提取可溶性蛋白，分离蛋白，利用Western-blot检测，说明目的基因RSG已在转基因烟草中正常转录。
7、RSG基因过表达后植物根长度的检测
为了检测目的基因RSG过表达烟草中对铝的耐性是否提高，选取经RT-PCR检测正确的转基因株系的嫩叶，对根伸长进行了检测，测定结果显示，RSG过表达烟草根伸长率明显高于野生型，说明RSG的过量表达能够缓解铝胁迫对烟草根伸长的影响。
8、RSG过表达烟草赤霉素含量的检测
以转基因烟草RO3和RI10为材料，经50 μM铝处理12 h后，以WT烟草味对照，对转基因烟草的根部赤霉素含量进行了测定，结果发现RSG过表达烟草RO3的赤霉素含量明显高于WT烟草；而RSG抑制表达烟草的赤霉素含量比WT烟草明显要低。这说明RSG的过量表达能够缓解铝胁迫对烟草根伸长的影响与赤霉素有关。
附图说明
图1是本发明载体pMD18T-RSG的构建图；
图2是本发明 RSG植物过载体载体pK2-35S-RSG构建示意图；
图3是本发明过表达RSG转基因烟草基因组插入水平检测结果示意图；
图4是本发明过表达RSG转基因烟草基因组转录水平检测结果示意图；
图5是本发明过表达RSG转基因烟草基因组蛋白表达水平检测结果示意图；
图6是本发明铝胁迫对转基因烟草根伸长率影响示意图；
图7是本发明赤霉素测定标准曲线；
图8是本发明铝胁迫对RSG转基因烟草赤霉素含量的影响结果示意图。
具体实施方式
试剂与仪器：
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。Taq plus DNA聚合酶、dNTP mixture、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)等购自大连TaKaRa生物公司，M-MLV反转录酶购于 Promaga公司，BamHI和XhoI来自北京天根生物公司，质粒快速提取试剂盒和胶回收试剂盒分别购自北京博泰克生物公司和上海生物工程有限公司，ECL荧光显影试剂盒和GST琼脂糖凝胶柱购自上海康为世纪生物公司，HRP标记抗体来源于Solarbio公司，弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂购自Sigma公司，AMP（氨苄青霉素）等抗生素、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）等试剂均为国产分析纯试剂。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所有引物序列均在大连宝生物公司合成。
本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：RSG基因cDNA的PCR扩增及TA克隆
从GenBank中查找烟草RSG基因的cDNA序列，并设计一对序列如下的引物：
上游引物 5' GGATCCATGGACCCGAAGTTCAGCGGAAAGC 3'（含有BamHI位点）
下游引物 5' CTCGAGTCAACCCCTGTTATTGAAGTTCATG 3'（含有XhoI I位点）；
上游引物5'端加特征序列，并由此形成BamHI酶切位点；下游引物3'末端加XhoI I酶切位点，以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到RSG基因的全长cDNA。
取处理后的烟草叶片0.2g（Fresh weight，FW）迅速冷冻于液氮中，采用TRI-ZOL法，按Invitrogen公司TRI-ZOL Reagent说明书粗提取总RNA，用25μl DEPC处理水（千分之一）溶解RNA，取1μl进行电泳，电泳图中RNA为三条带且无基因组、蛋白质条带、5S条带最弱为好。再取2.5μl总RNA按照Fermentas公司M-MLV反转录酶说明书反转录。反转录过程：15μl 体系（4 μl Oligo（dT）、3μl RNA、8 μl DEPC处理水），72℃金属浴10 min后，迅速冰浴5min，再添加1μl dNTP mixture (2.5mM)、1μl RNAase inhibition 、1.5μl 反转录酶、5μl 5×反转录buffer，40℃保持65min，使cDNA充分延伸，完成后再迅速置于70℃中，使反转录酶变性，5min后取出，即获得烟草cDNA。
TA克隆载体pMD18-T-RSG的构建（见图1），以野生型烟草cDNA为模板，先使用烟草18S内参检测cDNA反转录效果以确定模板的浓度，接着扩增RSG基因CDS编码区，使用引物NtRSG-F和NtRSG-N进行扩展，根据基因大小按1k bp/1 min的标准确定延伸时间，通过梯度PCR确定退火温度。PCR体系（20μl）：1μl cDNA、0.5μl NtRSG 5ˊ、0.5μl NtRSG 3ˊ、2μl taq plus DNA 聚合酶、2μl DNA buffer 和 14 μl 超纯水。反应过程：94℃变性5min、29个循环（94℃变性0.5min、53℃（或62℃）退火结合0.5min、72℃延伸1min20s）、72℃延伸9min，其中NtRSG的退火温度为53℃、62℃。
PCR产物经胶回收和凝胶电泳后，用凝胶成像仪（Bio-rad）上Volume Rect Tool工具对条带进行积分处理，按基因条带与载体条带浓度5:1进行TA克隆，TA克隆体系（6μl）：2μl 约200 ng/μl的NtRSG、0.5μl 约40 ng/μl 的pMD-18T、3.5μl Ligation Solution I。洗打混匀后旋转离心5s，于16℃金属浴8 h，采用热刺激转化法将TA克隆质粒转化DH 5α，经37℃、200rpm 50min后，室温11000rpm 离心5min，再涂布与含AMP抗性LB培养基中，37℃培养8 h。挑取6-8个单菌落，接种到含AMP液体LB培养基中培养8 h，采用碱裂解法手工提取质粒，经BamHI和XhoI单、双酶切和PCR检测正确，送2ml菌液至华大基因进行测序，测序结果经Aligament软件比对后，正确的进行后续实验。
实施例2：NtRSG入门克隆载体pENTR-2B-NtRSG和植物过表达载体pK2-35S-RSG的构建
将实施例1中TA克隆并测序成功的pMD18-T-RSG与实验室之前检验正确的pENTR-2B空载进行BamHI和XhoI双酶切并割胶回收，并将RSG基因回收片段，通过连接酶亚克隆到pENTR上，获取入门克隆载体pENTR-RSG，植物表达载体的构建通过Gateway LR reaction技术来构建植物过表达载体pK2-35S-RSG，LR反应质粒需通过质粒纯化试剂盒进行纯化，转化成功后的重组载体需要通过Spe(壮观霉素)的抗性LB培养基进行筛选。构建策略如图2所示，植物表达载体会通过T-DNA插入的方式，重组整合到烟草基因组中，并表达RSG基因，过表达载体pK2-35S-RSG由CaMV 35S强启动子组成型表达，烟草RNA酶 Dicer会将这种结构内切为22 bp左右的小RNA双链（si RNA），并引发RNA同源干扰，从而从转录水平降低RSG蛋白表达，从而获得含过量表达RSG转基因烟草植株。
实施例3：农杆菌浸染烟草及转基因烟草的培养与筛选
使用叶盘转化法，以根癌农杆菌C58C1为媒介，转染烟草15-20 min，浸染成功后的烟草外植体，放置于MS1培养基（含3%蔗糖）黑暗条件下共培养48 h，再转移至MS4（含3%蔗糖、50μg/ml卡拉霉素和100 μg/ml 头孢霉素）发芽培养基上分化愈伤组织并诱导出芽，在培养条件（日间30 ℃/夜间25 ℃，12 h光照，200 lx）约25 d 后，转染成功的外植体会分化出转基因小苗，剪取小苗并继代与MS（含2%蔗糖、50μg/ml卡拉霉素和100μg/ml头孢霉素）琼脂糖培养基中进行传代培养一次，以抑制农杆菌生长，以后传代则可以在无抗性的生根培养基MS琼脂糖培养基中培养。
实施例4：过表达转基因烟草基因组插入和转录水平检测
待传代培养的转基因小苗生长成熟后，分别剪取2份各0.1g 烟草叶片材料，掷与液氮中冷冻并于-80℃保存，用于基因组和RT-PCR检测。
pK2-35S-RSG基因组插入情况检测：采用CTAB法对烟草基因组进行提取，具体过程如下：1）取冻存与-80℃中的样品0.1 g于干净的1.5 ml EP管中，加液氮冷冻并研碎后，加入0.9 ml 2×CTAB buffer（2% CTAB、0.02 M EDTA、1.4 M NaCl、0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)）（65℃水浴预热）并继续研磨混匀后，置于65℃水浴锅中（每隔5 min取出并用力摇匀），30 min后取出EP管并置于冰上冷却。2）加入500 μl异戊醇－氯仿混合液（1：24）用力摇晃混匀以沉淀蛋白，室温、12000rpm下离心15 min后将上清转移至1.5 mL EP管。3）取上清置于新的1.5 mL EP管中，重复操作2一次。将上清转移至新的EP管并加入1/10体积的3 M醋酸钠（pH5.2）和约450 ml异丙醇，摇匀后置于-80℃中沉淀1h。4）沉淀结束后，取出EP管于4℃、12000 rpm下离心30 min，倒掉上清并用70%-75%无水乙醇洗涤两次后（4℃、11000 rpm、10 min），真空干燥或自然干燥，用TE buffer（含0.6% RNAase）完全溶解，置于37℃恒温培养箱里消化30 min以上，使RNA消化完全，取1μl进行电泳检测，条带清晰无蛋白和RNA污染为好，剩余置于-20℃下保存备用。
pK2-35S-RSG基因组插入情况检测：采用TRI-zol法对烟草RNA进行提取，通过PCR进行检测，过程同实施例1。
实施例5：过表达RSG转基因烟草RSG蛋白表达水平检测
取pK2-35S-RSG转基因烟草叶片各0.1 g，并以WT烟草为对照，提取植物可溶性蛋白。提取方法：取0.1g 0、1、3、5、7 d经处理的烟草叶片，经液氮冷冻后充分研磨至发白状粉末，加入1.5 ml蛋白粗提液（0.1M NaCl、0.01M HEPES-KOH (pH7.5)、15 %甘油、1 mM苯甲基磺酰氟、0.2%Triton-100、1mM EDTA，迅速混匀，带解冻后，用研棒缓慢混匀后，静止1min，至细胞充分分开悬浮并裂解，将细胞裂解液转移至新的2 ml EP管中，4℃、11000rpm离心10 min，取出上清液并加入饱和的硫酸铵溶液，至蛋白沉淀完全，4℃、11000rpm离心10 min收集粗蛋白，并重新溶解于0.5 ml PBS buffer中，粗蛋白浓度采用Bradford标准曲线法测定。测定蛋白浓度后，各取40 g总蛋白进行SDS-PAGE(12%)电泳以分离蛋白，电泳结束后通过转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上，烟草anti-RSG蛋白的兔多抗作为一抗与PVDF膜在4℃、40 rpm下孵育10 h，孵育后的膜分别与HRP标记的二抗（羊抗兔）在常温、40rpm下孵育2 h。最后用ECL试剂盒进行显影并进行观察。
实施例6：过表达RSG转基因烟草的获取与鉴定
通过酶切连接以及LR反应成功构建烟草RSG过表达载体pK2-35S-RSG，它们的T-DNA插入结构分别如图2所示，这个植物表达载体带有Km（卡拉霉素）抗性，并且它在转基因烟草中的表达由组成型启动子p35S(CaMV 35S启动子)进行控制，组成型表达RSG和RSG RNAi发卡结构（siRNA）。用这个植物表达载体，利用根癌农杆菌介导转染WT烟草，共获得具有Km抗性的RSG过表达烟草植株共4株（RO1、RO2、RO3和RO4），分别提取基因组为模板并进行PCR分析检测，发现所有共4个株系的转基因烟草基因组中均有RSG的插入（图3）；RT-PCR检测表明这4株Km抗性植物的转录水平均比WT烟草高，通过对PCR条带进行积分发现，转录水平最高的为RO3（图4）。
为了分析过表达RSG转基因烟草中RSG蛋白的表达情况，通过提取转基因烟草总蛋白，并用Anti-RSGp抗体进行Western blot分析，如图5所示，所有4株转基因烟草中RSG的含量均比WT烟草要高，RSG含量从大到小顺次是RO3、RO2、RO1和RO4，浓度分别为WT烟草的这说明3.6、3.1、2.9、2.6倍。通过基因组PCR、RT-PCR和Western blot蛋白水平分析，说明RSG基因已成功插入到烟草的基因组里，并在p35S控制下，组成型转录表达并能大量翻译出RSG蛋白（~38kD），其中RO3的RSG过表达效果最好。
在MS（含2%蔗糖）培养基上，12株转基因植物的生长与表型与WT烟草表现一致，无没有明显的形态学差异。同时，对RSG转基因烟草的赤霉素的含量进行检测，如图4所示，RO3转基因烟草的赤霉素含量最高，分别约为WT烟草的1.36倍。对Wester blot和赤霉素含量检测正确的烟草RO3进行继代组培，用于后续实验。
实施例7：RSG转基因烟草根伸长的检测
植物材料的培养：选取无菌培养下个体大小、长势相当的WT烟草和RSG过表达（RO3）和抑制表达（RI10）烟草，剪取相同部位含3片叶片的顶芽，继代到MS琼脂糖培养基中在相同培养条件（25 ℃，12 h光照，200 lx）下处理18 d，每组12个重复。
烟草铝胁迫处理：分别选取大小形态均一、长势相同的12株转基因烟草和WT烟草，移出后，用清水清洗根部以去除培养基，在自来水中进行悬浮培养。5天换水一次，3周后待烟草长势均一后选取6株转入到新的自来水（含50 μM Al3+）中进行铝胁迫实验。铝胁迫实验先用pH4.3的0.5mM CaCl2预处理过夜后，记录铝处理前的根长度，然后置于不同浓度的50 μM的AlCl3溶液（含有0.5mM CaCl2，pH 4.3）分别处理0、2、4、8、12、24 h后，记录铝处理后的根长度。
根长和鲜重的测定：在50 μΜ Al3+溶液或添加10μM GA（或0.5μM PAC）中处理转基因烟草和WT烟草12 h后，分别测量处理前后鲜重变化量，按公式：（（铝处理后的根长-铝处理前的根长）/（未经铝处理后的根长-未经铝处理前的根长））×100计算相对根伸长率（Relative Root Growth，RRG）。
转基因烟草RO3经50 μM铝处理12 h后，以WT烟草为对照，对转基因的根伸长进行了测定，结果发现RSG过表达烟草RO3的根伸长率明显高于WT烟草，约为WT烟草的2.13倍；而RSG抑制表达烟草的根伸长率的抑制比WT烟草更为严重，只有WT烟草的0.75倍（图6）。这说明RSG的过量表达能够缓解铝胁迫对烟草根伸长的影响。
实施例8： RSG转基因烟草赤霉素含量检测
为了进一步分析转基因烟草提高烟草对铝耐受能力是否与赤霉素有关，以转基因烟草RO3为材料，经50 μM铝处理12 h后，以WT烟草味对照，对转基因烟草的根部赤霉素含量进行了测定，测定方法如下：
1、制作标准曲线：
用95％乙醇配制GA3母液（100μg/mL），再分别用双蒸水配制浓度为0、1、2、3、4、6、12、18 μg/mL的标准赤霉酸（GA3）溶液。各取2mL与3mL浓硫酸反应（生成三环芳烃衍生物）后，测定反应产物在412 nm处的吸光值A，制作标准曲线，如图7。
2、样品的测定：
(1) 采取植株相同部位0.2 g新鲜叶片样品，剪碎，置于20 mL 4 ℃预冷的80%甲醇溶液中，低温研磨匀浆，4℃搅拌过夜；
(2) 用0.4mm孔径滤膜过滤，残渣再用80%甲醇溶液冲洗3次，第一次2小时，后2次半小时，将所有滤液合并；
(3) 抽真空浓缩至原体积的1/3；
(4) 等量石油醚脱色（2次），将下层甲醇溶液除去，取上层石油醚部分；
(5) 加0.2 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），振荡30 min，过滤；
(6) 用0.5 mol·L-1 的HCL将滤液调至pH=3.0；
(7) 先用等体积乙酸乙酯萃取1次，用分液漏斗萃取酯相，取水相再用乙酸乙酯萃取2次，合并酯相，沸水浴蒸干；
(8)冷却后加2 mL 95％的无水乙醇，再加入85%的浓硫酸3 mL，摇匀，放置20 min；
(9) 用紫外可见分光光度计在412 nm测OD值。
3、结果计算：
按公式计算：GA的含量（ng/g）=C·V/a/（FW·107）
C—按标准曲线方程求得的GA量；V—提取液量；
a－测试样品液体积；FW—叶片组织鲜重min；
结果如图8发现RSG过表达烟草RO3的赤霉素含量明显高于WT烟草，约为WT烟草的1.63倍。这说明RSG的过量表达能够缓解铝胁迫对烟草根伸长的影响。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 烟草赤霉素合成转录调控因子基因的植物表达载体及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggatccatgg acccgaagtt cagcggaaag c 31
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgagtcaa cccctgttat tgaagttcat g 31
Claims (2)
1.烟草赤霉素合成转录调控因子基因的植物表达载体，所述载体含有烟草赤霉素合成转录调控因子基因、CaMV35S强启动子，GenBank登录号为AB040471.1。
2.权利要求1所述的烟草赤霉素合成转录调控因子基因的植物表达载体在缓解铝胁迫能力增强的转基因植物中的应用。
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