CN110066783A - 一种无自切形式的微纤溶酶制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，包括步骤有：S1、无自切方式人微小纤溶酶的重组发酵；步骤S1中包含步骤：S12、液体发酵培养，在液体发酵培养过程中加入(NH4)2SO4和蔗糖。无自切形式的微纤溶酶制备方法解决现有技术中不能既避免因pH过低导致微纤溶酶酸水解同时又避免因pH值过高而导致微纤溶酶的自身催化降解的问题。

Description

一种无自切形式的微纤溶酶制备方法
技术领域
本发明涉及酶制备方法，具体涉及一种无自切形式的微纤溶酶制备方法。
背景技术
纤维蛋白溶解酶(纤溶酶)是一种来自纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶，纤溶酶原是哺乳动物血液的重要成分。人纤溶酶原(Plasminogen，Plg)是由791个氨基酸残基组成的多结构域蛋白，由N端活化前结构域、5个同源的Kringle结构域(每个大约80个氨基酸)、一个丝氨酸蛋白酶催化结构域和结构域间的连接序列组成，分子量大约为92000道尔顿，是人体纤溶系统的关键成分之一，用纤溶酶切割人纤溶酶原N端Arg68-Met69，或Lys77-Lys78或者Lys78-Val79之间的肽键，产生缩短的酶原，称为赖氨酸-纤溶酶原。由弹性蛋白酶进一步切割去除前4个Kringle结构域，产生另一个酶原，小纤溶酶原(通常是442-791位氨基酸)，进一步切掉第五个Kringle，得到微小纤溶酶原(通常是543-791位氨基酸)。纤溶酶原的Kringle区域含有赖氨酸结合位点，它们介导纤溶酶原与底物如纤溶蛋白的特异性结合，在Arg561与Val562之间的肽键进行切割，使纤溶酶原的酶原形式活化为它们具有酶活的形式，产生与相应蛋白质的由二硫键连接的双链形式，纤溶酶原蛋白活化的产物被称为纤溶酶，因此Lys-纤溶酶原活化的产物称为Lys-纤溶酶，而小纤溶酶原和微小纤溶酶原活化后的产物被称为小纤溶酶和微小纤溶酶。纤溶酶(Plasmin，Plm)，不仅发挥纤溶作用，溶解血栓，而且参与体内一系列与蛋白质水解有关的生理、病理过程。由于Plg分子量很大且非常柔韧，难以获得完整晶体，故其精确结构的确定受到限制，影响了结构和功能的深入研究。
人微小纤溶酶原(microplasminogen，mPlg)是Plg 543～791位间的249个氨基酸组成的肽链，有6对二硫键，不包括Plg的NTP、K1～K5区，但保留了纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶(SP)区，被纤溶酶原激活剂激活后(将Arg19-Val20切断)形成人微小纤溶酶(微纤溶酶，Ocriplasmin又称microplasmin，mPlm)，具有Plm的纤溶活性。mPlm包含两条多肽链，一条重链A通过两条二硫键与一条轻链B相连，A链与B链之间由两对二硫键相连接，这对二硫键对活性中心的形成十分重要，B链包含丝氨酸蛋白酶催化结构，纤溶酶在体内能够溶解血凝块，显示其丝氨酸蛋白酶催化活性，特征结构图为图一。
第一种将Ocriplasmin用于临床的药物是ThromboGenics研发的Jetrea。2012年10月18日，美国食品药品管理局(FDA)和ThromboGenics宣布，已批准Jetrea(Ocriplasmin)用于治疗症状性玻璃体黄斑粘连(VMA，是一种年龄相关性玻璃体后脱离(PVD)，即后玻璃体与内限制膜分离不完全的情况)。Jetrea是首个获得该适应证的药物。Ocriplasmin可降解眼中参与VMA发生的蛋白质。这些蛋白质的降解有助于玻璃体与黄斑的分离。该病的另一种治疗选择是玻璃体切除术。
Ocriplasmin能够降解构成血栓的主要成分—纤维蛋白，治疗血栓方面有着显著的疗效，以及相对较小的副作用。Ocriplasmin在眼睛内具有降解连接玻璃体和视网膜的蛋白质支架的潜力。这可能有助于治疗一些重要的眼科适应症，如症状性玻璃体粘连。
纤溶酶原或纤溶酶存在一些获取和应用障碍，人纤溶酶原分子量较大，利用一些宿主细胞如大肠杆菌、哺乳动物细胞等表达较困难，表达效率比较低；而且人纤溶酶的分子量较大，使其作为药物进行治疗机体疾病时扩散较慢，影响疗效。重组人纤溶酶原或人纤溶酶的截短形式(Ocriplasmin)能够从一定程度上解决以上所述困难。有研究报道使用人微纤溶酶用于治疗眼部疾病，或作为玻璃体切除术的辅助药物，在玻璃体的注射位置向玻璃体视网膜接触面的扩散不会受到太大阻碍(CN 100577202C)。
纤溶酶和多种蛋白酶一样，会发生自身催化性蛋白水解，即自溶降解。早在1960年代早期，确立了纤溶酶在酸性pH下较稳定。但是有报道称即使将纤溶酶保存在pH3.8条件下，仍有部分位点发生自催化降解，而pH再降低到一定程度，纤溶酶的自身催化降解作用会减弱，但会有酸水解因素导致其不稳定(W001/36608)。专利US5879923中提到另外一种方法是添加寡聚多肽复合物(oligopeptidic compounds)，可以稳定纤溶酶。专利WO93/15189提到将纤溶酶聚乙二醇化也可以增加纤溶酶稳定性。但是上述报道都没有从制备过程解决纤溶酶自溶降解的问题。
微小纤溶酶会自切降解导致自身失去活性，非还原电泳不能看出断裂情况，还原电泳可以可出断裂情况，微小纤溶酶全长约27000道尔顿，断裂后为约17000道尔顿和约10000道尔顿(自切位点在K156–E157、K166–V167、R177–V178，如图二所示)。目前的尚未见有文献或者专利报道在制备过程中解决微小纤溶酶的自切问题。
发明内容
本发明要提供一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，解决现有技术中不能既避免因pH过低的酸水解因素导致微纤溶酶稳定同时又避免因pH值过高而导致微纤溶酶的自身催化降解的问题。
为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
本发明提出了一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，包括步骤有：S1、无自切方式人微小纤溶酶(以下称微纤溶酶)的重组发酵；
步骤S1中包含步骤：S12、液体发酵培养，在液体发酵培养过程中加入(NH4)2SO4和蔗糖。
为了避免影响第一发酵过程中微纤溶酶的生长，使得能够快速增长一部分微纤溶酶，同时，为了避免后续微纤溶酶较多时因微纤溶酶自身酶活性较大而导致微纤溶酶存在较少，提高最后微纤溶酶的得到量：S12、液体发酵培养包括以下步骤：
S121、第一次发酵：将上灌种子液放入到培养液中培养，得到接种后培养基；
S122、饥饿培养：直至接种后培养基中菌体湿重到230-250g/L后，对接种后培养基进行饥饿培养0.5-1.0h；
S123、第二次发酵：
S1231、在步骤S122结束后，开始向接种后培养基中流加诱导补液，诱导补液的流加速度为3.6ml/h～13.625ml/h每升接种后培养基体积，诱导补液包含：甲醇、DDW以及甘油；
S1232、开始流加(NH4)2SO4和蔗糖直至发酵结束，保持在接种后培养基中(NH4)2SO4浓度为0.10mol/L～0.50mol/L且蔗糖为接种后培养基体积的3％～17％；
S1232、诱导36～60h结束发酵，得到发酵液。
为了保证微纤溶酶的生长有较好的培养液支持，步骤S121中培养液为FM-22培养液，步骤S121中按照上罐种子液与FM-22培养液的体积比为5％将上罐种子液接种于含有FM-22培养液的发酵罐中。
进一步为了保证微纤溶酶的生长有较好的培养液支持，FM-22培养液包括以下组份：KH2PO4 9.4g/L、CaCl2·2H20 0.28g/L、MgSO4·7H20 4.6g/L、(NH4)2SO4 15.7g/L以及甘油40g/L。
为了避免在离心分离过程中微纤溶酶自身降解，步骤S1中还包含步骤：S13、分离得发酵上清液；
S13、分离得发酵上清液包括：
S131、向发酵液中添加(NH4)2SO4得到分离液，保持分离液中含有0.3mol/L～0.7mol/L的(NH4)2SO4；
S132、将分离液放入到离心机中，以6000rpm～10000rpm离心10分钟；
S133、步骤132结束后，收集发酵上清液。
为了得到较纯的Ocriplasmin，该无自切形式的微纤溶酶制备方法还包括：S2、对发酵上清液进行纯化。
为了提高Ocriplasmin的纯化率，对发酵上清液进行纯化包括以下步骤：
S21、酶切激活前纯化，捕获和纯化收集发酵样品中的Ocriplasmin；
S22、采用一定比例的酶切激活Ocriplasmin，使其变为具有酶切活性形式的。
S23、酶切激活后纯化收集完整形式的Ocriplasmin。
优选的是，步骤S21所述的酶切激活前捕获和纯化，采用phenyl柱捕获，采用SP柱和30s柱纯化。
优选的是，步骤S22所述的的酶为尿激酶、葡激酶和/或链激酶。
优选的是，步骤S23所述的酶切后纯化收集方式采用的是phenyl柱层析方式。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
由于微纤溶酶的自身酶活性或导致微纤溶酶自身降解(也就是：微纤溶酶发生自切现象)，(NH4)2SO4和蔗糖的添加，降低了微纤溶酶的自身酶活性，也就降低了微纤溶酶自身降解几率，(NH4)2SO4和蔗糖对微纤溶酶的稳定性没有影响，仅是改变了其酶活性，因此提高了微纤溶酶的得到量，减少了材料成本的使用，提高了市场竞争力。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为SEQ：ID NO:1为Ocriplasmin的基因序列。
图2为SEQ：ID NO:2为Ocriplasmin的蛋白序列。
图3为Ocriplasmin的结构图。
图4为Ocriplasmin的发酵电泳图。
图5为Ocriplasmin的纯化电泳图。
图6为Ocriplasmin的酶激活后纯化电泳图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与作用更加清楚及易于了解，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步阐述：
S1、无自切方式人微小纤溶酶的重组发酵：
S11、种子液培养：
S111、第一次培养：将重组工程菌种(含编码Ocriplasmin基因序列的毕赤酵母工程菌)接种于含100ml YPG液体培养基的第一容器中，在环境温度为28℃且搅拌速度为220rpm条件下培养24小时，得到第一容器种子液；
S112、第二次培养：按第一容器种子液与YPG培养液的体积比为1％，将第一容器种子液转接到含YPG培养液第二容器中(每个第二容器中装250ml YPG培养基，共4瓶)，在环境温度为28℃且搅拌速度为220rpm条件下，培养经过一晚，得到上罐种子液；
S12、液体发酵培养：
S121、第一次发酵：
S1211、按照上罐种子液与FM-22培养液的体积比为5％，将1000ml上罐种子液接种于含20L FM-22培养液(FM-22培养液包括以下组份：KH2PO4 9.4g/L、CaCl2·2H200.28g/L、MgSO4·7H20 4.6g/L、(NH4)2SO4 15.7g/L以及甘油40g/L)的发酵罐中培养，得到接种液；
S1212、按照PTM1与接种液的体积比为4ml/L，向发酵罐中加入PTM1，得到接种后培养基；(为了使得发酵过程中微纤溶酶生长更好，为菌体在合成微纤溶酶时提供微量元素)
S1213、控制接种后培养基的发酵条件：第一、发酵罐中的通气量为1vvm；第二、向发酵罐中流加氨水，以控制发酵罐中接种后培养基的PH为5.0；第三、培养温度为28℃；第四、控制发酵罐内搅拌转速，以维持溶氧量在20％以上；
S1214、时刻监测接种后培养基中碳源，当接种后培养基中的碳源消耗完全时，按照碳源与接种后培养基体积比为50％向接种后培养基中流加碳源，碳源中含有甘油和PTM1，碳源中PTM1与甘油的体积比为12ml//L，继续培养菌体；(为了避免因碳源缺少而导致菌体在合成微纤溶酶受到阻碍，保证有充足的碳源，碳源是蛋白质合成的基础原料)
S122、饥饿培养：直至接种后培养基中菌体湿重到230-250g/L时，暂停补料，饥饿0.5-1.0h，饥饿时控制条件：第一、接种后培养基的PH调至3.1；第二、培养温度调整至26℃；(为了保证后续第二发酵时诱导时微纤溶酶生长更加顺序，一般生物生长时都是饥饿后，下次进食吸收更好，生长更快)
S123、第二次发酵：
S1231、步骤S122结束后，开始向接种后培养基中流加诱导补液，诱导补液的流加速度为3.6ml/h～13.625ml/h每升接种后培养基体积，以体积比计诱导补液中包含：80％甲醇、10％DDW(纯化水)以及10％甘油；
S1232、开始流加(NH4)2SO4和蔗糖直至发酵结束，保持在接种后培养基中(NH4)2SO4浓度为0.1～0.35mol/L且蔗糖为接种后培养基体积的10％；(由于第二次发酵过程中，是微纤溶酶生长最迅速且最多的时候，因此为了防止微纤溶酶自身降解(即是自切)，因而在此时加入(NH4)2SO4和蔗糖更加恰当)
S1233、诱导48h结束发酵，得到发酵液；
S13、分离得发酵上清液：
S131、向发酵液中添加(NH4)2SO4得到分离液，保持分离液中含有0.5mol/L的(NH4)2SO4；
S132、将分离液放入到离心机中，以8000rpm离心10分钟；
S133、步骤132结束后，收集发酵上清液。
如图4所示，实施例1：采用上述种子液培养以及液体发酵培养中除了S1232外所有步骤，得到发酵液(加(NH4)2SO4和蔗糖诱导24h)，然后对该发酵液进行电泳检测目的蛋白表达量，电泳时发酵液与聚丙酰胺凝胶的体积比为85％：15％。
实施例2：采用上述种子液培养以及液体发酵培养中所有步骤，得到发酵液(其中，步骤S1232中保持(NH4)2SO4浓度为0.1mol/L和蔗糖诱导24h)，然后对该发酵液进行电泳检测目的蛋白表达量，电泳时发酵液与聚丙酰胺凝胶的体积比为85％：15％。
实施例3：采用上述种子液培养以及液体发酵培养中所有步骤，得到发酵液(其中，步骤S1232中保持(NH4)2SO4浓度为0.25mol/L和蔗糖诱导24h)，然后对该发酵液进行电泳检测目的蛋白表达量，电泳时发酵液与聚丙酰胺凝胶的体积比为85％：15％。
实施例4：采用上述种子液培养以及液体发酵培养中所有步骤，得到发酵液(其中，步骤S1232中保持(NH4)2SO4浓度为0.5mol/L和蔗糖诱导24h)，然后对该发酵液进行电泳检测目的蛋白表达量，电泳时发酵液与聚丙酰胺凝胶的体积比为85％：15％。
实施例1至实施例4的实验结果如图4所示：实施例1发酵液中不含(NH4)2SO4，得到的微纤溶酶有降解产物；实施例2中至实例4发酵液中(NH4)2SO4浓度逐渐从0.1mol/L提高至0.5mol/L，对应得到纤溶酶的降解产物逐渐减少。由此可见，实施例4防止自切效果是最好的实施方式。
S2、对发酵上清液进行纯化：
S21、酶切激活前纯化，捕获和纯化收集发酵样品中的Ocriplasmin；
S211、用phenyl柱进行回收纯化：S2111、将发酵上清液PH调至6.0；S2112、用含有25mmol/L乙酸钠1mol/L硫酸铵平衡液平衡发酵上清液，平衡液的pH等于6.0；S2113、平衡后，经phenyl柱层析捕获目的蛋白；S2114、用pH6.0的25mmol/L乙酸钠溶液进行等度洗脱，收集得到phenyl柱捕获的含有目的蛋白的洗脱峰；
S212、用SP柱进行回收纯化：S2121、用pH6.0的25mmol/L乙酸钠平衡液对phenyl柱捕获的含有目的蛋白的洗脱峰进行平衡；S2122、平衡后，经SP柱层析分离纯化目的蛋白；S2123、用pH6.0的含有25mmol/L乙酸钠和0.5mol/L氯化钠的洗脱液进行等度洗脱，收集SP柱捕获的含有目的蛋白的洗脱峰；
S213、用30S柱进行回收纯化：S2131、用pH6.0的25mmol/L乙酸钠平衡液对SP柱捕获的含有目的蛋白的洗脱峰进行平衡；S2132、平衡后，经30S柱层析分离纯化目的蛋白；S2133、用pH6.0的含有25mmol/L乙酸钠和0.5mol/L氯化钠的洗脱溶液进行20％-50％，10个柱体积线性梯度洗脱，收集30S柱捕获的含有目的蛋白的洗脱峰。
实施例5：将步骤213得到的重组蛋白经(也就是：30S层析柱洗脱后纯化后的重组蛋白)15％的聚丙酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝显示分子量约为27KDa的单一条带，纯度大于90％。
实施例6：将步骤213得到的重组蛋白经(也就是：30S层析柱洗脱后纯化后的重组蛋白)，存放了48h后，再进行15％的聚丙酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝显示分子量约为27KDa的单一条带，纯度大于90％。
实施例7：将步骤213得到的重组蛋白经(也就是：30S层析柱洗脱后纯化后的重组蛋白)，存放了一周后，再进行15％的聚丙酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝显示分子量约为27KDa的单一条带，纯度大于90％。
从图5的显示可以看出来，实施例5至实施例7证明，本方法获得的微纤溶酶，稳定性极大提高，长时间不易降解。
S22、采用一定比例的酶酶切激活微纤溶酶，使其变为具有活性形式的Ocriplasmin：
S221、将30S柱捕获的含有目的蛋白调节到pH7.0；
S222、按照质量比(目的蛋白：尿激酶＝5000:1)向30S洗脱目的蛋白内加尿激酶，得到尿激酶与30S洗脱目的蛋白的混合体；
S223、对尿激酶与30S洗脱目的蛋白的混合体在25℃温度下进行酶切2h，得到活性形式的Ocriplasmin；
S23、采用SP柱层析方式纯化收集活性形式的Ocriplasmin：
S231、上样前使用25mmol/L乙酸钠以及0.1mol/L凝血酸，pH7.0，稀释S223步得到的酶切样品，控制电导率不高于8mS/cm；
S232、用pH7.0的含有25mmol/L乙酸钠以及0.1mol/L凝血酸的平衡液平衡层析柱；
S233、用pH7.0的含有25mmol/L 乙酸钠、0.15mol/L氯化钠以及0.1mol/L凝血酸的洗脱液进行等度洗脱，收集得到活性形式且无自切形式的微纤溶酶。
通过ELISA检测发现除去了99％的尿激酶。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，包括步骤有：S1、无自切方式人微小纤溶酶的重组发酵；
步骤S1中包含步骤：S12、液体发酵培养，在液体发酵培养过程中加入(NH4)2SO4和蔗糖。
2.根据权利要求1所述的一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，S12、液体发酵培养包括以下步骤：
S121、第一次发酵：将上灌种子液放入到培养液中培养，得到接种后培养基；
S122、饥饿培养：直至接种后培养基中菌体湿重到230-250g/L后，对接种后培养基进行饥饿培养0.5-1.0h；
S123、第二次发酵：
S1231、在步骤S122结束后，开始向接种后培养基中流加诱导补液，诱导补液的流加速度为3.6ml/h～13.625ml/h每升接种后培养基体积，诱导补液包含：甲醇、DDW以及甘油；
S1232、开始流加(NH4)2SO4和蔗糖直至发酵结束，保持在接种后培养基中(NH4)2SO4浓度为0.10mol/L～0.350mol/L且蔗糖为接种后培养基体积的3％～17％；
S1232、诱导36～60h结束发酵，得到发酵液。
3.根据权利要求2所述的一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，步骤S121中培养液为FM-22培养液，步骤S121中按照上罐种子液与FM-22培养液的体积比为5％将上罐种子液接种于含有FM-22培养液的发酵罐中。
4.根据权利要求3所述的一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，FM-22培养液包括以下组份：KH2PO4 9.4g/L、CaCl2·2H20 0.28g/L、MgSO4·7H20 4.6g/L、(NH4)2SO415.7g/L以及甘油40g/L。
5.根据权利要求1至4任一项所述的一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，
步骤S1中还包含步骤：S13、分离得发酵上清液；
S13、分离得发酵上清液包括：
S131、向发酵液中添加(NH4)2SO4得到分离液，保持分离液中含有0.3mol/L～0.7mol/L的(NH4)2SO4；
S132、将分离液放入到离心机中，以6000rpm～10000rpm离心10分钟；
S133、步骤132结束后，收集发酵上清液。
6.根据权利要求5所述的一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，还包括：S2、对发酵上清液进行纯化。
7.根据权利要求5所述的一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，对发酵上清液进行纯化包括以下步骤：
S21、酶切激活前纯化，捕获和纯化收集发酵样品中的微纤溶酶；
S22、采用一定比例的酶切激活微纤溶酶，使其变为具有酶切活性形式的。
S23、酶切激活后纯化收集完整形式的微纤溶酶。
8.根据权利要求7所述的一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，步骤S21所述的酶切激活前捕获和纯化，采用phenyl柱捕获，采用SP柱和30s柱纯化。
9.根据权利要求7所述的一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，步骤S22所述的的酶为尿激酶、葡激酶和/或链激酶。
10.根据权利要求7所述的一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，其特征在于，步骤S23所述的酶切后纯化收集方式采用的是SP柱层析方式。
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