WO2004097022A1 - 糖鎖の切断触媒 - Google Patents

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WO2004097022A1
WO2004097022A1 PCT/JP2004/004695 JP2004004695W WO2004097022A1 WO 2004097022 A1 WO2004097022 A1 WO 2004097022A1 JP 2004004695 W JP2004004695 W JP 2004004695W WO 2004097022 A1 WO2004097022 A1 WO 2004097022A1
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WO
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protein
chondroitin sulfate
amino acid
acid sequence
sulfate
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/004695
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masayuki Tanaka
Mamoru Kyogashima
Original Assignee
Seikagaku Corporation
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Publication date
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Priority to US10/551,550 priority patent/US20070134227A1/en
Priority to EP04724744A priority patent/EP1616955A4/en
Publication of WO2004097022A1 publication Critical patent/WO2004097022A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders

Definitions

  • the present invention relates to a novel sugar chain cleavage catalyst, a specific sugar chain cleavage agent, and the like.
  • CSA is a molecule in which “a disaccharide unit in which a glucuronic acid residue and an N-acetylgalatatosamine residue are] 31,3 glycoside-bonded” is continuously bonded.
  • Residue (i31-3) is a CS having a disaccharide unit as a main component, consisting of an N_acetylgalactosamine residue in which the 4-position is sulfated.
  • CSC is a molecule in which “a disaccharide unit in which a glucuronic acid residue and an N-acetylgalactosamine residue are / 31,3 glycosidic bonds” is continuously linked, and a “glucuronic acid residue ( 31-3) CS having a disaccharide unit consisting of an N-acetylgalactosamine residue in which the 6-position is sulfated as a main component.
  • CSD is a molecule consisting of “a disaccharide unit in which a glucuronic acid residue and an N-acetylgalactosamine residue are linked in a
  • This is a CS having a disaccharide unit consisting of a converted glucuronic acid residue (] 31-3) an N-acetylgalactosamine residue in which the 6-position is sulfated as a main component.
  • the Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, p33654-33663 (2002) describes HYAL 1, a kind of hyal mouth-dase.
  • Biochemical and biophysical research communications, 236 (1), plO-15, (1997) discloses the entire amino acid sequence of HYAL ⁇ and the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the same.
  • HYAL1 has substantially no activity of cleaving CSB, KS and CH having an average molecular weight of 7,000, and has activity of cleaving CSA, CSC and CSD. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel sugar chain cleavage catalyst containing HYAL1 as an essential component, a sugar chain specific cleavage agent, and the like.
  • a novel sugar chain cleavage catalyst containing HYAL1 as an essential component, a sugar chain-specific cleavage agent and drug, and HYAL1 as a specific sugar chain A method for specifically producing a low-molecular-weight sugar chain, which comprises at least a step for causing HYAL1 to act on a specific sugar chain, a DNA comprising HYAL1
  • the method for producing a catalyst comprising the steps of: expressing a protein using HYAL1; and collecting the expressed protein.
  • the method for producing a cleavage agent, and at least a step of expressing a protein using HYAL1-retaining DNA, and collecting the expressed protein It led to that provide a production method and the like.
  • the present invention comprises the following protein (A) or (B) as an essential component, and has an ability to specifically cleave one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. (Hereinafter referred to as "the present catalyst").
  • (B) includes an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted, or transposed, and is selected from the group consisting of HA, CSA, 3rd and 03D.
  • the catalyst of the present invention preferably does not have the ability to cleave DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000. Further, the present invention provides a specific cleavage agent for one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD, comprising a protein of the following (A) or (B) as an essential component (hereinafter referred to as a , "The cutting agent of the present invention").
  • the cleavage agent of the present invention preferably has no ability to cleave DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000.
  • the present invention provides a medicine (hereinafter, referred to as “the medicine of the present invention”) which is used for cutting into pieces.
  • (B) includes an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted, or transposed, and from the group consisting of HA, CSA, ⁇ 3 ⁇ and 3D A protein having an activity of specifically cleaving one or more selected sugar chains.
  • the medicament of the present invention preferably has no ability to cleave DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000.
  • the “living tissue” in which the sugar chain to be cleaved by the drug of the present invention is present is preferably a nucleus pulposus.
  • the medicament of the present invention is preferably a therapeutic agent for herniated disc.
  • the present invention provides a method for producing a sugar chain, comprising at least a step of causing a protein of the following (A) or (B) to act on one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. (Hereinafter referred to as “the cleavage method of the present invention”).
  • (B) contains an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted or transposed, and HA, CSA, CSC and CS A protein having an activity of specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of D.
  • DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000 are not cleaved.
  • the present invention provides a low-molecular-weight protein comprising at least a step of allowing the following protein (A) or (B) to act on one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD.
  • a method for specifically producing the converted sugar chain hereinafter referred to as “the sugar chain production method of the present invention”).
  • (B) a group comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted or transposed, and comprising HA, CSA, 3 ⁇ and 3D
  • a protein having an activity of specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of:
  • the present invention provides a method for producing the catalyst of the present invention, which comprises at least a step of expressing a protein using a DNA retaining any of the following (a) or (b) and collecting the expressed protein:
  • a method hereinafter, referred to as “the method for producing the catalyst of the present invention”.
  • SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted or transposed, and are HA, CSA, 3rd and 3rd.
  • the present invention provides a method for producing a cleavage agent of the present invention, which comprises at least a step of expressing a protein using a DNA having any of the following (a) or (b) and collecting the expressed protein: (Hereinafter referred to as “the method for producing the cutting agent of the present invention”).
  • the present invention provides a method for producing a drug of the present invention, which comprises at least a step of expressing a protein using a DNA having any of the following (a) or (b) and collecting the expressed protein: Hereinafter, referred to as “the method for producing the pharmaceutical of the present invention”.
  • the present invention provides a fusion protein of the following protein (A) or (B) and another peptide (hereinafter, referred to as “fusion protein of the present invention”).
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • (B) includes an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted, or transposed, and is selected from the group consisting of HA, CSA, 3 and 3D.
  • the fusion protein of the present invention preferably does not have the ability to cleave DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000.
  • the present invention treats a disease in which one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD are excessively present in a living tissue, characterized by administering the above-mentioned medicament of the present invention.
  • a method (hereinafter, referred to as “treatment method of the present invention”) is provided.
  • Preferred pharmaceuticals of the present invention and preferred biological tissues in the treatment method of the present invention are the same as those preferred in the aforementioned pharmaceuticals of the present invention.
  • FIG. 1 shows the results when HA was used as a substrate for HYAL1.
  • FIG. 2 shows the results when CH was used as the substrate for HYAL1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results when CSA was used as a substrate for HYAL1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results when CSB was used as a substrate for HYAL1.
  • FIG. 5 shows the results when CSC was used as a substrate for HYAL1.
  • FIG. 6 shows the results when CSD was used as a substrate for HYAL1.
  • FIG. 7 shows the results when KS was used as a substrate for HYAL1.
  • Figure 8 shows the chromatographic results when the enzyme source was HYAL1 and the substrate was HA.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of a chromatograph when the enzyme source was HYAL1 and the substrate was CSA.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of a chromatograph when the enzyme source was HYAL1 and the substrate was CSC.
  • Fig. 11 shows the results of chromatographs when the enzyme source was PH20 and the substrate was HA.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of a chromatograph when the enzyme source was PH20 and the substrate was CSA.
  • the catalyst of the present invention comprises the following protein (A) or (B) as an essential component, and has an ability to specifically cleave one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. Catalyst.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the protein of (A) is a protein of HYA L1.
  • proteins have amino acid substitutions and deletions in their amino acid sequences due to polymorphisms and mutations in the DNA that encodes them, as well as modification reactions during production of the protein in cells and during purification.
  • mutations such as insertion or transposition can occur, but nonetheless, there are proteins that exhibit substantially the same physiological and biological activities as proteins having no mutation.
  • a protein that does not show a large difference in its function can also be used as an essential component of the catalyst of the present invention. The same applies to the case where the above-described mutation is artificially introduced into the amino acid sequence of a protein. It is possible to do.
  • IL-2 human interleukin 2
  • serine retains interleukin 2 activity
  • certain proteins are known to have peptide regions that are not essential for activity. For example, signal peptides present in extracellularly secreted proteins and prosequences found in protease precursors, etc., and most of these regions are translated or converted to active proteins. Removed.
  • signal peptides present in extracellularly secreted proteins and prosequences found in protease precursors, etc., and most of these regions are translated or converted to active proteins. Removed.
  • Such a protein exists in a different form in its primary structure, but ultimately has a function equivalent to that of the protein (A).
  • the above protein (B) defines such a protein.
  • severeal amino acids refers to the number of amino acids that may cause mutation to such an extent that the activity of HYAL 1 is not lost.
  • the number is about 2 to 30, preferably 2 to 15, and more preferably 2 to 8 or less.
  • the number is about 2 to 22, preferably 2 to 11, and more preferably 2 to 6 or less.
  • the protein having the activity of specifically cleaving preferably has a homology of preferably 95% or more, more preferably 96% or more, and most preferably 97% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Amino acid sequence homology can be easily calculated using well-known computer software such as FASTA, and such software is also available on the Internet.
  • the amino acid sequences of the above-mentioned proteins (A) and (B) in the catalyst of the present invention may include the amino acid sequences of other protein peptides. That is, the proteins (A) and (B) may be fusion proteins with other peptides.
  • the present invention relates to a fusion tag of the above-mentioned protein (A) or (B) with another peptide.
  • a protein (the fusion protein of the present invention) is also provided.
  • the term “other peptide J” is used as a concept including “polypeptide”.
  • Examples of the fusion protein of the present invention include a fusion protein of HYAL1 and a marker peptide. Such a fusion protein of the present invention has an advantage that purification and analysis can be facilitated.
  • Examples of the above marker peptide include FLAG peptide, protein A, insulin signal sequence, His, CBP (calmodulin-binding protein), GST (daltathione S-transferase) and the like.
  • FLAG peptide FLAG peptide
  • protein A insulin signal sequence
  • His calmodulin-binding protein
  • GST dealtathione S-transferase
  • a fusion protein with a FLAG peptide can be easily purified by ab- ty chromatography using a solid phase to which an anti-FLAG antibody is bound.
  • the fusion protein with protein A can be easily purified by ab- chromatography using a solid phase to which IgG is bound.
  • fusion protein with a His tag a solid phase to which magnetic nickel is bound can be used.
  • the fusion protein with insulin signal is secreted extracellularly (eg, in a medium), extraction operations such as cell disruption are not required.
  • the fusion protein of the present invention is particularly preferably a fusion protein with the FLAG peptide.
  • the fusion protein of the present invention can be produced as follows.
  • DNA (a) a DNA (hereinafter, referred to as “DNA (a)”) encoding the protein (A) (a protein containing the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 435 in SEQ ID NO: 2) is prepared.
  • This DNA is not particularly limited as long as it encodes a protein containing the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-435 in SEQ ID NO: 2.
  • Examples of such DNA include DNAs having various different nucleotide sequences due to the degeneracy of the genetic code, and DNAs specified by the nucleotide sequences represented by nucleotide numbers 1 to 1308 in SEQ ID NO: 1 are preferable. .
  • This DNA is registered as GenBank accession No. U03056.
  • DNA (b) a DNA (hereinafter, referred to as “DNA (b)”) encoding the protein of (B) may be used in place of the protein of (A).
  • DNA (b) includes an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence of (A) have been deleted, substituted, inserted or transposed, and is derived from HA, CSA, CSC and CSD. It is not particularly limited as long as it has an activity of specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of: Whether or not they have the activity of cleaving these sugar chains can be detected by a general detection method for sugar chains of reduced molecular weight. For example, it can be detected by the shift of the sugar chain peak in GPC as shown in Examples described later, and is preferably detected by this method.
  • the presence or absence of the shift of the sugar chain peak in GPC can be used to determine the cleavage activity of HA, CSA, CSC and CSD.
  • the presence or absence of specificity can be detected.
  • deletion, substitution, insertion, or deletion of an amino acid having an activity of specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC, and CSD is performed. Dislocations can be easily selected.
  • DNA (b) examples include, for example, “DNA (a)", a DNA complementary to the DNA or a DNA having the nucleotide sequence of these DNAs, which hybridizes under stringent conditions. DNA is exemplified.
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Second Edition, Cold Edition). Spring Harbor Laboratory Press (1989) etc.).
  • stringent: simple conditions include a solution containing 50% formamide, 4 XSSC, 50 mM HEPES (pH 7.0), 10 X Denhardt's solution, 100 / zg / ml salmon sperm DNA, and 42 Hybridize at ° C, then 2XSSC, 0.1% SDS solution, 50 at room temperature. Conditions for washing under 0.1C with 0.1 XSSC, 0.1% SDS solution.
  • the expression of the protein using the DNA holding either the DNA (a) or the DNA (b) is performed using a vector (preferably an expression vector) holding the DNA.
  • Incorporation of the DNA into the vector can be performed by a usual method.
  • an appropriate expression vector such as a phage vector or a plasmid vector
  • a phage vector or a plasmid vector capable of expressing the introduced DNA
  • Such host-vector systems include E.
  • coli ⁇ (13 ⁇ 4 (Novagen), pTrcHis (Invitrogen), pGEX (Pharmacia Biotech), Trc99 (Pharmacia Biotech) , PKK233-3 (Pharmacia Biotech)
  • prokaryotic cells such as EZZZ18 (Pharmacia Biotech), pCH10 (Phanolemacia Biotech), pBAD (Invitrogen), pRSET (Invitrogen) or PSE420 (Invitrogen) Combination with an expression vector, COS cells ⁇ 3LL-HK46 cells and other mammalian cells, pGIR201 (Kitagawa, H., and Paulson, JC (1994) J. Biol. Chem.
  • pEF- BOS Melata, S., and Nagata, S. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 5322
  • pCXN2 Niwa, H., Yamanura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200
  • PCMV-2 manufactured by Eastman Kodak
  • pCEV18 pME18S
  • pSVL manufactured by Bulmasia Biotech
  • Examples of host cells include yeast, Bacillus subtilis, etc., and various vectors corresponding to these are used. It is shown.
  • a combination of prokaryotic cells especially E. coli cells
  • ⁇ ⁇ 1 ⁇ is particularly preferred.
  • Insect cells can also be used as host cells. Also in this case, various vectors corresponding to insect cells can be used. As insect cells, it is preferable to use high-expressing SF + cells (expresSf + (registered trademark)). Moreover, pPSC8 and pPSC12 are preferred as transfer vectors incorporating DNA. When DNA is incorporated into pPSC8, it can be incorporated using Smal, Kpnl, Pstl, Xbal Nrul, ⁇ . When incorporating DNA into pPSC12, l, Kpnl, Pstl, and ⁇ can be used for incorporation. In order to express the FLAG peptide fused to the ⁇ end of the protein, a sequence encoding the FLAG peptide is added to the end of the corresponding DNA before integration into the transfer vector. It is preferable to keep it.
  • the DNA After incorporating the DNA into the transfer vector, it is preferable to introduce it into the pakiurovirus. It is preferable to use Autographs californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV) or Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) as r. Then, insect cells may be infected with the paculovirus into which the desired DNA has been introduced.
  • AcNPV Autographs californica nucleopolyhedrovirus
  • BmNPV Bombyx mori nucleopolyhedrovirus
  • a vector constructed so as to express a fusion protein of a target protein and a marker peptide can be used. Expression of the protein from the DNA and collection of the expressed protein can also be performed according to ordinary methods. For example, a host is transformed by introducing an expression vector into which a target DNA is incorporated into a suitable host, the transformant is grown, and the expressed protein is collected from the grown product. It can be carried out.
  • the catalyst of the present invention has the ability to specifically cleave one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. Strands can be detected by common detection methods. The description of the method is the same as described above. Among them, those having the ability to specifically cleave the four types of sugar chains of HA, CSA, CSC and CSD are preferable.
  • the present catalyst does not have the ability to cleave DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000. Whether DS, KS or CH with an average molecular weight of 7000 is capable of being cleaved is detected by a general method for detecting a low-molecular-weight sugar chain using DS, KS or CH with an average molecular weight of 7000 as a substrate in the same manner as described above. be able to.
  • the catalyst of the present invention contains at least the protein of the above (A) or (B). That is, the catalyst of the present invention may use the protein of (A) or (B) itself as it is, or may adversely affect these proteins in addition to the protein of (A) or (B). Other components may be contained as long as they are not provided and do not affect the effects of the present invention.
  • the method for producing the catalyst of the present invention is not particularly limited, and the protein of (A) or (B) may be isolated from a natural product, and the protein of (A) or (B) may be produced by chemical synthesis or the like.
  • the protein of the above (A) or (B) may be produced by a genetic engineering technique.
  • a genetic engineering technique see the method for producing the catalyst of the present invention described later.
  • the form of the catalyst of the present invention is not limited, and may be a solution form, a frozen form, a lyophilized form, or an immobilized enzyme form bonded to a carrier.
  • the cleavage agent of the present invention is a specific cleavage agent for one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD, which comprises a protein of the following (A) or (B) as an essential component: .
  • A a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • B an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have a deleted, substituted, inserted or transposed amino acid sequence, and are composed of HA, CSA, 3 'and 3D
  • the cleavage agent of the present invention has an activity of specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. Strands can be detected by common detection methods. The description of the method is the same as described above. Among them, a cleavage agent that specifically cleaves four types of sugar chains, HA, CSA, CSC and CSD, is preferable.
  • the cleavage agent of the present invention does not have the ability to cleave DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000.
  • the presence or absence of the ability to cleave DS, KS and CH having an average molecular weight of 7000 can be determined in the same manner as described above by a general method for detecting low-molecular-weight sugar chains using DS, KS or CH having an average molecular weight of 7000 as a substrate. Can be detected.
  • the cleavage agent of the present invention is used to specifically cleave one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. It is preferably used for the purpose of not cleaving CH having an average molecular weight of 7,000.
  • the form of the cleavage agent of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a solution state, a frozen state, a lyophilized state, or an immobilized enzyme form bonded to a carrier.
  • the medicament of the present invention comprises the following protein (A) or (B) as an essential component, and specifically comprises one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD existing in living tissue.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • (B) includes an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted or transposed, and HA, CSA, ⁇ 3 ⁇ and ⁇ 3 A protein having an activity of specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of D.
  • the medicament of the present invention has an activity of specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. Strands can be detected by common detection methods. The description of the method is the same as described above. Among them, a drug that specifically cleaves four types of sugar chains, HA, CSA, CSC and CSD, is preferable.
  • the medicament of the present invention preferably has no ability to cleave DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000. Whether DS, KS or CH having an average molecular weight of 7000 has the ability to cleave is detected in the same manner as described above by a general method for detecting a low-molecular-weight sugar chain using DS, KS or CH having an average molecular weight of 7000 as a substrate. can do.
  • the medicament of the present invention is used for specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD existing in a living tissue. It is preferably used for the purpose of not cutting DS, KS and CH having an average molecular weight of 7000 under the following conditions.
  • the biological tissue to which the medicament of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a biological tissue in which it is desired to specifically cleave one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD.
  • a living tissue in which one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD are present in excess in a healthy state at a level higher than that in a healthy state is exemplified.
  • a nucleus pulposus is specifically exemplified as such a living tissue, and a nucleus pulposus in a state of a herniated disc is particularly preferable. That is, the medicament of the present invention is preferably an agent for treating a herniated disc.
  • treatment as used herein includes treatment for the purpose of prevention, suppression of progression (prevention of illness), improvement, treatment, and the like.
  • the medicament of the present invention having the activity of cleaving CS can also be sufficiently used as a therapeutic agent for herniated disc.
  • the animal to which the medicament of the present invention is applied is not particularly limited, but is preferably a vertebrate, and particularly preferably a mammal. As mammals, humans, dogs, Horses, magpies, horses, and wedges are presented, but those that apply to humans are particularly preferred.
  • the administration method of the medicament of the present invention is not particularly limited as long as the medicament of the present invention exerts a specific cleavage action of one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD in living tissue.
  • Non-limiting examples include administration by injection.
  • the medicament of the present invention is applied to the nucleus pulposus, it is preferable to inject the disc or spinal epidural space where the target nucleus pulposus exists.
  • the protein of the above (A) or (B) can be suitably formulated into the medicament of the present invention depending on the administration method.
  • the formulation is carried out by mixing with one or more pharmaceutically acceptable carriers and by any method well known in the technical field of pharmaceutics.
  • Dosage forms include injections (solutions, suspensions, emulsions, solids for dissolution before use, etc.), tablets, capsules, liquids and the like. Of these, injections are preferred.
  • the dose of the drug of the present invention depends on the type and specific activity of the above-mentioned protein (A) or (B), the type and condition of the animal to be administered, the type of living tissue to be administered, its condition, and the like. Although it is not particularly limited, it can be generally administered at a rate of about 0.1 / ig to about L00 Omg per day.
  • the cleavage method of the present invention comprises at least a step of causing a protein of the following (A) or (B) to act on one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. This is a method for specifically cutting sugar chains.
  • one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include a deleted, substituted, inserted or transposed amino acid sequence, and are selected from the group consisting of HA, CSA, 3 ⁇ and 3D A protein having an activity of specifically cleaving one or more sugar chains.
  • the description of the proteins (A) and (B) is the same as in the above “ ⁇ 1> Catalyst of the present invention”.
  • the protein of (A) or (B) is replaced with HA, CSA, ⁇ 3 ⁇ and ⁇
  • the method of acting on one or more sugar chains selected from the group consisting of SD is not particularly limited as long as these molecules come into contact with each other to cause an enzymatic reaction, and for example, the latter is added to the former.
  • the former may be added to the latter, or both may be added simultaneously.
  • proteins of the above (A) and (B) are immobilized on a carrier (eg, gel, beads, membrane, plate, etc.), and one or more selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. Two or more sugar chains may be contacted.
  • a carrier eg, gel, beads, membrane, plate, etc.
  • the conditions for the reaction after the two are brought into contact are not particularly limited as long as the conditions (A) or (B) act on the proteins, but they are around the optimum pH of these proteins (for example, pH 4 to pH 5). ), And more preferably in a buffer having a buffering action at the pH.
  • the temperature at this time is not particularly limited as long as the activity of these proteins is maintained, and is, for example, about 35 ° C to 40 ° C. When there is a substance that increases the activity of these proteins, the substance may be added to the mixture.
  • the reaction time can be appropriately adjusted depending on pH conditions, temperature conditions, the amounts of proteins and sugar chains to be acted on, and how much cleavage (reduction in molecular weight) is desired. Increasing the reaction time can increase the degree of cleavage (reducing the molecular weight), and shortening the reaction time can reduce the degree.
  • the cleavage method of the present invention may include at least a step of acting such a protein, and may further include another step.
  • one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD are specifically cleaved. Whether or not these sugar chains have been cleaved can be detected by a general method for detecting low-molecular-weight sugar chains. The description of the method is the same as described above. Among them, a method that specifically cleaves four types of sugar chains, HA, CSA, ⁇ 3 ⁇ and ⁇ 30 ⁇ , is preferable.
  • the cleavage method of the present invention preferably does not cleave DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000.
  • the fact that DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000 are not cleaved can also be detected by a general method for detecting a low-molecular-weight sugar chain.
  • the cleavage method of the present invention is used to specifically cleave one or two or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA and ⁇ 3 and ⁇ 030. , KS and CH having an average molecular weight of 7,000 are preferably used for the purpose of not cleaving.
  • Other explanations regarding the cutting method of the present invention are the same as those in the above “ ⁇ 1> Catalyst of the present invention”.
  • the method for producing a sugar chain of the present invention comprises at least a step of causing the protein of the following (A) or (B) to act on one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. And a method for specifically producing the sugar chain having a low molecular weight.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted or transposed, and comprises HA, CSA, SA3 ⁇ and ⁇ 3D A protein having an activity of specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group.
  • a sugar chain in which one or two or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD can be specifically produced is reduced in molecular weight. Whether or not a low-molecular-weight sugar chain has been produced can be confirmed by a general method for detecting a low-molecular-weight sugar chain. The description of the method is the same as described above. Among them, a method for specifically producing four types of sugar chains, HA, CSA, CSC and CSD, is preferable.
  • the method for producing a sugar chain of the present invention does not produce DS, KS and CH with reduced molecular weight.
  • the fact that DS, KS and CH are not produced can also be confirmed by a general method for detecting a low-molecular-weight sugar chain.
  • the sugar chain production method of the present invention is used for specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD. It is preferably used for the purpose of not cleaving DS, KS and CH having an average molecular weight of 7,000.
  • a method for isolating a low-molecular-weight sugar chain from the product can be performed by a known method.
  • the method for producing a catalyst according to the present invention comprises at least a step of expressing a protein using a DNA retaining any of the following (a) or (b) and collecting the expressed protein: It is.
  • the DNA in (a) above is not particularly limited as long as it encodes a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Such DNAs include DNAs having various base sequences depending on the degeneracy of the genetic code, but DNAs specified by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 are preferred.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 1 is registered as GenBank accession No. U03056.
  • the DNA of the above (b) also consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted or transposed, and is a group consisting of HA, CSA, CSC and CSD.
  • the protein is not particularly limited as long as it encodes a protein having an activity of specifically cleaving one or more sugar chains selected from the group consisting of: Examples of such DNA include, for example, the DNA described in (a) above, a DNA complementary to the DNA or a DNA having the nucleotide sequence of these DNAs, and a DNA that hybridizes under stringent conditions. Is done.
  • stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Old spring Harbor Laboratory Press (I 989 ) etc.).
  • Specific examples “Sutorinjiwento conditions”, 50% formamide, 4 XSSC, a solution containing 50mM HEPES (pH7. O), 10 X Denhardt 's solution, g / ml salmon sperm DNA, at 4 2 ° C
  • the conditions include washing with 2XSSC, 0.1% SDS solution at room temperature, and washing with 0.1XSSC, 0.1% SDS solution at 50 ° C at room temperature. It is preferable that the expression of the protein using the DNA holding either the above (a) or (b) is performed using a vector (preferably a current vector) holding the DNA. Incorporation of the DNA vector (1) can be performed by an ordinary method.
  • an appropriate expression vector capable of expressing the introduced DNA
  • a phage vector or a plasmid vector capable of expressing the introduced DNA
  • Such host-vector systems include mammalian cells such as COS cells and 3LL-HK46 cells, pGIR201 (Kitagawa, H., and Paulson, JC (1994) J. Biol. Chem. 269, 1394-1401), EF-BOS (Mizushima, S., and Nagata, S. (1990) Nucleic Acid Res.
  • pCXN2 Niwa, H., Yamanura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193- 200
  • pCMV-2 manufactured by Eastman Kodak
  • pCEV18 pME18S
  • mammalian cells such as pSVL (manufactured by Bulmasia Biotech) Combination with an expression vector, E.
  • yeast host cells include yeast and Bacillus subtilis, and various vectors corresponding thereto.
  • yeast host cells include yeast and Bacillus subtilis, and various vectors corresponding thereto.
  • a vector incorporating DNA a vector constructed so as to express a fusion protein of a target protein and a marker peptide can also be used. Expression of the protein from the DNA and collection of the expressed protein can also be performed according to ordinary methods.
  • transforming a host by introducing an expression vector into which a target DNA is incorporated into an appropriate host, growing the transformant, and collecting the expressed protein from the grown product can be done by
  • the term “growth” is a concept that includes the growth of transformant cells and the microorganism itself, and the growth of animals and insects incorporating the transformant cells.
  • the term “raw” The term “culture” is a concept including a medium (supernatant of a culture solution) after growing a transformant, and cultured host cells, secretions, excreta, and the like. Growth conditions (medium, culture conditions, etc.) can be appropriately selected according to the host used.
  • the collection of protein from the grown product can also be performed by a known extraction and purification method for protein.
  • the target protein when the target protein is produced in a soluble form that is secreted into the medium (supernatant of the culture solution), the medium may be collected and used as it is.
  • the target protein when the target protein is produced in a soluble form or secreted into the cytoplasm or in an insoluble (membrane-bound) form, a method using a nitrogen cavitation apparatus, homogenization, a glass bead mill method, sonication, Extraction by cell disruption such as osmotic shock method, freeze-thaw method, etc., extraction of surfactant, or a combination of these can be used to extract the target protein, and the extract can be used as it is. Good.
  • the protein can be further purified.
  • Purification may be incomplete purification (partial purification) or complete purification, and can be appropriately selected depending on the intended use of the target protein.
  • purification methods include salting out with ammonium sulfate (ammonium sulfate) and sodium sulfate, centrifugation, dialysis, ultrafiltration, adsorption chromatography, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase Processing operations such as chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, ab-hty chromatography, and electrophoresis, and combinations thereof, may be mentioned.
  • ammonium sulfate ammonium sulfate
  • sodium sulfate sodium sulfate
  • centrifugation dialysis
  • ultrafiltration ultrafiltration
  • adsorption chromatography ion-exchange chromatography
  • hydrophobic chromatography hydrophobic chromatography
  • reverse phase Processing operations such as chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, ab-hty chromatography, and electrophoresis, and combinations thereof, may be mentioned.
  • Whether or not the target protein has been produced can be confirmed by analyzing the amino acid sequence, action, substrate specificity and the like.
  • the cutting method of the present invention may include at least the expression / collection steps as described above, and may further include other steps.
  • the method for producing a cleavage agent according to the present invention comprises at least a step of expressing a protein using DNA having any of the following (a) or (b) and collecting the expressed protein: It is.
  • (b) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted or transposed, and consists of HA, CSA, 3 and SD
  • the method for producing a medicament of the present invention comprises the steps of: expressing a protein using a DNA having any of the following (a) or (b); and collecting the expressed protein: is there.
  • the treatment method of the present invention is characterized by administering the medicament of the present invention, and treats a disease in which one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD are excessively present in a living tissue. How to
  • COS-7 cells obtained from RIKEN PIO Resource Center
  • DMEM medium manufactured by Invitrogen
  • 10% fetal calf serum until they reached about 20-40% confluence. Cultures were performed at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • a Hyal-mouth-lase expression vector having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (HYAL1 cDNA) incorporated into a pFLAG_CMV6 vector (Sigma-Aldrich) was transformed into COS-7 cells using a TransFast Transfection kit (Promega). The cells were transfected and cultured at 37 ° C. for 3 days in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. Culture was performed at 37 ° C for under 5% C 0 2.
  • the cells cultured in the above (1) (transfected expression vector incorporating HYAL1 cDNA or transfected expression vector not incorporating HYAL1 cDNA) were added to lOmM Tris-HCl (pH7. 4 or pH 6.0), crushed in a solution containing 0.5% Triton X-100 and 0.25M sucrose using a cell scraper under ice-cooling. The solution after the crushing was used as it was as an enzyme solution.
  • the reaction is prepared in (2) in a reaction mixture containing 0.25% of various substrates, 0.15 M NaCl, and 50 mM sodium acetate buffer (pH 4 or pH 5) or sodium phosphate buffer (pH 6 or pH 7). The enzyme was added to a final concentration of 20% (vol / vol) and incubated at 37 ° C for 4 days.
  • the substrates used here are as follows.
  • This CS is sold by Seikagaku Corporation under the reagent catalog code No. 400650 and has the following properties. • Shows a single band on cellulose acetate membrane electrophoresis.
  • This DS (CSB) is sold by Seikagaku Corporation under the reagent power log code number 400660 and has the following properties.
  • This CS is sold by Seikagaku Corporation under the reagent catalog code No. 400670 and has the following properties.
  • a single band is shown by cellulose acetate membrane electrophoresis.
  • This CS is sold by Seikagaku Corporation under the reagent power log code number 400676, and has the following properties. Nitrogen content: 2.2-2.6% (measured by the method described in Z. Anal. Chem., 22, p. 366 (1883)) Sulfur content: 7.1 to 7.7% (Mikrochim. Acta., 123 how the measurement) Gala Kutosamin content according to (1% 5): 3 0 to 35% (amino acid autoanalyzer)
  • KS derived from corneal cornea; manufactured by Sei-Danigaku Kogyo Co., Ltd.
  • This KS is sold by Seikagaku Corporation as Reagent Catalog Code No. 400760 and has the following properties.
  • Nitrogen content 2.2 to 3.0% (measured by the method described in Z. Anal. Chem., 22, ⁇ 366 (1883)) • Sulfur content: 6.5 to 8.0% (Mikrochim. Acta. , Ro123 way measurement) 'Garatatosu content according to (1955): 34 ⁇ 40% (. Biochem J., 50, ⁇ 298 (1952) measured by the method described in)
  • Fig. 1 shows the results when HA was used as the substrate
  • Fig. 2 shows the results when CH with an average molecular weight of 7000 was used
  • Fig. 3 shows the results when CSA was used
  • Fig. Fig. 4 shows the results of using CSC
  • Fig. 5 shows the results of using CSC
  • Fig. 6 shows the results of using CSD
  • Fig. 7 shows the results of using KS. Show.
  • the vertical axis of each graph indicates the refractive index
  • the horizontal axis indicates time (retention time; minute).
  • each figure shows the enzyme solution of cells not transfected with HYAL1 cDNA
  • the lower row shows the enzyme solution of cells transfected with HYAL1 cDNA.
  • the result And most thick solid line (blue line) in FIG pH ⁇ then the thick solid line (red line) is pH 6, most thin solid line (green line) P H5, line by dot (black line) pH4 in the reaction mixture Shows the results of the reaction. If the retention time of the peak near the center of the graph shifts to a longer time than the upper graph (HYAL1 cDNA is not transfected), the substrate has a lower molecular weight.
  • HYAL1 has an activity to cleave not only HA but also CSA, CSC and CSD, but has substantially no activity to cleave DS (CSB), KS and CH with an average molecular weight of 7000.
  • HYAL1 The reactivity of HYAL1 to the substrate was compared with the reactivity of PH20 (testicular hyaluronidase: a hyaluronidase registered as GenBank accession No. S67798) to the substrate.
  • the enzyme solution and substrate used here are the same as the enzyme solution and substrate used in (3).
  • the composition of the reaction solution and the reaction temperature are the same as in (3).
  • the reaction time was set at 1 day, 4 days, 7 days, 14 days, and 5 points of unreacted. After the reaction was completed, each sample was frozen and stored at 1-30.
  • the enzyme solution of P1K0 used in FIGS. 11 and 12 was prepared in the same manner as HYAL1 by the method described in (1) and (2).
  • the expressing cells were crushed under the same conditions as in (2) to obtain an enzyme solution.
  • Fig. 8 shows the chromatographic results when the enzyme source was HYAL1 and the substrate was HA.
  • Fig. 9 shows the case where the enzyme source was HYAL1 and the substrate was CSA.
  • Fig. 10 shows the enzyme source was HYAL1 and the substrate was HSA1.
  • Fig. 11 shows the results when the enzyme source was PH20 and the substrate was HA
  • Fig. 12 shows the results when the enzyme source was PH20 and the substrate was CSA.
  • the vertical axis of each graph indicates the refractive index, and the horizontal axis indicates time (retention time; minute).
  • 0 day, 1 day, 4 days, 7S, and 14 days indicate the reaction time of each sample.
  • the thickest solid line (black line) in the figure is 0 days
  • the next thickest solid line (red line) is 1 day
  • the thinnest solid line (blue line) is 4 days
  • the thickest dot line (green line) is On the 7th
  • the line with the next thickest dot (orange line) shows the results on the 14th.
  • the substrate has a lower molecular weight.
  • the catalyst of the present invention and the cleavage agent of the present invention have the ability to specifically cleave one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD, It is extremely useful because it can be specifically cleaved (low molecular weight).
  • the drug of the present invention can specifically cleave one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD existing in a living tissue, so that cleavage is desired. Such a sugar chain can be cleaved to leave a sugar chain that is not desired to be cleaved, which is extremely useful.
  • the medicament of the present invention (the catalyst of the present invention, the cleavage agent of the present invention) includes HA, CSA, Since it cleaves one or more sugar chains selected from the group consisting of 3 and 3D by hydrolysis, unlike a bacterial lyase enzyme, it does not generate unsaturation and is a drug with higher safety It is very useful.
  • This sudden cutting method is also very useful because it can specifically cleave one or more sugar chains selected from the group consisting of HA, CSA, CSC and CSD.
  • the sugar chain production method of the present invention is also very useful because it can specifically, simply, rapidly, in large quantities, and inexpensively produce a predetermined low-molecular-weight sugar chain.
  • the method for producing the catalyst of the present invention, the method for producing the cutting agent of the present invention, and the method for producing the pharmaceutical of the present invention can also produce the catalyst of the present invention, the cutting agent of the present invention and the pharmaceutical of the present invention simply, quickly, in large quantities and at low cost, and are extremely useful. It is.
  • the fusion protein of the present invention can also be used as an essential component of the catalyst of the present invention, the cleavage agent of the present invention, and the medicament of the present invention, and is extremely useful.

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Abstract

ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C及びコンドロイチン硫酸Dからなる群から選ばれる1又は2以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒、該糖鎖の特異的切断剤、生体組織中に存在する該糖鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬、該糖鎖を特異的に切断する方法、低分子量化された該糖鎖を特異的に生産する方法、および該触媒、該切断剤および該医薬の製造方法。

Description

明 細 書 糖鎖の切断触媒 技術分野
本発明は、 新規な糖鎖切断触媒、 糖鎖の特異的切断剤等に関する。 背景技術
まず、 本明細書中で共通して用いる略号について説明する。
HA： ヒアルロン酸
CH： コンドロイチン
CS ： コンドロイチン硫酸
C S A： コンドロイチン硫酸 A
CSC ： コンドロイチン硫酸 C
C S D：コンドロイチン硫酸 D
DS (C SBと表記することもある） ：デルマタン硫酸
GPC：ゲル浸透ク口マトグラフィー
KS ：ケラタン硫酸
なお CSAは、 「グルクロン酸残基と N—ァセチルガラタトサミン残基とが ]3 1, 3グリコシド結合した二糖単位」 が連続して結合されてなる分子であって、 「ダルク ロン酸残基 （i31- 3) 4位が硫酸ィ匕された N_ァセチルガラクトサミン残基」 からなる 二糖単位を主たる構成成分とする C Sである。
CSCは、 「グルクロン酸残基と N—ァセチルガラクトサミン残基とが /3 1, 3グ リコシド結合した二糖単位」 が連続して結合されてなる分子であって、 「グルクロン 酸残基 （]31 - 3) 6位が硫酸ィ匕された N—ァセチルガラクトサミン残基」 からなる二糖 単位を主たる構成成分とする CSである。
CSDは、 ' 「グルクロン酸残基と N—ァセチルガラクトサミン残基とが |3 1, 3グ リコシド結合した二糖単位」 が連続して結合されてなる分子であって、 「 2位が硫酸 化されたグルクロン酸残基 （]31-3) 6位が硫酸ィ匕された N—ァセチルガラクトサミン 残基」 からなる二糖単位を主たる構成成分とする CSである。 The Journal of Biological Chemistry, Vol.277, p33654- 33663 (2002) には、 ヒ アル口-ダーゼの一種である HYAL 1が記載されている。 また Biochemical and biophysical research communications, 236(1), plO - 15, (1997) には、 HYAL丄 の全ァミノ酸配列及びこれをコードする cDNAの全塩基配列が開示されている。
しかし、 HYAL1が CSB、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断する活性を実質 的に有さず、 CSA、 C SC及び C SDを切断する活性を有することは知られていな い。 発明の開示
本発明は、 HYAL1を必須成分とする新規な糖鎖切断触媒、 糖鎖の特異的切断剤等を提 供することを課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 HYAL1を必須成分 とする新規な糖鎖切断触媒、 糖鎖の特異的切断剤及び医薬、 並びに HYAL1を特定の糖鎖 に作用させる工程を少なくとも含む糖鎖の特異的切断方法、 HYAL1を特定の糖鎖に作用 させる工程を少なくとも含む、 低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法、 HYAL1を保持する DNAを用いてタンパク質を発現させ、 発現されたタンパク質を採取 する工程を少なくとも含む、 前記触媒の製造方法、 HYAL1を保持する DNAを用いてタ ンパク質を発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 前記 切断剤の製造方法、 及び HYAL1を保持する DNAを用いてタンパク質を発現させ、 発現 されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 前記医薬の製造方法等を提供す るに至った。
本発明は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質を必須成分とし、 HA、 CSA、 C SC及ぴ C SDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する能力 を有する触媒 （以下、 「本突明触媒」 という） を提供する。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
(B) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 C SA、 じ3じ及び03 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
本発明触媒は、 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断する能力を有しな いものが好ましい。 また本発明は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質を必須成分とする、 HA、 CS A、 C S C及び C SDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖の特異的切断剤 (以下、 「本発明切断剤」 という） を提供する。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 じ3〇及び〇3 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
本発明切断剤は、 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断する能力を有し ないものが好ましい。
また本努明は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質を必須成分とし、 生体組織中に 存在する HA、 CSA、 CSC及び CSDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖 鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬 （以下、 「本発明医 薬」 という） を提供する。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
(B) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 〇3〇及びじ3 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
本発明医薬は、 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断する能力を有しな いものが好ましい。
また、 本発明医薬による切断対象となる糖鎖が存在する 「生体組織」 は、 髄核であ ることが好ましい。 また本発明医薬は、 椎間板ヘルニアの処置剤であることが好まし い。
また本宪明は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質を、 HA、 CSA、 CSC及び C S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含 む、 当該糖鎖を特異的に切断する方法 （以下、 「本発明切断方法」 という） を提供す る。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 CSC及び CS Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
本発明切断方法においては、 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHが切断され ないことが好ましい。
また本宪明は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質を、 HA、 CSA、 CSC及ぴ CSDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含 む、 低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法 （以下、 「本発明糖鎖生産方 法」 という） を提供する。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
(B) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 じ3〇及びじ3 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
本発明糖鎖生産方法においては、 低分子量化された DS、 KS及び CHが生産され ないことが好ましい。
また本宪明は、 下記 （a) 又は （b) のいずれかを保持する DN Aを用いてタンパ ク質を発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 本発明触 媒の製造方法 （以下、 「本発明触媒製造方法」 という） を提供する。
( a ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D N A。 ( b ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 揷入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 HA、 CSA、 じ3〇及び。 S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタ ンパク質をコードする DNA。
また本発明は、 下記 （a) 又は （b) のいずれかを保持する DNAを用いてタンパ ク質を発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 本発明切 断剤の製造方法 （以下、 「本発明切断剤製造方法」 という） を提供する。
( a ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D N A。 (b) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 HA、 CSA、 じ3じ及び。 S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタ ンパク質をコードする DNA。 また本発明は、 下記 （a) 又は （b) のいずれかを保持する DNAを用いてタンパ ク質を発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 本発明医 薬の製造方法 （以下、 「本発明医薬製造方法」 という） を提供する。
( a ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D NA。 ( b ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 HA、 CSA、 じ3じ及び。 SDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタ ンパク質をコードする DNA。
さらに本発明は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質と他のペプチドとの融合タン パク質 （以下、 「本発明融合タンパク質」 という） を提供する。
(A) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(B) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 じ3じ及び〇3 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
本発明融合タンパク質は、 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断する能 力を有しないものが好ましい。
さらに本発明は、 上記本発明医薬を投与することを特徴とする、 HA、 CSA、 C S C及び C S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖が生体組織に過剰に存在 する疾患を処置する方法 （以下、 「本発明処置方法」 という） を提供する。
本発明処置方法における好ましい本発明医薬及ぴ好ましい生体組織は、 上記本発明 医薬において好ましいものと同様である。 図面の簡単な説明
第 1図は、 HYAL1の基質として H Aを用いた場合の結果を示す図である。
第 2図は、 HYAL1の基質として CHを用いた場合の結果を示す図である。
第 3図は、 HYAL1の基質として CS Aを用いた場合の結果を示す図である。
第 4図は、 HYAL1の基質として C SBを用いた場合の結果を示す図である。
第 5図は、 HYAL1の基質として CSCを用いた場合の結果を示す図である。
第 6図は、 HYAL1の基質として CSDを用いた場合の結果を示す図である。
第 7図は、 HYAL1の基質として KSを用いた場合の結果を示す図である。 第 8図は酵素源を HYAL1、 基質を HAとした場合のクロマトグラフの結果を示す図で める。
第 9図は酵素源を HYAL1、 基質を C S Aとした場合のクロマトグラフの結果を示す図 である。
第 1 0図は酵素源を HYAL1、'基質を C S Cとした場合のクロマトグラフの結果を示す 図である。
第 1 1図は酵素源を PH20、 基質を HAとした場合のクロマトグラフの結果を示す図 である。
第 1 2図は酵素源を PH20、 基質を C S Aとした場合のクロマトグラフの結果を示す 図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を、 癸明の実施の形態によって詳説する。
< 1〉本発明触媒
本発明触媒は、 下記 （A) 又は （B ) のタンパク質を必須成分とし、 HA、 C S A、 C S C及ぴ C S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する能 力を有する触媒である。
(A) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 C S A、 C S C及び C S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
(A) のタンパク質は HYA L 1のタンパク質である。
なお、 天然に存在するタンパク質には、 それをコードする D N Aの多型や変異の他、 生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのァミノ酸配列中 にアミノ酸の置換、 欠失、 揷入又は転位等の変異が起こりうるが、 それにもかかわら ず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、 生物学的活性を示すものがある ことが知られている。 このように （A) のタンパク質に対して構造的に若干の差違が あってもその機能については大きな違いが認められないタンパク質も、 本発明触媒の 必須成分として用いることができる。 人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のよ うな変異を導入した場合も同様であり、 この場合にはさらに多種多様の変異体を作製 することが可能である。 例えば、 ヒトインターロイキン 2 (IL-2) のアミノ酸配列中 の、 あるシスティン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン 2活性 を保持することが知られている（Science, 224, 1431 (1984) )。 また、 ある種のタンパク 質は、 活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。 例えば、 細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルぺプチドゃ、 プロテアーゼの前駆 体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、 これらの領域のほとんどは翻訳後、 又 は活性型タンパク質への転換に際して除去される。 このようなタンパク質は、 一次構 造上は異なった形で存在しているが、 最終的には （A) のタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質である。 上記の （B ) のタンパク質は、 このようなタンパク質を規 定するものである。
本明細書において 「数個のアミノ酸」 とは、 H Y A L 1の活性が失われない程度の 変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、 例えば 6 0 0アミノ酸残基からなるタン パク質の場合、 2〜3 0程度、 好ましくは 2〜1 5、 より好ましくは 2〜8以下の数 を示す。 配列番号 2の場合には、 2〜2 2程度、 好ましくは 2〜 1 1、 より好ましく は 2〜 6以下の数を示す。
本明細書において、 （B ) のタンパク質と同様に、 配列番号 2で示されるアミノ酸 配列と 9 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ、 HA、 C S A、 C S C及ぴ C S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性 を有するタンパク質も本発明触媒の有効成分として使用することができる。
配列番号 2で示されるァミノ酸配列と 9 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列か らなり、 かつ、 H A、 C S A、 C S C及び C S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以 上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質は、 配列番号 2で示されるアミ ノ酸配列と好ましくは 95%以上、 さらに好ましくは 96%以上、 最も好ましくは 97%以 上の相同性を有することが好ましい。 アミノ酸配列の相同性は、 FASTAのような周知の コンピュータソフトウエアを用いて容易に算出することができ、 このようなソフトゥ エアはインターネットによっても利用に供されている。
また本発明触媒における上記 （A) 及び （B ) のタンパク質のアミノ酸配列には、 他のタンパク質ゃぺプチドのアミノ酸配列が含まれていても良い。 すなわち上記 (A) 及ぴ （B ) のタンパク質は、 他のペプチドとの融合タンパク質であっても良い。 本発明は、 このような上記 （A) 又は （B ) のタンパク質と他のペプチドとの融合タ ンパク質 （本発明融合タンパク質） をも提供する。 本明細書における 「他のぺプチ ド J という用語は、 「ポリペプチド」 を含む概念として用いる。
本発明融合タンパク質としては、 HYAL 1とマーカーぺプチドとの融合タンパク 質等が例示される。 このような本発明融合タンパク質は、 精製や分析を容易にするこ とができるというメリットがある。 上記マーカーぺプチドとしては例えば FLAGぺプチ ド、 プロテイン A、 インスリンシグナル配列、 His、 CBP (カルモジュリン結合タンパ ク質） 、 GST (ダルタチオン S—トランスフェラ一ゼ) などが挙げられる。 例えば FLAGぺプチドとの融合タンパク質は、 抗 FLAG抗体を結合させた固相を用いたアブイ- ティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。 プロテイン Aとの 融合タンパク質は、 I gGを結合させた固相を用いたアブイ-ティークロマトグラフ ィ一によつて簡便に精製することができる。 同様に、 Hisタグとの融合タンパク質につ いては磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができる。 またインスリンシグナ ルとの融合タンパク質は、 細胞外 （培地等） に分泌されることから、 細胞破碎等の抽 出操作が不要となる。 本発明融合タンパク質は、 なかでも FLAGペプチドとの融合タン パク質であることが好ましい。
本発明融合タンパク質は、 以下の通り製造することができる。
まず、 前記 （A) のタンパク質 （配列番号 2におけるアミノ酸番号 1〜435で示 されるアミノ酸配列を含むタンパク質） をコードする DNA (以下 「DNA (a) 」 という） を用意する。 この DNAは、 配列番号 2におけるアミノ酸番号 1〜435で 示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限 定されない。 このような DNAとしては、 遺伝暗号の縮重によって種々の異なったヌ クレオチド配列を有する DNAが存在するが、 配列番号 1におけるヌクレオチド番号 1〜1 308で示されるヌクレオチド配列によって特定される DNAが好ましい。 こ の DNAは、 GenBank accession No. U03056 として登録されている。
また、 前記 （A) のタンパク質に代えて前記 (B) のタンパク質をコードする DN A (以下 「DNA (b) 」 という） を用いてもよい。 「DNA (b) 」 は、 前記 (A) のアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転 位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 C SC及び C SDからなる群から 選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有する限りにおいて特に限定 されない。 これらの糖鎖を切断する活性を有するか否かは、 低分子量化した糖鎖の一般的な検 出方法によって検出することができる。 例えば、 後述の実施例に示すような G PCに おける糖鎖のピークの移動によって検出することができ、 この方法によって検出され ることが好ましい。
また、 HA、 CSA、 CSC及び CSD以外の種々の基質 （糖鎖） を用いて、 GP Cにおける糖鎖のピークの移動の有無を検出することにより、 HA、 CSA、 CSC 及び CSDに対する切断活性の特異性の有無を検出することができる。 このような方 法によって、 HA、 CSA、 CSC及ぴ CSDからなる群から選ばれる 1又は 2以上 の糖鎖を特異的に切断する活性を保持しているアミノ酸の欠失、 置換、 揷入又は転位 を容易に選択することができる。
このような 「DNA (b) 」 としては、 例えば 「DNA (a) 」 若しくは当該 DN Aに相捕的な DNA又はこれらの DNAの塩基配列を有する DNAと、 ストリンジェ ントな条件下でハイプリダイズする D N Aが例示される。
ここで 「ストリンジヱントな条件」 とは、 いわゆる特異的なハイプリッドが形成さ れ、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう （Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning, Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照） 。 「ストリンジ: ントな条件」 として具体的には、 50%ホルムアミ ド、 4 X S S C、 50mM H E P E S (pH7.0) 、 10 X Denhardt' s solution, 100 /zg/mlサケ精子 DNAを含む溶液中、 42°Cでハイプリダイズさせ、 次いで 室温で 2 X S S C、 0.1% S D S溶液、 50。C下で 0.1 X S S C、 .0.1% S D S溶液で洗浄 する条件が挙げられる。
上記 DNA (a) 又は DNA (b) のいずれかを保持する D N Aを用いたタンパク 質の発現は、 当該 DNAが保持されたベクター （好ましくは発現ベクター） を用いて 行うことが好ましい。 DN Aのベクターへの組込みは、 通常の方法によって行うこと ができる。
DNAを導入するベクターとしては、 例えば、 導入した DNAを発現させることが できる適当な発現ベクター （ファージベクター或いはプラスミドベクター等） を使用 することができ、 本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。 このよ うな宿主一ベクター系としては、 大腸菌 （E. coli) と、 ρΕΤ1¾ (Novagen社製） 、 pTrcHis (インビトロゲン社製） 、 pGEX (フアルマシア バイオテック社製） 、 Trc99 (フアルマシア バイオテック社製） 、 PKK233-3 (フアルマシア バイオテック社 製） 、 EZZZ18 (フアルマシア バイオテック社製） 、 pCHl lO (ファノレマシア バイオ テック社製） 、 pBAD (インビトロゲン社製） 、 pRSET (インビトロゲン社製） 又は PSE420 (インビトロゲン社製) 等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ、 COS細 胞ゃ 3LL-HK46細胞などの哺乳類細胞と、 pGIR201 (Kitagawa, H. , and Paulson, J. C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1394-1401) 、 pEF-BOS (Mizushima, S. , and Nagata, S. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 5322 ) 、 pCXN2 (Niwa, H. , Yamanura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200)、 pCMV - 2 (イース トマン コダック (Eastman Kodak)製） 、 pCEV18、 pME18S (丸山ら， Med. Immunol. , 20, 27 (1990) ) 又は pSVL (ブアルマシア バイオテック社製） 等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わ せのほか、 宿主細胞として酵母、 枯草菌などが例示され、 これらに対応する各種べク ターが例示される。 上述の宿主一ベクター系の中でも特に原核細胞 （特に大腸菌細 胞） と ρΕΤ1¾との組み合わせが好ましい。
また、 宿主細胞として昆虫細胞を用いることもできる。 この場合にも、 昆虫細胞に 対応する各種ベクターを用いることができる。 昆虫細胞としては、 高発現 S F +細胞 (expresSf+ (登録商標））を用いることが好ましい。 また、 D N Aを組み込むトランスフ ァーベクターとしては pPSC8や pPSC12が好ましい。 D N Aを pPSC8に組み込む場合には、 Smal、 Kpnl, Pstl、 Xbal Nrul、 Πを利用して組み込みを行うことができる。 D N Aを pPSC12に組み込む場合には、 l、 Kpnl, Pstl、 ΜΠを利用して組み込みを行う ことができる。 また、 タンパク質の Ν末端に FLAGペプチドが融合されたかたちで発現 されるようにするために、 トランスファーベクターに組み込む前に、 対応する D N A の末端に FLAGぺプチドをコ一ドする配列を付加しておくことが好ましい。
D N Aをトランスファ一べクターに組み込んだ後、 これをパキユウロウィルスに導 入することが好ましい。 ノ キユウロウイノレスとしては、 Autographs californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV) や、 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) ¾r 用いることが好ましい。 そして、 目的とする D NAが導入されたパキュロウィルスを 昆虫細胞に感染させればよい。
D NAを組込むベクターは、 目的とするタンパク質とマーカーぺプチドとの融合タ ンパク質を発現するように構築されたものを用いることができる。 D NAからのタン パク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、 通常の方法に従って行うことがで さる。 例えば、 目的とする D N Aが組み込まれた発現べクターを適当な宿主に導入するこ とによって宿主を形質転換し、 この形質転換体を生育させ、 その生育物から発現され たタンパク質を採取することによって行うことができる。
本発明触媒は、 HA、 CSA、 C SC及び CSDからなる群から選ばれる 1又は 2 以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有しており、 この能力の有無も、 低分子量化し た糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。 その方法の説明は前記と 同様である。 なかでも、 HA、 CSA、 CSC及び CSDの 4種類の糖鎖を特異的に 切断する能力を有するものが好ましい。
また本努明触媒は、 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断する能力を有 しないものが好ましい。 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHに対する切断能力 の有無も、 前記と同様に DS、 KS又は平均分子量 7000の CHを基質として用い て、 低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
本発明触媒は、 少なくとも前記の （A) 又は （B) のタンパク質を含んでいればよ レ、。 すなわち本発明触媒は、 前記の （A) 又は （B) のタンパク質自体をそのまま本 発明触媒としてもよく、 前記の （A) 又は （B) のタンパク質に加えて、 これらのタ ンパク質に悪影響を与えず、 かつ、 本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、 他 の成分を含有させてもよい。
本発明触媒の製造方法も特に限定されず、 天然物から上記 （A) 又は （B) のタン パク質を単離してもよく、 化学合成等によって上記 （A) 又は （B) のタンパク質を 製造してもよく、 遺伝子工学的手法によって上記 （A) 又は （B) のタンパク質を製 造してもよい。 遺伝子工学的手法によって本発明触媒を製造する方法については、 後 述の本発明触媒製造方法を参照されたい。
本発明触媒の形態も限定されず、 溶液形態、 凍結形態、 凍結乾燥形態、 担体と結合 した固定化酵素形態のレ、ずれであってもよい。
< 2 >本発明切断剤
本発明切断剤は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質を必須成分とする、 HA、 C SA、 CSC及び CSDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖の特異的切断剤 である。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。 ( B ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 じ3〇及び〇3 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
本発明切断剤は、 HA、 CSA、 CSC及び CSDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有しており、 この能力の有無も、 低分子量化 した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。 その方法の説明は前記 と同様である。 なかでも、 HA、 CSA、 CSC及び CSDの 4種類の糖鎖を特異的 に切断する切断剤であることが好ましい。
また本発明切断剤は、 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断する能力を 有しないものが好ましい。 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHに対する切断能 力の有無も、 前記と同様に DS、 KS又は平均分子量 7000の CHを基質として用 いて、 低分子量ィ匕した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
そして本発明切断剤は、 HA、 CSA、 CSC及び CSDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、 このような目的の下で DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断しない目的で用いられることが好ま しい。
本発明切断剤の製剤化には、 公知の方法を用いることができる。 また本発明切断剤 の形態も特に限定されず、 例えば溶液状態、 凍結状態、 凍結乾燥状態、 担体と結合し た固定化酵素形態の 、ずれであってもよい。
本発明切断剤に関するその他の説明は、 前記の 「く 1 >本発明触媒」 と同様である。 遺伝子工学的手法によって本発明切断剤を製造する方法については、 後述の本発明切 断剤製造方法を参照されたレヽ。
< 3 >本発明医薬
本発明医薬は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質を必須成分とし、 生体組織中に 存在する HA、 CSA、 CSC及び CSDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖 鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬である。
(A) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 〇3〇及び〇3 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
本発明医薬は、 HA、 CSA、 C SC及び CSDからなる群から選ばれる 1又は 2 以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有しており、 この能力の有無も、 低分子量化し た糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。 その方法の説明は前記と 同様である。 なかでも、 HA、 CSA、 C S C及び C SDの 4種類の糖鎖を特異的に 切断する医薬であることが好ましい。
また本発明医薬は、 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断する能力を有 しないものが好ましい。 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHに対する切断能力 の有無も、 前記と同様に DS、 KS又は平均分子量 7000の CHを基質として用い て、 低分子量ィ匕した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
そして本発明医薬は、 生体組織中に存在する HA、 CSA、 CSC及び C SDから なる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、 こ のような目的の下で DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断しない目的で用 いられることが好ましい。
また本発明医薬が適用される生体組織は、 HA、 CSA、 CSC及び CSDからな る群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断することが望まれる生体組織で ある限りにおいて特に限定されない。 例えば、 HA、 CSA、 CSC及び CSDから なる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖が、 健常状態におけるレベルよりも過剰に存 在しているような生体組織が挙げられる。 このような生体組織として具体的には髄核 が例示され、 なかでも椎間板ヘルニアの状態にある髄核が好ましい。 すなわち本発明 医薬は、 椎間板ヘルニアの処置剤であることが好ましい。 本明細書における 「処置」 の用語には、 予防、 進行抑制 （悪ィ匕防止） 、 改善、 治療等を目的とする処置が含まれ る。
近年、 コンドロイチナーゼを椎間板に投与して髄核を融解し、 椎間板ヘルニアを治 療する試みが現に行われている （米国特許第 4 6 9 6 8 1 6号、 Clinical Orthopaedics, 253, 301-308 (1990)) 。 このことから、 C Sを切断する活性を有する 本発明医薬は、 同様に椎間板ヘルニアの処置剤として十分に利用しうるものである。 そして本発明医薬が適用される動物も特に限定されないが、 脊椎動物であることが 好ましく、 なかでも哺乳類であることが好ましい。 哺乳類としては、 ヒ ト、 ィヌ、 ネ コ、 ゥサギ、 ゥマ、 ヒッジ等が提示されるが、 ヒトに対して適用されるものが特に好 ましい。
本発明医薬の投与方法は、 本発明医薬による生体組織中の HA、 CSA、 CSC及 ぴ C SDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖の特異的切断作用が発揮される 限りにおいて特に限定されないが、 例えば注射による投与が挙げられる。 本発明医薬 を髄核に適用する場合には、 目的とする髄核が存在する椎間板又は脊髄硬膜外腔に注 射することが好ましい。
投与方法に応じて上記 （A) 又は （B) のタンパク質を適宜製剤化して、 本発明医 薬とすることができる。 通常、 製剤化は医薬的に許容される一つあるいはそれ以上の 担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により行わ れる。 剤形としては、 注射剤 （溶液、 懸濁液、 乳濁液、 用時溶解用固形剤等） 、 錠剤、 カプセル剤、 液剤等が挙げられる。 なかでも注射剤が好ましい。
本発明医薬の投与量は、 上記 （A) 又は （B) のタンパク質の種類、 比活性、 投与 される動物の種類や症状等、 投与対象となる生体組織の種類やその状態等によって個 別的に設定されるべきものであり、 特に限定されないが、 一般的には一日あたり 0. 1 /i g〜： L 00 Omg程度を投与することができる。
本発明医薬に関するその他の説明は、 前記の 「< 1 >本発明触媒」 と同様である。 遺伝子工学的手法によって本発明医薬を製造する方法については、 後述の本発明医薬 製造方法を参照されたい。
< 4〉本発明切断方法
本発明切断方法は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質を、 HA、 CSA、 CSC 及び C SDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖に作用させる工程を少なくと も含む、 当該糖鎖を特異的に切断する方法である。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
(B) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 3〇及び〇3 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
上記 （A) 及び （B) のタンパク質に関する説明は、 前記の 「< 1〉本発明触媒」 と同様である。 上記 （A) 又は （B) のタンパク質を、 HA、 CSA、 〇3〇及び〇 S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖に作用させる方法は、 これらの分子 が相互に接触して酵素反応が生ずる状態となる限りにおいて特に限定されず、 例えば 前者に後者を添加してもよく、 後者に前者を添加してもよく、 両者を同時に添加して あよい。
また、 上記 （A) 及び （B) のタンパク質を担体 （例えば、 ゲル、 ビーズ、 膜、 プ レート等） に固定させ、 これと HA、 CSA、 C S C及ぴ C SDからなる群から選ば れる 1又は 2以上の糖鎖とを接触させてもよい。
両者を接触させた後の反応の条件は、 上記 （A) 又は （B) のタンパク質が作用す る条件である限りにおいて特に限定されないが、 これらのタンパク質の至適 p H付近 (例えば pH4~pH5程度） で反応させることが好ましく、 当該 pH下で緩衝作用 を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。 またこのときの温度も、 これら のタンパク質の活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、 35°C〜40°C 程度が例示される。 またこれらのタンパク質の活性を増加させる物質がある場合には、 その物質を添カ卩してもよい。 反応時間は、 pH条件、 温度条件、 作用させるタンパク 質及び糖鎖の量、 及びどの程度の切断 （低分子量化） を所望するか等によって適宜調 節することができる。 反応時間を長くすれば切断 （低分子量化） の程度を増すことが でき、 反応時間を短くすればその程度を減ずることができる。
また本発明切断方法には、 このようなタンパク質の作用工程が少なくとも含まれて いればよく、 さらに他の工程が含まれていてもよい。
本発明切断方法によって、 HA、 CSA、 C S C及び C SDからなる群から選ばれ る 1又は 2以上の糖鎖が特異的に切断される。 これらの糖鎖が切断されたか否かは、 低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。 その方法の 説明は前記と同様である。 なかでも、 HA、 CSA、 〇3〇及び〇30の4種類の糖 鎖を特異的に切断する方法であることが好ましい。
また本発明切断方法は、 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断しないこ とが好ましい。 DS、 KS及び平均分子量 7000の CHが切断されていないことも、 低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によつて検出することができる。
すなわち本発明切断方法は、 HA、 CSA、 〇3〇及ぴ030からなる群から選ば れる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、 このような目的の 下で DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断しない目的で用いられることが 好ましい。 本発明切断方法に関するその他の説明は、 前記の 「< 1〉本発明触媒」 と同様であ る。
< 5〉本発明糖鎖生産方法
本発明糖鎖生産方法は、 下記 （A) 又は （B) のタンパク質を、 HA、 CSA、 C S C及ぴ C S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖に作用させる工程を少な くとも含む、 低分子量^ ί匕された当該糖鎖を特異的に生産する方法である。
(Α) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
( Β ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 HA、 CSA、 〇3〇及び〇3 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタン パク質。
本発明糖鎖生産方法により、 HA、 CSA、 CSC及び CSDからなる群から選ば れる 1又は 2以上の糖鎖が低分子量化された糖鎖を特異的に生産することができる。 低分子量化された糖鎖が生産されたか否かは、 低分子量化した糖鎖の一般的な検出方 法によって確認することができる。 その方法の説明は前記と同様である。 なかでも、 HA、 CSA、 C S C及び C SDの 4種類の糖鎖を特異的に生産する方法であること が好ましい。
また本発明糖鎖生産方法は、 低分子量化された DS、 KS及び CHを生産しないこ とが好ましい。 DS、 KS及び CHが生産されていないことも、 低分子量化した糖鎖 の一般的な検出方法によって確認する.ことができる。
すなわち本発明糖鎖生産方法は、 HA、 CSA、 C SC及び C SDからなる群から 選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、 このような目 的の下で DS、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断しない目的で用いられるこ とが好ましい。
生成物から低分子量化された糖鎖を単離する方法等は、 公知の方法によって行うこ とができる。
本発明糖鎖生産方法に関するその他の説明は、 前記の 「< 1 >本発明触媒」 及び 「< 4〉本発明切断方法」 と同様である。 < 6〉本発明触媒製造方法
本突明触媒製造方法は、 下記 （a) 又は （b) のいずれかを保持する DN Aを用い てタンパク質を発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 本発明触媒の製造方法である。
( a ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D N A。 (b) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 HA、 CSA、 じ3〇及びじ S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタ ンパク質をコードする DNA。
上記 （a) の DNAは、 配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を コードするものである限りにおいて特に限定されない。 このような DNAとしては、 遺伝暗号の縮重によつて種々の異なった塩基配列を有する D N Aが存在するが、 配列 番号 1で示される塩基配列によって特定される DNAが好ましい。 配列番号 1で示さ れる DNAは、 GenBank accession No. U03056 として登録されている。
上記 （b) の DNAも、 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数 個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 HA、 CSA、 CSC及び CSDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切 断する活性を有するタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されな い。 このような DNAとしては、 例えば上記 （a) に記載の DNA若しくは当該 DN Aに相捕的な DNA又はこれらの DNAの塩基配列を有する DNAと、 ストリレジェ ントな条件下でハイプリダイズする D N Aが例示される。
ここで 「ストリンジェントな条件」 とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが形成さ れ、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう （Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, し old spring Harbor Laboratory Press (I989)等参照） 。 「ストリンジヱントな条件」 として具体的には、 50%ホルムアミ ド、 4 X S S C、 50mM H E P E S (pH7. O) 、 10 X Denhardt' s solution, g/mlサケ精子 DNAを含む溶液中、 42°Cでハイプリダイズさせ、 次いで 室温で 2 X S S C、 0.1% S D S溶液、 50°C下で 0.1 X S S C、 0.1% S D S溶液で洗浄 する条件が挙げられる。 上記 （a ) 又は （b ) のいずれかを保持する D NAを用いたタンパク質の発現は、 当該 D NAが保持されたベクター （好ましくは宪現ベクター） を用いて行うことが好 ましい。 D NAのべクタ■ ■の組込みは、 通常の方法によって行うことができる。
D N Aを導入するベクターとしては、 例えば、 導入した D N Aを発現させることが できる適当な発現ベクター （ファージベクター或いはプラスミドベクター等） を使用 することができ、 本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。 このよ うな宿主—ベクター系としては、 COS細胞、 3LL - HK46細胞などの哺乳類細胞と、 pGIR201 (Kitagawa, H. , and Paulson, J. C. (1994) J. Biol. Chem. 269， 1394- 1401 ) 、 EF-BOS (Mizushima, S. , and Nagata, S. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 5322) 、 pCXN2 (Niwa, H. , Yamanura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193- 200)、 pCMV-2 (イーストマン コダック（Eastman Kodak)製） 、 pCEV18、 pME18S (丸山 ら， Med. Immunol. , 20, 27 (1990) ) 又は pSVL (ブアルマシア バイオテック社製） 等 の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせ、 大腸菌 （E. coli) と、 pTrcHis (イン ビトロゲン社製) 、 pGEX (フアルマシア バイオテック社製） 、 Trc99 (フアルマシ 了 バイオテック社製) 、 pKK233-3 (フアルマシア バイオテック社製） 、 EZZZ18 (フアルマシア バイォテック社製) 、 pCHHO (フアルマシア バイオテック社製） 、 pET (ストラタジーン社製） 、 pBAD (ィンビトロゲン社製） 、 pRSET (ィンビトロゲン 社製） 、 及び pSE420 (インビトロゲン社製） 等の原核細胞用の発現ベクターとの組み 合わせ、 昆虫細胞とバキュロウィルスとの組み合わせのほ力 宿主細胞として酵母、 枯草菌などが例示され、 これらに対応する各種ベクターが例示される。 上述の宿主一 ベクター系の中でも特に哺乳類細胞 （特に COS細胞） と pFLAG-CMV6 (SIGMA社製） との 組み合わせが好ましい。
また、 D NAを組込むベクターは、 目的とするタンパク質とマーカーペプチドとの 融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることもできる。 D N Aから のタンパク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、 通常の方法に従って行うこ とができる。
例えば、 目的とする D N Aが組み込まれた発現べクタ一を適当な宿主に導入するこ とによって宿主を形質転換し、 この形質転換体を生育させ、 その生育物から発現され たタンパク質を採取することによって行うことができる。
ここで 「生育」 とは、 形質転換体である細胞や微生物自体の増殖や、 形質転換体で ある細胞を組み込んだ動物 ·昆虫等の生育を含む概念である。 また、 ここでいう 「生 育物」 とは、 形質転換体を生育させた後の培地 （培養液の上清） 及び培養された宿主 細胞 ·分泌物 ·排出物等を包含する概念である。 生育の条件 （培地や培養条件等） は、 用いる宿主に合わせて適宜選択できる。
生育物からのタンパク質の採取も、 タンパク質の公知の抽出 '精製方法によって行 うことができる。
例えば目的とするタンパク質が、 培地 （培養液の上清） 中に分泌される可溶性の形 態で産生される場合には、 培地を採取し、 これをそのまま用いてもよい。 また目的と するタンパク質が細胞質中に分泌される可溶性の形態、 又は不溶性 （膜結合性） の形 態で産生される場合には、 窒素キヤビテーシヨン装置を用いる方法、 ホモジナイズ、 ガラスビーズミル法、 音波処理、 浸透ショック法、 凍結融解法等の細胞破碎による抽 出、 界面活性剤抽出、 又はこれらの組み合わせ等の処理操作によって目的とするタン パク質を抽出することができ、 その抽出物をそのまま用いてもよい。
これらの培地や抽出物から、 タンパク質をさらに精製することもできる。 精製は、 不完全な精製 （部分精製） であっても、 完全な精製であってもよく、 目的とするタン パク質の使用目的等に応じて適宜選択することができる。
精製方法として具体的には、 例えば硫酸アンモニゥム （硫安） や硫酸ナトリウム等 による塩析、 遠心分離、 透析、 限外濾過法、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交換ク 口マトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 ゲルろ過 法、 ゲル浸透クロマトグラフィー、 アブイ-ティークロマトグラフィー、 電気泳動法 等や、 これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
目的とするタンパク質が製造されたか否かは、 アミノ酸配列、 作用、 基質特異性等 を分析することによって確認することができる。
また本発明切断方法には、 以上のような発現 ·採取工程が少なくとも含まれていれ ばよく、 さらに他の工程が含まれていてもよい。
< 7 >本発明切断剤製造方法
本発明切断剤製造方法は、 下記 （a ) 又は （b ) のいずれかを保持する D N Aを用 いてタンパク質を発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 本発明切断剤の製造方法である。
( a ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D N A。 ( b ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 HA、 C S A、 じ3じ及ぴじ S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタ ンパク質をコードする D NA。
本発明切断剤製造方法に関するその他の説明は、 前記の 「< 6 >本発明触媒製造方 法」 と同様である。 く 8〉本発明医薬製造方法
本発明医薬製造方法は、 下記 （a ) 又は （b ) のいずれかを保持する D NAを用い てタンパク質を発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 本発明医薬の製造方法である。
( a ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D NA。 ( b ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 HA、 C S A、 。3 ( 及ぴじ
S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタ ンパク質をコードする D NA。
本発明医薬製造方法に関するその他の説明は、 前記の 「< 6 >本発明触媒製造方 法」 と同様である。
< 9〉本発明処置方法
本発明処置方法は、 本発明医薬を投与することを特徴とする、 HA、 C S A、 C S C及び C S Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖が生体組織に過剰に存在す る疾患を処置する方法である。
本発明処置方法に関するその他の説明は、 前記の 「く 3 >本発明医薬」 と同様であ る。 以下に、 本発明の実施例を具体的に説明する。 しかしながら、 これらによって本発 明の技術的範囲が限定されるものではない。 (1) HYAL 1遺伝子の発現
COS— 7細胞 （理化学研究所パイオリソースセンターより入手） を、 10%のゥ シ胎児血清を含む D M E M培地 （Invitrogen社製） 中で約 20〜 40%コンフルェン トになるまで培養した。 培養は 5 % C O 2の下で 37 °Cで実施した。
配列番号 1で示される塩基配列（HYAL1の cDNA)を pFLAG_CMV6ベクター （ SIGMA- Aldrich社製） に組み込んだヒアル口 -ダーゼ発現ベクターを、 TransFast Transfection kit (Promega社製） を用いて C O S— 7細胞にトランスフエクトし、 1 0 %のゥシ胎児血清を含む DMEM培地中、 37でで 3日間培養した。 培養は 5 % C 02の下で 37 °Cで実施した。
また、 配列番号 1で示される塩基配列（HYAL1の cDNA)が組み込まれていない pFLAG- CMV6ベクターをトランスフエクトした細胞についても、 同様に培養した。
(2) 酵素液の調製
上記 （1) で培養された細胞 （HYAL1の cDNAを組み込んだ発現ベクターをトランスフ ェクトしたもの、 又は HYAL1の cDNAを組み込んでいない発現ベクターをトランスフエク トしたもの） を、 lOmM Tris-HCl(pH7.4又は pH6.0)、 0.5% Triton X-100及び 0.25M シ ユークロースを含有する溶液中、 氷冷下でセルスクレーパーを用い破砕した。 この破 砕後の液をそのまま酵素液として用いた。
(3) 基質特異性の解析
(2) で調製された酵素液を種々の基質と反応させることによって、 酵素の基質特 異性を解析した。 反応は、 0.25%の各種基質、 0.15M NaCl、 及び 50mM酢酸ナトリゥム 緩衝液 （pH 4又は pH5) 又はリン酸ナトリウム緩衝液 （pH6又は pH7) を含有する反応混 合液に （ 2 ) で調製された酵素を最終濃度 20 % (vol/vol)となるよう添加し、 37 °C で 4日間ィンキュベートすることによって行った。
ここで用いた基質は、 以下の通りである。
*HS ： (鶏冠由来；生ィ匕学工業株式会社製）
* CH： (サメ由来；生化学工業株式会社製） 平均分子量 7000
* C S A (クジラ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
この C Sは、 生化学工業株式会社の試薬カタ口グコード番号 400650として同社から 販売されているものであり、 以下の性質を有する。 •セルロースァセテ一ト膜電気泳動で単一のバンドを示す。
•窒素含量： 2.4-2. 8% (Z. Anal. Chem. , 22, ρ366(1883)に記載の方法で測定)
'硫黄含量： 6. 2〜6. 6% (Mikrochim. Acta. , 123 (1955)に記載の方法で測定）
'ガラクトサミン含量： 32. 0〜37. 0% (アミノ酸自動分析器）
•ダルク口ン酸含量： 35. 0〜 40. 0 % (力ルバゾール反応）
'分子量： 25, 000〜50, 000 (Biochem. J., 23, pp517 (1929)に記載の方法で測定）
* 4 -硫酸 / 6 -硫酸： 80Z20 (J. Biol. Chem. , 243, ρ1536 (1968)に記載の方法で 測定）
* D S (プタ皮由来；生ィ匕学工業株式会社製）
この DS (CSB) は、 生化学工業株式会社の試薬力タログコード番号 400660とし て同社から販売されているものであり、 以下の性質を有する。
•赤外分光光度計で純粋と判断される
'窒素含量： 2.4〜2. 9% (Z. Anal. Chem. , 22, ρ366(1883)に記載の方法で測定）
'硫黄含量： 6. 2〜6. 9% (Mikrochim. Acta. , ρ123 (1955)に記載の方法で測定）
•ガラクトサミン含量： 32. 0〜37. 0% (アミノ酸自動分析器）
.ィズロン酸含量： 36. 0〜 42. 0% (カノレバゾール反応）
'分子量： 11,000〜25,000 (Biochem. J., 23, p517 (1929)に記載の方法で測定）
*CSC (サメ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
この C Sは、 生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号 400670として同社から 販売されているものであり、 以下の性質を有する。
.セルロースァセテ一ト膜電気泳動で単一のパンドを示す。
•窒素含量： 2. 3 ~ 2. 7 % (Z. Anal. Chem. , 22, Ρ366 (1883)に記載の方法で測定） •硫黄含量： 6.4〜 6 · 8 (Mikrochim. Acta. , Ρ123 (1955)に記載の方法で測定） •ガラクトサミン含量： 32. 0~37. 0% (アミノ酸自動分析器）
-ダルク口ン酸含量： 34. 0〜 39. 0% (カルパゾール反応）
'分子量： 40, 000〜80， 000 (Biochem. J.， 23, pp517 (1929)に記載の方法で測定) • 4-硫酸 / 6-硫酸： 10Z90 (J. Biol. Chem. , 243, ρ1536 (1%8)に記載の方法で 測定）
* C S D (サメ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
この C Sは、 生化学工業株式会社の試薬力タログコード番号 400676として同社から 販売されているものであり、 以下の性質を有する。 窒素含量： 2. 2-2. 6% (Z. Anal. Chem. , 22， p366 (1883)に記載の方法で測定） 硫黄含量： 7. 1~7. 7% (Mikrochim. Acta. , 123 (1%5)に記載の方法で測定） ガラ クトサミン含量： 30〜 35% (アミノ酸自動分析器）
ダルク口ン酸含量： 32〜 35 % (カノレバゾール反応）
*KS (ゥシ角膜由来；生ィ匕学工業株式会社製）
この K Sは、 生化学工業株式会社の試薬カタ口グコード番号 400760として同社から 販売されているものであり、 以下の性質を有する。
.セルロースァセテ一ト膜電気泳動で単一のバンドを示す。
•窒素含量： 2. 2 ~ 3. 0% (Z. Anal. Chem. , 22, ρ366 (1883)に記載の方法で測定） •硫黄含量： 6. 5〜 8. 0 % (Mikrochim. Acta. , ρ123 (1955)に記載の方法で測定） 'ガラタトース含量： 34〜40% (Biochem. J. , 50, Ρ298 (1952)に記載の方法で 測定）
'ガラクトサミン含量：検出限界以下 （アミノ酸自動分析器）
•ダルコサミン含量： 30〜40% (HITACHI KLA-5；株式会社日立製作所製） インキュベート後の溶液を、 ゲル浸透クロマトグラフィー （カラム ： TSKgel- G2500PWXL, TSKgel_G3000P L及び TSKgel- G4000PWXLの 3本。 溶出液は 0.2M NaCl、 流 速は 0.6mL/分） に付し、 屈折率ピークの位置の移動を観察した。
基質として HAを用いた場合の結果を第 1図に、 平均分子量 7000の CHを用い た場合の結果を第 2図に、 CS Aを用いた場合の結果を第 3図に、 C SBを用いた場 合の結果を第 4図に、 C S Cを用いた場合の結果を第 5図に、 CSDを用いた場合の 結果を第 6図に、 KSを用いた場合の結果を第 7図にそれぞれ示す。 各グラフの縦軸 は屈折率を、 横軸は時間 （保持時間；分） を示す。 各図の上段 （各図 A) は HYAL1の cDNAをトランスフエタトしていない細胞の酵素液を、 下段 （各図 B) は HYAL1の cDNAを 卜ランスフエクトした細胞の酵素液をそれぞれ用いた場合の結果である。 また図中の 最も太い実線 （青線） は pH\ 次に太い実線 （赤線） は pH6、 最も細い実線 （緑線） は PH5、 ドットによる線 （黒線） は pH4の反応混合液中でそれぞれ反応させたときの結果 を示す。 グラフの中央付近に存在するピークの保持時間が、 上段のグラフ （HYAL1の cDNAをトランスフエクトしていない） よりも長時間側にシフトした場合には、 基質が 低分子量化されたことになる。
第 1図より、 HYAL1の cDNAをトランスフエクトした細胞の酵素液を p H 4又は p H 5 の条件下で HAに作用させると、 中央付近に存在するピークが長時間側にシフトした (H Aが低分子量化された） 。 このことから、 HYAL1の cDNAでトランスフエクトした細 胞では、 HAを切断する活性を有する HYAL1が実際に発現されていることが確認された。 第 2図、 第 4図及び第 7図より、 HYAL1の cDNAをトランスフエタトした細胞の酵素液 を pH4〜7の条件下で CS B、 KS又は及び平均分子量 7000の CHに作用させ ても、 中央付近に存在するピークのシフトは観察されなかった （これらの基質は低分 子量化されなかった） 。 このことから、 HYAL1は CSB、 KS及び平均分子量 7000 の CHを切断する活性を実質的に有しないことが示された。
第 3図、 第 5図及び第 6図より、 HYAL1の cDNAをトランスフエクトした細胞の酵素液 を pH4又は pH5の条件下で CSA、 C S C又は C S Dに作用させると、 中央付近 に存在するピークが長時間側にシフトした （これらの基質が低分子量化された） 。 こ のことから、 HYAL1は CSA、 CSC及び CSDを切断する活性を有することが示され た。
以上の結果から、 HYAL1は HAのみならず CSA、 C S C及び C S Dを切断する活性 を有するが、 DS (CSB) 、 KS及び平均分子量 7000の CHを切断する活性を 実質的に有しないことが示された。
また、 ィンキュベート後の溶液は不飽和糖を反映する 210nmの吸収を示さなかったこ とから、 HYAL1は CSA、 C S C及び C SDを加水分解により切断することが示された。
(4) 基質への反応性の解析
HYAL1の基質への反応性を PH20 (精巣ヒアルロニダーゼ： GenBank accession No. S67798 として登録されているヒアルロニダーゼ） の基質への反応性と比較した。
ここで用いた酵素液、 基質は （3) で用いた酵素液、 基質と同じである。 また反応 液の組成、 反応温度も （3) と同じである。 ただし、 反応時間は 1日間、 4日間、 7 日間、 14日間及び未反応の 5点を設定し、 反応終了後それぞれの試料は一 30 で 凍結保存した。
また第 1 1図、 第 1 2図で用いた P1K0の酵素液は （1) 及び （2) で記載された方 法により HYAL1と同様に調製した。 PH20の cDNAを pFLAG- CMV6べクターに組み込み、 その ヒアルロニダーゼ発現ベクターを （1) と同条件で COS細胞に導入して PH20タンパク質 を一過性発現させた。 その発現細胞を （2) と同条件で破砕し酵素液とした。
反応後の各試料は （3) と同様ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて示差屈折率ピ ークの位置の移動を観察した。 第 8図は酵素源を HYAL1、 基質を HAとした場合のクロマトグラフの結果を示し、 第 9図は酵素源を HYAL1、 基質を C S Aとした場合、 第 1 0図は酵素源を HYAL1、 基質を
C S Cとした場合の結果をそれぞれ示す。 また第 1 1図は酵素源を PH20、 基質を HA とした場合、 第 1 2図は酵素源を PH20、 基質を C S Aとした場合の結果をそれぞれ示 す。 各グラフの縦軸は屈折率を、 横軸は時間 （保持時間；分） を示す。 図中の 0日、 1日、 4日、 7 S、 1 4日はそれぞれの試料の反応時間を示す。 また、 図中の最も太 い実線 （黒線） は 0日、 次に太い実線 （赤線） は 1日、 最も細い実線 （青線） は 4日、 最も太いドットによる線 （緑線） は 7日、 次に太いドットによる線 （橙線） は 1 4日 での結果を示す。
( 3 ) と同様グラフの中央付近に存在するピークの保持時間が長時間側にシフトし た場合には、 基質が低分子量化されたことになる。
第 8図より、 反応時間が 0の場合に認められるピークの保持時間が、 1日以上反応 させた場合に長時間側に移行する （H Aが低分子量ィ匕した） ことが判明した。 同様に 第 9図より基質を C S Aとした場合にも、 1ョ以上反応させることで、 ピーク保持時 間が長時間側に移行し、 第 1 0図より基質を C S Cとした場合にも同様の結果を示す ことが判明した。 このことから HYAL1は HA、 C S A及び C S Cに対しほぼ同様の反応 性を示すことが判明した。
第 1 1図より酵素源を PH20、 基質を HAとした場合、 反応時間に応じてピークの保 持時間が長時間側に移行することが判明した。 一方基質を C S Aとした場合には、 反 応時間を増加させてもピークの保持時間は顕著な変化を示さないことが第 1 2図より 示された。 このことから PH20は、 C S Aに対する反応性と比較して HAに対しては強 い反応性を示すことが判明した。
以上の結果より HYAL1は、 K120とは異なる基質反応性を有することがわかった。 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、 本発明の精神と範囲を 逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明ら かである。
本出願は、 2003年 3月 31日出願の日本特許出願 （特願 2003- 097301) および 2003年 4月 18日出願の日本特許出願 （特願 2003-113965) に基づくものであり、 その内容はここに 参照として取り込まれる。 ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。 産業上の利用可能性
本発明触媒及び本発明切断剤は、 HA、 CSA、 C SC及び C SDからなる群から 選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有することから、 このような 糖鎖を特異的に切断 （低分子量化） することができ極めて有用である。 また本発明医 薬は、 生体組織中に存在する HA、 CSA、 CSC及び CSDからなる群から選ばれ る 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断することができることから、 切断を望むこのよ うな糖鎖を切断し、 切断を望まない糖鎖を残存させることができ極めて有用である。 さらに本発明医薬 （本発明触媒、 本発明切断剤） は、 HA、 CSA、 。3じ及ぴじ3 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を加水分解により切断することから、 細菌由来のリァーゼ酵素と違つて不飽和も生成せず、 さらに安全性が高い医薬とする ことができる可能性があり、 極めて有用である。
また本突明切断方法も、 HA、 CSA、 C S C及ぴ C SDからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断でき極めて有用である
本発明糖鎖生産方法も、 低分子量化された所定の糖鎖を特異的に、 かつ簡便、 迅速、 大量、 安価に生産することができ極めて有用である。
本発明触媒製造方法、 本発明切断剤製造方法及び本発明医薬製造方法も、 本発明触 媒、 本発明切断剤及び本発明医薬を簡便、 迅速、 大量かつ安価に製造することができ、 極めて有用である。 本発明融合タンパク質も、 本発明触媒、 本発明切断剤や本発明医 薬の必須成分とすることができ、 極めて有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 下記 （A) 又は （B ) のタンパク質を有効成分として含有し、 ヒアノレロン酸、 コンドロイチン硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及ぴコンドロイチン硫酸 Dからなる群 から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン 硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1 又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
2 . デルマタン硫酸、 ケラタン硫酸及び平均分子量 7 0 0 0のコンドロイチンを 切断する能力を有しないことを特徴とする、 請求の範囲 1に記載の触媒。
3 . 下記 （A) 又は （B ) のタンパク質を有効成分として含有し、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群 から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖の特異的切断剤。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン 硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1 又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
4 . デルマタン硫酸、 ケラタン硫酸及び平均分子量 7 0 0 0のコンドロイチンを 切断する能力を有しないことを特徴とする、 請求の範囲 3に記載の切断剤。
5 . 下記 （A) 又は （B ) のタンパク質を有効成分として含有し、 生体組繊中に 存在するヒアルロン酸、 コンドロイチン硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロ ィチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断するために 用いられることを特徴とする医薬。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。 ( B ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン 硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及ぴコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1 又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
6 . デルマタン硫酸、 ケラタン硫酸及び平均分子量 7 0 0 0のコンドロイチンを 切断する能力を有しないことを特徴とする、 請求の範囲 5に記載の医薬。
7 . 生体組織が、 髄核であることを特徴とする、 請求の範囲 5又は 6に記載の医
8 . 医薬が、 椎間板ヘルニアの処置剤であることを特徴とする、 請求の範囲 5〜 7のいずれか 1項に記載の医薬。
9 . 下記 （A) 又は （B ) のタンパク質を、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、 当該糖鎖を特異的に切断する方法。
(A) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン 硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1 又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
1 0 . 該タンパク質が、 デルマタン硫酸、 ケラタン硫酸及び平均分子量 7 0 0 0 のコンドロイチンを切断する能力を有さないことを特徴とする、 請求の範囲 9に記載 の方法。
1 1 . 下記 （A) 又は （B ) のタンパク質を、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫 酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1又 は 2以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、 低分子量化された当該糖鎖を特 異的に生産する方法。 (A) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン 硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1 又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
1 2 . 低分子量化されたデルマタン硫酸、 ケラタン硫酸及びコンドロイチンを生 産しないことを特徴とする、 請求の範囲 1 1に記載の方法。
1 3 . 下記 （a ) 又は （b ) のいずれかを保持する D NAを用いてタンパク質を 発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 請求の範囲 1又 は 2に記載の触媒の製造方法。
( a ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D N A。 ( b ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチ ン硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードする D NA。
1 4 . 下記 （a ) 又は （b ) のいずれかを保持する D NAを用いてタンパク質を 発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 請求の範囲 3又 は 4に記載の切断剤の製造方法。
( a ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D NA。 ( b ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチ ン硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードする D NA。
1 5 . 下記 （a ) 又は （b ) のいずれかを保持する D NAを用いてタンパク質を 発現させ、 発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、 請求の範囲 5〜 8のいずれか 1項に記載の医薬の製造方法。
( a ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D NA。 ( b ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列における 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、 かつ、 ヒアノレロン酸、 コンドロイチ ン硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードする D NA。
1 6 . 下記 （A) 又は （B) のタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質。
(A) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン 硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1 又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
1 7 . デルマタン硫酸、 ケラタン硫酸及び平均分子量 7 0 0 0のコンドロイチン を切断する能力を有しないことを特徴とする、 請求の範囲 1 6に記載の融合タンパク
1 8 . 請求の範囲 5記載の医薬を投与することを特徴とする、 ヒアルロン酸、 コ ンドロィチン硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群か ら選ばれる l又は 2以上の糖鎖が生体組織に過剰に存在する疾患を処置する方法。
1 9 . 医薬が、 デルマタン硫酸、 ケラタン硫酸及び及び平均分子量 7 0 0 0のコ ンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、 請求の範囲 1 8に記載の 方法。
2 0 . 生体組織が、 髄核であることを特徴とする、 請求の範囲 1 8に記載の方法。
2 1 . 疾患が、 椎間板ヘルニアであることを特徴とする、 請求の範囲 1 8に記載 の方法。
2 2 . 下記 （A) 又は （B ) のタンパク質の、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫 酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1又 は 2以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒としての使用。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン 硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1 又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
2 3 . 下記 （A) 又は （B ) のタンパク質の、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫 酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1又 は 2以上の糖鎖の特異的切断剤としての使用。
(A) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン 硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1 又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
2 4 . 下記 (A) 又は （B ) のタンパク質の、 生体組織中に存在するヒアルロン 酸、 コンドロイチン硫酸 A ~¾ンド口イチン硫酸 C及ぴコンドロイチン硫酸 Dから—な る群から選ばれる 1又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する医薬の製造の ための使用。
(A) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
( B ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、 かつ、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン 硫酸 A、 コンドロイチン硫酸 C及びコンドロイチン硫酸 Dからなる群から選ばれる 1 又は 2以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
2 5 . 医薬が、 デルマタン硫酸、 ケラタン硫酸及び平均分子量 7 0 0 0のコンド ロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、 請求の範囲 2 4に記載の使用。
2 6 . 生体組織が、 髄核であることを特徴とする、 請求の範囲 2 4又は 2 5に記 載の使用。
2 7 . 医薬が、 椎間板ヘルニアの処置剤であることを特徴とする、 請求の範囲 2 4〜 2 6のレ、ずれか 1項に記載の使用。
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