CN102065886A - 修饰的透明质酸酶及其在治疗透明质酸相关疾病和病症中的应用 - Google Patents

修饰的透明质酸酶及其在治疗透明质酸相关疾病和病症中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于治疗透明质酸相关病症、疾病和失调的含有透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的组合、组合物以及试剂盒。在一个实施例中，所述产品包括额外药剂或治疗。这种产品可用于给予所述产品以治疗透明质酸相关的疾病或者病症的方法中，例如透明质酸相关癌症，例如富含透明质酸肿瘤。所述方法包括单独或与其它治疗组合给予透明质酸降解酶组合物。本发明还提供了用于提供透明质酸相关疾病和病症的延长的治疗效果的方法及组合物。

Description

修饰的透明质酸酶及其在治疗透明质酸相关疾病和病症中的应用
相关申请
本申请要求以下文件的优先权：Gregory Frost于2004年4月14日提交的题为“COMBINATION THERAPY USING A MODIFIED SOLUBLE HYALURONIDASE AND THERAPEUTIC AGENTS AND TREATMENTS，”的美国临时申请序列号61/124,278；Gregory Frost于2008年5月29日提交的题为“COMBINATION THERAPY USING A SOLUBLE HYALURONIDASE AND CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS，”的美国临时申请序列号61/130,357；以及Gregory Frost于2008年10月8日提交的题为“MODIFIED HYALURONIDASES AND USES IN TREATING HYALURONAN-ASSOCIATED DISEASES AND CONDITIONS，”的美国临时申请序列号61/195,624。
本申请涉及同日提交的题为“MODIFIED HYALURONIDASES AND USES IN TREATING HYALURONAN-ASSOCIATED DISEASES AND CONDITIONS，”的美国专利申请序列号(Attorney Dkt.No.0119374-00091/3066)，其要求美国临时申请序列号61/124,278，61/130,357和61/195,624的优先权。上述相关申请的主题全文援引加入作为参考。
上述每篇参考文献的主题全文援引加入作为参考。
发明领域
本发明提供了用于治疗透明质酸相关病症、疾病和失调的含有透明质酸降解酶特别是可溶性透明质酸酶的组合、组合物以及试剂盒。在一个实施例中，所述产品包括额外药剂或治疗。这种产品可用于给予所述产品以治疗透明质酸相关的疾病或者病症的方法中，例如透明质酸相关癌症，例如富含透明质酸肿瘤。所述方法包括单独或与其它治疗组合给予透明质酸降解酶组合物，如透明质酸酶组合物。本发明还提供了用于提供透明质酸相关疾病和病症的延长的治疗效果的方法及组合物。
背景技术
透明质酸(透明质酸；HA)是糖胺聚糖，主要存在于结缔组织、皮肤、软骨和哺乳动物的滑液中。透明质酸是眼玻璃体的主要成分。在结缔组织中，与透明质酸相结合的结合水在组织之间产生水合基质。HA在许多细胞的胞外基质中发现，特别是在软结缔组织中。HA在各种生理学过程中起作用，如在在胞内基质中水和血浆蛋白质稳态中(Laurent TC et al(1992)FASEB J 6：2397-2404)。一些疾病与透明质酸的表达和/或产生相关。
包括透明质酸酶在内的透明质酸降解酶是降解透明质酸的酶。已治疗应用各种透明质酸降解酶，典型地作为分散和播散剂(dispersing and spreading agents)与其它治疗剂组合。需要给予透明质酸降解酶用于治疗特别是透明质酸相关疾病和病症的改进的组合物和方法。
发明内容
本发明提供了治疗透明质酸相关疾病或病症的方法。所述方法包括给予透明质酸降解酶、如透明质酸酶、特别是可溶性透明质酸酶、如任何动物或细菌透明质酸酶的步骤。透明质酸降解酶用聚合物如PEG化部分修饰。举例的透明质酸降解酶是可溶性人透明质酸酶。这种可溶性透明质酸酶及其制备在例如共同在审的公开为US 20040268425的美国申请系列号10/795,095，公开为US 20050260186的美国申请系列号11/065,716，公开为US20060104968的美国专利申请系列号11/238,171中描述。这种可溶性透明质酸酶用聚合物如PEG化部分修饰。透明质酸降解酶如透明质酸酶用聚合物修饰以改变性质，例如但非限于半衰期和药动学。修饰包括直接连接或者经接头间接连接、如共价或经其它稳定键连接聚合物，如葡聚糖，PEG化或sialation部分，或者其它这种化合物，如天然或糖聚合物。在本文举例性实施方案中，透明质酸降解酶是PEG化的。
本发明提供了治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症的方法，及治疗透明质酸相关疾病或病症的方法。这种方法包括给予通过缀合于聚合物而修饰的可溶性透明质酸酶。本文还提供了含有可溶性透明质酸酶的组合物，所述可溶性透明质酸酶的量为足以保持血浆中透明质酸酶的血浆水平为至少3U/mL达至少一周，及含有这种组合物的组合。本发明提供的组合物和组合中的可溶性透明质酸酶缀合于聚合物。
本发明提供了治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症的方法。所述方法包括给予对象每周一次以上、预定周数的足以保持血浆中透明质酸酶的药理学活性水平为至少大约为或者为3U/mL的量的可溶性透明质酸酶，以防止所述底物重新合成为治疗前水平。所述方法中使用的透明质酸酶通过缀合于聚合物而修饰，所述预定周数为一周以上。在一些实施例中，预定周数为至少两周，如两周、三周或者四周。在被治疗病症或疾病中积累的举例性透明质酸酶底物包括透明质酸。在一个实施例中，在来自对象样品中的透明质酸表达是在治疗前测量。
在治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症的方法的一些实施例中，在预定周数之后，中断给药第一段预定时间，如至少一周，然后恢复给药至少一周。例如，给药可以中断一周、两周、三周或四周，然后恢复给药至少一周。在进一步实施例中，在第一段预定时间后，可溶性透明质酸酶进一步被给予对象每周一次以上、预定周数，其量为足以保持血浆中透明质酸酶的药理学活性水平为至少大约为或者为3U/mL，以防止所述底物重新合成为治疗前水平。在任何这些方法的一些实施方案中，给药及给药中断的循环重复多次。
在本发明提供的方法的一些实施方案中，透明质酸酶的给药量为足以保持血浆中透明质酸酶的药理学活性水平至少为或大约为3U/mL-12U/mL。例如，透明质酸酶可以以足以保持血浆中透明质酸酶的药理学活性水平至少为或大约5U/mL，6U/mL，7U/mL，8U/mL，9U/mL，10U/mL，15U/mL，20U/mL，30U/mL，40U/mL，45U/mL，50U/mL或更高的量被给予。在所述方法的特定实施方案中，透明质酸酶的给药量为足以保持血浆中透明质酸酶的药理学活性水平为至少为或大约10U/mL。
在治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症的方法的一个实施方案中，透明质酸酶一周两次被给予。给予对象的透明质酸酶的量可以是例如0.02mg/kg(对象)，0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.06mg/kg，0.07mg/kg，0.08mg/kg，0.09mg/kg，0.1mg/kg，0.15mg/kg，0.2mg/kg，0.25mg/kg，0.30mg/kg，0.35mg/kg，0.40mg/kg，0.45mg/kg，0.5mg/kg，0.55mg.kg，0.6mg/kg，0.7mg/kg，0.8mg/kg，0.9mg/kg，1.0mg/kg，1.1mg/kg，1.2mg/kg，1.3mg/kg，1.4mg/kg，1.5mg/kg或更多。在一个实施例中，给予的透明质酸酶的量是0.05mg/kg-0.8mg/kg。在进一步实施例中，给予的透明质酸酶的量是或者大约是50,000单位(U)；60,000U；70,000U；80,000U；90,000U；100,000U；200,000U；300,000U；400,000U；500,000U；600,000U；700,000U；800,000U；900,000U；1,000,000U；1,500,000U；2,000,000U；2,500,000U；3,000,000U；3,500,000U；4,000,000U或更多。
本发明提供了治疗对象中透明质酸相关疾病或病症的方法。这种方法包括步骤(a)测量来自对象的样品中的透明质酸表达或透明质酸(hyaluron)；及(b)如果来自对象的样品中的透明质酸表达或透明质酸(hyaluron)升高或者处于指示疾病或病症的水平，给予对象含有可溶性透明质酸酶的组合物。这些方法中使用的可溶性透明质酸酶通过缀合于聚合物而修饰。在一些实施例中，来自对象的样品是组织或体液，例如血液样品、肿瘤活检、脑脊液、尿、汗、精液或唾液样品。
在治疗透明质酸相关疾病或病症的方法的特定实施方案中，还将治疗所述疾病或病症的第二种不同药剂给予对象。在一些实施例中，所述第二种药剂和含有可溶性透明质酸酶的组合物在单一组合物中被给予。在其它实施例中，所述第二种药剂和含有可溶性透明质酸酶的组合物分开给予，如同时、相继或以任何顺序间歇给予。在一个实施方案中，所述第二种药剂在给予含有可溶性透明质酸酶的组合物之后给予。例如，所述第二种药剂可以在给药周期中第一次给予可溶性透明质酸酶之后给予，并且任选在一或多次个后续可溶性透明质酸酶给予后，如在每一次后续可溶性透明质酸酶给予后，在每两次后续可溶性透明质酸酶给予后，或者一周一次，每二周一次，每三周一次或者一月一次。
在本发明提供的治疗透明质酸相关疾病或病症的方法的一些方面中，在给予含有可溶性透明质酸酶的组合物之后至少0.5分钟、至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少1小时或者1小时以上给予所述第二种药剂。在一些实施例中，在一些实施例中，在给予含有可溶性透明质酸酶的组合物之后至少或者2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时给予所述第二种药剂。在一个实施例中，在含有可溶性透明质酸酶的组合物之后至少48小时给予所述第二种药剂。在另一个实施例中，在含有可溶性透明质酸酶的组合物之后至少72小时给予所述第二种药剂。在本发明提供的治疗透明质酸相关疾病或病症的方法的进一步方面中，来自对象的样品中的透明质酸表达与对照样品或标准中的表达相比较。
在治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症的方法及治疗透明质酸相关疾病或病症的方法中使用的透明质酸酶缀合于聚合物。在一些实施例中，聚合物是sialation或PEG化部分。在本发明提供的一些方法中，给予对象第二种药剂，如以上及本文所述。在一些实施例中，所述第二种药剂是抗癌剂或疗法，例如化疗剂、放疗、抗体、肽、基因治疗载体、病毒或核酸。用于本发明提供的一些方法中的举例性第二种药剂包括抗癌剂，例如阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式视黄酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；Alvocidibs；安巴腙；二霉素；阿美蒽醌；Amifostines；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；氨茴霉素；Apaziquones；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；Banoxantrones；Batabulins；巴马司他；BCGLive；贝那昔滨；苯达莫司汀；苯佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；Biricodars；比生群；比生群；Bisnafide Dimesylates；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素c；卡普睾酮；Canertinibs；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；含有聚苯丙生的卡莫司汀；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；Crisnatols；环磷酰胺；阿糖胞苷liposomals；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；达依泊汀α；柔红霉素liposomals；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素2；右尼古地平；Dexonnaplatins；右雷佐生；地扎胍宁；地吖醌；Dibrospidiums；地诺孕素；Dinalins；Disermolides；多西他塞；Dofequidars；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；多柔比星HCL；Docorubicin HCL脂质体注射液；阿霉素；屈洛昔芬；屈他雄酮丙酸酯；偶氮霉素；依考莫司汀；依达曲沙；Edotecarins；依氟鸟氨酸；Elacridars；依利奈法德；Elliott’s B溶液；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；Enzastaurins；依匹哌啶；表柔比星；阿法依伯汀；依地前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A铵；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；Galarubicins；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/Ozogamicins；吉罗酚；Gimatecans；Gimeracils；格洛沙腙；Glufosfamides；醋酸性瑞林；羟基脲；Ibritumomabs/Tiuxetans；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；Ilomastats；Imatinib mesylates；Imexons；Improsulfans；Indisulams；Inproquones；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2及其它白介素(包括重组白介素)；Intoplicines；Iobenguanes[131-I]；Iproplatins；Irinotecans；伊索拉定；Ixabepilones；酮曲沙；L-亚硝基羟基丙氨酸；兰瑞肽；Lapatinibs；Ledoxantrones；来曲唑；Leucovorins；Leuprolides；(Leuprorelides)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNUs；洛莫司汀；Lonafarnibs；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美坦辛；氮芥；Meclorethamines/氮芥；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美法仑1L-PAMs；美诺立尔；美雄烷；巯基嘌呤；6-巯基嘌呤；美司钠；Metesinds；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；M氯苯乙嘧胺；美妥替哌；米帕；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；Mitocarcins；Mitocromins；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；Mivobulins；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；Mubritinibs；霉酚酸；Nandrolone Phenpropionates；奈达铂；Nelzarabines；奈莫柔比星；硝氨丙吖啶；诺考达唑；Nofetumomabs；诺加霉素；Nolatrexeds；Nortopixantrones；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；Ortataxels；Oteracils；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；Pamidronates；Patubilones；培加酶；培门冬酶；培非司亭；Peldesines；佩里霉素；Pelitrexols；培美曲塞；戊氮芥；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；Perifosines；Picoplatins；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；Pixantrones；Plevitrexeds；Plicamycid光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；Porfimers；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；螺丙醇；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡呋菌素；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；绛色霉素；Sabarubicins；沙芬戈；沙格司亭；Satraplatins；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；Sparfosates；Sparfosic Acids；稀疏霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；Squalamines；链黑菌素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；Sunitinib Malate；6-硫代鸟嘌呤(6-TG)；Tacedinalines；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；Tariquidars；牛磺莫司汀；Tecogalans；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26s；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；Thiamiprines；硫代鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；Tiazofurins；噻氯咪索；替洛隆；Timcodars；噻莫西酸；替拉扎明；Topixantrones；托泊替康；托瑞米芬；Tositumomabs；曲贝替定(Ecteinascidin 743)；曲妥珠单抗；曲托龙；Tretinoins/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；Triplatin Tetranitrates；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；乌拉莫司汀；乌瑞替派；戊柔比星；Valspodars；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄霉素A(胍甲环素)；折尼铂；Zilascorbs[2-H]；净司他丁；Zoledronate；佐柔比星；和Zosuquidars。
在本发明提供的任何治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症的方法及治疗透明质酸相关疾病或病症的方法中，可溶性透明质酸酶和/或第二种药剂可以局部或全身给予，例如口服、静脉内(IV)、皮下、肌肉内、肿瘤内、真皮内(radermally)、局部、透皮、经直肠或表皮下给予。在本发明提供的方法的特定实施例中，可溶性透明质酸酶和/或第二种药剂静脉内给予。在其它实施例中，可溶性透明质酸酶和/或第二种药剂肿瘤内给予。
本发明提供的是治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症的方法及治疗透明质酸相关疾病或病症的方法。在一些实施例中，其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症与高组织间隙液压相关。在进一步的实施例中，由本发明提供的方法治疗的疾病或病症是椎间盘压力(disc pressure)、癌症或水肿。水肿例如可以由器官移植，卒中或脑外伤导致。在被治疗的疾病或病症是癌症的情况中，癌症可以是肿瘤，如实体肿瘤。在一些实施例中，与相同组织类型的非癌组织相比或者与相同肿瘤类型的非转移肿瘤相比，肿瘤具有增加的透明质酸的细胞和/或基质表达。在特定的实施例中，待治疗的疾病或病症是晚期癌症、转移癌和/或未分化癌。在一个实施例中，所述疾病或病症是卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、脑癌或结肠癌。在本发明提供的方法的一些实施例中，治疗导致对象肿瘤大小缩小。
在一些实施方案中，提供的方法中使用的可溶性透明质酸酶是可溶性PH20，包括但非限于绵羊、小鼠、猴、牛、细菌或人PH20。在一些实施例中，PH20的可溶形式是已被截短除去C-末端GPI的可溶性PH20。在本发明提供的方法的一些方面中，可溶性透明质酸酶具有包括在SEQ ID NO：1中的氨基酸序列或者与包括在SEQ ID NO：1中的氨基酸序列具有至少大约91％氨基酸序列相同性的序列，由此可溶性透明质酸酶是可溶的、N-糖基化的和中性活性的。在其它实施例中，可溶性透明质酸酶包括SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，该序列在氨基酸残基467-483之间(包括端点)的一个氨基酸残基处被截短。例如，可溶性透明质酸酶可以包括SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，该序列在选自467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482和483的一个氨基酸残基处被截短。
在一些方面中，本发明提供的方法中使用的可溶性透明质酸酶在CHO细胞中被分泌。在其它方面中，可溶性透明质酸酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸36-467，36-468，36-469，36-470，36-471，36-472，36-473，36-474，36-475，36-476，36-477，36-478，36-479，36-480，36-481，36-482或36-483所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的氨基酸36-467，36-468，36-469，36-470，36-471，36-472，36-473，36-474，36-475，36-476，36-477，36-478，36-479，36-480，36-481，36-482或36-483所示的氨基酸序列具有至少大约91％氨基酸序列相同性的序列。在特定实施例中，可溶性透明质酸酶选自含有SEQ ID NO：4-9和46-48任一所示氨基酸序列的多肽，其等位基因变体、物种变体或其它变体。在一个实施方案中，可溶性透明质酸酶是由编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的核酸序列编码的多肽。在另一个实施方案中，可溶性透明质酸酶选自由编码SEQ ID NO：4-9所示氨基酸序列的核酸序列编码的多肽。在这种情况中，可溶性透明质酸酶可以通过在CHO细胞中表达产生。例如，在一个实施方案中，可溶性透明质酸酶命名为rHuPH20。另外，在一些方面中，本发明提供的方法中使用的可溶性透明质酸酶是糖基化的。
如以上讨论的，在本发明提供的治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症及治疗透明质酸相关疾病或病症的方法中，通过缀合于聚合物修饰的透明质酸酶被给予对象。在一些实施例中，缀合于可溶性透明质酸酶的聚合物含有PEG化部分(PEG)，例如甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(5kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-丁醛(mPEG-丁醛)(30kDa)，甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)(30kDa)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(10kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(20kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(60kDa分支的)；生物素-聚(乙二醇)-N-琥珀酰亚胺酯(生物素-PEG-NHS)(5kDa生物素化的)；聚(乙二醇)-p-硝基苯基碳酸酯(PEG-p-硝基苯基-碳酸酯)(30kDa)；或聚(乙二醇)-丙醛(PEG-丙醛)(30kDa)。在一些方面中，PEG是分支或线性PEG。在特定实施例中，PEG是甲氧基-PEG(mPEG)，例如，甲氧基聚(乙二醇)丁酸的线性N-羟基琥珀酰亚氨基酯。这种PEG可以具有30或者大约30千道尔顿的分子量。
本发明提供了含有可溶性透明质酸酶的组合物，所述可溶性透明质酸酶的量为足以保持血浆中透明质酸酶的血浆水平为至少3U/mL达至少一周，其中可溶性透明质酸酶缀合于聚合物。在一些方面中，血浆中透明质酸酶水平至少是或大约3U/mL-12U/mL。缀合于透明质酸酶的举例性聚合物包括但非限于sialation或PEG化部分。组合物可以一周至少两次给予至少一周以上。在一些实施例中，组合物含有至少或大约2.0mg-60mg的缀合于聚合物的可溶性透明质酸酶，缀合于聚合物的可溶性透明质酸酶具有至少或大约20,000U/mg，25,000U/mg，30,000U/mg，31,000U/mg，32,000U/mg，33,000U/mg，34,000U/mg，35,000U/mg，36,000U/mg，37,000U/mg，38,000U/mg，39,000U/mg，40,000U/mg，45,000U/mg，50,000U/mg，55,000U/mg，60,000U/mg或更高的比活性。另外，在一些方面中，组合物每次给予至少10mL。
本发明提供的组合物可以配制为用于口服、静脉内(IV)、皮下、肌肉内、肿瘤内、真皮内、局部、透皮、经直肠或表皮下给药。在一个实施例中，组合物被配制为用于静脉内给药。本发明提供的组合物还可以含有组氨酸和/或NaCl。例如，在一个实施方案中，组合物用是或大约10mM组氨酸和/或130mM NaCl配制。组合物可以具有是或大约是6.0，6.1.，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1或7.2的pH。在一个实施例中，组合物具有是或大约6.5的pH。
本发明提供了含有一种含有可溶性透明质酸酶的组合物及含有治疗透明质酸相关疾病或病症的药剂的第二种组合物的组合，所述可溶性透明质酸酶的量为足以保持血浆中透明质酸酶的血浆水平在至少3U/mL水平至少一周，其中可溶性透明质酸酶缀合于聚合物。在一些实施例中，含有可溶性透明质酸酶的组合物一周给予至少二次至少一周以上。在进一步的方面中，含有可溶性透明质酸酶的组合物含有至少或大约2.0mg-60mg的缀合于聚合物的可溶性透明质酸酶；缀合于聚合物的可溶性透明质酸酶具有至少或大约20,000U/mg，25,000U/mg，30,000U/mg，31,000U/mg，32,000U/mg，33,000U/mg，34,000U/mg，35,000U/mg，36,000U/mg，37,000U/mg，38,000U/mg，39,000U/mg，40,000U/mg，45,000U/mg，50,000U/mg，55,000U/mg，60,000U/mg或更高的比活性。
本发明提供的组合的第一种和第二种组合物共配制或分别提供。在一些实施例中，本发明提供的组合中的缀合于透明质酸酶的聚合物是sialation或PEG化部分。在进一步实施方案中，组合中的第二种药剂是抗癌剂或疗法，例如化疗剂、放疗、抗体、肽、基因治疗载体、病毒或核酸。在特定实施例中，第二种药剂是抗癌剂，选自阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式视黄酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；Alvocidibs；安巴腙；二霉素；阿美蒽醌；Amifostines；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；氨茴霉素；Apaziquones；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；Banoxantrones；Batabulins；巴马司他；BCG Live；贝那昔滨；苯达莫司汀；苯佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；Biricodars；比生群；比生群；Bisnafide Dimesylates；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素c；卡普睾酮；Canertinibs；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；含有聚苯丙生的卡莫司汀；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；Crisnatols；环磷酰胺；阿糖胞苷liposomals；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；达依泊汀α；柔红霉素liposomals；柔红霉素s/道诺霉素；柔红霉素s；地西他滨；地尼白介素2；右尼古地平；Dexonnaplatins；右雷佐生；地扎胍宁；地吖醌；Dibrospidiums；地诺孕素；Dinalins；Disermolides；多西他塞；Dofequidars；去氧氟尿苷；阿霉素liposomals；阿霉素HCL；Docorubicin HCL liposome injection；阿霉素；屈洛昔芬；屈他雄酮丙酸酯s；偶氮霉素；依考莫司汀；依达曲沙；Edotecarins；依氟鸟氨酸；Elacridars；依利奈法德；Elliott’s B溶液；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；Enzastaurins；依匹哌啶；表柔比星；阿法依伯汀；依地前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A铵；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；Galarubicins；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/Ozogamicins；吉罗酚；Gimatecans；Gimeracils；格洛沙腙；Glufosfamides；醋酸性瑞林；羟基尿；Ibritumomabs/Tiuxetans；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；Ilomastats；Imatinib mesylates；Imexons；Improsulfans；Indisulams；Inproquones；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2及其它白介素(包括重组白介素)；Intoplicines；Iobenguanes[131-I]；Iproplatins；Irinotecans；伊索拉定；Ixabepilones；酮曲沙；L-亚硝基羟基丙氨酸；兰瑞肽；Lapatinibs；Ledoxantrones；来曲唑；Leucovorins；Leuprolides；亮丙瑞林(Leuprorelides)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNUs；洛莫司汀；Lonafarnibs；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美坦辛；氮芥；Meclorethamines/氮芥；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美法仑lL-PAMs；美诺立尔；美雄烷；巯基嘌呤；6-巯基嘌呤；美司钠；Metesinds；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；M氯苯乙嘧胺；美妥替哌；米帕；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；Mitocarcins；Mitocromins；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；Mivobulins；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；Mubritinibs；霉酚酸；Nandrolone Phenpropionatess；奈达铂；Nelzarabines；奈莫柔比星；硝氨丙吖啶；诺考达唑；Nofetumomabs；诺加霉素；Nolatrexeds；Nortopixantrones；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；Ortataxels；Oteracils；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；Pamidronates；Patubilones；培加酶；培门冬酶；培非司亭；Peldesines；佩里霉素；Pelitrexols；培美曲塞；戊氮芥；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；Perifosines；Picoplatins；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；Pixantrones；Plevitrexeds；Plicamycid光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；Porfimers；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；螺丙醇；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡呋菌素；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；绛色霉素；Sabarubicins；沙芬戈；沙格司亭；Satraplatins；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；Sparfosates；Sparfosic Acids；稀疏霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；Squalamines；链黑菌素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；Sunitinib Malate；6-硫代鸟嘌呤(6-TG)；Tacedinalines；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；Tariquidars；牛磺莫司汀；Tecogalans；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26s；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；Thiamiprines；硫代鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；Tiazofurins；噻氯咪索；替洛隆；Timcodars；噻莫西酸；替拉扎明；Topixantrones；托泊替康；托瑞米芬；Tositumomabs；曲贝替定(Ecteinascidin 743)；曲妥珠单抗；曲托龙；Tretinoins/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；Triplatin Tetranitrates；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；乌拉莫司汀；乌瑞替派；戊柔比星；Valspodars；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄霉素A(胍甲环素)；折尼铂；Zilascorbs[2-H]；净司他丁；Zoledronate；佐柔比星；和Zosuquidars.
在一种方法中，含有修饰的透明质酸降解酶的组合物被给予患有透明质酸相关疾病或病症或者可能患有这种疾病或病症的对象，随后给予用于治疗实施疾病或病症的第二种不同药剂。在给予透明质酸降解酶之后24小时以上给予第二种药剂或治疗。给予可以全身或局部进行或者通过任何合适途径进行，如静脉内、口服、皮下或肌肉内。
在治疗对象中的透明质酸相关疾病或病症的另一种方法中，含有修饰的透明质酸降解酶的组合物被全身给予患有透明质酸相关疾病或病症或者可能患有这种疾病或病症的对象。修饰的透明质酸降解酶以至少有效降低组织间隙液压24小时以上的量给予。给予透明质酸降解酶可以治疗疾病或病症或者可以后跟第二种药剂或疗法或者与第二种药剂或疗法一起给予。可以静脉内、口服、皮下或肌肉内、包括例如肿瘤内实现给予。
还提供了在对象中降低组织间隙液压的方法，其是给予对象含有有效量的修饰的透明质酸降解酶的组合物。透明质酸降解酶的量降低组织间隙液压24小时以上；透明质酸降解酶的量功能等价于在或大约10至1,000,000透明质酸酶单位之间，如在或大约10至50,000,000单位，10至40,000,000单位，10至36,000,000单位，10至12,000,000单位，10至1,200,000单位，10至1,000,000单位，10至500,000单位，100至100,000单位，500至50,000单位，1000至10,000单位，5000至7500单位，5000单位至50,000单位，或1,000至10,000单位。单位通常参照未修饰的透明质酸酶测量。降低组织间隙液压可以在对象中实现透明质酸相关疾病或病症的治疗。
在实施本发明任何方法中，来自对象的样品中透明质酸表达可以在治疗之前、期间或之后进行测量(或评估或监测)。如果需要，来自对象的样品中透明质酸表达可以与对照样品中的表达或者与标准比较。因此提供了治疗对象中的透明质酸相关疾病或病症的方法，首先测量来自对象的样品中透明质酸表达；然后给予对象含有修饰的透明质酸降解酶的组合物。给予包括局部和全身给予，例如但不限于口服、静脉内(IV)、皮下、肌肉内、肿瘤内、真皮内、局部、透皮、口服、经直肠或表皮下。样品例如是组织或体液，例如但不限于血样、肿瘤活检、脑脊液、尿、汗、精液或唾液样品。
所述方法可以提供给予非透明质酸降解酶的用于治疗特定疾病的第二种药剂或疗法而实施。例如，如果疾病是肿瘤，则第二种药剂可以是化疗剂和/或放疗方案/治疗。举例性的第二种药剂是抗癌剂。
当第二种药剂是药物或组合物时，第二种药剂和透明质酸酶可以分开、在一个组合物中一起或者在两种组合物中同时、或者间歇或相继或其任何组合方式给予。典型地，含有透明质酸降解酶的组合物在给予第二种药剂之前给予。在一些实施方案中，第二种药剂或疗法可以在含透明质酸酶组合物之前实现或给予。在其中时间不需要24小时以上的方法中，含有可溶性透明质酸酶的组合物的给予与第二种药剂或疗法之间的时间可以是之前(或之后)30秒或60秒内、至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少1小时或1小时以上。时间差可以是给予第二种药剂或疗法之前最短或2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、48小时或72小时。
举例性第二种药剂和疗法包括例如抗癌剂，其是化疗剂、放疗、抗体、肽、基因治疗载体、病毒如溶瘤病毒以及核酸如输送抗癌蛋白或其它治疗蛋白的基因治疗载体。其它举例性第二种药剂或疗法包括但非限于镇痛药、抗炎药、抗微生物剂、杀阿米巴剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森氏病药、抗疟药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗关节炎药、抗真菌剂、抗高血压药、解热药、抗寄生虫药、抗组胺药、α肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀细菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药、避孕药、化妆或美容制剂、减充血剂、利尿药、镇静剂、诊断剂、治疗性抗体、电解质、催眠药、激素制剂、高血糖药、肌肉松弛剂、肌肉紧张剂、眼科制剂、拟副交感神经药、psychic energizer agent、镇静剂(sedative agent)、睡眠诱导剂、拟交感神经药、安定药、尿道制剂(urinary agent)、阴道制剂(vaginal agent)、杀病毒剂、维生素制剂、非甾类抗炎药及血管紧张素转化酶抑制药。举例性的这种药剂为：阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式视黄酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；Alvocidibs；安巴腙；二霉素；阿美蒽醌；Amifostines；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；氨茴霉素；Apaziquones；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；Banoxantrones；Batabulins；巴马司他；BCG Live；贝那昔滨；苯达莫司汀；苯佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；Biricodars；比生群；Bisnafide Dimesylates；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素c；卡普睾酮；Canertinibs；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；含有聚苯丙生的卡莫司汀；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；Crisnatols；环磷酰胺；阿糖胞苷liposomal；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；达依泊汀α；柔红霉素liposomals；柔红霉素s/道诺霉素；柔红霉素s；地西他滨；地尼白介素2；右尼古地平；Dexonnaplatins；右雷佐生；地扎胍宁；地吖醌；Dibrospidiums；地诺孕素；Dinalins；Disermolides；多西他塞；Dofequidars；去氧氟尿苷；阿霉素liposomal；阿霉素HCL；Docorubicin HCL脂质体注射液；阿霉素；屈洛昔芬；屈他雄酮丙酸酯s；偶氮霉素；依考莫司汀；依达曲沙；Edotecarins；依氟鸟氨酸；Elacridars；依利奈法德；Elliott’s B溶液；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；Enzastaurins；依匹哌啶；表柔比星；阿法依伯汀；依地前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A铵；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；Galarubicins；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/Ozogamicins；吉罗酚；Gimatecans；Gimeracils；格洛沙腙；Glufosfamides；醋酸性瑞林；羟基脲；Ibritumomabs/Tiuxetans；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；Ilomastats；Imatinib mesylates；Imexons；Improsulfans；Indisulams；Inproquones；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2及其它白介素(包括重组白介素)；Intoplicines；Iobenguanes[131-I]；Iproplatins；Irinotecans；伊索拉定；Ixabepilones；酮曲沙；L-亚硝基羟基丙氨酸；兰瑞肽；Lapatinibs；Ledoxantrones；来曲唑；Leucovorins；Leuprolides；亮丙瑞林(Leuprorelides)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNUs；洛莫司汀；Lonafarnibs；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美坦辛；氮芥；Meclorethamines/氮芥；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美法仑1L-PAMs；美诺立尔；美雄烷；巯基嘌呤；6-巯基嘌呤；美司钠；Metesinds；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；M氯苯乙嘧胺；美妥替哌；米帕；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；Mitocarcins；Mitocromins；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；Mivobulins；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；Mubritinibs；霉酚酸；Nandrolone Phenpropionatess；奈达铂；Nelzarabines；奈莫柔比星；硝氨丙吖啶；诺考达唑；Nofetumomabs；诺加霉素；Nolatrexeds；Nortopixantrones；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；Ortataxels；Oteracils；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；Pamidronates；Patubilones；培加酶；培门冬酶；培非司亭；Peldesines；佩里霉素；Pelitrexols；培美曲塞；戊氮芥；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；Perifosines；Picoplatins；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；Pixantrones；Plevitrexeds；Plicamycid光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；Porfimers；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；螺丙醇；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡呋菌素；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；绛色霉素；Sabarubicins；沙芬戈；沙格司亭；Satraplatins；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；Sparfosates；Sparfosic Acids；稀疏霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；Squalamines；链黑菌素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；Sunitinib Malate；6-硫代鸟嘌呤(6-TG)；Tacedinalines；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；Tariquidars；牛磺莫司汀；Tecogalans；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26s；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；Thiamiprines；硫代鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；Tiazofurins；噻氯咪索；替洛隆；Timcodars；噻莫西酸；替拉扎明；Topixantrones；托泊替康；托瑞米芬；Tositumomabs；曲贝替定(Ecteinascidin 743)；曲妥珠单抗；曲托龙；Tretinoins/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；Triplatin Tetranitrates；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；乌拉莫司汀；乌瑞替派；戊柔比星；Valspodars；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄霉素A(胍甲环素)；折尼铂；Zilascorbs[2-H]；净司他丁；Zoledronate；佐柔比星；和Zosuquidars。
透明质酸相关疾病或病症包括例如与高组织间隙液压相关或包括高组织间隙液压的疾病或病症，如椎间盘压力、癌症和水肿。水肿可以产生自或表现在例如器官移植、卒中或脑外伤。癌症包括实体和淋巴/血液肿瘤和转移性疾病，及未分化肿瘤。适于治疗的肿瘤典型显示与相同组织类型的非癌组织相比或与相同肿瘤类型的非转移肿瘤相比透明质酸的细胞和/域间质表达。癌症包括卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、其它胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌之一或多种。
如所述的，液压本文方法、组合物和组合中的透明质酸降解酶包括可溶性透明质酸酶，包括非人动物透明质酸酶、细菌透明质酸酶和人透明质酸酶。可溶性透明质酸酶的例子是PH20的可溶性活性部分，如绵羊、牛和人PH20。为使PH20可溶，如人PH20，PH20被截短以除去C末端GPI锚附着信号序列。参照人PH20，截短终止于残基467-482之任一残基或者在人等位基因或物种变体或其它变体中相应于SEQ ID NO：1的残基467-482之任一残基。例如，透明质酸降解酶可以选自含有SEQ ID NO：4-9和47-48任一氨基酸序列的多肽及其等位基因变体、物种变体和其它变体。透明质酸降解酶可以是由编码SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4-9和47-48任一氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO：49的核酸序列编码的。它们可以是具有这种氨基酸序列的透明质酸降解酶。透明质酸降解酶选自其其它变体。其它变体选自在其全长与来自SEQ ID NO：1，4-9和47-48的连续氨基酸序列具有至少60％，65，70，75，80，85，88％，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或更高序列相同性的多肽，只要所述多肽是可溶的并显示透明质酸酶活性(即可以降解透明质酸)，这可以通过本领域技术人员已知的方法包括本文所述方法评估。
特别是，透明质酸降解酶可以是通过表达编码人PH20可溶性透明质酸酶或其等位基因或物种或其它变体的氨基酸1-482或36-482(即如SEQ IDNO：1所示)的核酸分子而产生。表达可以包括在细胞如CHO细胞中的表达和分泌。例如，组合物被命名为重组人PH20(rHuPH20)，其通过在CHO细胞中表达与编码分泌用信号序列如氨基酸1-35的核酸连接的编码氨基酸36-482的核酸而产生。rHuPH20分离自培养基。分离后，其被修饰，如通过与一或多个PEG化部分(PEG)或其它聚合物反应而修饰。其它透明质酸降解酶可以类似修饰并且可以通过重组表达产生或分离自天然来源。这种方法和产物是本领域技术人员已知的。
用于修饰透明质酸降解酶的举例性聚合物包括但非限于甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(5kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-丁醛(mPEG-丁醛)(30kDa)，甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)(30kDa)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(10kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(20kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(60kDa分支的)；生物素-聚(乙二醇)-N-琥珀酰亚胺酯(生物素-PEG-NHS)(5kDa生物素化)；聚(乙二醇)-p-硝基苯基碳酸酯(PEG-p-硝基苯基-碳酸酯)(30kDa)；和聚(乙二醇)-丙醛(PEG-丙醛)(30kDa)。
PEG部分是熟知的，包括商业可能的那些或可以合成的那些。PEG部分可以是分支的或线性PEG，如甲氧基-PEG(mPEG)，包括例如甲氧基聚(乙二醇)丁酸的线性N-羟基琥珀酰亚胺基酯。PEG的分子量可以是任何合适值，如30或大约30千道尔顿。
当透明质酸降解酶被修饰时，比活性可能降低。为补偿，采用更大量(重量)的修饰品种。例如，PEG化rHuPH20的比活性可以比天然rHuPH20的比活性低2、3或4倍或低大约2、3或4倍。剂量相应被调整以输送希望的单位。剂量依赖于疾病或病症及特定透明质酸降解酶，如特定透明质酸酶，及其修饰。典型剂量是或大约是10至50,000,000单位，10至40,000,000单位，10至36,000,000单位，10至12,000,000单位，10至1,200,000单位，10至1,000,000单位，10至500,000单位，100至100,000单位，500至50,000单位，1000至10,000单位，5000至7500单位，5000单位至50,000单位，或者1,000至10,000单位可溶性透明质酸酶。在透明质酸降解酶不是透明质酸酶情况中，典型剂量功能等价于是或者大约是10至50,000,000透明质酸酶单位，10至40,000,000单位，10至36,000,000单位，10至12,000,000单位，10至1,200,000单位，10至1,000,000单位，10至500,000单位，100至100,000单位，500至50,000单位，1000至10,000单位，5000至7500单位，5000单位至50,000单位，或者1,000至10,000透明质酸酶单位。这种剂量被选择以实现或可以用于实现给药后对象组织中组织间隙液压降低至少25％、大约25％、50％或大约50％，其可以被保持大约或1或2小时以上，或者至少8或至少大约8小时，至少24或至少大约24小时，至少48或至少大约48小时，或者至少72或至少大约72小时。
给予修饰的透明质酸降解酶组合物如修饰的透明质酸酶组合物可以实现血管体积改变，如在肿瘤中。这种改变可以是对象组织的血管体积增加至少2倍或大约2倍或者至少3倍或大约3倍。给予含有透明质酸降解酶的组合物可以实现对象组织中的水含量降低至少25％或大约25％或者至少50％或大约50％。在给予含有透明质酸降解酶的组合物后这些改变可以保持或表现至少8或大约8小时、至少24或大约24小时、至少48或大约48小时或者至少72或大约72小时。
给予含有透明质酸降解酶的组合可以实现对象组织中透明质酸阳性细胞百分比的降低。透明质酸阳性细胞可以发生在肿瘤如实体肿瘤中。治疗可以实现对象中的肿瘤大小的降低。
给予含有透明质酸降解酶的组合物可以表现为和/或观察为对象血液中的透明质酸酶活性。对象血液中透明质酸酶的半衰期是至少1或大约1、至少5或大约5、8或大约8、10或大约10、15或大约15、24或大约24、48或大约48或者72或大约72小时。例如，当含有透明质酸降解酶的组合物的给予导致对象血液中的透明质酸酶活性时，1ml来自对象的血浆具有至少5％或大约5％的给予患者的总透明质酸酶活性，持续至少1或大约1、5或大约5、8或大约8、10或大约10、15或大约15、24或大约24、48或大约48或者72或大约72小时。
还提供了组合，其含有：
第一种组合物，其含有有效量的透明质酸降解酶用于降低组织间隙液压，其中所述的量降低组织间隙液压24小时以上；透明质酸降解酶的量功能等价于是或大约是10至1,000,000之间，大约10至50,000,000单位、10至40,000,000单位、10至36,000,000单位、10至12,000,000单位、10至1,200,000单位、10至1,000,000单位、10至500,000单位、100至100,000单位、500至50,000单位、1000至10,000单位、5000至7500单位、5000单位至50,000单位或1,000至10,000透明质酸酶；以及第二种组合物，其含有用于治疗透明质酸相关疾病或病症的药剂。
透明质酸降解酶通过缀合于聚合物如增加透明质酸酶半衰期的聚合物而修饰。举例性聚合物包括葡聚糖、sialation或PEG化部分和/或其组合物。透明质酸降解酶可以是可溶性透明质酸酶，其可以包括选自上述非人动物透明质酸酶、人透明质酸酶和细菌透明质酸酶的那些，以及包括是上述用于本发明方法中的PH20的可溶形式的可溶性透明质酸酶第二种药剂或疗法包括上述用于本发明方法中的任何物质。
通过本文方法，治疗的癌症或含有富含蛋白聚糖的细胞外周基质的其它疾病，所述蛋白聚糖含有透明质酸。这种癌症和其它疾病适于用修饰的可溶性透明质酸酶或本文所述其它药剂(上述和下述)治疗。如本文详述，与修饰的透明质酸降解酶如PEG化rHuPH20接触导致细胞外周外被萎陷。如例举的，PEG化rHuPH20(PEGrHuPH20)以剂量依赖方式降低肿瘤IFP，实现IV给予后降低85％以上的肿瘤IFP。在单剂PEGrHuPH20后肿瘤外周HA保持耗竭超过3天。随着围绕肿瘤细胞的细胞外周透明质酸的组织学萎陷，肿瘤水含量显著降低3天以上，与通过表观扩散系数(ADC)MRI和IFP监测在肿瘤中检测到的改变一致。另外，如举例示出的，在给药后8小时内作为肿瘤内血管的血管减压的结果实现了肿瘤血管体积选择性增加3.5倍。这通过组织学和超声证实。肿瘤微环境中的这种透明质酸可以用可溶性修饰的透明质酸酶如PEG化rHuPH20(PEGrHuPH20)靶向。如举例示出的，PEG化rHuPH20与化疗剂如多西他赛或脂质体多柔比星共给药与单独给予化疗剂时相比可以增加化疗剂在动物模型中的抗肿瘤活性。
附图简述
图1描绘了用人PC3前列腺癌细胞肌肉内接种以建立肿瘤的裸鼠(PC3前列腺癌模型)中的肿瘤体积。接种后，对小鼠进行如下治疗方案，其中给予活性药物成分(API)缓冲液、30mg/kg多西他赛、10mg/kg多西他赛、PEG化rHuPH20(P)或者PEG化rHuPH20加10mg/kg多西他赛(T+P)。在各种时间点测量肿瘤体积以评估PEG化rHuPH20与多西他赛共给予对多西他赛的抗肿瘤活性的作用。
图2描绘了在肌肉内注射人PC3前列腺癌细胞然后用缓冲液(对照小鼠)、多西他赛、PEG化rHuPH20或者PEG化rHuPH20/多西他赛治疗后各个时间点小鼠在1500mm3肿瘤体积下的存活百分比。
图3描绘了用人PC3前列腺癌细胞肌肉内接种以建立肿瘤的裸鼠(PC3前列腺癌模型)中的肿瘤体积。接种后，对小鼠进行如下治疗方案，其中给予API缓冲液、PEG化rHuPH20(P)、脂质体多柔比星(D)或者PEG化rHuPH20加脂质体多柔比星(D+P)。在各种时间点测量肿瘤体积以评估PEG化rHuPH20与脂质体多柔比星共给予对脂质体多柔比星的抗肿瘤活性的作用。
图4描绘了给予3000、7000、10000或30000单位的PEG化rHuPH20(P)后在第0、3、7、10、14、17、21、24天的体重变化(百分比)。
图5描绘了10mg/kg多西他赛与3000、7000、10000单位的PEG化rHuPH20(T+P)共给予裸鼠后在第0、7、14、和21天的体重变化(百分比)。这些小鼠在第3、10、17和24天还接受了3000、7000或10000单位的PEG化rHuPH20。还描绘了接受仅API缓冲液或10mg/kg doctaxel的小鼠的体重变化。
图6描绘了给予各种剂量的PEG化rHuPH20与10mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192100201
(多西他赛)、PEG化rHuPH20单独、Taxotere
Figure BPA00001277192100202
(多西他赛)单独或API缓冲液单独的裸鼠的血液中粒细胞数。组1小鼠在第0、3、7、10、14、17、21、24天接受API缓冲液；组2-5在第0、3、7、10、14、17、21、24天接受剂量分别为3000、7000、10000或30000单位/小鼠的PEG化rHuPH20；组6-8在第0、7、14、21天被共给予Taxotere(多西他赛)与分别为3000、7000、10000单位/小鼠的PEG化rHuPH20，；组9和10在第0、7和14天接受10mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192100204
(多西他赛)或30mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192100205
(多西他赛)。然后评估在各时间点血液中粒细胞数。
图7描绘了给予各种剂量的PEG化rHuPH20与10mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192100206
(多西他赛)、PEG化rHuPH20单独、Taxotere
Figure BPA00001277192100207
(多西他赛)单独或API缓冲液单独的裸鼠血清中白蛋白水平。组1小鼠在第0、3、7、10、14、17、21、24天接受API缓冲液；组2-5在第0、3、7、10、14、17、21、24天接受剂量分别为3000、7000、10000或30000单位/小鼠的PEG化rHuPH20；组6-8在第0、7、14、21天被共给予Taxotere
Figure BPA00001277192100211
(多西他赛)与分别为3000、7000、10000单位/小鼠的PEG化rHuPH20；组9和10在第0、7和14天接受10mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192100212
(多西他赛)或30mg/kg Taxotere(多西他赛)。
图8描绘了在富HA人前列腺肿瘤异种移植物模型PC3中重复给予单独PEG化rHuPH20的作用。如实施例16A所述，在第0、3、5、7、10、12、14和17天，小鼠用对照缓冲液和各种量(酶单位(U))的PEG化HuPH20注射。在第2、4、7、11、14和18天，通过用Visual Sonics
Figure BPA00001277192100214
超声系统捕获图像并用超声成像软件程序在每组动物中测量研究期间的肿瘤体积(mm3)。这些结果也示于表29。
图9描绘了给予API缓冲液或3000U PEG化rHuPH20后，在具有各种程度透明质酸(HA)肿瘤表达(+++、++和+)的三种不同肿瘤模型(PC3，4T1-GFP，Mat LyLu)中的肿瘤体积和存活百分比。结果描述于实施例17C，也示于表33-37。如实施例17所述，通过确定每组中在每个时间点的“存活”动物百分比而在每种模型中评估效果。为此研究，选择大于或等于1500mm3的肿瘤体积作为终点，其被认为是类似于半死(非存活)状态，具有低于1500mm3的肿瘤体积的动物被认为是存活的，而具有1500mm3或更大肿瘤体积的动物被认为是病态的(morbid)。
图10描绘了如实施例18所述，在PC3脑肿瘤模型中用PEG化rHuPH20或对照缓冲液治疗后在各时间点存活的小鼠百分比。通过评估在指示时间存活的小鼠数确定存活率。
图11描绘了如实施例18所述，在PC3脑肿瘤模型中用对照缓冲液、辐射或者辐射与PEG化rHuPH20联合治疗后在各时间点存活的小鼠百分比。通过评估在指示时间存活的小鼠数确定存活率。
图12描绘了小鼠中给予PEG化rHuPH20之后PK回归曲线。
详细描述
提纲
A.定义
B.用于治疗透明质酸相关病症、疾病和失调的方法和组合物综览
1.透明质酸
2.透明质酸相关疾病
3.治疗方法及组合物
4.组合及其治疗方法
C.含有透明质酸降解酶的组合物
1.透明质酸酶
a.哺乳动物类型透明质酸酶
b.细菌透明质酸酶
c.来自水蛭、其它寄生虫和甲壳纲动物的透明质酸酶
2.其它透明质酸降解酶
3.可溶性透明质酸降解酶
a.可溶性人PH20
b.rHuPH20
4.透明质酸降解酶的糖基化
5.修饰的(聚合物缀合的)透明质酸降解酶
a.PEG化可溶性透明质酸降解酶
D.产生编码透明质酸降解酶及其多肽的核酸的方法
1.载体和细胞
2.表达
a.原核细胞
b.酵母细胞
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
3.纯化技术
4.透明质酸降解酶多肽的PEG化
F.组合物的制备、配制及给予
1.配制
a.注射剂、溶液和乳液
b.冻干的粉末
c.局部给予
d.用于其它给予途径的组合物
2.剂量和给予
3.联合疗法
4.包装和制造品
G.评估活性、生物利用度和药动学的方法
1.评估透明质酸降解酶的活性的测定
2.药动学和耐受性
3.动物模型
H.透明质酸降解酶在治疗透明质酸相关病症、疾病和失调中的应用
1.透明质酸相关病症和疾病
癌症、包括富透明质酸癌症
2.治疗透明质酸相关病症和疾病中的应用
a.透明质酸相关疾病标记物的检测(用于治疗和评估治疗作用的对象的选择)
i.用于透明质酸相关疾病标记物的测定
ii.相对于对照样品透明质酸相关标记物的检测
b.治疗癌症中的应用
抗癌剂和其它治疗
c.治疗与升高的组织间隙液压相关的其它疾病中的应用
3.作为播散剂的应用
4.皮下灌注术中的应用
5.玻璃体切割术和眼科失调和病症的应用
6.基因治疗应用
7.化妆品应用
8.器官移植中的应用
9.脑中糖胺聚糖积累的治疗中的应用
10.心血管疾病中糖胺聚糖积累的治疗中的应用
11.肺病中的应用
12.其它应用
I.实施例
A.定义
除非特别指出，则本文所用所有技术和学术用语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。除非特别指出，则本文中所有专利、专利申请、公开的应用和申请、Genbank序列、数据库、网站以及其它公开材料均以其全部内容并入作参考。在术语具有多个定义的情况中，以在本章节中所述含义为主。参考URL或其他这样的标示符或地址时，应理解所述的标示符可改变而且网上的具体信息时有时无，但通过在网上搜索应当能获得相当的信息。参考上述内容可证明所述信息的可用性以及公众传播。
如本文所用，给药方案是指给予的药剂例如含有可溶性透明质酸酶的组合物或其它药剂的量和给予频率。所述给药方案与所治疗的疾病或者病症相关，因此是可变的。
如本文所用，给予频率是指连续给予治疗之间的时间。例如，频率可以是天、周或月。例如，频率可以是每周一次以上，例如，一周二次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次或每日。频率也可以是一周、两周、三周或四周。特定频率与治疗的特定疾病或者病症相关。通常地，频率是每周一次以上，通常是每周二次。
如本文所用，“给药周期(cycle of administration)”是指在连续给予期间重复的给予酶和/或第二种药剂的给药方案的重复安排。例如，举例性的给药周期是28天周期，其中每周给予二次共三周，随后中断给予一周。
如本文所用，针对给予或中断给予周数的“预定”是指预先决定或建立的时间期间。时间期间可以是凭经验确定并且与疾病或病症、病症严重性、特定患者及治疗医生技能水平内的其它因素相关。
如本文所用，透明质酸降解酶是指催化透明质酸聚合物(也称为透明质酸或HA)裂解为较小分子量片段的酶。透明质酸降解酶的例子是透明质酸酶，及具有解聚透明质酸能力的特定软骨素酶(chondroitinase)和裂合酶。是透明质酸降解酶的举例性软骨素酶包括但非限于软骨素ABC裂合酶(也称为软骨素酶ABC)，软骨素AC裂合酶(也称为硫酸软骨素裂合酶或硫酸软骨素eliminase)和软骨素C裂合酶。软骨素ABC裂合酶包括两种酶，硫酸软骨素-ABC内裂合酶(endolyase)(EC 4.2.2.20)和硫酸软骨素-ABC外裂合酶(EC4.2.2.21)。举例性硫酸软骨素-ABC内裂合酶和硫酸软骨素-ABC外裂合酶包括但非限于来自Proteus vulgaris和Flavobacterium heparinum(Proteus vulgaris硫酸软骨素-ABC内裂合酶如SEQ ID NO：98所示；Sato et al.(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1)：39-46)的那些。来自细菌的举例性软骨素酶AC酶包括但非限于来自Flavobacterium heparinum Victivallis vadensis，如SEQ ID NO：99所示，和Arthrobacter aurescens(Tkalec et al.(2000)Applied and Environmental Microbiology 66(1)：29-35；Ernst et al.(1995)Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5)：387-444)的那些。来自细菌的举例性软骨素酶C酶包括但非限于来自Streptococcus和Flavobacterium(Hibi et al.(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2)：121-4；Michelacci et al.(1976)J.Biol.Chem.251：1154-8；Tsuda et al.(1999)Eur.J.Biochem.262：127-133)的那些。
如本文所用，透明质酸酶是指一类透明质酸降解酶。透明质酸酶包括细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)，来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物(EC 3.2.1.36)的透明质酸酶，以及哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)。透明质酸酶包括任何非人源以及来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的任何酶，所述非人源包括但不限于鼠、犬、猫、野兔、禽类、牛、绵羊、猪、马、鱼类、蛙科动物、细菌。举例的非人透明质酸酶包括来自如下动物的透明质酸酶：牛(SEQ ID NO：10、11、64和BH55(美国专利号5,747,027和5,827,721))、黄蜂(SEQ ID NO：12和13)、蜜蜂(SEQ ID NO：14)、白脸马蜂(SEQ ID NO：15)、胡蜂(SEQ ID NO：16)、小鼠(SEQ ID NO：17-19、31)、猪(SEQ ID NO：20-21)、大鼠(SEQ ID NO：22-24、30)、兔(SEQ ID NO：25)、绵羊(SEQ ID NO：26、27、63和65)、黑猩猩(SEQ ID NO：101)、猕猴(Rhesus monkey)(SEQ ID NO：102)、猩猩(SEQ ID NO：28)、猕猴(cynomolgus monkey)(SEQ ID NO：29)、豚鼠(SEQ ID NO：32)、Arthrobacter sp.(菌株FB24)(SEQID NO：67)、Bdellovibrio bacteriovorus(SEQ ID NO：68)、Propionibacterium acnes(SEQ ID NO：69)、Streptococcus agalactiae((SEQ ID NO：70)；18RS21(SEQ ID NO：71)；血清型Ia(SEQ ID NO：72)；血清型III(SEQ ID NO：73)、Staphylococcus aureus(菌株COL(SEQ ID NO：74)；菌株MRSA252(SEQ IDNOS：75 and 76)；菌株MSSA476(SEQ ID NO：77)；菌株NCTC 8325(SEQ IDNO：78)；菌株bovine RF122(SEQ ID NOS：79 and 80)；菌株USA300(SEQ IDNO：81)、Streptococcus pneumoniae((SEQ ID NO：82)；菌株ATCC BAA-255/R6(SEQ ID NO：83)；血清型2、菌株D39/NCTC 7466(SEQ ID NO：84)、Streptococcus pyogenes(血清型M1)(SEQ ID NO：85)；血清型M2、菌株MGAS10270(SEQ ID NO：86)；血清型M4、菌株MGAS10750(SEQ ID NO：87)；血清型M6(SEQ ID NO：88)；血清型M12、菌株MGAS2096(SEQ ID NO：89和90)；血清型M12、菌株MGAS9429(SEQ ID NO：91)；血清型M28(SEQ IDNO：92)；Streptococcus suis(SEQ ID NO：93-95)；Vibrio fischeri(菌株ATCC700601/ES114(SEQ ID NO：96))、以及Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其特异于透明质酸并且不裂解软骨素或硫酸软骨素(Ohya、T.and Kaneko、Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta 198：607)。透明质酸酶还包括人源的那些。举例的人透明质酸酶包括HYAL1(SEQ ID NO：36)、HYAL2(SEQID NO：37)、HYAL3(SEQ ID NO：38)、HYAL4(SEQ ID NO：39)和PH20(SEQID NO：1)。透明质酸酶还包括可溶性透明质酸酶，包括绵羊和牛PH20、可溶性人PH20和可溶性rHuPH20。商业可获得的牛或绵羊可溶性透明质酸酶的例子是Vitrase
Figure BPA00001277192100261
(绵羊透明质酸酶)和Amphadase
Figure BPA00001277192100262
(牛透明质酸酶)。
提及的透明质酸降解酶包括前体透明质酸降解酶多肽和成熟透明质酸降解酶多肽(如其中已经除去信号序列的那些多肽)、其具有活性的截短形式，以及包括等位基因变体和物种变体，由剪接变体编码的变体，以及其它变体，包括与SEQ ID NO：1和10-48、63-65、67-102所示前体多肽具有40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者更多序列相同性的多肽，或者其成熟形式。例如，提及的透明质酸降解酶也包括SEQ ID NO：50-51所示人PH20前体多肽变体。透明质酸降解酶也包括含有化学或者翻译后修饰的那些酶，以及不含有化学或者翻译后修饰的那些酶。这种修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化(farnesylation)、羧化、羟基化、磷酸化及本领域已知的其它多肽修饰。
如本文所用，可溶性透明质酸酶是指特征在于其在生理条件下的可溶性的多肽。例如，通过其在加热至37℃的Triton X-114溶液中分配至水相而可以区分可溶性透明质酸酶(Bordier et al.，(1981)J.Biol.Chem.，256：1604-7)。膜锚定的如脂质锚定的透明质酸酶将分配在去污剂富集相，但是在用磷脂酶-C处理后将分配至去污剂不足或者水相中。可溶性透明质酸酶包括膜锚定的透明质酸酶，其中透明质酸酶与膜锚定相关的一或多个区域已经被除去或者修饰，其中所述可溶形式保留透明质酸酶活性。可溶性透明质酸酶包括重组可溶性透明质酸酶以及包含于或者纯化自天然来源的那些酶，例如绵羊或者牛睾丸提取物。举例的这种可溶性透明质酸酶是可溶性人PH20。其它可溶性透明质酸酶包括绵羊(SEQ ID NO：27、63、65)和牛(SEQ ID NO：11、64)PH20。
如本文所用，可溶性人PH20或者sHuPH20包括缺少所有或者部分C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点的成熟多肽，由此在表达时所述多肽是可溶的。举例的sHuPH20多肽包括具有SEQ ID NO：4-9和47-48之一所示的氨基酸序列的成熟多肽。这种举例的sHuPH20多肽的前体多肽包括信号序列。举例的前体如SEQ ID NO：3和40-46所示，其在第1-35位氨基酸均含有一个具有35个氨基酸的信号序列。可溶性HuPH20多肽还包括在本文所述生产和纯化方法期间或者之后降解的那些序列。
如本文所用，可溶性重组人PH20(rHuPH20)是指在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达的可溶形式的人PH20。可溶性rHuPH20由包含信号序列及由SEQ ID NO：49所示的核酸编码。还包括是其等位基因变体及其它可溶变体的DNA分子。编码可溶rHuPH20的核酸在CHO细胞中表达，其分泌成熟多肽。如在培养基中产生，在C末端具有异质性，由此产物是混合物，其可以包括不同丰度的任一或多个SEQ ID NO：4-9。也包括相应的等位基因变体及其它变体，包括相应于SEQ ID NO：50-51所示前体人PH20多肽的那些变体。其它变体与SEQ ID NO：4-9和47-48所示任何序列可具有60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的序列相同性，只要其保留透明质酸酶活性且是可溶的即可。
如本文所用，透明质酸酶底物是指由透明质酸酶裂解和/或解聚的底物(例如蛋白质或多糖)。通常，透明质酸酶底物是糖胺聚糖。举例的透明质酸酶底物是透明质酸(HA)。
如本文所用，透明质酸相关疾病、失调或病症是指其中透明质酸水平升高作为疾病或病症的原因、结果或在其中观察到的任何疾病或病症。透明质酸相关疾病或病症与组织或细胞中升高的透明质酸表达、增加的组织间隙液压、降低的血管体积和/或增加的组织水含量相关。透明质酸相关疾病、失调或病症可以通过给予含有透明质酸降解酶如透明质酸酶例如可溶性透明质酸酶的组合物单独或与另一种疗法和/或药剂联合或额外给予而治疗。举例的疾病和病症包括但不限于富透明质酸癌症，例如肿瘤，包括实体肿瘤如晚期癌症、转移癌、未分化癌、卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和其它癌症。透明质酸相关疾病或病症的例子还包括与升高的组织间隙液压相关的疾病，如与椎间盘压力相关的疾病，及水肿，例如由器官移植、卒中、脑外伤或其它损伤导致的水肿。举例的透明质酸相关疾病或病症包括与升高的组织间隙液压、降低的血管体积和/或增加的组织水含量相关的疾病和病症，包括癌症椎间盘压力和水肿。在一个实施例中，透明质酸相关病症、疾病或失调的治疗包括升高的组织间隙液压(IFP)、降低的血管体积和增加的组织水含量之一或多种的改善、降低或其它有益效果。
如本文所用，升高的透明质酸水平根据疾病或病症是指特定组织、体液或细胞中透明质酸的量。例如，作为存在富透明质酸肿瘤的结果，透明质酸(HA)水平可以在体液如血液、尿、唾液和血清和/或在肿瘤组织或细胞中升高。所述水平可以与标准或其它合适对照比较，如来自未患有HA相关疾病的对象的可比样品。
如本文所用，缀合于透明质酸降解酶如透明质酸酶的聚合物是指直接或经接头共价连接于或其它方式稳定连接于透明质酸降解酶的聚合物。这种聚合物典型增加血清半衰期，并包括但不限于sialic部分、PEG化部分、葡聚糖以及糖和其它部分如用于糖基化。
如本文所用，天然透明质酸降解酶例如天然可溶性透明质酸酶是未用聚合物例如PEG化部分(PEG)或sialation部分修饰的透明质酸降解酶。因此，天然透明质酸降解酶是未修饰的。典型地，天然透明质酸降解酶如天然可溶性透明质酸酶与已通过缀合于聚合物例如PEG而修饰的透明质酸降解酶相比在生物学环境(例如在对象中)中具有降低的半衰期。
如本文所用，比活性是指每mg蛋白质的活性单位。毫克透明质酸酶通过溶液在280nm的吸收定义，假定摩尔消光系数大约为1.7，以M-1cm-1单位表示。
如本文所用，活性是指与全长(完整)蛋白质相关的多肽或其部分的功能活性。功能活性包括但不限于生物学活性、催化或酶活性、抗原性(结合或与多肽竞争结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力及特异结合多肽受体或配体的能力。
如本文所用，透明质酸酶活性是指酶催化裂解透明质酸的能力。美国药典(USP)用于透明质酸酶的XXII测定通过在酶与透明质酸(HA)在37℃反应30分钟后测量高分子量透明质酸(HA)底物的量而间接确定透明质酸酶活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645 United States Pharmacopeia Convention，Inc，Rockville，MD)。在测定中可以使用参考标准溶液以确定任何透明质酸酶的以单位表示的相对活性。确定透明质酸酶如可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性的体外测定是本领域已知的并在本文中描述。举例的测定包括下文描述(见实施例3)的微浊度(microturbidity)测定，其通过检测当未裂解的透明质酸结合血清白蛋白时形成的不溶沉淀而间接测量由透明质酸酶对透明质酸的裂解。参考标准可以用于例如产生标准曲线以确定被测试的透明质酸酶的以单位表示的活性。
如本文所用，透明质酸酶活性单位是指U.S.P.National Formulary(NFXIII)单位(NFU)，通过与标准透明质酸酶样品(例如USP或WHO标准)比较而确定，例如使用实施例2所述的基于浊度降低ELISA的测定，其中浊度降低单位通过经U.S.P.标准化的透明质酸酶样品(例如USP或WHO标准)的标准曲线而与NFU和U.S.P.单位相关联。因此，实施例2确定的酶活性是相对TRU(参见例如Dorfman et al.，1948，J.Biol.Chem.172：367)。透明质酸酶单位标准化为标准活性。因此，例如PEG化透明质酸酶可以显示较低活性/mg。为本文目的，剂量参照单位。如果需要，特定的修饰的透明质酸酶的单位/mg(标准活性)可以凭经验确定。
如本文所用，提及透明质酸降解酶时的“功能等价量”或其语法变体是指实现与参照酶如透明质酸酶的量所实现的相同作用的透明质酸降解酶量。例如，任何透明质酸降解酶的活性可以与rHuPH20的活性相比以确定实现与已知量的rHuPH20相同的作用的透明质酸降解酶的功能等价量。例如，透明质酸降解酶作为涂布或扩散剂的能力可以通过将其与台盼蓝一起注射进小鼠的体侧皮肤而评估(参见例如美国专利公开号20050260186)，可以确定实现与例如100单位透明质酸酶参考标准相同的扩散量所需的透明质酸降解酶的量。所需的透明质酸降解酶的量因此功能等价于100单位。在另一个实施例中，透明质酸降解酶增加共给予药剂的体内活性(例如化疗剂的抗肿瘤活性)的能力可以在动物模型或人对象中评估，如实施例14所述，可以确定实现与例如rHuPH20的给予数量相同的共给予药剂活性增加所需的透明质酸降解酶的量。
如本文所用，天然发生的α-氨基酸的残基是在自然届中发现的20个α-氨基酸的残基，它们通过在人体中的其关联mRNA密码子对负载的tRNA分子的特异性识别而被掺入蛋白质中。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或者双链核酸。当提及探针或者引物时，包括单链分子，其任选被标记，如用检测标记标记，例如荧光或者放射标记。这种分子典型是这样的长度，由此其靶对于探查或者引导(priming)文库是统计学独特的或者是低拷贝数(典型少于5个，通常少于3个)。通常地，探针或者引物包含与感兴趣的基因互补或者相同的序列的至少14、16或者30个连续核苷酸。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或者更多个核酸。
如本文所用，肽是指长度为2-40个氨基酸的多肽。
如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中存在的氨基酸是根据其已知的三字母或者单字母缩写词识别的(表1)。在各个核酸片段中存在的核苷酸根据本领域常用的标准一个字母命名法命名。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基基团和羧基基团的有机化合物。多肽含有两或多个氨基酸。对于本发明，氨基酸包括20个天然发生的氨基酸、非天然氨基酸以及氨基酸类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
如本文所用，“氨基酸残基”是指对多肽在其肽键处进行化学消化(水解)而形成的氨基酸。本文所述氨基酸残基假定是“L”异构体形式。也如此命名的“D”异构体形式中的残基可以由任何L-氨基酸残基取代，只要多肽保留希望的功能性质即可。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游离羧基基团。与J.Biol.Chem.，243：3557-3559(1968)所述标准多肽命名法一致，以及采用37 C.F.R.§§1.821-1.822，氨基酸残基的缩写在表1中示出。
表1：对照表
Figure BPA00001277192100301
应注意本文由公式表示的所有氨基酸残基序列从左至右方向是从氨基末端至羧基末端的常规方向。此外，短语“氨基酸残基”广义是指包括对照表(表1)中列举的氨基酸以及修饰的和独特的氨基酸，如在37C.F.R.§§1.821-1.822中提及的那些氨基酸，在此并入作参考。另外，应注意在氨基酸序列的起始或者末尾的破折号表示与一或多个氨基酸残基的其它序列、与氨基末端基团如NH2或者与羧基末端基团如COOH的肽键。
如本文所用，“天然发生的氨基酸”是指在多肽中存在的20个L-氨基酸。
如本文所用，“非天然氨基酸”是指具有与天然氨基酸相似的结构但是在结构上被修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。非天然发生的氨基酸因此包括例如除了所述20个天然发生的氨基酸之外的氨基酸或者氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-立体异构体(isostereomers)。举例的非天然氨基酸在本文描述且为本领域技术人员已知。
如本文所用，DNA构建体是单链或者双链的、线性或者环状DNA分子，其含有以在自然中未发现的方式组合和并列的DNA节段。DNA构建体以人工操纵的结果存在，包括操纵的分子的克隆及其它拷贝。
如本文所用，DNA节段是具有特定属性的较大的DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长的DNA分子的一部分，如质粒或者质粒片段，当从5’至3’方向读取时，编码该特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的单链或者双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源、在体外合成，或者从天然分子与合成分子的组合中制备。在本文多核苷酸分子的长度以核苷酸(缩写为nt)或者碱基对(缩写为bp)表示。术语“核苷酸”在上下文允许的情况下用于单链和双链分子。当该术语用于双链分子时，其用于描述全长，且应理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两条链的长度可以略有不同，因此其末端可以错列；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸均不可配对。这种未配对的末端的长度通常不超过20个核苷酸。
如本文所用，两个蛋白质或者核酸之间的“相似性”是指蛋白质的氨基酸序列或者核酸的核苷酸序列之间的关系。相似性可基于残基序列及其中包含的残基的相同性和/或同源性程度。评估蛋白质或者核酸之间相似性程度的方法为本领域技术人员已知。例如，在评估序列相似性的一个方法中，以产生序列之间最大水平相同性的方式排列两个氨基酸或者核苷酸序列。“相同性”是指氨基酸或者核苷酸序列保持不变的程度。氨基酸序列以及某种程度上的核苷酸序列的排列对比也可考虑氨基酸(或者核苷酸)中的保守差异和/或常见取代。保守差异是保持所包含的残基的物理-化学性质的那些差异。序列对比可以是整体对比(对比序列的全长序列及包含所有残基的对比)或者局部对比(仅包括最相似区域的序列部分的对比)。
“相同性”具有本领域公认的含义，可以使用公开的技术计算(见例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；以及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。虽然有许多方法测量两个多核苷酸或者多肽之间的相同性，术语“相同性”仍为本领域技术人员熟知(Carillo，H.& Lipton，D.，SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。
如本文所用，同源(关于核酸和/或氨基酸序列)是指大于或者等于25％的序列同源性，典型为大于或者等于25％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或者95％的序列同源性；如果需要则可以指定精确的百分比。对于本发明，除非特别指出，则术语“同源性”与“相同性”通常可互换使用。通常地，为了确定同源性或者相同性百分比，对比序列由此获得最高级别的匹配(见例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；以及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carillo et al.(1988)SIAMJ Applied Math 48：1073)。对于序列同源性，保守氨基酸的数目通过标准对比算法程序确定，可以使用每个供应商确定的默认空位罚分(default gap penalties)。基本同源的核酸分子通常在中等严格或者高严格条件下沿着感兴趣的核酸的长度杂交。也包含这样的核酸分子，其含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子。
任两个分子是否具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％“相同”或者“同源”的核苷酸序列或者氨基酸序列，可以使用已知的计算机算法确定，如“FASTA”程序，使用Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444中所述默认参数(其它程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(I)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.，et al.，J Molec Biol215：403(1990))；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994以及Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库的BLAST函数可用于确定相同性。其它商购或者公开的程序包括DNAStar“MegAlign”程序(Madison，WI)和University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)“Gap”程序(Madison WI)。蛋白质和/或核酸分子的同源性或者相同性百分比可以通过例如使用GAP计算机程序对比序列信息确定(例如Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48：443，由Smith and Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2：482改进)。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的被比对标志(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两条序列中较短一条中所述标志的总数的结果。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(包含1这个值表示恒等(identities)，0表示非恒等(non-identities))和加权比较矩阵(Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14：6745)，如Schwartz和Dayhoff，eds.，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)所述；(2)每一缺口罚分3.0，每一缺口中的每个符号额外罚分0.10；以及(3)末端缺口无罚分。
因此，如本文所用，术语“相同性”或者“同源性”是指待检和参考多肽或者多核苷酸之间的对比。如本文所用，术语至少“90％相同”是指相对于参考多肽的核酸或者氨基酸序列从90至99.99的相同性百分比。在90％或者更高水平的相同性表示这样的事实，即例如假定对比长度为100个氨基酸的待检和参考多肽，待检多肽中不超过10％(即100个中的10个)的氨基酸与参考多肽不同。在待检和参考多核苷酸之间可以进行相似对比。这种差异可以表现为在多肽全长随机分布的点突变，或者其可以群集在不同长度直至最大允许长度的一或多个位置，例如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异确定为核酸或者氨基酸取代、插入或者缺失。在大约85-90％以上的特异性或者相同性水平，结果应与所述程序和空位参数集无关；这种高水平相同性可易于评估，通常通过人工对比而不依赖于软件进行。
如本文所用，对比序列是指使用同源性(相似性和/或相同性)对比核苷酸或者氨基酸序列种相应位置。通常，对比具有50％或者更高相同性的两或多个序列。对比的序列是指在相应位置对比的两或多个序列，且可包括衍生自RNA的对比序列，如EST及其它cDNA，以基因组DNA序列对比。
如本文所用，“引物”是指在适当条件下合适的缓冲液及在合适温度下，可作为模板指导的DNA合成的起始点的核酸分子(例如存在四种不同的三磷酸核苷和聚合剂，如DNA聚合酶、RNA聚合酶或者逆转录酶)。应意识到某些核酸分子可作为“探针”和作为“引物”。然而，引物具有3’羟基基团以进行延伸。引物可用于各种方法中，包括例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、锅柄式PCR、捕获PCR、表达PCR、3′和5′RACE、原位PCR、连接介导的PCR以及其它扩增方案。
如本文所用，“引物对”是指一组引物，其包含与待扩增(例如通过PCR)的序列的5’末端杂交的5’(上游)引物以及与待扩增序列的3’末端的互补体杂交的3’(下游)引物。
如本文所用，“特异性杂交”是指通过互补碱基配对，核酸分子(例如寡核苷酸)与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和成分。与体外杂交特别相关的参数进一步包括退火和洗涤温度、缓冲液成分以及盐浓度。举例的除去非特异性结合的核酸分子的高严格洗涤条件是0.1×SSPE、0.1％ SDS、65℃，中等严格条件是0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃。本领域已知相等的严格条件。技术人员可易于调节这些参数以实现核酸分子与适于特定应用的靶核酸分子的特异性杂交。当提及两个核苷酸序列时，互补是指两个核苷酸序列能杂交，典型在相对的核苷酸之间具有低于25％、15％或者5％的错配。如果需要，将指定互补性百分比。通常，选择两个分子，由此其在高严格条件下杂交。
如本文所用，与产物基本相同是指足够相似，由此感兴趣的性质未充分改变，由此所述基本相同的产物可用于代替该产物。
如本文所用，也应理解术语“基本相同”或者“相似”随着上下文的语境而有所变化。
如本文所用，等位基因变体或者等位基因变异是指基因的两或多种改变形式占据相同染色体位置。等位基因变异是通过突变自然产生的，且可以导致群内表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无变化)，或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”在本文也用于表示由基因的等位基因变体编码的蛋白质。通常，基因的参考形式编码来自种群或者物种的单个参考成员的多肽的野生型形式和/或优势型形式。通常，包括物种之间和之中的变体的等位基因变体与相同物种的野生型或者优势型形式典型具有至少80％、90％或者更高的氨基酸相同性；相同性程度依赖于基因以及对比是种间还是种内对比。通常地，种内等位基因变体与野生型和/或优势型形式具有至少大约80％、85％、90％或95％或者更高的相同性，包括与多肽的野生型和/或优势型形式具有96％、97％、98％、99％或者更高的相同性。本文提及的等位基因变体通常是指相同物种的成员之中的蛋白质变异。
如本文所用，“等位基因”与“等位基因变体”在本文可互换使用，是指基因的另一形式或者其一部分。等位基因占据同源染色体上的相同座或者位置。当一个对象具有基因的两个相同的等位基因时，称该对象对于该基因或者等位基因是纯合的。当一个对象具有基因的两个不同的等位基因时，称该对象对于该基因是杂合的。特定基因的等位基因在一个核苷酸或者几个核苷酸上可以彼此不同，且可以包含核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因也可以是含有突变的基因形式。
如本文所用，物种变体是指不同物种、包括不同的哺乳动物种如小鼠和人之中的多肽变体。
如本文所用，剪接变体是指通过对基因组DNA的初级转录物进行不同处理而产生的变体，产生一种以上类型的mRNA。
如本文所用，修饰是指对多肽的氨基酸序列或者核酸分子的核苷酸序列的修饰，分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置换。修饰多肽的方法为本领域技术人员熟知，如通过使用重组DNA技术进行修饰。
如本文所用，术语“启动子”是指基因的一部分，其含有使得RNA聚合酶结合及转录起始的DNA序列的。启动子序列通常在但不总是在基因的5’非编码区发现。
如本文所用，分离的或者纯化的多肽或者蛋白质或者其生物活性部分基本上没有来自该蛋白质衍生自其中的细胞或者组织的细胞材料或者其它污染蛋白质，或者当其是化学合成时基本上没有化学前体或者其它化学物质。如果制备物看起来不存在通过本领域技术人员用于评估这种纯度的标准分子方法确定可易于检测的杂质，则可以确定其是基本纯的，所述标准分析方法薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)；或者是足够纯的，由此进一步纯化不改变所述物质的物理和化学性质，如酶和生物学活性。本领域技术人员已知纯化化合物产生化学基本纯的化合物的方法。然而，化学基本纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可增加化合物的比活性。
术语基本上没有细胞材料包括这样的蛋白质制备物，其中所述蛋白质与其从中分离或者重组产生的细胞的细胞成分分离。在一个实施方案中，术语基本没有细胞材料包括酶蛋白质制备物，其具有低于大约30％(干重)的非酶蛋白质(在本文也称作污染蛋白质)，通常低于大约20％的非酶蛋白质或者10％的非酶蛋白质，或者低于大约5％的非酶蛋白质。当所述酶蛋白质是重组产生的，其也基本上没有培养基，即存在低于大约20％、10％或者5％酶蛋白质制备物体积的培养基。
如本文所用，术语基本没有化学前体或者其它化学物质包括这样的酶蛋白质制备物，其中所述蛋白质与参与其合成的化学前体或者其它化学物质分离。该术语包括具有低于大约30％(干重)、20％、10％、5％或者更低的化学前体或者非酶化学物质或者成分的酶蛋白质制备物。
如本文所用，关于例如合成的核酸分子或者合成的基因或者合成的肽提及的术语合成是指核酸分子或者多肽分子是通过重组方法和/或通过化学合成方法产生。
如本文所用，通过使用重组DNA方法通过重组发生产生是指使用熟知的分子生物学方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，载体(或者质粒)是指用于将异源核酸导入细胞以使其表达或者复制的独立的元件。载体典型保留附加体，但是可以设计为实现基因或者其一部分整合进基因组的染色体中。也包含这样的载体，其是人工染色体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这种载体的选择和使用为本领域技术人员熟知。
如本文所用，表达载体包括能表达与调节序列可操纵地连接的DNA的载体，所述调节序列如启动子区域，其能实现这种DNA片段的表达。这种额外的节段可包括启动子和终止子序列，任选可包含一或多个复制起源、一或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或者病毒DNA，或者可以含有这两个元件。因此，表达载体是指重组DNA或者RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或者其它载体，在导入合适的宿主细胞中使得克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些载体，以及保留附加体或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其与外源基因可操纵地连接以将该外源基因转移(作为运载体或者穿梭载体)进细胞中。
如本文所用，当提及DNA节段时所用术语“可操纵地连接”是指排列该节段，由此其发挥与指定目的一致的功能，例如转录在启动子中开始，并且通过编码节段行进至终止子。
如本文所用，术语“评估(assessing)”是指包括在数量上和性质上确定获得的样品中存在的蛋白酶或者其结构域的活性绝对值，以及获得的指数、比率、百分比、目测或者其它表示活性水平的数值。评估可以是直接或者间接评估，实际检测的化学物种当然不需要是蛋白酶解产物自身，但是可例如是其衍生物或者一些进一步的物质。例如，检测补体蛋白质的裂解产物，如通过SDS-PAGE以及考马斯蓝染色蛋白质进行。
如本文所用，生物学活性是指化合物的体内活性或者当在体内给予化合物、组合物或者其它混合物时获得的生理反应。因此，生物学活性包括这种化合物、组合物和混合物的治疗作用和药物活性。生物学活性可以在设计为检测或者使用这种活性的体外系统中观测。因此，对于本发明而言，蛋白酶的生物学活性是其中多肽被水解的其催化活性。
如本文所用，当提及两个核酸序列时所用术语“等价”是指这两个序列编码相同的氨基酸序列或者等价蛋白质。当等价用于描述两个蛋白质或者肽时，是指这两个蛋白质或者肽具有基本相同的氨基酸序列，仅具有基本上不改变所述蛋白质或者肽的活性或者功能的氨基酸取代。当等价是指性质时，所述性质不需要表现为相同程度(例如两个多肽可以呈现不同速率的相同类型酶活性)，但是所述活性通常基本相同。
如本文所用，“调节”或者“改变”是指分子如蛋白质的活性改变。举例的活性包括但不限于生物活性，如信号转导。调节可包括增强活性(即正调节或者激动活性)、降低活性(即负调节或者抑制)或者活性的任何其它改变(如周期性、频率、持续时间、动力学或者其它参数的改变)。调节可以与背景相关，通常是与指定状态对比，例如野生型蛋白质、组成型状态蛋白质，或者在指定细胞类型或者状况中表达的蛋白质。
如本文所用，组合物是指任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水溶液、非水溶液或者其任何组合。
如本文所用，组合是指两或多个项目之间或者之中的任何关联。所述组合可以是两或多个单独的项目，如两个组合物或者两个集合，可以是其混合物，如两或多个项目的单混合物，或者其任何变化。所述组合的元件通常功能上联合或者相关。
如本文所用，试剂盒是经包装的组合，其任选包含其它元件，如另外的试剂以及所述组合或者其元件的使用说明书。
如本文所用，“疾病或者失调”是指由一些原因或者状况导致的生物体内的病理状况，所述原因或状况包括但不限于感染、获得性状况、遗传状况，特征在于可鉴别的症状。本发明感兴趣的疾病和失调是透明质酸相关疾病和失调。
如本文所用，“治疗”患病对象是指所述对象的症状在治疗后部分或者全部减轻，或者保持稳定。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在的疾病和/或防止疾病的症状恶化或者进展。治疗还包括本发明提供的修饰的干扰素和组合物的任何药物学应用。
如本文所用，药物学有效药剂包括任何治疗剂或者生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、常规治疗药物，包括小分子药物和治疗性蛋白质。
如本文所用，治疗是指使得病症、失调或者疾病的症状或者其它指征得以改善或者另外有益地改变的任何方式。
如本文所用，治疗作用是指治疗对象获得的结果，其改变、典型地改善或者减轻疾病或者病症的症状或者治愈疾病或者病症。治疗有效量是指组合物、分子或者化合物在给予对象后产生治疗作用的量。
如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物如人。
如本文所用，患者是指对象是人。
如本文所用，通过治疗如通过给予药物组合物或者其它治疗剂使特定疾病或失调的症状得以改善是指归因于给予所述组合物或者治疗剂或者与之相关的症状的任何减轻，无论持久或是短暂、持续或者瞬时的减轻。
如本文所用，防止或者预防是指降低疾病或者病症发生的危险的方法。
如本文所用，“治疗有效量”或者“治疗有效剂量”是指药剂、化合物、材料或者含有化合物的组合物至少足以产生治疗作用的数量。因此，治疗有效量是预防、治愈、改善、阻止或者部分阻止疾病或者失调的症状必需的数量。
如本文所用，单位剂量形式是指适于人和动物对象的物理分离的单位，且单独包装。
如本文所用，单剂量配制物是指用于直接给药的配制物。
如本文所用，“制造品”是指生产和销售的产品。如本申请中所用，该术语包括在包装物品中包含的透明质酸降解酶如透明质酸酶和第二种药剂组合物。
如本文所用，流体是指可以流动的任何组合物。因此流体包括半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、乳液形式的组合物及其它这种组合物。
如本文所用，“试剂盒”是指本发明提供的组合物以及另一项目的组合，用于包括但不限于激活、给予、诊断和评估生物活性或者性质的目的。试剂盒任选包括使用说明书。
如本文所用，细胞提取物或者裂解物是指从裂解或者破坏的细胞中制备的制备物或者部分。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类动物，包括人、大猩猩和猴；啮齿动物，如小鼠和大鼠；禽类，如鸡；反刍动物，如山羊、牛、鹿、绵羊(sheep)；绵羊(ovine)，如猪及其它动物。非人动物是除了人之外的预期动物。本发明提供的酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数酶源自动物，包括源自哺乳动物。
如本文所用，对照是指与检测样品基本相同的样品，不同之处是其未用检测参数处理，或者如果是血浆样品，则其可以来自未受感兴趣的状况影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
如本文所用，除非特别指出，则单数形式“一种”包括其复数形式。因此，例如提及一种化合物包含“一种胞外结构域”是指具有一或多个胞外结构域的化合物。
如本文所用，范围和量可以特定数值或范围的“大约值”表示。大约也包括精确量。因此，“大约5个碱基”是指“大约5个碱基”以及“5个碱基”。
如本文所用，“任选地”是指随后描述的事件或者情况发生或者不发生，且该描述包括其中所述事件或者情况发生的情形以及其中所述事件或者情况不发生的情形。例如，任选取代的基团是指该基团未被取代或者被取代。
如本文所用，抗癌治疗包括给予治疗癌症的药物和其它药剂以及治疗方案，如放疗。
如本文所用，治疗性抗体是指用于治疗的任何抗体，包括但不限于单克隆抗体、人抗体、scFv、二价抗体、Fab、及其它抗体片段。
如本文所用，抗体片段是指任何小于全长、保留至少一部分全长抗体的特异性结合能力的抗体衍生物。抗体片段的例子包括但不限于Fab，Fab′，F(ab)2，单链Fv(scFv)，Fv，dsFv，二价抗体和Fd片段。片段可以包括如通过二硫键连接在一起的多个链。抗体片段通常含有至少大约50个氨基酸，典型至少200个氨基酸。
如本文所用，Fv抗体片段由通过非共价相互作用连接的一条可变重链结构域(VH)和一条可变轻链(VL)结构域组成。
如本文所用，dsFv是指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用，F(ab)2片段是免疫球蛋白用胃蛋白酶在pH4.0-4.5消化而产生的抗体片段；其可以重组产生。
如本文所用，Fab片段是免疫球蛋白用木瓜蛋白酶消化产生的抗体片段；其可以重组产生。
如本文所用，scFv是指含有通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头长度是使得两个可变结构域互相基本不感染而连接。举例的接头是分散有一些Glu或Lys以增强溶解性的(Gly-Ser)n残基。
如本文所用，hsFv是指Fab片段中正常存在的恒定结构域已用杂二聚卷曲螺旋结构域取代的抗体片段(参加例如Arndt et al.(2001)J Mol Biol.7：312：221-228)。
如本文所用，二价抗体是二聚scFv；二价抗体通常具有比scFv短的肽接头，并且它们优先二聚。
如本文所用，人源化抗体是指被修饰以包括“人”氨基酸序列以便给予人时不引起免疫应答的抗体。制备这种抗体的方法是已知的。例如，表达单克隆抗体的杂交瘤经重组DNA技术改变以表达抗体，其中非可变区的氨基酸组成基于人抗体。计算机程序已被设计用于鉴别这种区域。
如本文所用，除非特别指出，则任何保护性基团、氨基端及其它化合物的缩写与其通常用途、公认的缩写或者IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(见(1972)Biochem.  11：1726)所述一致。
B.用于治疗透明质酸相关病症、疾病和失调的方法和组合物综览
本发明提供了治疗透明质酸相关病症、疾病和失调的方法、组合物和组合。本发明提供的方法、组合物和组合采用能降解透明质酸的透明质酸降解酶，透明质酸是胞外基质的关键成分及组织间隙屏障的主要组分。许多疾病和病症与透明质酸酶底物如透明质酸的积累表达或过表达相关，这种积累表达和过表达促使疾病或病症的进展和/或严重性。因此，为解聚底物目的给予这种酶可以产生对这种疾病和病症的治疗。
任何透明质酸降解酶包括其变体(例如截短变体)均可以用于本发明中，只要所述酶显示酶活性。通常透明质酸降解酶通过缀合于增加酶的半衰期的聚合物(例如PEG)而被修饰。增加的半衰期可以增加全身透明质酸酶活性及延长透明质酸降解作用期间。另外，增加的半衰期可促使防止与疾病或病症相关的透明质酸酶底物的重新合成和再生。例如，如本文所述，通过缀合于聚合物而显示增加的半衰期的修饰的透明质酸降解酶可以防止肿瘤内透明质酸再生。本发明提供的修饰的透明质酸降解酶也可以与第二种药剂联合和/或共配制以用于治疗透明质酸相关病症、疾病和/或失调。
1.透明质酸
糖胺聚糖(GAG)是胞外基质(ECM)的复杂线性多糖。GAG特征在于N-取代的己糖胺和糖醛酸的重复二糖结构(例如透明质酸(HA)，硫酸软骨素(CS)，软骨素(C)，硫酸皮肤素(DS)，硫酸类肝素(HS)，肝素(H))，或其和半乳糖的重复二糖结构(例如硫酸角质素(KS))。除了HA，所有均共价结合于核心蛋白。GAG与其核心蛋白在结构上被称为蛋白聚糖(PG)
HA是线性重复多糖，由N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸二糖单位构成。HA的代谢是动力学过程，在组织中的正常周转从几周到皮肤中的低于一天。HA通过三种保守HA合酶(HAS)在浆膜合成并在受体介导的胞吞后通过细胞相关的或酸活性的透明质酸酶(Culty 1992；Zhou 2000)及外切糖苷酶降解为单糖。
HA在许多细胞的胞外基质中存在，特别是在软结缔组织中。透明质酸(HA)主要存在于结缔组织、皮肤、软骨及哺乳动物滑液中。透明质酸也是眼玻璃体的主要成分。HA被赋予各种生理学功能，如在胞内基质中的水和血浆蛋白质稳态中(Laurent TC et al(1992)FASEB J 6：2397-2404)。在结缔组织中，与透明质酸相结合的结合水在组织之间产生空间，因此产生适于细胞运动及增殖的环境。在身体中，例如，在对象组织中，透明质酸以大约5小时的半衰期被替换，并很大程度上负责对流体流经组织的抗性。透明质酸在与细胞活动力包括快速发育、再生、修复、胚胎发生、胚胎学发育、伤口愈合、血管发生和肿瘤发生相关的生物学现象中起作用(参见例如Toole 1991Cell Biol.Extracell.Matrix，Hay(ed)，Plenum Press，New York，1384-1386；Bertrand et al..1992 Int.J.Cancer 52：1-6；Knudson et al.，1993 FASEB J.7：1233-1241)。HA产生在增殖细胞中增加并且可能在有丝分裂中起作用。其还参与行进(locomotion)和细胞迁移，以及在细胞调节、发育和分化中起作用(Laurent et al..(1992)FASEB J 6：2397-2404).
HA已用于临床医学。其组织保护及流变性质已在眼科手术中证实对于在白内障手术期间保护角膜内皮有用。血清HA是肝病和各种炎症如类风湿性关节炎的诊断指标。由HA积累导致的组织间隙水肿可导致各器官功能障碍(Laurent et al.(1992)FASEB J 6：2397-2404)。透明质酸蛋白质相互作用也参与胞外基质或“基质(ground substance)”的结构。
当致癌病毒转化成纤维细胞时HA合成增加，HA的升高水平与各种癌症(cancers)如黑素瘤和一些癌(carcinoma)中的过度增生和恶性表型相关(参见例如Itano et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99；3609-3614.)。另外，透明质酸水平与肿瘤进攻性相关(Ozello et al..1960 Cancer Res.20：600-604；Takeuchi et al..1976，Cancer Res.36：2133-2139；Kimata et al..1983 Cancer Res.43：1347-1354)。在实体肿瘤恶性中已报道了HA代谢的局部异常，其中HA升高水平经常与肿瘤如乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌的预后不良相关。HA积累降低了肿瘤细胞之间和之中的接触抑制((参见例如Itano et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99；3609-3614.)。
2.透明质酸相关疾病
许多疾病或病症与透明质酸酶底物例如HA的过表达或积累表达相关，其可以加剧或促使疾病或病症的严重性或预后。HA积累的背后原因可能是由于HA合酶过表达、淋巴引流不良或底物合成和降解不平衡中的一或多种。
因此，可以用本发明组合物、化合物和方法治疗的透明质酸相关疾病、病症和失调是表达或积累透明质酸作为疾病、病症或失调的原因、结果或症状的病症、疾病和失调。这种疾病、病症和/或失调包括例如，与增加的组织间隙液压、增加的组织水含量、椎间盘压力和水肿相关的那些。透明质酸相关疾病、病症和/或失调包括但不限于富透明质酸癌症，例如肿瘤，包括实体肿瘤，例如晚期癌症、转移性癌症、未分化癌症卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和其它癌症。透明质酸相关疾病和失调的例子还包括椎间盘压力、癌症和水肿，例如由器官移植、卒中、脑外伤和其它损伤导致的水肿。
例如，透明质酸相关疾病或病症包括实体肿瘤，包括良性和恶性肿瘤。实体恶性肿瘤的例子包括例如与乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌相关的那些。肿瘤特别是恶性肿瘤中HA水平的异常积累当与间质或细胞区室相关时是预后不良的指征。
例如，在Auvinen(2000)对患有乳腺癌的患者的存活率研究中，5年存活随着间质HA水平增加而下降；对于低、中和高HA水平，5年总体存活分别为45％、39％和26％(p＝0.002)，无复发存活分别为66％、56％和40％(p＝0.008)。HA阳性癌细胞的存在与腋窝淋巴结阳性(positivity)和分化不良显著相关。显示HA阳性癌细胞的患者的5年总体存活与不具有HA阳性癌细胞的患者相比显著较低(54％ versus 81％，p＝0.01).
在胃癌中，Setala et al.(1999)检查了215名I-IV期胃癌患者的HA谱。发现了高比例HA阳性细胞并与深度肿瘤侵袭、淋巴结转移、阳性淋巴侵袭、不良分化级以及在单变量存活分析中的预后差显著相关。
在结肠直肠癌中，Ropponen et al.(1998)检查了202个结肠直肠癌样品中平均跟踪14年的HA与总体存活和无复发存活之间的细胞学联系。对于187名有价值患者，高HA密度和标记指数经常被发现并与更差总体存活、更短无复发存活及升高的Duke分类显著相关。
Anttila et al.(2000)研究了309个上皮卵巢癌和45个匹配的转移损害中的HA水平。尽管在73％(309个中的227个)病例中，透明质酸阳性癌细胞部分＜10％，但是高间质HA水平与不良分化、严重组织学表型、高级别阶段(advanced stage)及大原发残留肿瘤显著相关。
透明质酸相关疾病可以通过可以给予含有透明质酸降解酶如透明质酸酶例如可溶性透明质酸酶的组合物单独或与另一种疗法和/或药剂联合或额外给予而治疗。透明质酸相关病症、疾病或失调的治疗包括诸如升高的组织间隙液压(IFP)、降低的血管体积和/或增加的组织水含量的任何相关物理表现或症状之一或多种的改善、降低或其它有益效果。
在一个实施例中，透明质酸相关病症、疾病或失调的治疗包括升高的组织间隙液压(IFP)、降低的血管体积和增加的组织水含量之一或多种的改善、降低或其它有益效果。在另一个实施例中，治疗可以包括对另一种症状例如肿瘤大小(例如质量/体积)、预后包括对象的存活和/或无复发存活的改善或有益效果。
3.治疗方法及组合物
因此，本发明提供了治疗透明质酸(HA)相关病症、疾病和失调的方法和组合物。所述方法如治疗方法使用含有修饰的透明质酸降解酶的组合物单独或含有修饰的透明质酸降解酶并进一步含有一或多种用于治疗透明质酸病症、疾病和/或失调的额外药剂的组合物或组合。在本发明方法采用的组合物和组合中，透明质酸降解酶如透明质酸酶被修饰，如通过缀合于一或多种聚合物而修饰，从而透明质酸酶如可溶性透明质酸酶的半衰期增加。本发明提供的修饰的透明质酸降解酶可以单独用于治疗透明质酸相关病症、疾病和失调，或者可以与其它药剂如治疗剂(例如化疗剂)联用。含有透明质酸降解酶和其它药剂的组合物可以分别提供在组合中或者在单个组合物中提供。
在一些实施例中，修饰的透明质酸降解酶被单独给予以治疗透明质酸相关疾病或病症。因此，本发明还提供了含有透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶的组合物，及给予修饰的透明质酸降解酶治疗透明质酸相关基本即与透明质酸酶底物的积累表达相关的基本的方法。例如，这种治疗可以用于在透明质酸相关疾病如富透明质酸癌症中实现降低的组织间隙液压。如本发明所示，用修饰的透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶治疗不仅除去透明质酸和降低组织间隙液压(IFP)，而且可以恢复接触抑制。因此，给予透明质酸降解酶可以通过恢复细胞间和细胞中的接触而实现治疗。如本发明所示，透明质酸降解酶的修饰如PEG化改善了透明质酸降解酶作为肿瘤治疗的有效性。
特别地，全身给予修饰的透明质酸降解酶对于治疗肿瘤包括脑肿瘤是有效的。例如，全身给予修饰的透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶降低富透明质酸肿瘤中的组织间隙液压(IFP)，实现IFP中的剂量依赖性持续降低，例如持续大于1小时、2小时、4小时、8小时、10小时、12小时、16小时、24小时、48修饰和72小时的降低。透明质酸酶可以透明质酸特异性方式实现这种降低。
另外，与在患有透明质酸相关肿瘤的对象中给药后降低透明质酸表达的能力一致，修饰的透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶的全身给予可以实现肿瘤水含量的持续降低，例如保持至少1小时、2小时、4小时、8小时、10小时、12小时、16小时、24小时、48小时或72小时，及透明质酸相关肿瘤中的血管体积的降低，导致肿瘤血管的血管减压(vascular decompression)。因此，本发明进一步提供了含有修饰的透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶的组合物，及实现血管体积持续增加和/或患有透明质酸相关疾病或病症例如透明质酸相关癌症的对象组织中水含量的持续增加。
未修饰的透明质酸降解酶典型具有分钟级别的血液中酶活性的短半衰期，通常低于5分钟。这意味着这种酶通常不适于用于静脉给予和其中它们的作用期间短的其它给予。用于本发明组合物和方法中的透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶通过缀合于聚合物例如sialation部分或PEG化部分(PEG)而修饰。典型地，在给予对象后，聚合物增加透明质酸降解酶如透明质酸酶的半衰期。本发明提供的修饰的透明质酸降解酶(例如通过缀合于聚合物修饰)的酶活性的血浆半衰期通常是或者是大约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、55小时、60小时或更长。在一个实施例中，通过缀合于聚合物修饰的可溶性透明质酸酶与未修饰酶相比实现血浆半衰期增加大于100倍、200倍、250倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍、2000倍。在一个实施例中，血浆中酶的半衰期超过24小时。
由于半衰期差异，修饰的透明质酸酶的活性期间与天然(未通过缀合于聚合物而修饰)的透明质酸酶相比增加。例如，在给予天然(非修饰)可溶性透明质酸酶后，例如，透明质酸可以在24小时内恢复，没有可观察到的变化。在给予已通过缀合于增加透明质酸降解酶半衰期的聚合物(例如PEG)而修饰的透明质酸降解酶如透明质酸酶后，透明质酸表达在给予后24小时、48小时、72小时或更长时间保持降低。
典型地，修饰的缀合于聚合物的透明质酸降解酶与未修饰透明质酸降解酶相比具有降低的比活性。比活性通常降低大约或者2倍、3倍、4倍、5倍或更多。例如，如本文它处所述，命名为rHuPH20的未修饰的PH20的比活性是大约120,000U/mg。PEG化rHuPH20的比活性是大约30,000U/mg。然而，由于增加的半衰期，修饰的透明质酸降解酶显示增加的活性持续时间。因为HA能够被再生，因此具有延长的作用持续时间的酶可以抵消ECM中的HA重合成和沉积。
因此，在本发明提供的方法、组合和组合物中，修饰的透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶以足以保持HA最低血浆水平为至少3U/mL血浆中的酶的量提供。例如，HA的最低血浆水平保持在是或大约是3U/mL-12U/mL或更高的水平，例如大约或在4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、11U/mL、12U/mL、13U/mL、14U/mL、15U/mL、16U/mL、17U/mL、18U/mL、19U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、40U/mL、45U/mL、50U/mL或更高的水平。提供维持至少3U/mL血浆中的酶，酶可以去除与疾病或病症相关的HA，例如肿瘤HA，并且还可以抵消HA重合成。因此，在这种治疗中，透明质酸酶底物不允许积累。对于预后与HA表达相关的疾病或病症如具有恶性固体肿瘤的癌症，病症(例如癌性病症)可以被治疗和/或改善。
因此，本发明的含有缀合于聚合物的透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的组合物可以提供对与积累的透明质酸酶底物相关的疾病或病症的延长的或持续的治疗，例如一或多种症状的延长的或持续的改善。例如，通过缀合于聚合物而修饰的修饰的可溶性透明质酸酶的全身(例如静脉内)给予可以实现在富透明质酸肿瘤组织中的细胞基质中持续的(例如至少24、48和72小时)的透明质酸表达降低。
为了持续修饰的酶在血浆中的作用更长时间，可以实现给药周期。因此，可以根据给药方案连续给予修饰的酶以保持血浆中修饰的透明质酸酶恒定水平任何希望的时间长度。血浆中的水平可以通过测量血浆中修饰的透明质酸酶水平而如本文所述在治疗期间监测。这意味着在治疗期间血浆中存在的透明质酸酶的最低水平不仅足以去除与疾病或病症相关的HA，而且也足以抵消HA重合成。每当血浆中的水平低于至少或大约3U/mL，连续给予可以呈周期性。但是，在每次给予前无需测量血浆水平。通常，为保持透明质酸酶血浆水平为至少3U/mL，含有缀合于聚合物的透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的组合物一个月给予几次，通常一周至少一次，典型地一周大于一次。例如，修饰的透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶一周给予两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次或每日给予。典型地，这种酶一周给予二次。
如本文它处所讨论，维持透明质酸酶血浆水平为至少3U/mL所需的修饰的透明质酸酶的剂量可以凭经验确定。通常，如本文举例，在一个给药周期维持血浆中至少3U/mL所需的单次给予修饰的可溶性透明质酸酶的剂量是或是大约0.02mg/kg(对象)，0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.06mg/kg，0.07mg/kg，0.08mg/kg，0.09mg/kg，0.1mg/kg，0.15mg/kg，0.2mg/kg，0.25mg/kg，0.30mg/kg，0.35mg/kg，0.40mg/kg，0.45mg/kg，0.5mg/kg，0.55mg.kg，0.6mg/kg，0.7mg/kg，0.8mg/kg，0.9mg/kg，1.0mg/kg，1.1mg/kg，1.2mg/kg，1.3mg/kg，1.4mg/kg，1.5mg/kg或更高。典型地，剂量是或是大约0.05mg/kg至是或是大约0.8mg/kg。如下讨论，应理解这种量是在一个给药周期定期(例如一周两次)给予以维持血浆水平一段希望时间长度。假设平均人体重为75kg，具有比活性是或大约是20,000U/mg-60,000U/mg、通常是或是大约35,000U/mg的修饰的可溶性透明质酸酶被给予是或大约60,000U；70,000U；80,000U；90,000U；100,000U；200,000U；300,000U；400,000U；500,000U；600,000U；700,000U；800,000U；900,000U；1,000,000U；1,500,000U；2,000,000U；2,500,000U；3,000,000U；3,500,000U；4,000,000U或更多。例如，可以给予含有是或大约2.0-60mg修饰的透明质酸酶的修饰的透明质酸酶的组合物。本发明还提供了这种组合物。
给药周期时间长度可以凭经验确定，并且与待治疗的疾病、病症严重性、特定患者及治疗医生技能水平内的其它因素相关。用透明质酸酶治疗的时间长度可以是一周、二周、一个月、几个月、一年、几年或更长。例如，修饰的透明质酸酶可以在一年或更长时间内一周给予两次。如果在不存在中断治疗情况下疾病症状持续，则治疗可以持续额外一段时间。在治疗期间，可以监测疾病和/或治疗相关毒性或副作用的迹象。
另外，给药周期可以调整以加入中断治疗期，以便提供暴露于酶的休息期。治疗中断的时间长度可以是预定时间或者可以根据患者如何应答或者根据观察到的副作用而凭经验确定。例如，治疗可以中断一周、二周、一个月或几个月。理解并预期在中断治疗期间，透明质酸酶的血浆水平将下降到3U/mL以下。通常，中断治疗期被固定到患者的给药方案中。例如，一种举例的给药方案是28天治疗周期，前3周一周二次给予修饰的酶，随后一周不给药。在一个实施例中，0.05mg/kg-0.8mg/kg修饰的酶可以一周二次给予三周，随后一周不给药。因此，例如，在28天周期期间，患者可以在第1、4、8、11、15和18天被给药，随后一周中断治疗。如上所述，给药周期可以是任何希望的时间长度。因此，28天给药周期可以重复任何时间长度。根据特异于患者和待治疗疾病的个人考虑采取满足患者需要的给药周期和给药方案属于治疗医生技能水平。
4.组合及其治疗方法
透明质酸降解酶如透明质酸酶短时(temporarily)消化透明质酸，由此促进药剂输送。因此，例如，由于透明质酸降解酶通过降解糖胺聚糖而开放胞间隙的能力，给予透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶允许分子扩散，由此改善共配制的或共给药的分子或者透明质酸酶给予后给予的分子的生物利用度、药动学和/或药效学特征。在一些实施例中，使用透明质酸酶的分子的生物利用度是不使用透明质酸酶给予的分子的生物利用度的70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。典型地，生物利用度大约90％。另外，如上讨论，透明质酸降解酶包括修饰的透明质酸降解酶可以通过其它机理治疗肿瘤。
因此，在一个实施例中，透明质酸相关病症、疾病或失调的治疗包括给予含有修饰的透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶的组合物，及一或多种额外的治疗所述疾病或失调的药剂和/或治疗，例如抗癌剂如化疗、用于治疗癌症的抗体、载体或核酸。在这个实施例中，第二种治疗或药剂可以分别给予或与透明质酸酶一起给予。例如，修饰的透明质酸降解酶在额外的药剂或治疗之前、之后或与其一起给予。因此，透明质酸降解酶特别是修饰的透明质酸降解酶如PEG化可溶性透明质酸酶可以作为治疗剂单独给予或者与其它治疗剂联合给予。透明质酸降解酶如透明质酸酶给予可以促进治疗剂输送，例如经静脉内、皮下和/或肿瘤内的输送，特别是用于输送治疗或药剂至具有胞外透明质酸高表达的组织，例如显示HALO(富含蛋白聚糖包括透明质酸的细胞周基质)形成的组织。通过透明质酸降解酶如透明质酸酶降解胞外基质中的透明质酸的能力，透明质酸降解酶促进治疗剂给予到希望的位置。
典型地，第二种药剂和修饰的透明质酸降解酶例如修饰的透明质酸酶被分别给予。例如，额外的药剂或治疗可以同时、依次或以任何次序间歇给予。典型地，修饰的透明质酸降解酶如透明质酸酶在额外药剂和/或治疗之前给予，例如在额外药剂或治疗之前至少0.5分钟、1分钟、5分钟、15分钟或30分钟、或者1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、72小时或更多小时。在一些实施例中，由于修饰的酶的长半衰期及其作用时间，修饰的酶可以在额外药剂或治疗给予之前至少24小时或大约24小时、至少48修饰或大约48小时或至少72小时或大约72小时或更长时间给予。
第二种药剂的给予频率可以凭经验确定。给予频率的确定属于本领域医生水平并且依赖于各种因素，包括治疗的特定疾病或病症、疾病严重性、被治疗的患者及修饰的酶的给药周期。通常，第二种药剂例如抗癌剂或治疗(例如化疗剂)的给予时机典型地与修饰的酶的给药周期相关。例如，第二种药剂可以在给以周期中修饰的酶的第一次给予之后和/或周期中任一或多个后续给予之后给予。在其它实施例中，第二种药剂在周期中修饰的酶的每一次后续给予之后、在每隔一次周期中修饰的酶的其它后续给予之后给予，或者在修饰的酶的给药周期期间一周一次、每两周一次、每三周一次或一月一次。在一些实施例中，修饰的酶的每个给药周期仅给予一次第二种药剂。在另外的实施例中，第二种药剂在给药周期之间间歇给予。例如，在第一个给药周期期间不给予第二种药剂，但是在第二个周期期间给予，随后跳过第三个周期并在第四个周期期间再给予…或者其任何变化形式。
下述章节描述了含有修饰的透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶和/或其它药剂的举例性组合物和复合物，制备它们的方法，及使用它们治疗透明质酸相关疾病、失调和病症的方法。
C.含有透明质酸降解酶的组合物
本发明提供了含有修饰的透明质酸降解酶特别是可溶性透明质酸酶的组合物及使用这种组合物给药治疗透明质酸相关疾病或病症的方法。本发明提供的组合物中含有的透明质酸降解酶通过缀合于聚合物(例如PEG)而修饰。本发明可以使用任何这种修饰的透明质酸降解酶，只要酶显示对透明质酸的酶活性(例如透明质酸酶活性)。在一些情况中，本发明方法、组合物和组合中使用的修饰的透明质酸降解酶与未修饰的透明质酸降解酶(例如未缀合于聚合物)相比显示增加的透明质酸酶活性。通常，如本文它处所讨论，修饰的透明质酸降解酶与未修饰的透明质酸降解酶相比显示增加的半衰期。
透明质酸(Hyaluronan，也称为hyaluronic acid或hyaluronate)是非硫酸化糖胺聚糖，广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织。透明质酸是胞外基质的关键成分和组织间隙屏障的主要组分。通过催化透明质酸水解，透明质酸降解酶降低透明质酸的粘度，由此增加组织通透性及增加肠胃外给予的流体的吸收速率。由此，透明质酸降解酶如透明质酸酶已用作例如涂布或分散剂，与其它制剂、药物和蛋白质联合以增强它们的分散和输送。
透明质酸降解酶通过裂解透明质酸聚合物而作用降解透明质酸，透明质酸聚合物由重复的经交替β-1→4和β-1→3糖苷键连接起来的D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)二糖单位组成。透明质酸链可以达到大约25,000个二糖重复或长度更长，透明质酸聚合物在体内的大小可以从大约5,000到20,000,000Da。因此，用于本发明方法的透明质酸降解酶包括具有催化透明质酸二糖链或聚合物裂解的能力的任何酶。在一些实施例中，透明质酸降解酶裂解透明质酸链或聚合物中的β-1→4糖苷键。在其它实施例中，透明质酸降解酶催化透明质酸链或聚合物中的β-1→3糖苷键的裂解。
因此，透明质酸降解酶如透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族，透明质酸是胞外基质的关键成分和组织间隙屏障的主要组分。通过催化组织间隙屏障的主要组分透明质酸水解，透明质酸降解酶降低透明质酸的粘度，由此增加组织通透性。由此，透明质酸降解酶如透明质酸酶已用作例如涂布或分散剂，与其它制剂、药物和蛋白质联合以增强它们的分散和输送。透明质酸降解酶还用作佐剂以增加用于皮下灌注术(皮下液体给予)的其它注射药物的吸收和分散，及作为皮下尿路造影术的添加剂用于改善不透射线制剂的吸收。透明质酸降解酶例如透明质酸酶可以用于眼科程序中，例如在眼科手术前局部麻醉中的球周和Tenon下阻断(peribulbar and sub-Tenon’s block)。透明质酸酶还可以用于其它治疗性及化妆应用，例如促进整容手术如眼睑成形术和拉皮中的运动不能。
各种形式的透明质酸降解酶包括透明质酸酶已被制备并批准用于包括人的对象中的治疗性应用。本发明的组合物和方法可以经这些及其它应用用于治疗透明质酸相关疾病或病症。例如，动物来源的透明质酸酶制剂包括Vitrase
Figure BPA00001277192100521
(ISTA Pharmaceuticals)，其是一种纯化的绵羊睾丸透明质酸酶，及Amphadase
Figure BPA00001277192100522
(Amphastar Pharmaceuticals)，其是牛睾丸透明质酸酶。Hylenex
Figure BPA00001277192100523
(Halozyme Therapeutics)是由含有编码可溶性rHuPH20的核酸的基因工程中华仓鼠卵巢(CHO)细胞生产的人重组透明质酸酶。
本发明提供的组合物和方法中的透明质酸降解酶的例子是可溶性透明质酸酶。其它的举例性透明质酸降解酶包括但不限于具有裂解透明质酸能力的特定的软骨素酶和裂合酶。
如下所述，透明质酸降解酶以膜结合或可溶形式存在。为本发明目的，可溶性透明质酸降解酶提供用于本发明方法、用途、组合物或组合中。因此，当透明质酸降解酶包括糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚和/或另外方式膜锚定或不溶时，透明质酸降解酶以可溶形式提供。因此，透明质酸降解酶包括截短的变体，例如被截短以除去所有或部分GPI锚。本发明提供的透明质酸降解酶还包括可溶性透明质酸降解酶的等位基因或物种变体或其它变体。例如，透明质酸降解酶在其一级序列中可以含有一或多个变异，如氨基酸取代、添加和/或缺失。透明质酸降解酶的变体与不含变异的透明质酸降解酶相比通常显示至少或大约60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列相同性。任何变异可以包括在透明质酸降解酶中用于本发明目的，置于酶保留透明质酸酶活性，如至少或大约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高的不含变异的透明质酸降解酶的活性(如通过本领域熟知并且在本文描述的体外和/或体内测定测得)。
当本发明方法和用途描述可溶性透明质酸酶的用途时，相应地可以使用任何透明质酸降解酶，通常是可溶性透明质酸降解酶。
1.透明质酸酶
透明质酸酶是一大家族透明质酸降解酶的成员。有三种通用类别的透明质酸酶：哺乳动物型透明质酸酶，细菌透明质酸酶，以及来自水蛭、其它寄生虫以及甲壳动物的透明质酸酶。这种酶可以用于本发明组合物、组合和方法中。
a.哺乳动物型透明质酸酶
哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)是endo-β-N-乙酰基-己糖胺酶，其使透明质酸的β1→4糖苷键水解为各种寡糖长度，如四糖和六糖。这些酶具有水解和转糖苷酶活性，且可以降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)，通常为C4-S和C6-S。这种类型的透明质酸酶包括但不限于来自如下来源的透明质酸酶：牛(cows，bovine)(SEQ ID NO：10、11和64及BH55(美国专利号5,747,027和5,827,721))，绵羊(ovis aries)(SEQ ID NO：26、27、63和64)，黄蜂(SEQ ID NO：12和13)、蜜蜂(SEQ ID NO：14)、白脸马蜂(SEQ ID NO：15)、胡蜂(SEQ ID NO：16)、小鼠(SEQ ID NO：17-19、31)、猪(SEQ ID NO：20-21)、大鼠(SEQ ID NO：22-24、30)、兔(SEQ ID NO：25)、猩猩(SEQ ID NO：28)、猕猴(cynomolgus monkey)(SEQ ID NO：29)、豚鼠(SEQ ID NO：32)和人透明质酸酶。本发明提供的组合物、组合和方法中的透明质酸酶的例子是可溶性透明质酸酶。
哺乳动物透明质酸酶可进一步再分为如下类型：中性活性，主要在睾丸提取物中发现；酸性活性，主要在器官如肝中发现。举例的中性活性的透明质酸酶包括PH20，包括但不限于衍生自不同物种如绵羊(SEQ ID NO：27)、牛(SEQ ID NO：11)和人(SEQ ID NO：1)的PH20。人PH20(也称作SPAM1或者精子表面蛋白PH20)，通常通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着在浆膜。其天然参与精子-卵子粘附，并且通过消化透明质酸有助于精子穿透卵丘细胞层。
除了人PH20(也称作SPAM1)之外，在人基因组中还鉴别了五个透明质酸酶-样基因，即HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和HYALP1。HYALP1是假基因，HYAL3(SEQ ID NO：38)未示出对于任何已知底物具有酶活性。HYAL4(SEQ ID NO：39所示前体多肽)是软骨素酶，对于透明质酸呈现出很低活性。HYAL1(SEQ ID NO：36所示前体多肽)是原型酸活性酶，PH20(SEQ ID NO：1所示前体多肽)是原型中性活性酶。酸活性透明质酸酶，如HYAL1和HYAL2(SEQ ID NO：37所示前体多肽)在中性pH(即pH 7)下通常没有催化活性。例如，HYAL1在体外在pH 4.5以上具有很低的催化活性(Frost et al.(1997)Anal.Biochemistry，251：263-269)。HYAL2是酸活性酶，在体外具有极低比活性。所述透明质酸酶样酶也可以通过如下特点而鉴定：其通常通过糖基磷脂酰肌醇锚附着在浆膜，如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova，et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA.100(8)：4580-5)，以及其通常是可溶的，如人HYAL1(Frost et al，(1997)Biochem Biophys Res Commun.236(1)：10-5)。
PH20
PH20与其它哺乳动物透明质酸酶一样，是endo-β-N-乙酰基-己糖胺酶，其使透明质酸的β1→4糖苷键水解为各种寡糖长度，如四糖和六糖。它们具有水解和转糖苷酶活性，且可以降解透明质酸和硫酸软骨素如C4-S和C6-S。PH20天然参与精子-卵子粘附，并且通过消化透明质酸有助于精子穿透卵丘细胞层。PH20位于精子表面及在溶酶体衍生的顶体中，在此其结合于顶体内膜。浆膜PH20仅在中性pH具有透明质酸酶活性，而顶体内膜PH20在中性及酸性pH均具有活性。除了是透明质酸酶之外，PH20还看起来是HA诱导的细胞信号传导的受体，以及围绕卵母细胞的透明带的受体。
举例性的PH20蛋白包括但不限于人(SEQ ID NO：1所示前体多肽，SEQ ID NO：2所示成熟多肽)、黑猩猩(SEQ ID NO：101)、猕猴(Rhesus monkey)(SEQ ID NO：102)、牛(SEQ ID NO：11和64)、兔(SEQ ID NO：25)、绵羊PH20(SEQ ID NO：27、63和65)、猕猴(cynomolgus monkey)、豚鼠(SEQID NO：32)、大鼠(SEQ ID NO：30)和小鼠(SEQ ID NO：31)PH20多肽。
牛PH20是具有553个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：11)。牛PH20与人PH20的序列对比示出仅微弱同源，由于在牛多肽中没有GPI锚而在从第470位氨基酸至相应羧基末端存在多个缺口(见例如Frost GI(2007)Expert Opin.Drug.Deliv.4：427-440)。事实上，在除了人之外的许多其它PH20中，预示无明显的GPI锚。因此，从绵羊和牛中产生的PH20多肽以可溶形式存在。尽管牛PH20呈现出与浆膜的附着非常松散，但是其不是通过磷脂酶敏感性锚锚定(Lalancette et al.(2001)Biol Reprod.65(2)：628-36)。牛透明质酸酶的这种独特性质使得可以将提取的可溶性牛睾丸透明质酸酶用于临床应用(WydaseHyalase
Figure BPA00001277192100552
)。
人PH20 mRNA转录物正常被翻译产生具有509个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：1)，其含有在N-末端的具有35个氨基酸的信号序列(氨基酸残基位置1-35)以及在C末端的具有19个氨基酸的GPI锚附着信号序列(氨基酸残基位置491-509)。因此，成熟的PH20是具有474个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO：2所示。在转运前体多肽至ER并除去信号肽之后，C末端GPI附着信号肽被裂解以促进GPI锚在相应于SEQ ID NO：1所示前体多肽的位置490的氨基酸位置共价附着于新形成的C末端氨基酸。因此，产生具有SEQID NO：2所示氨基酸序列的474个氨基酸的GPI锚定的成熟多肽。
人PH20在中性和酸性pH均显示透明质酸酶活性。在一个方面中，人PH20是原型中性活性透明质酸酶，其通常通过GPI锚锁定于浆膜。在另一个方面中，PH20在顶体内膜上表达，在此其在中性和酸性pH均具有透明质酸酶活性。看起来PH20含有在多肽不同区域的两个催化位点：肽1和肽3区(Cherr et al.，(2001)Matrix Biology 20：515-525)。有证据提示相应于SEQ IDNO：2所示成熟多肽的氨基酸位置107-137及SEQ ID NO：1的前体多肽的位置142-172的PH20的肽1区是在中性pH的酶活性所需的。在这一区域内的位置111和113(相应于SEQ ID NO：2所示成熟多肽)的氨基酸看起来对于活性是重要的，因为通过氨基酸置换进行诱变导致与野生型PH20相比分别为具有3％透明质酸酶活性或不可检测到透明质酸酶活性的PH20多肽(Arming et al.，(1997)Eur.J.Biochem.247：810-814)。
相应于SEQ ID NO：2所示成熟多肽的氨基酸位置242-262及SEQ IDNO：1的前体多肽的位置277-297的肽3区看起来对于在酸性pH的酶活性是重要的。在这个区域内，成熟PH20多肽的氨基酸位置249和252看起来对活性是关键的，诱变任一个均导致产生基本上丧失活性的多肽(Arming et al.，(1997)Eur.J.Biochem.247：810-814)。
除了催化位点之外，PH20还含有透明质酸结合位点。实验证据提示这个位点位于相应于SEQ ID NO：1的前体多肽的氨基酸位置205-235及SEQ IDNO：2所示成熟多肽的位置170-200的肽2区内。这个区域在透明质酸酶中高度保守并且类似于肝素结合基序。在位置176(相应于SEQ ID NO：2所示成熟PH20多肽)的精氨酸残基的突变为甘氨酸导致具有仅大约1％野生型多肽透明质酸酶活性的多肽(Arming et al.，(1997)Eur.J.Biochem.247：810-814)。
在SEQ ID NO：1例证的多肽的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490，人PH20有七个潜在的N-链接的糖基化位点。因为SEQ IDNO：1的氨基酸36-464看起来含有最低活性人PH20透明质酸酶结构域，N-连接的糖基化位点N-490不是合适透明质酸酶活性所需的。人PH20中有6个二硫键。SEQ ID NO：1例证的多肽的半胱氨酸残基C60和C351之间及C224和C238之间(分别相应于SEQ ID NO：2所示成熟多肽的残基C25和C316，以及C189和C203)的两个二硫键。另外四个二硫键在SEQ ID NO：1例证的多肽的半胱氨酸残基C376和C387之间；在C381和C435之间；在C437和C443之间；在C458和C464之间(分别相应于SEQ ID NO：2所示成熟多肽的残基C341和C352之间；C402和C408之间；C346和C400之间；及C423和C429之间)形成。
b.细菌透明质酸酶
细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1 or EC 4.2.99.1)降解透明质酸，及不同程度降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素。分离自细菌的透明质酸裂合酶在它们的作用方式方面不同于透明质酸酶(其它来源，例如透明质酸氨基葡糖苷酶(hyaluronoglucosaminidases)，EC 3.2.1.35)。它们是催化透明质酸中N-乙酰-β-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸残基之间的β1→4-糖苷键的消除反应而非水解的内-β-N-乙酰氨基己糖苷酶，产生3-(4-脱氧-β-D-gluc-4-enuronosyl)-N-乙酰-D-葡糖胺四糖和六糖，及二糖终产物。反应导致在其非还原末端具有不饱和己糖醛酸残基的寡糖形成。
用于本发明组合物、组合和方法中的来自细菌的透明质酸酶的例子包括但不限于微生物中的透明质酸降解酶，包括Arthrobacter，Bdellovibrio，Clostridium，Micrococcus，Streptococcus，Peptococcus，Propionibacterium，Bacteroides，和Streptomyces的菌株。这种酶的特定例子包括但不限于Arthrobacter sp.(菌株FB24)(SEQ ID NO：67)，Bdellovibrio bacteriovorus(SEQ ID NO：68)，Propionibacterium acnes(SEQ ID NO：69)，Streptococcus agalactiae((SEQ ID NO：70)；18RS21(SEQ ID NO：71)；血清型Ia(SEQ ID NO：72)；血清型III(SEQ ID NO：73)，Staphylococcus aureus(菌株COL(SEQ ID NO：74)；菌株MRSA252(SEQ ID NOS：75和76)；菌株MSSA476(SEQ ID NO：77)；菌株NCTC 8325(SEQ ID NO：78)；菌株bovine RF122(SEQ ID NOS：79和80)；菌株USA300(SEQ ID NO：81)，Streptococcus pneumoniae((SEQ ID NO：82)；菌株ATCC BAA-255/R6(SEQ ID NO：83)；血清型2，菌株D39/NCTC 7466(SEQ ID NO：84)，Streptococcus pyogenes(血清型M1)(SEQ ID NO：85)；血清型M2，菌株MGAS10270(SEQ ID NO：86)；血清型M4，菌株MGAS10750(SEQ ID NO：87)；血清型M6(SEQ ID NO：88)；血清型M12，菌株MGAS2096(SEQ ID NOS：89和90)；血清型M12，菌株MGAS9429(SEQ ID NO：91)；血清型M28(SEQ ID NO：92)；Streptococcus suis(SEQ ID NOS：93-95)；Vibrio fischeri(菌株ATCC 700601/ES114(SEQ ID NO：96))，及Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其特异于透明质酸并且不裂解软骨素或硫酸软骨素(Ohya，T.and Kaneko，Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta 198：607).
c.来自水蛭、其它寄生虫和甲壳纲动物的透明质酸酶
来自水蛭、其它寄生虫和甲壳纲动物的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)是生成四糖和己糖终产物的内-β-葡糖醛酸糖苷酶。这些酶催化透明质酸中β-D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1→3-键的水解。来自水蛭的举例的透明质酸酶包括但不限于来自如下的透明质酸酶：Hirudinidae(例如Hirudo medicinalis)，Erpobdellidae(例如Nephelopsis obscura和Erpobdella punctata，)，Glossiphoniidae(例如Desserobdella picta，Helobdella stagnalis，Glossiphonia complanata，Placobdella ornata and Theromyzon sp.)和Haemopidae(Haemopis marmorata)(Hovingh et al.(1999)Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.124(3)：319-26)。具有与水蛭透明质酸酶相同作用机制的来自细菌的举例的透明质酸酶是来自蓝细菌，Synechococcus sp.的透明质酸酶(菌株RCC307，SEQ ID NO：97)。
2.其它透明质酸降解酶
除了透明质酸酶家族之外，其它透明质酸降解酶可以用于本发明组合物、组合和方法中。例如，可以采用具有裂解透明质酸能力的酶，包括特定软骨素酶和裂合酶。能降解透明质酸的举例的软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂合酶(也称为软骨素酶ABC)，软骨素AC裂合酶(也称为硫酸软骨素裂合酶或硫酸软骨素eliminase)和软骨素C裂合酶。生产和纯化用于本发明组合物、组合和方法中的这种酶的方法是本领域已知的(例如U.S.Patent No.6,054,569；Yamagata，et al.(1968)J.Biol.Chem.243(7)：1523-1535；Yang et al.(1985)J.Biol.Chem.160(30)：1849-1857)。
软骨素ABC裂合酶含有两种酶，即硫酸软骨素-ABC内裂合酶(EC4.2.2.20)和硫酸软骨素-ABC外裂合酶(EC 4.2.2.21)(Hamai et al.(1997)J Biol Chem.272(14)：9123-30)，它们降解各种硫酸软骨素和硫酸皮肤素类型的糖胺聚糖。硫酸软骨素，硫酸软骨素蛋白聚糖和硫酸皮肤素是硫酸软骨素-ABC内裂合酶的优选底物，但是该酶还可以以较低速率作用于透明质酸。硫酸软骨素-ABC内裂合酶降解各种硫酸软骨素和硫酸皮肤素类型的糖胺聚糖，产生不同大小的Δ4-不饱和寡糖的混合物，它们最终被降解为Δ4不饱和四糖和二糖。硫酸软骨素-ABC外裂合酶具有相同底物特异性，但是从聚合的硫酸软骨素及它们的由硫酸软骨素-ABC内裂合酶产生的寡糖片段除去二糖残基(Hamai，A.et al.(1997)J.Biol.Chem.272：9123-9130)。举例的硫酸软骨素-ABC内裂合酶和硫酸软骨素-ABC外裂合酶包括但不限于来自Proteus vulgaris和Flavobacterium heparinum(Proteus vulgaris硫酸软骨素-ABC内裂合酶示于SEQ ID NO：98(Sato et al.(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1)：39-46)的那些。
软骨素AC裂合酶(EC 4.2.2.5)对硫酸软骨素A和C、软骨素和透明质酸有活性，但是对硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)无活性。来自细菌的举例的软骨素酶AC酶包括但不限于来自Flavobacterium heparinum和Victivallis vadensis的那些酶，分别示于SEQ ID NO：99和100，及来自Arthrobacter aurescens的那些酶(Tkalec et al.(2000)Applied and Environmental Microbiology 66(1)：29-35；Ernst et al.(1995)Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5)：387-444)。
软骨素酶C裂解硫酸软骨素C，产生四糖加不饱和6-硫酸化二糖(delta Di-6S)。其还裂解透明质酸，产生不饱和未硫酸化二糖(delta Di-OS)。来自细菌的举例的软骨素酶C酶包括但不限于来自Streptococcus和Flavobacterium的那些(Hibi et al.(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2)：121-4；Michelacci et al.(1976)J.Biol.Chem.251：1154-8；Tsuda et al.(1999)Eur.J.Biochem.262：127-133)。
3.可溶性透明质酸降解酶
本发明的组合物、组合、用途和方法中提供的是可溶性透明质酸降解酶，包括修饰的可溶性透明质酸酶。可溶性透明质酸降解酶包括以可溶形式存在的任何透明质酸降解酶，包括但不限于可溶性透明质酸酶，包括非人可溶性透明质酸酶，包括非人动物可溶性透明质酸酶，细菌可溶性透明质酸酶和人透明质酸酶，Hyal1、牛PH20和绵羊PH20，其等位基因变体及其它变体。例如，可溶性透明质酸降解酶包括已经修饰为可溶的任何透明质酸降解酶。例如，含有GPI锚的透明质酸降解酶可以通过截短和除去全部或部分GPI锚而制成可溶的。在一个实施例中，正常通过GPI锚锚定膜的人PH20，可以通过截短或者除去在C末端的全部或者部分GPI锚而制成可溶的。
可溶性透明质酸降解酶还包括中性活性的和酸活性的透明质酸酶。根据各种因素，例如但不限于给药后和/或给药部位希望的酶活性水平，可以选择中性活性和酸性活性透明质酸酶。在一个特定实施例中，用于本发明的组合物、组合和方法中的透明质酸降解酶是可溶性中性活性透明质酸酶。
举例的可溶性透明质酸酶是来自任何物种的PH20，如SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30、31、63-65和101-102任一所示，或者是其缺乏全部或者部分C-末端GPI锚的截短形式，只要所述透明质酸酶是可溶的且保留透明质酸酶活性即可。可溶性透明质酸酶还包括SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30、31、63-65和101-102任一所示酶或者其截短形式的等位基因变体或者其他变体。本领域技术人员已知等位基因变体及其它变体，包括与SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30、31、63-65和101-102任一所示酶或者其截短形式具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更高的序列相同性的多肽。氨基酸变体包括保守和非保守突变。应理解对于透明质酸酶活性是重要的或者另外所需的残基，如上述及本领域技术人员已知的任何残基，通常是不变的并且不能改变。这些包括例如活性位点残基。因此，例如，人PH20多肽或其可溶形式的氨基酸残基111、113和176(相应于SEQ ID NO：2所示成熟PH20多肽的残基)通常是不变的且不改变。赋予糖基化和正确折叠所需的二硫键形成的其它残基也可以是不变的。
在一些情况中，可溶性透明质酸降解酶正常是GPI锚定的(如人PH20)并且通过C末端截短而变成可溶。这种截短可以除去全部GPI锚附着信号序列，或者可以除去仅一些GPI锚附着信号序列。但是，所得多肽是可溶的。在其中可溶性透明质酸降解酶保留一部分GPI锚附着信号序列的情况中，可以保留GPI锚附着信号序列中的1、2、3、4、5、6、7或更多个氨基酸残基，只要多肽是可溶的即可。含有一或多个GPI锚氨基酸的多肽称为扩展的可溶性透明质酸降解酶(extended soluble透明质酸降解酶)。本领域技术人员使用本领域公知方法能确定多肽是否是GPI锚定的。这种方法包括但不限于使用已知算法预测GPI锚附着信号序列和ω-位点的存在及位置，及在用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)或D(PI-PLD)进行消化之前和之后进行溶解性分析。
扩展的可溶性透明质酸降解酶可以通过对任何天然GPI锚定的透明质酸降解酶进行C末端截短而产生，从而得到的多肽是可溶的并且含有GPI锚附着信号序列的一或多个氨基酸残基。C末端截短的但保留部分GPI锚附着信号序列的举例的扩展的可溶性透明质酸降解酶包括但不限于灵长类来源的扩展的可溶PH20(esPH20)多肽，例如人和黑猩猩esPH20多肽。例如，esPH20多肽可以通过对SEQ ID NO：1、2或101所示任何成熟或前体多肽或其等位基因或其它变体包括其活性片段进行C末端截短而制备其中所得的多肽是可溶的并且含有GPI锚附着信号序列的一或多个氨基酸残基。等位基因变体和其它变体是本领域技术人员已知的并且包括与SEQ ID NO：1或2任一具有60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％或更高序列相同性的多肽。本发明提供的esPH20多肽与野生型多肽如具有SEQ ID NO：1、2或101所示序列的多肽相比，C末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸，条件是所得esPH20多肽是可溶的并保留来自GPI锚附着信号序列的一或多个氨基酸残基。
典型地，在本发明的组合物、组合和方法中使用可溶性人透明质酸降解酶，如可溶性人PH20。尽管可以使用其它动物的透明质酸降解酶如PH20，但是这种制备物具有潜在免疫原性，因为其是动物蛋白。例如，大部分患者证实继发于摄取的食物的优先致敏作用，因为这些是动物蛋白，所有患者均具有随后致敏作用的危险。因此，非人制备物可能不适于长期使用。如果需要非人制备物，则本发明预期这种多肽可以制备为具有降低的免疫原性。这种修饰在本领域技术人员的技术水平范围内，并且可以包括例如除去和/或置换分子上的一或多个抗原性表位。
本发明的方法中使用的透明质酸降解酶，包括透明质酸酶(例如PH20)，可以重组产生或者从天然来源例如从睾丸提取物中纯化或者部分纯化。生产重组蛋白包括重组透明质酸降解酶的方法在本文它处提供并且是本领域公知的。
a.可溶性人PH20
举例的可溶性透明质酸酶是可溶性人PH20。可溶形式的重组人PH20已经产生，且可用于本发明描述的组合物、组合和方法中。这种可溶形式的PH20的产生在美国公开的专利申请US20040268425；US 20050260186 andUS20060104968以及在下文的实施例中描述。例如，可溶性PH20多肽，包括C末端截短的变体多肽，其包括SEQ ID NO：1中的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1中包括的氨基酸序列具有至少91％，92％，93％，94％，95％，95％，97％，98％的序列相同性，保留透明质酸酶活性并且是可溶的。这些多肽中包括的是完全缺乏全部或部分GPI锚附着信号序列的可溶性PH20多肽。还包括含有GPI锚的至少一个氨基酸的扩展的可溶性PH20(esPH20)多肽。因此，这些多肽不是具有共价附着于ER的蛋白质的C末端的GPI锚并锚定于浆膜胞外小叶，而是分泌和可溶的。C末端截短的PH20多肽可以是与全长野生型多肽如具有SEQ ID NO：1或2的序列的全长野生型多肽或其等位基因或物种变体或其它变体相比C末端被截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60个或更多个氨基酸。
本发明通过的举例的C末端截短的人PH20多肽包括具有C末端截短以产生含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497或其等位基因或物种变体的相应位置的多肽的任何多肽。当在哺乳动物细胞中表达时，加工过程中35个氨基酸的N末端信号序列被裂解，蛋白质的成熟形式被分泌。因此，举例的成熟C末端截短的可溶性PH20多肽可以含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸36至465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497或其等位基因或物种变体的相应位置。表2提供了举例的C末端截短的PH20多肽包括C末端截短的可溶性PH20多肽的非限制性例子。在下表2中，提供了前体和成熟多肽的长度(以氨基酸表示)和描述C末端截短的PH20蛋白的前体和成熟多肽的举例的氨基酸序列的序列标识符(SEQ ID NO)。野生型PH20多肽也包括在表2中用于对比。
表2.举例的C末端截短的PH20多肽
Figure BPA00001277192100621
  SPAM1-PPME   474   118   439   162
  SPAM1-KPPM   473   119   438   163
  SPAM1-LKPP   472   120   437   164
  SPAM1-FLKP   471   121   436   165
  SPAM1-AFLK   470   122   435   166
  SPAM1-DAFL   469   123   434   167
  SPAM1-IDAF   468   124   433   168
  SPAM1-CIDA   467   40   432   47
  SPAM1-VCID   466   125   431   169
  SPAM1-GVCI   465   126   430   170
可溶形式包括但不限于具有C-末端截短的任何形式，以产生含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸467、477、478、479、480、481、482和483的多肽。当在哺乳动物细胞中表达时，具有35个氨基酸的N-末端信号序列在加工期间被裂解，分泌成熟形式的蛋白质。因此，成熟的可溶性多肽含有SEQ ID NO：1的36至467、477、478、479、480、481、482和483位氨基酸。终止于氨基酸位置477至483(相应于SEQ ID NO：1所示前体多肽)的缺失突变体呈现出与全长GPI-锚定形式相比更高的分泌的透明质酸酶活性。因此，举例的可溶性透明质酸酶是SEQ ID NO：4-9任一所示的长度为442、443、444、445、446或者447个氨基酸的可溶性人PH20多肽或者其等位基因或者种变体或者其它变体。
通常地，可溶形式的PH20是使用蛋白质表达系统产生的，其便于适当N-糖基化，以保证多肽保留活性，因为糖基化对于透明质酸酶的催化活性和稳定性非常重要。这种细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如DG44CHO细胞)。
b.rHuPH20
重组的可溶形式的人PH20已经产生，且可以用于本发明组合物、组合和方法中。这种可溶形式重组人PH20的产生在美国公开的专利申请US20040268425；US 20050260186和US20060104968以及在下文的实施例2-6中描述。举例的这种多肽是从编码1-482位氨基酸(SEQ ID NO：3所示)的核酸分子中产生的那些多肽。这种举例核酸分子如SEQ ID NO：49所示。翻译后加工除去了具有35个氨基酸的信号序列，留下具有447个氨基酸的可溶性重组人PH20(SEQ ID NO：4)。由于在培养基中产生，因此在C末端有异质性，从而命名为rHuPH20的产物包括混合物，其可以包括各种丰度的SEQ ID NO：4-9之任一或多个。典型地，rHuPH20在便于正确N-糖基化以保留活性的细胞如CHO细胞(例如DG44 CHO细胞)中产生。
4.透明质酸降解酶的糖基化
一些透明质酸降解酶包括透明质酸酶的糖基化包括N-和O-联糖基化，可以对于它们的催化活性和稳定性是重要的。尽管改变修饰糖蛋白的聚糖的类型可以对蛋白质的抗原性、结构折叠、溶解性和稳定性有巨大影响，但是据信大多数酶不需要糖基化来实现最佳酶活性。对于一些透明质酸酶，除去N-联糖基化可以导致透明质酸酶活性的近乎完全失活。因此，对这种透明质酸酶，N-联聚糖的存在对于产生活性酶是关键的。
N-联寡糖分成几种主要类型(甘露寡糖(oligomannose)、复杂、杂种、硫酸化)，所有均具有经Asn残基的酰胺氮附着的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心，所述Asn在-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列内(其中Xaa不是Pro)。针对凝固蛋白C已报道在-Asn-Xaa-Cys位点的糖基化。在一些情况中，透明质酸降解酶如透明质酸酶可以含有N-糖苷键和O-糖苷键。例如，PH20具有O-联寡糖和N-联寡糖。在SEQ ID NO：1例证的人PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490有七个潜在的N-链接的糖基化位点。如上所述，在N490的N联糖基化不是透明质酸酶活性所需的。
在一些实施例中，用于本发明的组合物、组合和/或方法中的透明质酸降解酶在一个或所有糖基化位点糖基化。例如，对于人PH20或其可溶形式，相应于SEQ ID NO：1的氨基酸N82，N166，N235，N254，N368和N393的N-糖基化位点的2、3、4、5或6个位点糖基化。在一些实施例中，透明质酸降解酶在一或多个天然糖基化位点糖基化。在其它实施例中，透明质酸降解酶在一或多个非天然糖基化位点被修饰是赋予多肽在一或多个额外位点的糖基化。在这种例子中，额外糖部分的附着可以增强分子的药动学性质，如改善的半衰期和/或改善的活性。
在其它实施例中，用于本发明的组合物、组合和/或方法中的透明质酸降解酶部分去糖基化(或N-部分糖基化多肽)。例如，保留完全糖基化透明质酸酶的全部或部分透明质酸酶活性的部分去糖基化可溶性PH20多肽可以用于本发明的组合物、组合和/或方法中。举例的部分去糖基化的透明质酸酶包括来自任何物种的部分去糖基化的PH20多肽的可溶形式，如SEQ ID NO：1、2、11、25、27、29、30、31、32、63、65、101和102所示任一种，或其等位基因变体、截短变体或其它变体。这种变体是本领域技术人员已知的，包括与SEQ ID NO：1、2、11、25、27、29、30、31、32、63、65、101和102的任一或其截短形式有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高序列相同性的多肽。本发明提供的部分去糖基化透明质酸酶还包括杂种、融合和嵌合的部分去糖基化透明质酸酶及部分去糖基化透明质酸酶缀合物。
糖苷酶或糖苷水解酶是催化糖苷键水解产生两个较小糖的酶。脊椎动物中的主要N-聚糖类型包括高甘露糖聚糖、杂种聚糖(hybrid glycans)和复杂聚糖(complex glycans)。有一些糖苷酶导致仅部分蛋白质去糖基化，包括：EndoF1，其裂解高甘露糖及杂种型聚糖；EndoF2，其裂解双触角复合型(biantennary complex type)聚糖；EndoF3，其裂解双触角和更分支化的复杂聚糖；EndoH，其裂解高甘露糖和杂种型聚糖。用一或全部这些糖苷酶处理透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶如可溶性PH20可以产生仅部分去糖基化，因此保留透明质酸酶活性。
部分去糖基化透明质酸降解酶如部分去糖基化可溶性透明质酸酶可以通过用一或多种糖苷酶消化产生，所述糖苷酶通常是不除去所有N-聚糖而是仅使蛋白质部分去糖基化的糖苷酶。例如，用上述糖苷酶(例如EndoF1，EndoF2和/或EndoF3)的一种或全部处理PH20(例如称为rHuPH20的重组PH20)导致部分去糖基化。这些部分去糖基化的PH20多肽可以显示与完全糖基化的多肽相当的透明质酸酶活性。相反，用裂解所有N-聚糖的糖苷酶PNGaseF处理PH20导致所有N-聚糖的完全除去，由此使PH20无酶活性。因此，尽管全部N-联糖基化位点(例如在SEQ ID NO：1例证的人PH20的氨基酸N82，N166，N235，N254，N368和N393的那些位点)可以被糖基化，但是用一或多种糖苷酶处理可以使与未用一或多种糖苷酶消化的透明质酸酶相比糖基化程度降低。
部分去糖基化透明质酸降解酶包括部分去糖基化可溶性PH20多肽可以具有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或80％的完全糖基化多肽的糖基化水平。典型地，部分去糖基化透明质酸降解酶包括部分去糖基化可溶性PH20多肽显示是由完全糖基化多肽显示的透明质酸酶活性的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％，130％，140％，150％，200％，300％，400％，500％，1000％或更高的透明质酸酶活性。
5.修饰的(聚合物缀合的)透明质酸降解酶
在一个实施例中，本发明的组合物和组合含有已通过缀合于一或多种聚合物分子(聚合物)而修饰的透明质酸降解酶特别是可溶性透明质酸酶，以典型增加透明质酸降解酶的半衰期，例如促进对象中治疗作用延长/持续(prolonged/sustained)。
将聚合物分子如聚乙二醇(PEG化部分(PEG))共价或其它稳定方式附着于透明质酸降解酶如透明质酸酶，赋予所得的透明质酸降解酶-聚合物组合物有益性质。这种性质包括生物相容性、蛋白质(和酶活性)在对象血液、细胞和/或组织中的半衰期延长、有效屏蔽蛋白质免于蛋白酶和水解、生物分布改善、药动学和/或药效学增强及水溶性增加。
可以缀合于透明质酸降解酶如透明质酸酶的举例的聚合物包括天然和合成的均聚物，如多元醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)，及进一步的杂聚物，即包含一或多种不同偶联基团例如羟基和胺基团的聚合物。合适的聚合物分子的例子包括选自如下的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚丙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇，PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)，PEG-氧基羰基咪唑(oxycarbonylimidazole)(CDI-PEG)，分支的聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚-D，L-氨基酸，聚乙烯-共-马来酸酐，聚苯乙烯-共-马来酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖，肝素，同源白蛋白，纤维素，包括甲基纤维素，羧甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，壳聚糖水解物，淀粉如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，糖原，琼脂糖及其衍生物，瓜尔胶，pullulan，菊粉，黄原酸胶，角叉菜胶，果胶，褐藻酸水解物和生物聚合物。
典型地，聚合物是聚环氧烷(PAO)如聚环氧乙烷，如PEG，典型地mPEG，其与多糖如葡聚糖和pullulan相比，具有更少的能交联的反应基团。典型地，聚合物是非毒性聚合物分子如(m)聚乙二醇(mPEG)，使用相对简单的化学，其可以共价缀合于透明质酸降解酶如透明质酸酶(例如缀合于蛋白质表面上的附着基团)。
治疗剂的PEG化已报道增加对蛋白酶解的抗性，增加血浆半衰期及降低抗原性和免疫原性。PEG化方法学的实例是本领域已知的(参见，例如Luand Felix，Int.J.Peptide Protein Res.，43：127-138，1994；Lu and Felix，Peptide Res.，6：142-6，1993；Felix et al.，Int.J.Peptide Res.，46：253-64，1995；Benhar et al.，J.Biol.Chem.，269：13398-404，1994；Brumeanu et al.，J Immunol.，154：3088-95，1995；see also，Caliceti et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10)：1261-77 and Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2)：3S-8S)。PEG化也可以用于体内核酸分子的输送中。例如，腺病毒的PEG化可以增加稳定性及基因转移(参见例如Cheng et al.(2003)Pharm.Res.20(9)：1444-51)。
用于附着于透明质酸降解酶包括透明质酸酶的合适的聚合物分子包括但不限于聚乙二醇(PEG)及PEG衍生物如甲氧基聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧基羰基咪唑(CDI-PEG)、分支PEG和聚环氧乙烷(PEO)(参见例如Roberts et al.，Advanced Drug Delivery Review 2002，54：459-476；Harris and Zalipsky，S(eds.)″Poly(ethylene glycol)，Chemistry and Biological Applications″ACS Symposium Series 680，1997；Mehvar et al.，J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，3(1)：125-136，2000；Harris，Nature Reviews 2：215 et seq.(2003)；and Tsubery，J Biol.Chem 279(37)：38118-24，2004)。聚合物分子的分子量可以是典型地从大约3kDa到大约60kDa。在一些实施方案中，缀合于蛋白质如rHuPH20的聚合物分子具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或大于60kDa的分子量。
a.PEG化可溶性透明质酸降解酶
用于本发明方法、组合物和组合中的透明质酸降解酶可以是PEG化的透明质酸降解酶，如PEG化可溶性透明质酸降解酶。在一个实施例中，其是PEG化可溶性透明质酸酶，例如PEG化rHuPH20。通过共价附着(缀合)PEG或PEG衍生物而修饰多肽(即“PEG化”)的各种方法是本领域已知的(参见例如U.S.2006/0104968；U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；和U.S.2004/0235734)。PEG化的技术包括但不限于专门的接头和偶联化学(参见例如Harris，Adv.Drug Deliv.Rev.54：459-476，2002)，多个PEG部分附着于单个缀合位点(如通过使用分支的PEG；参见例如Veronese et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.12：177-180，2002)，位点特异性PEG化和/或单PEG化(参见例如Chapman et al.，Nature Biotech.17：780-783，1999)，以及定点酶促PEG化(参见例如Sato，Adv.Drug Deliv.Rev.，54：487-504，2002)。本领域描述的方法和技术可以产生具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个PEG或PEG衍生物附着于单蛋白质分子的蛋白质(参见例如U.S.2006/0104968)。
本领域已描述了许多PEG化试剂。这种试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚氨基(NHS)激活的PEG、琥珀酰亚氨基mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯、mPEG琥珀酰亚氨基丙酸酯、mPEG琥珀酰亚氨基丁酸酯、mPEG羧甲基-3-羟基丁酸琥珀酰亚氨基酯、同双功能(同双功能)PEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯、同双功能PEG丙醛、同双功能PEG丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、p-硝基苯基-碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、分支的mPEG2丁醛、mPEG乙酰、mPEG哌啶酮、mPEG methylketone、mPEG“无接头”马来酰亚胺、mPEG乙烯基砜、mPEG硫醇、mPEG orthopyridylthioester、mPEG orthopyridyl disulfide、Fmoc-PEG-NHS，Boc-PEG-NHS、乙烯基砜PEG-NHS，丙烯酸PEG-NHS，荧光素PEG-NHS和生物素PEG-NHS(参见例如Monfardini et al.，Bioconjugate Chem.6：62-69，1995；Veronese et al.，J.Bioactive Compatible Polymers 12：197-207，1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,183,550；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US 2004/0235734；U.S.2005/000360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 01064951；EP 0822199；WO 00176640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；和WO 0187925)。
D.产生编码透明质酸降解酶的核酸及其多肽的方法
本文所述透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的多肽可以通过本领域熟知的蛋白质纯化和重组蛋白质表达方法获得。可以使用本领域技术人员已知的鉴别编码希望的基因的核酸的任何方法。本领域可利用的任何方法均可用于获得编码透明质酸酶的全长(即包含全部编码区)cDNA或者基因组DNA克隆，所述透明质酸酶例如源自细胞或者组织。修饰的或者变体可溶性透明质酸酶可以从野生型多肽中工程化，如通过定向诱变技术进行。
可以使用本领域已知的克隆和分离核酸分子的任何可利用的方法克隆或者分离多肽。这种方法包括核酸的PCR扩增以及文库的筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选以及基于活性的筛选。
扩增核酸的方法可用于分离编码希望的多肽的核酸分子，所述方法包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。含有核酸的材料可用作起始材料，从中可以分离希望的编码多肽的核酸分子。例如，DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、液体样品(例如血液、血清、唾液)、健康和/或患病对象的样品可用于扩增方法。核酸文库也可以用作起始材料的来源。可以设计引物以扩增希望的多肽。例如，可以基于从中产生希望的多肽的表达的序列设计引物。可以基于多肽氨基酸序列的回译设计引物。可以对通过扩增产生的核酸分子测序，并证实其编码希望的多肽。
另外的核苷酸序列可以与编码多肽的核酸分子结合，包括含有限制性核酸内切酶位点的接头序列，用于将合成的基因克隆进载体中，例如蛋白质表达载体或者设计用于扩增编码核心蛋白的DNA序列的载体。此外，限定功能性DNA元件的额外核苷酸序列可以与编码多肽的核酸分子可操纵地连接。举例的这种序列包括但不限于设计为促进胞内蛋白质表达的启动子序列，以及设计为促进蛋白分泌的分泌序列，例如异源信号序列。这种序列为本领域技术人员已知。其它的核苷酸残基序列如限定蛋白质结合区的碱基序列也可以与编码酶的核酸分子连接。这种区域包括但不限于便于或者编码便于酶由特定靶细胞吸收的蛋白质的残基序列，或者另外改变合成基因的产物的药动学的残基序列。例如，酶可以与PEG部分连接。
此外，可以加入标记或者其它部分，例如以助于多肽的检测或者亲和性纯化。例如，额外的核苷酸残基序列如限定表位标记或者其它检测标记的碱基序列也可以与编码酶的核酸分子连接。举例的这种序列包括编码His标记(例如6×His，HHHHHH；SEQ ID NO：54)或者Flag标记(DYKDDDDK；SEQ ID NO：55)的核酸序列。
然后可以将鉴别的和分离的核酸插入合适的克隆载体中。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或者修饰的病毒，但是所述载体系统必须与使用的宿主细胞相容。这种载体包括但不限于噬菌体如λ衍生物，或者质粒如pCMV4、pBR322或者pUC质粒衍生物或者Bluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)。其它表达载体包括在本文例证的HZ24表达载体。插入克隆载体中可例如通过将DNA片段与具有互补的粘性末端的克隆载体连接而实现。插入可以通过使用TOPO克隆载体(INVITROGEN，Carlsbad，CA)实现。如果用于使DNA片段化的互补限制位点不存在于克隆载体中，则可以对该DNA分子末端进行酶处理修饰。或者，希望的任何位点可以通过将核苷酸序列(接头)连接在DNA末端上而产生；这些连接的接头可以含有特异性化学合成的编码限制性核酸内切酶识别序列的寡核苷酸。在另一方法中，裂解的载体和蛋白质基因可以通过同聚加尾修饰。重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和声穿孔(sonoporation)处理导入宿主细胞中，由此产生基因序列的许多拷贝。
在特定的实施方案中，用掺入分离的蛋白质基因、cDNA或者合成的DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞使得产生基因的多个拷贝。因此，通过生长转化体、从所述转化体中分离重组DNA分子以及当需要时从分离的重组DNA中挽回插入的基因，由此可以获得大量所述基因。
1.载体和细胞
对于重组表达一或多个希望的蛋白质，如本文描述的任何蛋白质，可以将含有编码该蛋白质的核苷酸序列的全部或者一部分插入合适的表达载体中，即含有插入的蛋白质编码序列转录和翻译必需的元件的载体。所述必需的转录和翻译信号也可以由酶基因的天然启动子和/或其侧翼区域提供。
本发明还提供了含有编码所述酶的核酸的载体。本发明也提供了含有所述载体的细胞。所述细胞包括真核细胞和原核细胞，所述载体是适用于本发明的任何载体。
本发明提供了含有载体的原核细胞和真核细胞，包括内皮细胞。这种细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、Archea、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。通过将上述细胞在编码的蛋白质由细胞表达的条件下生长，以及回收表达的蛋白质，所述细胞用于产生其蛋白质。对于本发明，例如所述酶可以分泌进培养基中。
本发明提供了含有编码透明质酸降解多肽的核苷酸序列的载体，在一些实施例中，是编码与天然或者异源信号序列结合的可溶性透明质酸酶的核苷酸序列，以及其多个拷贝。可以选择所述载体以在细胞中表达酶蛋白，或者由此所述酶蛋白作为分泌的蛋白质表达。
许多宿主-载体系统可用于表达蛋白质编码序列。这些系统包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒及其它病毒)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母；或者用噬菌体、DNA、质粒DNA或者粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件的强度和特异性不同。根据使用的宿主-载体系统，可以使用任一种合适的转录和翻译元件。
本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体中的任何方法均可用于构建表达载体，所述表达载体含有具有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列的嵌合基因。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组技术(遗传重组)。编码蛋白质或者其结构域、衍生物、片段或者同系物的核酸序列的表达，可以通过另一个核酸序列调节，由此所述基因或者其片段在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子控制。在特定的实施方案中，启动子不是希望的蛋白质基因的天然启动子。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist and Chambon，Nature 290：304-310(1981))，包含于Rous肉瘤病毒的3’长末端重复中的启动子(Yamamoto et al.Cell 22：787-797(1980))，疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.，Nature 296：39-42(1982))；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)或者tac启动子(DeBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25(1983))，也见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”：in Scientific American 242：79-94(1980))；含有胭脂碱合成酶启动子的植物表达载体(Herrara-Estrella et al.，Nature 303：209-213(1984))或者花椰菜花叶病毒35SRNA启动子(Garder et al.，Nucleic Acids Res.9：2871(1981))，以及光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶启动子(Herrera-Estrella et al.，Nature 310：115-120(1984))；酵母及其它真菌的启动子元件如Gal4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子，碱性磷酸酶启动子，以及呈现出组织特异性且已经用于转基因动物中的如下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift et al.，Cell 38：639-646(1984)；Ornitz et al.，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，Hepatology7：425-515(1987))；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan et al.，Nature 315：115-122(1985))，在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl et al.，Cell 38：647-658(1984)；Adams et al.，Nature 318：533-538(1985)；Alexander et al.，Mol.Cell Biol.7：1436-1444(1987))，在睾丸、乳腺、淋巴细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder et al.，Cell 45：485-495(1986))，在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinckert et al.，Genes and Devel.1：268-276(1987))，在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf et al.，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)；Hammer et al.，Science235：53-581987))，在肝脏中有活性的α-1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey et al.，Genes and Devel.1：161-171(1987))，在骨髓细胞中有活性的β珠蛋白基因控制区(Magram et al.，Nature 315：338-340(1985)；Kollias et al.，Cell 46：89-94(1986))，在脑少突神经胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead et al.，Cell 48：703-712(1987))，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani，Nature 314：283-286(1985))，以及在下丘脑的促性腺激素细胞中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason et al.，Science 234：1372-1378(1986))。
在特定的实施方案中，使用这样的载体，其含有与编码希望的蛋白质或者其结构域、片段、衍生物或者同系物的核酸可操纵地连接的启动子，一或多个复制起点，以及任选一或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。举例的转化大肠杆菌细胞的质粒载体包括例如pQE表达载体(得自Qiagen，Valencia，CA；也见Qiagen描述该系统公开的文献)。pQE载体具有用以提供重组蛋白质在大肠杆菌中被紧密调节的高水平表达的噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)以及双lac操纵子阻抑模块，用以有效翻译的合成的核糖体结合位点(RBS II)，6×His标记编码序列，t0和T1转录终止子，ColE1复制起点，以及赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。pQE载体可以在重组蛋白质的N-或者C-末端放置6×His标记。这种质粒包括pQE 32、pQE 30和pQE 31，其为所有三个读框提供多克隆位点，以及提供N-末端6×His标记的蛋白质的表达。转化大肠杆菌细胞的其它举例的质粒载体包括例如pET表达载体(见美国专利4,952,496，得自NOVAGEN，Madison，WI；也见由Novagen描述该系统公开的文献)。这种质粒包括pET 11a，其含有T71ac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操纵子，以及lac阻抑物基因；pET12a-c，其含有T7启动子、T7终止子以及大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET 15b和pET19b(NOVAGEN，Madison，WI)，其含有His-TagTM前导序列，用于His柱纯化，以及允许在经过柱纯化后裂解的凝血酶裂解位点，T7-lac启动子区域以及T7终止子。
举例的哺乳动物细胞表达载体是HZ24表达载体。所述HZ24表达载体衍生自pCI载体主链(Promega)。其含有编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA，F1复制起点，巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区域(CMV)，以及SV40晚期聚腺苷酸化信号(SV40)。所述表达载体也具有来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点(IRES)以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
2.表达
透明质酸降解酶多肽包括可溶性透明质酸酶多肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，包括体内和体外方法。希望的蛋白质可以在适于产生需要量和形式如给予和治疗需要的蛋白质的任何生物体中表达。表达宿主包括原核和真核生物体乳大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物。表达宿主的蛋白质产生水平以及在表达的蛋白质上存在的翻译后修饰的类型可有所不同。表达载体的选择可基于这些及其它因素，如考虑到调节和安全性、生产成本以及是否需要纯化以及纯化方法。
许多表达载体是本领域技术人员可利用和已知的，且可用于蛋白质的表达。表达载体的选择受到宿主表达系统选择的影响。通常地，表达载体可包括转录启动子及任选增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体典型具有选择标记，其使得可以选择和维持转化的细胞。在一些情况中，复制起点可用于扩增载体的拷贝数。
透明质酸降解酶多肽如可溶性透明质酸酶多肽也可作为蛋白质融合体利用或者表达。例如，可以产生酶融合体，为酶增加另外的功能性。举例的酶融合蛋白包括但不限于信号序列、标记以及指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合体，所述标记如定位标记如his6标记或者myc标记，或者纯化标记如GST融合体。
a.原核细胞
原核细胞，特别是大肠杆菌，提供了产生大量蛋白质的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的简便且快速的技术。大肠杆菌的表达载体可含有可诱导启动子，这种启动子可用于诱导高水平的蛋白质表达以及用于表达对于宿主细胞呈现出一些毒性的蛋白质。举例的可诱导启动子包括lac启动子、trp启动子、杂交tac启动子、T7和SP6RNA启动子，以及温度调节的λPL启动子。
如本发明提供的任何蛋白质可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。细胞质是还原环境，对于一些分子而言这可以导致不溶的包涵体形成。还原剂如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇及变性剂如胍-HCl和尿素可用于再溶解蛋白质。另一种方法是蛋白质在细菌的细胞周质间隙内的表达，提供了氧化环境和伴侣蛋白样及二硫键异构酶，且可导致可溶性蛋白质产生。典型地，前导序列与待表达的蛋白质融合，指导该蛋白质定向于细胞周质。然后通过细胞周质内的信号肽酶除去前导序列。举例的细胞周质靶向前导序列包括来自的果胶裂解酶基因的pelB前导序列以及衍生自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况中，细胞周质表达使得表达的蛋白质渗漏进培养基中。蛋白质的分泌使得可以将其快速且简便地从培养上清中纯化。未分泌的蛋白质可以通过渗透性裂解得自细胞周质。与细胞质表达相似，在一些情况中，蛋白质可以成为不溶，可以使用变性剂和还原剂促进溶解和再折叠。诱导温度和生长也可以影响表达水平和溶解性，使用典型在25℃-37℃之间的温度。典型地，细菌产生无糖基化蛋白质。因此，如果蛋白质需要糖基化以发挥功能，则可以在从宿主细胞中纯化之后在体外增加糖基化。
b.酵母细胞
酵母如Saccharomyces cerevisae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Kluyveromyces lactis和Pichia pastoris是熟知的酵母表达宿主，可用于如本文所述任何蛋白质的产生。酵母可以用附加型复制载体转化或者通过同源重组稳定的染色体整合。典型地，可诱导启动子用于调节基因表达。举例的这种启动子包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子，如CUP1、AOX1或者其它Pichia或者其它酵母启动子。表达载体通常包括选择标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3，以选择和维持转化的DNA。在酵母表达的蛋白质通常的可溶的。与伴侣蛋白如Bip和蛋白质二硫键异构酶的共表达可改善表达水平和溶解性。此外，在酵母中表达的蛋白质可以使用分泌信号肽融合体如来自Saccharomyces cerevisae的酵母交配型α-因子分泌信号以及与酵母细胞表面蛋白如Aga2p交配粘附受体或者Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合体定向分泌。可以对蛋白酶裂解位点如Kex-2蛋白酶裂解位点进行工程化，以从表达的多肽中除去融合的序列，因为其退出分泌途径。酵母也能在Asn-X-Ser/Thr基序糖基化。
c.昆虫细胞
昆虫细胞，特别是使用杆状病毒表达的昆虫细胞，可用于表达多肽如透明质酸酶多肽。昆虫细胞表达高水平的蛋白质且能进行高等真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有有限的宿主范围，其改善了安全性并减少了真核细胞表达的调节考虑。典型的表达载体使用启动子以进行高水平表达，如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒如Autographa californica核型多角体病毒(AcNPV)以及Bombyx mori核型多角体病毒(BmNPV)，昆虫细胞系如衍生自Spodoptera frugiperda的Sf9、Pseudaletia unipuncta(A7S)和Danaus plexippus(DpN1)。对于高水平表达，待表达的分子的核苷酸序列与病毒的多角体蛋白的起始密码子的立即下游融合。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中被精确加工，且可用于将表达的蛋白质分泌进培养基中。此外，细胞系Pseudaletia unipuncta(A7S)和Danaus plexippus(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白质。
昆虫细胞中另一种表达系统使用稳定转化的细胞。细胞系如Schneider2(S2)和Kc细胞(Drosophila melanogaster)及C7细胞(Aedes albopictus)可用于表达。Drosophila金属硫蛋白启动子可用于在存在镉或者铜重金属诱导的条件下诱导高水平表达。表达载体典型通过使用选择标记如新霉素和潮霉素维持。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可用于表达包括透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶多肽的蛋白质。表达构建体可以通过病毒感染如腺病毒或者通过直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过物理方式如电穿孔和显微注射等方式移至哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞表达载体典型包括mRNA帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)以及聚腺苷酸化元件。也可以加入IRES元件以使得可以与另一基因如选择标记双顺反子表达。这种载体通常包括转录启动子-增强子以高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞类型启动子和增强子区域也可用于表达。举例的启动子/增强子区域包括但不限于来自如下基因的那些区域，如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2，以及促性腺激素释放激素基因控制。选择标记可用于选择和维持具有表达构建体的细胞。举例的选择标记基因包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，可以在存在氨甲喋呤的条件下进行表达，以选择仅表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面信号分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可以指导蛋白质在细胞表面上以活性状态表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。举例的细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤以及异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8以及HKB细胞。也可以使细胞系适应于无血清培养基，其促进分泌的蛋白质从细胞培养基中纯化。例如包括CHO-S细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11619-012)和无血清EBNA-1细胞系(Pham et al.，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42.)。也可以使细胞系适应在特殊培养基中生长以优化最大表达水平。例如，使DG44CHO细胞适应于在化学限定的无动物产物的培养基中悬浮培养生长。
e.植物
转基因植物细胞和植物可用于表达蛋白质，如本文所述任何蛋白质。使用直接DNA转移技术将表达构建体移至植物，所述直接DNA转移技术如微粒轰击和PEG介导的转移进原生质体中，以及使用农杆菌介导的转化。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术通常在双子叶宿主如Arabidopsis和烟草与单子叶宿主如玉米和水稻之间有所不同。举例的用于表达的植物启动子包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子以及遍在蛋白和UBQ3启动子。选择标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶通常用于促进转化的细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以作为细胞培养维持、聚集体(愈伤组织)或者再生为全植物。转基因植物细胞也可以包括藻类，其被工程化为产生透明质酸酶多肽。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，这样可以影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。
3.纯化技术
从宿主细胞中纯化多肽、包括透明质酸降解酶多肽(例如可溶性透明质酸酶多肽)或者其它蛋白质的方法依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白质通常在除去细胞之后从培养基中纯化。对于细胞内表达，可以裂解细胞并且从提取物中纯化蛋白质。当转基因生物体如转基因植物和动物用于表达时，组织或者器官可以用作起始材料产生裂解的细胞提取物。此外，转基因动物的生产可包括在乳或者蛋中多肽的产生，其是可以收集的，且如果需要，则可以提取蛋白质并且使用本领域标准方法进一步纯化。
蛋白质，如可溶性透明质酸酶多肽，可以通过使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化，所述技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级分离和大小排阻层析、硫酸铵沉淀以及离子交换层析，如阴离子交换层析。亲和性纯化技术也可用于改善制备的效率和纯度。例如，结合透明质酸酶的抗体、受体及其它分子可用于亲和性纯化中。表达构建体也可工程化为在蛋白质中加入亲和标记如myc表位、GST融合体或者His6，并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂亲和纯化。纯度可以通过本领域已知的任何方法评估，包括凝胶电泳和染色以及分光光度测定技术。本发明提供的纯化的rHuPH20组合物典型具有大约120,000单位/mg的比活性，如实施例2所测定。
4.透明质酸降解酶多肽的PEG化
聚乙二醇(PEG)已广泛用于生物材料、生物工程及医学，主要是引物PEG是生物相容性、无毒性、非免疫原性及水溶性聚合物(Zhao and Harris，ACS Symposium Series 680：458-72，1997)。在药物输送领域，PEG衍生物已广泛用于共价附着(即“PEG化”)于蛋白质以降低免疫原性、蛋白酶解及肾清除以及增强溶解性(Zalipsky，Adv.Drug Del.Rev.16：157-82，1995)。类似地，PEG已附着于低分子量相对疏水药物以增强溶解性，降低毒性及改变生物分布。典型地，PEG化药物以溶液注射。
一种密切相关的应用是合成交联的可降解的PEG网络或配制品以用于药物输送，因为许多用于设计可降解的可溶性药物载体的相同化学也可以用于设计可降解的凝胶(Sawhney et al.，Macromolecules 26：581-87，1993)。还已知大分子间复合物可以通过混合两种互补聚合物的溶液而形成。这种复合物通常通过所涉及的聚合物之间的静电相互作用(聚阴离子-聚阳离子)和/或氢键(多酸-多碱)和/或水性环境中的聚合物之间的疏水相互作用而稳定化(Krupers et al.，Eur.Polym J.32：785-790，1996)。例如，在合适条件下混合聚丙烯酸(PAAc)和聚环氧乙烷(PEO)的溶液导致形成主要基于氢键的复合物。这些复合物在生理条件下的解离已用于输送游离药物(即非PEG化的)。另外，互补聚合物的复合物已从均聚物和共聚物形成。
许多PEG化试剂已在本领域描述。这种试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚氨基(NHS)活化的PEG，琥珀酰亚氨基mPEG，mPEG2-N-琥珀酰亚胺，mPEG琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯，mPEG琥珀酰亚氨基丙酸酯，mPEG琥珀酰亚氨基丁酸酯，mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酰亚氨基酯，同双功能PEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯，同双功能PEG丙醛，同双功能PEG丁醛，PEG马来酰亚胺，PEG酰肼，p-硝基苯基-碳酸酯PEG，mPEG-苯并三唑碳酸酯，丙醛PEG，mPEG丁醛，分支的mPEG2丁醛，mPEG乙酰，mPEG哌啶酮，mPEG methylketone，mPEG“无接头”马来酰亚胺，mPEG乙烯基砜、mPEG硫醇、mPEG orthopyridylthioester、mPEG orthopyridyl disulfide、Fmoc-PEG-NHS，Boc-PEG-NHS、乙烯基砜PEG-NHS，丙烯酸PEG-NHS，荧光素PEG-NHS和生物素PEG-NHS(参见例如Monfardini et al.，Bioconjugate Chem.6：62-69，1995；Veronese et al.，J.Bioactive Compatible Polymers 12：197-207，1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,183,550；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US 2004/0235734；U.S.2005/000360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP01064951；EP 0822199；WO 00176640；WO 0002017；WO 0249673；WO9428024；和WO 0187925).
在一个实施例中，聚乙二醇具有从大约3kD至大约50kD、优选从大约5kD至大约30kD的分子量。PEG与药物的共价附着(已知为“PEG化”)可以通过已知的化学合成技术实现。例如，蛋白质的PEG化可以通过将NHS-活化的PEG与蛋白质在合适反应条件下反应而实现。
尽管已描述了许多PEG化反应，但是通常适用的那些反应赋予方向性，使用温和反应条件并且不需要深入的下游加工以除去毒性催化剂或副产物。例如，单甲氧基PEG(mPEG)仅具有一个反应性末端羟基，因此其使用限制所得PEG-蛋白质产物混合物的一些异质性。聚合物末端的相对于末端甲氧基的羟基基团的活化通常是实现有效蛋白质PEG化所需的，目的在于使衍生化的PEG更易感于亲核攻击。攻击亲核体通常是赖氨酸残基的ε-氨基，但是如果局部条件是有利的则其它胺也可以反应(例如N末端α-胺或者组氨酸的环胺)。在含有单赖氨酸或半胱氨酸的蛋白质中可以进行更定向的附着。后一种残基可以被PEG-马来酰亚胺靶向进行硫醇特异性修饰。或者，PEG酰肼可以与高碘酸盐氧化的透明质酸降解酶反应并在NaCNBH3存在下被还原。更具体地，PEG化CMP糖可以与透明质酸降解酶在合适糖基转移酶存在下反应。一种技术是“PEG化”技术，其中一些聚合物分子与相应多肽偶联。当使用这种技术时，免疫系统对识别多肽表面上的负责形成抗体的表位有困难，因此降低免疫应答。对于直接导入人体循环系统中以提供特定生理学作用的多肽(即药物)，典型的潜在免疫应答是IgG和/或IgM应答，而被吸入呼吸系统的多肽(即工业多肽)潜在地可导致IgE应答(即变态反应)。一种解释降低的免疫应答的理论是聚合物分子屏蔽多肽表面上负责导致抗体形成的免疫应答的表位。另一种理论或至少部分因素是缀合物越重，则获得越降低的免疫应答。
典型地，为制备本发明的PEG化透明质酸降解酶包括PEG化透明质酸酶，PEG部分经共价附着与多肽缀合。PEG化技术包括但不限于专门的接头及偶联化学(参见例如Harris，Adv.Drug Deliv.Rev.54：459-476，2002)，多个PEG部分附着于单个缀合位点(如使用分支的PEG；参见例如Veronese et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.12：177-180，2002)，位点特异性PEG化和/或单PEG化(参见例如Chapman et al.，Nature Biotech.17：780-783，1999)，及定位酶促PEG化(参见例如Sato，Adv.Drug Deliv.Rev.，54：487-504，2002)。现有技术描述的方法和技术可以产生具有附着于单个蛋白质分子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者超过10个PEG或PEG衍生物的蛋白质(参见例如U.S.2006/0104968)。
作为制备PEG化透明质酸降解酶如PEG化透明质酸酶的示例PEG化方法的例子，PEG醛、琥珀酰亚胺及碳酸酯已各自用于将PEG部分典型地琥珀酰亚氨基PEG缀合于rHuPH20。例如，rHuPH20已经缀合于举例的琥珀酰亚氨基单PEG(mPEG)试剂，包括mPEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)，mPEG-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)，和(用于附着“分支”PEG的)mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺。这些PEG化琥珀酰亚氨基酯含有在PEG基团和活化的交联接头与单个或分支PEG基团之间的不同长度的碳主链。这些差异可以用于例如提供不同的反应动力学及潜在限制在缀合过程期间可供PEG附着于rHuPH20的位点。
包含线性或分支PEG的琥珀酰亚氨基PEG(如上)可以缀合于rHuPH20。PEG可以用于可重复地产生rHuPH20，其包含分子的组合，所述分子具有每个透明质酸酶大约3至6个PEG分子。这种PEG化rHuPH20组合物可以容易地被纯化以产生具有大约25,000或30,000单位/mg蛋白质透明质酸酶活性的比活性的组合物，并且基本上不含非PEG化rHuPH20(小于5％非PEG化的)。
使用各种PEG试剂，可以例如用mPEG-SBA(30kD)，mPEG-SMB(30kD)制备举例形式的透明质酸降解酶特别是可溶性人重组透明质酸酶(例如rHuPH20)，以及基于mPEG2-NHS(40kD)，mPEG2-NHS(60kD)的分支形式。已使用NHS化学及碳酸酯和醛采用以下每种试剂产生rHuPH20的PEG化形式：mPEG2-NHS-40K分支的，mPEG-NHS-10K分支的，mPEG-NHS-20K分支的，mPEG-NHS-40K分支的，mPEG2-NHS-60K分支的；mPEG-SBA-5K；mPEG-SBA-20K；mPEG-SBA-30K；mPEG-SMB-20K；mPEG-SMB-30K；mPEG-butyrldehyde-；mPEG-SPA-20K；mPEG-SPA-30K；和PEG-NHS-5K-生物素。已使用得自Dow Chemical Corporation分公司Dowpharma的PEG试剂制备PEG化透明质酸酶，包括用Dowpharma的p-硝基苯基-碳酸酯PEG(30kDa)PEG化的透明质酸酶及用丙醛PEG(30kDa)PEG化的透明质酸酶。
在一个实施例中，PEG化包括将mPEG-SBA例如mPEG-SBA-30K(具有大约30kDa的分子量)或另一种PEG丁酸衍生物的琥珀酰亚氨基酯缀合于可溶性透明质酸酶。PEG丁酸衍生物的琥珀酰亚氨基酯如mPEG-SBA-30K容易偶联于蛋白质的氨基。例如，m-PEG-SBA-30K和rHuPH20的共价缀合(其大小大约为60KDa)提供了rHuPH20和mPEG之间的稳定酰胺键，如下述方案1所示。
方案1：
Figure BPA00001277192100811
典型地，mPEG-SBA-30K或其它PEG以PEG∶多肽摩尔比10∶1在合适缓冲液例如130mM NaCl/10mM HEPES pH 6.8中加入到透明质酸降解酶中，在一些情况中是透明质酸酶，随后灭菌，例如过滤灭菌，并且例如搅拌下在冷室内于4℃持续缀合过夜。在一个实施例中，缀合的PEG-透明质酸降解酶被浓缩及进行缓冲液交换。
偶联PEG丁酸衍生物的琥珀酰亚氨基酯如mPEG-SBA-30K的其它方法是现有技术已知的(参见例如U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；和U.S.2004/0235734)。例如，多肽如透明质酸降解酶(例如透明质酸酶)可以通过在硼酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.0)中于4℃反应1小时而偶联于NHS活化的PEG衍生物。所得PEG化蛋白质可以经超滤纯化。牛碱性磷酸酶的PEG化可以通过将磷酸酶与mPEG-SBA在含有0.2M磷酸钠和0.5M NaCl(pH7.5)的缓冲液中于4℃混合30分钟而实现。未反应的PEG可以超滤除去。另一种方法将多肽与mPEG-SBA在去离子水中反应，在其中加入三乙胺以升高pH至7.2-9。所得混合物在室温搅拌若干小时以完成PEG化。
F.组合物的制备、配制及给予
本发明提供了缀合于聚合物的修饰的透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶的药物组合物。还提供了含有用于治疗与透明质酸相关疾病或病症相关的疾病或病症的第二种药剂的药物组合物。这种药剂的例子包括但不限于抗癌剂，包括药物、多肽、核酸、抗体、肽、小分子、基因治疗载体、病毒和其它治疗剂。修饰的透明质酸降解酶包括修饰的可溶性透明质酸酶可以与这种第二种药剂的药物配制品共配制或共给予以增强其输送到身体内与过量或积累的透明质酸相关的希望的部位或组织。例如，肿瘤与积累的透明质酸相关。这种过量的透明质酸可帮助导致阻止导水率。导入透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶特别是缀合于聚合物以增强半衰期的可溶性透明质酸酶可以抵消透明质酸的这种组织中的积累，由此改善部位或组织内的导水率，使得所述部位或组织更易感于第二种药剂或一些药剂经局部或全身输送。例如，本发明提供了PEG化可溶性透明质酸酶如rHuPH20的组合物，当其与含有抗癌剂的组合物一起或分别(间歇、同时或依次)给予肿瘤时，可以使肿瘤更易感于这种抗肿瘤剂。如本文其它处讨论，PEG化可溶性透明质酸酶的组合物还可以被单独给予以治疗与积累的透明质酸酶底物表达相关的疾病或病症。
化合物可以配制为合适的药物制备物，如溶液、悬浮液、片剂、可分散片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、缓释配制物或酏剂，用于口服给予，以及经皮贴剂和干粉吸入剂。典型地，使用本领域熟知的技术和方法将化合物配制为药物组合物(见例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，Fourth Edition，1985，126)。通常，配制模式应适于给予模式。组合物可以共配制或者提供为独立的组合物。
通常，组合物配制为冻干或液体形式。当组合物以冻干形式提供时，它们可以在即将使用前用合适缓冲液例如无菌盐水溶液重配。组合物可以一起或分别提供。为本发明目的，这种组合物典型地分别提供。透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶和第二种药剂可以包装为分别组合物以用于一起、相继或间歇给予。组合可以包装为试剂盒。
组合物可以配制为经本领域技术人员已知的任何途径给予，包括肌肉内、静脉内、真皮内、损害内、腹膜内注射、硬膜外、鼻内、皮下、肿瘤内、口服、阴道、直肠、局部(topical)、局部(local)、耳、吸入、含服(例如舌下)及经皮给予或任何途径。根据治疗位置，给予可以是局部(local)、局部(topical)或全身的。局部(local)给予至需要治疗的区域可以通过例如但不限于手术期间局部输注，局部(topical)施用例如在手术后与伤口敷料一起，通过注射，通过导管，通过栓剂或通过植入方式。组合物也可以与其它生物活性剂给予，相继、间歇或在同一组合物中。给予也可以包括受控释放系统，包括受控释放配制品和装置控制释放，如通过泵。
在任何给定例子中最合适的途径取决于各种因素，如疾病性质、疾病进程、疾病严重性及使用的特定组合物。为本发明目的，希望的是透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶和/或第二种药剂的给予使得药物学可利用量或水平存在于血浆中。例如，组合物例如通过静脉内给予而全身给予。在一些情况中，这种组合物的给予是使得它们到达具有积累的透明质酸的皮肤或组织的间质(interstitium)。例如，将可溶性透明质酸酶导入肿瘤间质将增强局部输送的及全身可利用的抗癌剂的输送，当组织间隙液压降低以及扩增和/或结缔组织转运增加时其可以更容易穿透肿瘤。因此，透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶及第二种药剂或一些药剂可以通过不同给予途径给予。因此，在一个实施例中，可溶性透明质酸酶酶局部例如肿瘤内给予与积累的透明质酸相关的部位或组织，第二种药剂全身例如静脉内给予。其它给予模式也包括在本发明内。药物组合物可以配制成适合每种给予途径的剂型。
可以采用给予方法以降低透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶及其它分子暴露于降解过程，如蛋白酶解降解和经抗原性和免疫原性应答的免疫学介入。这种方法的例子包括在治疗部分的局部给予。
1.配制
鉴于管理机构或者其它机构根据普遍公认用于动物和人的药典的许可制备药物可接受的组合物。组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末和缓释配方形式。组合物可以用传统粘合剂和载体如甘油三酯配制为栓剂。口服配制品可以包括标准载体如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁和其它这种制剂。配制品应适合给予模式。
药物组合物可包括载体如稀释剂、佐剂、赋形剂或者给予酶或激活剂的运载体。举例的合适的药物载体在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。这种组合物含有治疗有效量的通常是纯化形式的化合物，以及适量的载体以提供恰当给予患者的形式。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物油、植物油或者合成的油，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。当药物组合物通过静脉内给予时，水是典型的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。除了活性成分之外，组合物还可含有：稀释剂如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或者羧甲基纤维素；滑润剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；以及粘合剂如淀粉、天然树胶如阿拉伯树胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚烯吡酮、crospovidones以及本领域技术人员已知的其它这种粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水和乙醇。如果需要，组合物也可以含有微量的湿润剂或者乳化剂，或者PH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、山梨聚糖单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、油酸三乙醇胺及其它这种物质。
在一个实施例中，药物制备物可以是液体形式，例如溶液、糖浆或者悬浮液。这种液体制备物可以通过常规方式制备，使用药物可接受的添加剂如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或者氢化食用油脂)、乳化剂(例如卵磷脂或者阿拉伯胶)、非水性载体(例如杏仁油、油酯，或者分馏的植物油)以及防腐剂(例如甲基或者丙基-p-羟基苯甲酸酯或者山梨酸)。在另一实施例中，药物制备物可以冻干形式存在，在使用之前用水或者其它合适的运载体重建。
药物治疗活性化合物及其衍生物典型以单位剂量形式或者多剂量形式配制和给予。每个单位剂量含有足以产生希望的治疗作用的预定数量的治疗活性化合物，以及必要的药物载体、运载体或者稀释剂。单位剂量形式包括但不限于片剂、胶囊剂、丸剂、粉末、颗粒剂、无菌肠胃外溶液或悬液、口服溶液或悬液以及油水乳液，其含有合适数量的化合物或其药物学可接受衍生物。单位剂量形式可以包含在安瓿和注射器或者单独包装的片剂或者胶囊剂中。多剂量形式是包装在一个容器中的多个相同的单位剂量形式，以独立的单位剂量形式给予。举例的多剂量形式包括小瓶、药片或者胶囊的瓶或者品脱或者加仑瓶。因此，多剂量形式是未独立包装的多个单位剂量。通常地，可以制备含有0.005％-100％活性成分的剂量形式或者组合物，余量由无毒载体组成。
药物组合物可以配制成适合每种给予途径的剂量形式。
a.注射剂、溶液及乳液
本发明包括肠胃外给药，通常特征在于注射，皮下、肌肉内、肿瘤内、静脉内或真皮内注射。注射剂可以常规形式制备，如液体溶液或者悬液，适于在注射之前形成溶液或者悬液的固体形式，或者作为乳液(emulsion)。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或者乙醇。另外，如果希望，待给予的药物组合物还可以含有溶剂形式的激活剂，如pH缓冲剂、金属离子盐或其它这种缓冲剂。药物组合物还可含有其它微量无毒辅助物质，如湿润剂或者乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂，及其它这种物质，如乙酸钠、山梨聚糖单月桂酸酯、油酸三乙醇胺及环糊精。本发明也涵盖了缓释或者持续释放系统的植入，由此维持恒定水平的剂量(见例如美国专利No.3,710,795)。这种肠胃外组合物中含有的活性化合物的百分比高度依赖于其特殊性质，以及化合物的活性和对象的需求。
例如，本发明的修饰的可溶性透明质酸酶的标准稳定化配制品用EDTA、NaCl、CaCl2、组胺、乳糖、白蛋白、PluronicF68、TWEEN
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和/或其它去污剂或其它类似制剂之一或多种配制。例如，本发明组合物可以含有一或多种pH缓冲剂(例如组胺、磷酸盐或其它缓冲剂)，或者酸性缓冲剂(如乙酸盐、柠檬酸盐、丙酮酸盐、Gly-HCl、琥珀酸盐、乳酸盐、马来酸盐或其它缓冲剂)，张力改性剂(例如氨基酸、多元醇、NaCl、海藻糖、其它盐和/或糖)，稳定剂，螯合剂如乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸盐或钙EDTA，除氧剂如甲硫氨酸、抗坏血酸/抗坏血酸盐、柠檬酸/柠檬酸盐或白蛋白，和/或防腐剂如含有芳环的防腐剂(如苯酚或甲酚)。用于含有透明质酸降解酶的组合物的举例的稳定剂包括去污剂如聚山梨醇酯和蛋白质如人血清白蛋白。用于本发明的血清白蛋白的举例的浓度包括0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL，但是可以更高或更低。聚山梨醇酯也可以以是或大约是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、00.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％的浓度存在于组合物中。金属螯合剂如钙EDTA(CaEDTA)也可以存在，例如浓度在大约0.02mM至0mM之间，如0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM或更高。组合物的pH和摩尔渗透压浓度可以由本领域技术人员调整以优化条件，用于希望的组合物活性和稳定性。在一些实施例中，本发明的组合物的摩尔渗透压浓度是或大约是100mOsm/kg、120mOsm/kg、140mOsm/kg、160mOsm/kg、180mOsm/kg、200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg、400mOsm/kg、420mOsm/kg、440mOsm/kg、460mOsm/kg、500或更高mOsm/kg，pH为或大约为6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8。
通常NaCl以例如是或大约是100mM-150mM或更高的量提供在本发明配制品中。例如，举例的配制品可以含有是或大约是10mM的组胺和/或是或大约是130mM的NaCl。其它配制品可以额外或者替代含有乳糖，是或大约是13mg/ml。另外，抗细菌剂或抗真菌剂包括但不限于硫柳汞可以存在于配制品中。配制品可进一步含有白蛋白、PluronicF68、TWEEN
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和/或其它去污剂。配制品以在或大约在6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4的pH提供。用于本发明的修饰的可溶性透明质酸酶的浓缩配制品通常在给予前在盐水溶液或其它盐缓冲溶液中稀释以维持合适盐浓度。
根据局部和全身应用设计注射剂。对于本发明，局部给予是直接给予与积累的或过量的透明质酸相关的受影响的间质组织。肠道外给予的制备物包括易用于注射的无菌溶液、无菌干燥的可溶物，如冻干的粉末，易用于在使用之前与溶剂组合，包括皮下注射用片剂、易用于注射的无菌悬浮液、易用于在使用之前与载体组合的无菌干燥的不溶物，以及无菌乳状液。溶液可以是水溶液或者非水溶液。如果静脉内给予，合适的载体包括生理盐水或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
用于肠胃外制备物中的药物可接受的载体包括水性载体、非水性载体、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局麻剂、悬浮和分散剂、乳化剂、螯合剂(sequestering agent)或者螯合剂(chelating agents)，及其它药物可接受的物质。举例的水性载体包括氯化钠注射液、Ringers注射液、等渗右旋糖注射液、无菌注射用水、右旋糖和乳酸化Ringers注射液。非水性肠胃外载体包括源自植物的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油以及花生油。在多剂量容器中包装的肠胃外给予的制备物中可以加入抑制细菌或者抑制真菌浓度的抗微生物剂，包括苯酚或者甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基p-羟基苯甲酸酯、thimerosal、苯扎氯铵以及苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局麻剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括Polysorbate 80(TWEENs 80)。金属离子的螯合剂(sequestering agent)或者螯合剂(chelating agent)包括EDTA。药物载体也包括乙醇、聚乙二醇和丙二醇作为水混溶性载体；以及调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或者乳酸。
如果静脉内给予，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，含有增稠剂和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
调节药物活性化合物的浓度，由此注射可以提供有效量以产生希望的药理学作用。如本文其它处讨论，修饰的可溶性透明质酸酶以足以维持血浆中透明质酸酶在或大约在3U/mL的量提供。如本领域所已知，精确剂量依赖于患者或者动物的年龄、体重和一般状况。单位剂量的肠胃外给予的制备物包装在安瓿、小瓶或者带有针头的注射器中。含有药物活性化合物的液体溶液或者重建的粉末制备物的体积与待治疗的疾病以及选择用于包装的特定制造品相关。如本领域所已知和实施，用于肠胃外给予的所有制备物必须是无菌的。
b.冻干粉末
本发明感兴趣的是冻干粉末，其可以重建作为溶液、乳状液及其它混合物给予。其也可以重建和配制为固体或者凝胶。
无菌的冻干粉末是通过将可溶性透明质酸酶化合物和/或第二种药剂溶解于缓冲溶液中制备。缓冲溶液可含有改善稳定性的赋形剂或者粉末的其它药物成分或者从粉末制备的重建溶液。随后在本领域技术人员已知的标准条件下对溶液进行灭菌过滤，之后冻干，由此提供希望的配制品。简而言之，冻干的粉末通过溶解于在合适的缓冲液如柠檬酸、磷酸钠或者磷酸钾或者本领域技术人员已知的其它这种缓冲液中的赋形剂如右旋糖、山梨糖、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或者其它合适物质中而制备。然后，在所得混合物中加入选择的酶，搅拌直至其溶解。将所得混合物进行灭菌过滤或者处理以除去颗粒及保证无菌性，按比例分配于小瓶中冻干。每个小瓶含有单剂量的(1mg-1g，通常1-100mg，如1-5mg)或者多剂量的化合物。冻干粉末可以在适当条件下贮存，如在大约4℃至室温下贮存。
用缓冲液重建这种冻干的粉末提供了用于肠胃外给予的配制品。精确量依赖于治疗的适应症和选择的化合物。这种量可以凭经验确定。
c.局部给予(Topical administration)
局部混合物(Topical mixtures)如针对局部(local)和全身给予所述而制备。所得混合物可以是溶液、悬液、乳液等，并且被配制为乳膏、凝胶、软膏剂、乳液、溶液、酏剂、洗剂、悬液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂(irrigations)、喷雾、栓剂、绷带、皮肤贴剂或任何其它的适合局部给予的配制品。
化合物或去药物学可接受衍生物可以配制为气雾剂用于局部施用，如通过吸入施用(参见例如U.S.Patent No.4,044,126，4,414,209，和4,364,923，其描述了用于输送治疗炎症特别是哮喘的类固醇的气雾剂)。这些用于给予呼吸道的配制品可以呈气雾剂或者用于喷雾器的溶液形式，或者作为微细粉末用于吸入法，其单独或者与惰性载体如乳糖组合。在这种情况中，配制品的颗粒典型地为直径小于50微米，优选小于10微米。
化合物可以配制用于局部(local)或局部(topical)施用，如局部(topical)施用于皮肤或粘膜，如眼中，其形式为凝胶、乳膏和洗剂，及施用于眼睛或者用于脑池内或脊柱内施用。本发明包括局部(Topical)给予以用于经皮输送以及用于给予眼睛或粘膜，或者用于吸入疗法。也可以给予活性化合物单独或者与其它药物学可接受赋形剂组合的鼻用溶液。
本发明提供了适合经皮给予的配制品。它们可以任何合适形式提供，例如不连续的贴剂，适于与受者的表皮保持紧密接触一段长时间。这种贴剂含有在任选地缓冲的水溶液中的活性化合物，所述活性化合物在水溶液的浓度例如是0.1至0.2M。适于经皮给予的配制品也可以经电离子透入疗法输送(参见例如PharmaceuticalResearch 3(6)，318(1986))并典型采用活性化合物的任选地缓冲的水溶液的形式。
d.用于其它给予途径的组合物
根据治疗的病症，其它给予途径如局部(topical)施用、经皮贴剂、口服和直肠给予也包括在本发明中。例如，用于直肠给予的药物剂量形式是直肠栓剂、用于全身作用的胶囊剂和片剂。直肠栓剂包括用于插入直肠的固体本体，其在体温融化或软化而释放一或多种药物学或治疗活性成分。用于直肠栓剂中的药物学可接受物质是升高熔点的基底(base)或运载体和制剂。基底的例子包括可可油(theobroma oil)、甘油-明胶、carbowax(聚氧乙烯二醇)和脂肪酸单-、二及三甘油酯的合适混合物。可以使用各种基底的组合。升高栓剂熔点的制剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压制方法或模塑制备。直肠栓剂的典型重量是大约2-3克。用于直肠给予的片剂和胶囊剂用与口服给予相同的药物学可接受物质经相同方法制造。
适于直肠给予的配制品可以提供为单位剂量栓剂。它们可以通过将活性化合物与一或多种常规固体载体例如可可油混合，成型所得混合物。
对于口服给予，药物组合物可以采用例如片剂或胶囊剂形式，其经常规方式用药物学可接受赋形剂制备，所述赋形剂如粘合剂(例如预明胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或者湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以用本领域公知方法包衣。
适合含服(舌下)给予的配制品包括例如含有在调味基底通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄耆胶中的活性化合物的锭剂(lozenge)；及含有在惰性基底如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯树胶中的化合物的锭剂(pastille)。
药物组合物还可以通过控制释放配制品和/或输送装置给予(参见例如U.S.Patent Nos.3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；3,847,770；3,916,899；4,008,719；4,687,610；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548；5,354,566；5,591,767；5,639,476；5,674,533和5,733,566)。
已知各种输送系统并且可以用于给予选择的组合物，包括但不限于脂质体中包囊、微粒、微囊、能表达化合物的重组细胞、受体介导的胞吞及编码可溶性透明质酸酶的核酸分子的输送或者其它制剂如逆转录病毒输送系统。
因此，在一些实施方案中，脂质体和/或纳米颗粒也可以用于给予本发明组合物。脂质体从分散在水性介质的磷脂形成并自发形成多层同中心双层小泡(也称为多层小泡(MLV))。MLV通常直径从25nm至4μm。MLV的超声导致形成直径在200至500埃的小单层小泡(SUV)，其在核心中含有水溶液。
当分散在水中时，根据脂质与水的摩尔比，磷脂可以形成脂质体之外的各种结构。脂质体的物理特征依赖于pH、离子强度及二价阳离子的存在。脂质体可以显示对离子和急性物质的低渗透性，但是升高的温度经历相变，其显著改变它们的渗透性。相变涉及从已知为凝胶态的紧密填充的有序结构向已知为流体态的松散填充的不太有序的结构的变化。这发生在特征性相变温度并且导致对离子、糖和药物的渗透性增加。
脂质体与细胞经不同机制相互作用：网状内皮组织系统的吞噬细胞如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的胞吞；吸附至细胞表面，经非特异性弱疏水或静电力，或者经与细胞表面成分的特异性相互作用；通过脂质体的脂双层插入到质膜中与细胞质膜融合，同时释放脂质体内容物至细胞质中；以及经脂质体脂质转移到细胞或亚细胞膜，或者反之，无需与脂质体内容物有任何关联。改变脂质体配方可以改变运行的机制，尽管在同一时间可以有一种以上机制运行。纳米囊通常可以以稳定和可重复方式捕获化合物。为避免由于细胞内聚合物过载导致的副作用，这种超细颗粒(大小约0.1μm)应使用能体内降解的聚合物设计。满足这些要求的生物可降解聚烷基氰基丙烯酸酯纳米颗粒可用于本发明，这种颗粒可以容易制备。
2.剂量和给予
活性剂例如透明质酸降解酶如透明质酸酶和/或第二种药剂以足够引起治疗有用作用不存在不希望的副作用的量包括进来。例如，如本文其它处所述，修饰的可溶性透明质酸酶以维持血浆中至少或大约3U/mL的足够量配制用于全身给予，通常为3U/mL-12U/mL或更高，例如大约或在4U/mL，5U/mL，6U/mL，7U/mL，8U/mL，9U/mL，10U/mL，11U/mL，12U/mL，13U/mL，14U/mL，15U/mL，16U/mL，17U/mL，18U/mL，19U/mL，20U/mL，25U/mL，30U/mL，35U/mL，40U/mL，45U/mL，50U/mL或更高的水平。
确定维持血液中至少3U/mL透明质酸酶所用的修饰的透明质酸降解酶例如修饰的可溶性透明质酸酶的量属于本领域技术人员水平范围。血液中透明质酸酶水平可以随时间监测以包装足够量的透明质酸酶存在于血液中。可以进行本领域技术人员已知的任何测量血浆中的透明质酸酶的测定。例如，可以在血浆中的蛋白质上进行实施例所述的微浊度测定或酶学测定。应理解血浆正常含有透明质酸酶。这种血浆透明质酸酶典型在酸性pH具有活性(U.S.Patent No.7,105,330)。因此，在用修饰的酶治疗之前，应确定血浆透明质酸酶水平并用作基线。治疗后血浆透明质酸酶的后续测量可以与治疗前水平进行比较。或者，可以在抑制血浆中内源溶酶体透明质酸酶活性(其正常在酸性pH显示活性)的pH条件下进行测定。因此，当修饰的可溶性透明质酸酶在中性pH下有活性时(例如人PH20)，仅测量修饰的中性活性可溶性透明质酸酶的水平。
含有活性剂的组合物可以包括药物学可接受载体。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统如本文提供的测定中测试化合物而凭经验确定。组合物中透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶或第二种药剂的浓度依赖于复合物的吸收、失活和排泄速率、复合物的理化特征、给药方案及给药量以及本领域技术人员已知的其它因素。例如，例如，应理解精确剂量和治疗持续时间根据治疗的组织确定，并且可以使用已知的检测方案凭经验确定或者通过从体内或者体外检测数据中外推，和/或可以从特定药剂的已知给药方案确定。例如，用于治疗透明质酸相关疾病或病症的药剂和治疗如抗癌剂是本领域公知的。因此，组合物中第二种药剂的剂量可以根据在给定给予途径下针对该药剂的标准给药方案而选择。
应注意浓度和剂量也可以根据治疗的个体的年龄而变化。应进一步了解的是对于任何特定对象，应根据个体需要和给予或者监督所述配制物的给予的人员的专业判断调整特定的给药方案，本文所述浓度范围只是举例说明而无限制其范围之意。组合物可以一小时、一天、一周、一个月、一年给予或者只给予一次。通常地，选择限制毒性的给药方案。应注意由于毒性或者骨髓、肝或者肾或者其它组织功能障碍，主治医生已知怎样及何时终止、中断或者调整治疗方案至较低剂量。相反，如果临床治疗反应不足(排除毒性副作用)，主治医生也已知怎样及何时调整治疗方案至更高水平。
被给予以治疗疾病或病症例如透明质酸相关疾病或病症如富含HA的肿瘤的透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的量可以通过标准临床技术确定。另外，可以采用体外测定和动物模型以帮助鉴别最佳剂量范围。可以根据经验确定的精确剂量可以依赖于特定的酶、给予途径、待治疗的疾病的类型以及疾病的严重性。举例的剂量范围是或者大约是50单位至50,000,000单位的缀合于聚合物的可溶性透明质酸酶，或者功能等价量的缀合于聚合物的另一种透明质酸降解酶。应理解活性单位标准化为标准活性，例如在测定透明质酸酶活性的微浊度测定中测量的活性。
缀合于聚合物的可溶性透明质酸酶如PEG化可溶性透明质酸酶与未如此缀合的天然可溶性透明质酸酶相比可以呈现每mg总蛋白更低的活性，即呈现更低的比活性。例如，如本文其它处所述，举例的rHuPH20制备物显示比活性为120,000单位/mg，而PEG化形式的rHuPH20显示比活性为30,000单位/mg。典型地，PEG化形式的rHuPH20显示在是或大约是26,000至是或大约是38,000U/mg之间范围内的比活性。因此，为实现相等的活性单位，需要更大量总蛋白。例如，缀合于聚合物的透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶需要1.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多的总蛋白(mg)以达到未如此缀合的透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的相同活性单位。为本发明目的，剂量以单位提及。
因此，例如本发明的缀合于聚合物例如PEG的可溶性透明质酸酶可以以或大约以10至50,000,000单位、10至40,000,000单位、10至36,000,000单位、10至12,000,000单位、10至1,200,000单位、10至1,000,000单位、10至500,000单位、100至100,000单位、500至50,000单位、1000至10,000单位、5000至7500单位、5000Units至50,000单位、或1,000至10,000单位给予。当透明质酸降解酶不是缀合于聚合物的透明质酸酶时，其可以以功能等价于是或大约是10至50,000,000单位、10至40,000,000单位、10至36,000,000单位、10至12,000,000单位、10至1,200,000单位、10至1,000,000单位、10至500,000单位、100至100,000单位、500至50,000单位、1000至10,000单位、5000至7500单位、5000Units至50,000单位、或者1,000至10,000单位的量给予。
通常，为保持血浆中至少3U/mL透明质酸酶的本发明目的，给予是或大约是0.02mg/kg(对象)，0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.06mg/kg，0.07mg/kg，0.08mg/kg，0.09mg/kg，0.1mg/kg，0.15mg/kg，0.2mg/kg，0.25mg/kg，0.30mg/kg，0.35mg/kg，0.40mg/kg，0.45mg/kg，0.5mg/kg，0.55mg.kg，0.6mg/kg，0.7mg/kg，0.8mg/kg，0.9mg/kg，1.0mg/kg，1.1mg/kg，1.2mg/kg，1.3mg/kg，1.4mg/kg，1.5mg/kg或更高的量。通常当修饰的透明质酸酶的比活性是或大约是20,000U/mg至60,000U/mg时，通常给予是或大约是35,000U/mg，60,000U；70,000U；80,000U；90,000U；100,000U；200,000U；300,000U；400,000U；500,000U；600,000U；700,000U；800,000U；900,000U；1,000,000U；1,500,000U；2,000,000U；2,500,000U；3,000,000U；3,500,000U；4,000,000U或更多。
典型地，本发明涵盖的透明质酸酶的注射或输注体积是或者大约是0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、30ml、40ml、50ml或者更多。透明质酸降解酶如透明质酸酶可以以原液提供，所述原液为或大约约为50U/ml、100U/ml、150U/ml、200U/ml、400U/ml或者500U/ml(或功能等价量)，或者可以是更浓缩形式，例如为或大约为1000U/ml、1500单位/ml、2000U/ml、4000U/ml或者5000U/ml以直接使用或者在使用之前稀释为有效浓度。给予的透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的体积与所需剂量有关，但是可以根据透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶原液浓度变化。例如，本发明预期透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶给予体积不超过大约50ml，典型为5-30ml体积给予，通常在不超过大约10mL体积给予。可以使用注射泵由医生谨慎决定输注更大体积。给予时间也可以由治疗医生调整。例如，当静脉内给予时，可以用注射泵以在1分钟、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，15、20、25、30或更多分钟期间给予组合物，通常在或大约在15分钟。透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶可以以液体或冻干配制品提供。冻干配制品对于储存大单位剂量透明质酸降解酶是理想的。
在一个实施例中，透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶作为联合疗法的一部分被给予，给予透明质酸降解酶和第二种药剂或治疗用于治疗所述疾病或病症。在一个实施例中，透明质酸降解酶和第二种药剂或治疗可以共配制及一起给予。在另一个实施例中，透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶在第二种药剂或治疗制备物随后、间歇或同时给予。通常透明质酸降解酶在给予第二种药剂或治疗制备物之前给予以允许透明质酸降解酶降解对象的细胞、组织或液体如胞间隙、胞外基质、肿瘤组织、血液或其它组织中的透明质酸。例如，透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶可以在给予第二种药剂制备物之前0.5分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时或更长时间给予。在一些实施例中，透明质酸降解酶与第二种药剂制备物一起给予。本领域技术人员能理解，共给予的希望的邻近显著依赖于在特定组织背景及被治疗的特定疾病中药剂的半衰期，并且可以通过在合适模型如合适动物模型中测试在各种时间给予药剂的作用而优化。在一些情况中，透明质酸降解酶如透明质酸酶的给予的最佳时间将超过60分钟。
第二种药剂及多种药剂或治疗或多种治疗的制备物可以一次性给予，或者可以分成一些更小剂量以间隔给予。选择的药剂/治疗制备物可以在治疗时间过程例如在几小时、天、周或月过程以一或多剂给予。在一些情况中，精确剂量和给予过程依赖于适应症和患者耐受性。通常，本文第二种药剂/治疗的给药方案是本领域技术人员已知的。
3.联合疗法
本文描述的任何组合物或组合可以进一步与其它治疗剂或药物学制剂或治疗如程序例如治疗透明质酸相关癌症的药剂或治疗共配制或在一起、在其之前、间歇或随后共给予。这种药剂包括但不限于其它生物制品、小分子化合物、分散剂、麻醉剂、血管收缩剂和手术，或其组合。用于治疗疾病或病症的这种其它药剂和治疗包括所有本文举例示出的是本领域技术人员已知的或者可以凭经验确定。在另一个实施例中，可以给予局部麻醉剂例如利多卡因以缓解疼痛。在一些实施例中，麻醉剂可以与血管收缩剂联合提供以制剂麻醉作用持续时间。
因此，在一个实施例中，本发明的组合物可以与局部麻醉剂共配制或共给予。麻醉剂包括短期作用和长期局部麻醉药物配制品。短期作用局部麻醉药物配制品含有溶解在盐水或其它合适注射载体中的利多卡因或血管局部麻醉药物。典型地，用短期作用局部麻醉剂进行的局部麻醉持续大约20-30分钟。举例的麻醉剂包括例如非吸入性局部麻醉剂，如氨布卡因；amoxecaines；阿米卡因；阿托卡因；阿替卡因；benoxinates；苯甲醇；苯佐卡因；贝托卡因；biphenamines；丁丫卡因；布美卡因；布比卡因；布他卡因；氨苯丁酯；布坦卡因；carbizocaines；氯普鲁卡因；氯丁卡因；氯达卡因；可卡因；地昔卡因；二胺卡因；辛可卡因；达克罗宁；依鲁卡因；依替卡因；尤普罗辛；fexicaines；福莫卡因；heptacaines；海克卡因；羟普鲁卡因；羟丁卡因；isobutambens；凯托卡因；亮氨卡因；利多卡因；甲哌卡因；美普卡因；octocaines；奥索卡因；oxethacaines；奥布卡因；非那卡因；哌诺卡因；哌罗卡因；匹多卡因；polidocanols；普莫卡因；丙胺卡因；普鲁卡因；丙泮卡因；丙哌卡因；丙氧卡因；丙美卡因；吡咯卡因；夸他卡因；奎尼卡因；利索卡因；罗多卡因；罗哌卡因；水杨酸基醇(salicyl alcohols)；suicaines；丁卡因；曲喷卡因；和三甲卡因；以及各种其它非吸入性麻醉剂如阿法沙龙；阿莫拉酮；乙苯噁啶；芬太尼；氯胺酮；左沙屈尔；美西妥拉；美索比妥；咪达唑仑；米那索龙；西泮尼地；丙帕酯；pramoxines；异丙酚；remifentanyls；sufentanyls；替来他明；和佐拉敏。配制品中的有效量根据特定患者、待治疗疾病、给予途径及其它考虑而变化。这种剂量可以凭经验确定。
由于局部麻醉剂的短半衰期，经常希望将这种麻醉剂与血管收缩剂共给予或共配制。血管收缩剂的例子包括α肾上腺素能受体激动剂，包括including儿茶酚胺和儿茶酚胺衍生物。特定的例子包括但不限于levonordefrin，肾上腺素和去甲肾上腺素。例如局部麻醉配制品如利多卡因可以被配制为含有低浓度肾上腺素或另一种肾上腺素能受体激动剂如levonordefrin。将局部麻醉剂与肾上腺素能受体激动剂联合在药物制备中很常见(参见例如U.S.Patent No.7,261,889和5,976,556)。需要血管收缩剂以增加麻醉剂的半衰期。血管收缩剂如肾上腺素刺激注射组织中的血管上的α肾上腺素能受体。这对于收缩组织中的血管有作用。血管收缩导致局部麻醉剂停留在组织中更长时间，导致麻醉作用持续时间大大增加。
通常，血管收缩剂与麻醉剂联合用于本发明。麻醉剂和血管收缩剂可以作为单个药物组合物的部分一起给予或者作为不同药物组合物的部分一起给予，只要血管收缩剂在麻醉剂已给予以产生延长的麻醉的附近起收缩血管作用即可。在一个实施例中，麻醉剂和血管收缩剂一起在溶液中给予。另外，麻醉剂和血管收缩剂可以与本发明组合物配制在一起或者分开配制。优选单一配制品。麻醉剂和血管收缩剂可以通过注射、通过渗入或通过局部给予例如作为凝胶或糊剂的一部分而给予。典型地，麻醉剂和血管收缩剂可以通过直接注射进待麻醉部位而给予，例如通过皮下给予。配制品中的有效量根据特定患者、待治疗疾病、给予途径及其它考虑而变化。这种剂量可以凭经验确定。例如举例的利多卡因的量是或大约是10mg至1000mg，100mg至500mg，200mg至400mg，20mg至60mg，or 30mg至50mg。给予的利多卡因的剂量根据个体及给予途径而变化。肾上腺素可以如下量给予，例如10μg至5mg，50μg至1mg，50μg至500μg，50μg至250μg，100μg至500μg，200μg至400μg，1mg至5mg or 2mg至4mg。典型地，肾上腺素可以与利多卡因以1∶100,000至1∶200,000稀释度组合，其意味着100ml麻醉剂含有0.5-1mg肾上腺素。给予的体积可以根据待治疗的疾病及给予途径而调整。举例的体积包括1-100ml，1-50ml，10-50ml，10-30ml，1-20ml，或1-10ml，典型地10-50ml麻醉剂/血管收缩剂配制品。给予可以是与本发明的可溶性透明质酸酶的组合物和其它药剂的给予相继、同时或间歇进行。
4.包装和制造品
本发明还提供了制造品，其含有包装材料、有效治疗透明质酸相关疾病或病症的药物组合物及指示所述组合物和组合用于治疗透明质酸相关疾病或病症的标签。在一个实施例中，药物组合物含有透明质酸降解酶，没有第二种药剂或治疗。在另一个实施例中，制造品含有透明质酸降解酶和第二种药剂或治疗或者一些药剂或治疗。在这个实施例中，第二种药剂和透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的药物组合物可以一起或单独提供，用于包装为制造品。举例的制造品是含有单个室的容器和双室的容器。容器包括但不限于管、瓶子和注射器。容器可以进一步包括用于皮下给药的针。
本发明的制造品含有包装材料。用于包装药品的包装材料是本领域技术人员熟知的。参见例如美国专利5,323,907，5,033,252和5,052,558，每个均以其全文引入本文。药物包装材料的例子包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶及任何适合选择的配方和目的给予及治疗模式的包装材料。本发明包括各种本发明化合物和组合物的配制品以及针对任何透明质酸相关疾病或病症的治疗。
有效用于治疗透明质酸相关疾病或病症的组合物(例如含有透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的组合物和/或第二种药剂或治疗，一起或者单独提供的)也可以作为试剂盒提供。试剂盒可包含本文描述的药物组合物以及给予项目。例如组合物可以由给予装置提供，如注射器、吸入器、剂量杯、滴管或者涂药器。所述试剂盒可任选包含使用说明书，包括剂量、给药方案和给予模式说明书等内容。试剂盒也可以包含本文描述的药物组合物以及诊断项目。例如，这种试剂盒可包含测量透明质酸的浓度、量或者活性的项目。
G.评估活性、生物利用度和药动学的方法
可使用一些测定评估对象是否具有与透明质酸相关疾病、病症或失调相关的标记及因此适合于用本发明方法进行治疗。这种测定可以包括测量透明质酸的量，测量组织间隙液压、血管体积和水含量。还可以使用测定评估透明质酸降解酶包括可溶性透明质酸酶的体外和体内活性，以及其它药剂例如化疗剂在存在和/或不存在透明质酸降解酶如可溶性修饰的透明质酸酶情况下的体外和体内活性。这种测定包括评估与修饰的透明质酸降解酶如PEG化透明质酸降解酶(例如PEG化可溶性透明质酸酶)共给予的药剂的药动学性质包括生物利用度和耐受性的那些测定。这种测定可用于例如确定用于治疗的修饰的透明质酸降解酶及任选地共给予的药剂如化疗剂的合适剂量以及给药频率。
1.评估透明质酸降解酶活性的测定
透明质酸降解酶活性可以通过使用本领域熟知的方法评估。例如，用于透明质酸酶的USP XXII测定在酶与HA于37℃反应30分钟后，通过测量剩余的未降解透明质酸(HA)的量而间接确定活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645 United States Pharmacopeia Convention，Inc，Rockville，MD)。在确定任何透明质酸酶单位表示的活性的测定中可以使用透明质酸酶参考标准(USP)或国家配制(National Formulary，NF)标准透明质酸酶溶液。在一个实施例中，使用微浊度(microturbidity)测定法测量活性。这种方法基于当透明质酸与血清白蛋白结合时形成不溶的沉淀。通过将透明质酸酶与透明质酸钠(透明质酸)保温一定时间(例如10分钟)，然后加入酸化的血清白蛋白沉淀未消化的透明质酸钠，由此测量活性。在额外一段显色时间之后，在640nm测量所得样品的浊度。得自透明质酸酶活性作用在透明质酸钠底物上的浊度降低用以测量透明质酸酶活性。在另一个实施例中，使用微滴定测定测量透明质酸酶活性，其中在与透明质酸酶保温后测量残余的生物素化的透明质酸(见例如Frost and Stern(1997)Anal.Biochem.251：263-269，美国专利出版物20050260186)。透明质酸的葡糖醛酸上的游离羧基被生物素化，将生物素化的透明质酸底物与微滴定平板共价结合。在与透明质酸酶保温后，使用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应监测残余的生物素化透明质酸底物，并与在与已知活性的透明质酸酶标准物反应之后获得的结果对比。测量透明质酸酶活性的其它测定为本领域已知且可用于本发明的方法中(见例如Delpech et al.，(1995)Anal.Biochem.229：35-41；Takahashi et al.，(2003)Anal.Biochem.322：257-263)。Biochem.251：263-269，U.S.Patent Publication No.20050260186)。
也评估了透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶(例如PEG化rHuPH20)作为播散剂或者分散剂的能力。例如，可以将台盼蓝染料与或者不与透明质酸降解酶一起注射如皮下或真皮内注射进裸鼠每一侧的侧面皮肤中。然后使用如测微计测量染色面积，以确定透明质酸降解酶作为播散剂的能力(美国公布专利No.20060104968)。如上所述及以下实施例1证实，也可以用动物模型和/或人类对象例如在临床试验背景下体内评估透明质酸降解酶如透明质酸酶与另一种药剂如化疗剂的共给药对该药剂的药动学和药效学性质的作用。不是透明质酸酶的透明质酸降解酶的功能活性可以用任一这些测定与透明质酸酶进行比较。可以进行比较以确定透明质酸降解酶的功能等价量。例如，透明质酸降解酶用作播散剂或扩散剂的能力可以通过将其与台盼蓝一起注射(例如皮下或真皮内)进小鼠体侧皮肤中评估，可以确定实现例如100单位透明质酸酶参考标准相同扩散量所需的量。所需的透明质酸降解酶的量因此功能等价于100透明质酸酶单位。也可以测量在用修饰的透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶治疗之前和之后如在肿瘤中的导水率(K)以评估修饰的透明质酸降解酶制备物的活性。
修饰的透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶包括PEG化透明质酸酶影响上述任一或多种与透明质酸相关疾病和失调相关的标记或者任何其它相关标记或表型的能力可以用任一或多种上述测定进行评估。例如，修饰的透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶降低透明质酸水平或含量、halo形成或大小、组织间隙液压、水含量和/或血管体积的能力可以用上述任一或多种测定在体外、离体和/或体内评估。在一个实施例中，修饰的透明质酸酶可以给予患有肿瘤的对象或合适的动物模型，评估对透明质酸水平、halo形成或大小、组织间隙液压、水含量和/或血管体积的作用，并与未被给予修饰的透明质酸酶的对象或动物模型进行比较。在一些实施例中，修饰的透明质酸酶可以与另一种药剂如化疗剂一起给药。
2.药动学和耐受性
药动学和耐受性研究可以使用动物模型进行或者在临床研究期间用患者进行，以评估与修饰的透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶共给药对药剂如化疗剂的性质的作用。动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、豚鼠和非人灵长类动物模型，如猕猴或者恒河猴。在一些情况中，药动学和耐受性研究是使用健康动物进行。在其它实施例中，该研究是使用具有认为应予以透明质酸治疗的疾病的动物模型进行，如具有任何透明质酸相关疾病或者病症的动物模型进行。
例如与修饰的透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶共给予的化疗剂的药动学可以通过测量给予后的如下参数评估：最大(峰)化疗剂浓度(Cmax)，高峰期(即最大化疗剂浓度出现时，Tmax)，最小化疗剂浓度(即化疗剂剂量之间最小浓度，Cmin)，消除半衰期(T1/2)以及曲线下面积(即在时间对应浓度绘图而产生的曲线下的面积，AUC)。皮下给予化疗剂时，化疗剂的绝对生物利用度通过对比在皮下输送后化疗剂的曲线下面积(AUCsc)与静脉内输送后化疗剂的AUC(AUCiv)而确定。绝对生物利用度(F)可以使用下式计算：F＝([AUC]sc×剂量sc)/([AUC]iv×剂量iv)。在皮下给予之后血浆中化疗剂的浓度可以通过使用本领域已知的适于评估血液样品中化疗剂的浓度的任何方法测量。
在药动学研究中可以给予一系列剂量和不同的给药频率，以评估增加或者降低剂量中的共给予的药剂如化疗剂和/或修饰的透明质酸降解酶(例如PEG化rHuPH20)的浓度的影响。皮下给予的化疗剂的药动学性质如生物利用度也可以与或者不与修饰的透明质酸酶共给予而进行评估。例如，可以使用一或多种给予途径给予狗如小猎犬单独的化疗剂或者与修饰的透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶组合给予。可以进行这种研究以评估与透明质酸酶共给予对于化疗剂的药动学性质如生物利用度的作用。
评估安全性和耐受性的研究为本领域已知且可用于本发明中。在与或者不与修饰的透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶共给予的药剂如化疗剂的给予之后，可以监测任何不利反应的发生。不利反应可包括但不限于注射部位的反应，如水肿或者肿胀、头痛、发热、疲劳、寒战、面红、头晕、荨麻疹、哮喘或者胸闷、恶心、呕吐、僵直、背痛、胸痛、肌肉痉挛、癫痫或者抽搐、血压改变以及过敏性或者严重超敏性反应。典型地，在安全和耐受性研究中给予一系列剂量和不同的给药频率，以评估增加或者降低剂量中的化疗剂和/或修饰的透明质酸降解酶(例如修饰的透明质酸酶)的浓度的影响。
3.动物模型
透明质酸相关疾病、失调或病症的动物模型可以用于评估与另一种药剂如化疗剂共给药或不共给药而给予修饰的透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶的体内影响。可以使用合适动物模型的举例的透明质酸相关疾病包括例如晚期癌症、转移癌、未分化癌症、卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和其它癌症。透明质酸相关疾病或病症的例子还包括椎间盘压力、癌症和水肿，例如由器官移植、卒中、脑创伤或其它损伤导致的水肿。
动物模型可以包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、豚鼠和非人灵长类模型如猕猴(cynomolgus monkeys)或恒河猴(rhesus macaques)。在一些实施例中，免疫缺陷小鼠如裸鼠或SCID小鼠被移植来自透明质酸相关癌症的肿瘤细胞系以建立癌症的动物模型。举例的来自透明质酸相关癌症的细胞系包括但不限于PC3前列腺癌细胞、BxPC-3胰腺腺癌细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞、MCF-7乳腺肿瘤细胞、BT474乳腺肿瘤细胞、Tramp C2前列腺肿瘤细胞和Mat-LyLu前列腺癌细胞，以及本文描述的与透明质酸相关的例如含有升高的透明质酸水平的其它细胞系。修饰的透明质酸酶然后可以给予小鼠以评估对例如透明质酸水平或含量、halo形成或大小、组织间隙液压、水含量和/或血管体积的作用。在一些实施例中，化疗剂与修饰的透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶共给予，并且评估对例如药动学、肿瘤大小或发病率的作用。
H.透明质酸降解酶在治疗透明质酸相关病症、疾病和失调中的应用
本文描述的方法包括透明质酸降解酶的治疗应用。以下描述的治疗应用是举例性的，并不限制本文描述方法的应用。
本发明方法包括使用透明质酸降解酶治疗任何透明质酸相关疾病或病症的方法，包括但不限于富含透明质酸的癌症及与透明质酸相关的其它癌症，如与升高的组织间隙液压相关的其它疾病，如与椎间盘压力和水肿相关的疾病，及其它透明质酸相关疾病和病症，所述水肿例如是由器官移植、卒中、脑创伤或其它损伤导致的水肿或其它水肿。
富含透明质酸的癌症包括与升高的组织间隙液压相关的癌症、实体肿瘤、晚期癌症、转移癌、未分化癌症，例如但不限于卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌和其它癌症。
治疗应用包括给予组合物，单独或与其它治疗或药剂联用，用于治疗透明质酸相关疾病或病症，包括癌症治疗、降低肿瘤体积、增加对化疗或其它癌症治疗的敏感性、增强癌症治疗或其它治疗剂的生物利用度或输送、降低组织间隙液压、增加血管体积、降低对象组织中的水含量及其它治疗。
所述方法还包括选择用于治疗的对象，例如在治疗对象之前，例如确定对象是否具有透明质酸相关疾病或病症，例如通过使用测定透明质酸或相关分子的表达的方法，例如使用下述实施例3(a)所述方法，如确定与对照相比的HA表达，所述对照如对照组织、细胞、液体或其它样品，例如来自正常对象(例如不具有透明质酸相关疾病的对象)的组织、细胞、液体，已知表达相对低水平HA的样品(例如细胞系)，如本文描述的举例的肿瘤细胞系，例如HCT 116细胞系、HT29细胞系、NCI H460细胞系、DU145细胞系、Capan-1细胞系及来自用这种细胞系产生的肿瘤模型的肿瘤(参见例如实施例17A)。
在这个实施例中，在来自对象的样品中测量一或多种标记例如透明质酸或HAS2的表达，并任选与另一种样品或标准比较。在测量后，确定所述疾病或病症是否是透明质酸相关疾病或病症。在一个实施例中，所述方法进一步包括治疗，例如给予含有可溶性透明质酸酶的组合物单独或与一或多种其它治疗联合。所述方法进一步包括评估治疗，如测量对象的细胞、组织或液体中的透明质酸水平。
1.透明质酸相关病症和疾病
本发明提供了通过给予含有透明质酸降解酶如透明质酸酶例如可溶性透明质酸酶的组合物单独或联合另一种治疗和/或药剂或者在另一种治疗和/或药剂给予之外给予而治疗透明质酸相关疾病或病症的方法，所述可溶性透明质酸酶典型地是通过缀合于聚合物而修饰(例如增加半衰期)。
透明质酸相关病症和疾病是其中透明质酸水平升高作为疾病或病症的原因、结果或在疾病或病症中观察到的疾病或病症，并且可以通过给予含有透明质酸降解酶如透明质酸酶例如可溶性透明质酸酶单独或者联合另一种治疗和/或药剂或在另一种治疗和/或药剂给予之外给予而治疗。
典型地，透明质酸相关疾病或病症与相比于对照例如另一种组织、细胞或体液在组织、细胞或体液(例如肿瘤组织或肿瘤相关组织、血液或胞间隙)中升高的透明质酸表达。升高的透明质酸表达可以是相比于正常组织、细胞或体液升高，所述正常组织、细胞或体液例如是与被测试样品类似的组织、细胞或体液，但是分离自不同对象，如正常对象(即不具有疾病或病症，或者不具有被测试对象类型的疾病或病症。升高的透明质酸表达可以是相比于来自另一个对象的类似组织而言升高，所述另一个对象具有相似疾病或病症但是其疾病不同样严重和/或不是透明质酸相关的或者表达相对较低透明质酸并因此与透明质酸相关性程度较低。例如，被测试的对象可以是具有透明质酸相关癌症的对象，其中组织、细胞或液体中的HA量与具有不太严重癌症如早期、分化或其它类型癌症的对象相比是升高的。在另一个实施例中，细胞、组织或液体含有相比于对照样品升高的透明质酸水平，所述对照样品例如是具有已知量或相对量HA的液体、组织、提取物(例如细胞或核提取物)、核酸或肽制备物、细胞系、生物活检、标准或其它样品，如已知表达相对低水平HA的样品例如肿瘤细胞系，如本文描述的表达低水平HA的举例的肿瘤细胞系，例如HCT 116细胞系、HT29细胞系、NCI H460细胞系、DU145细胞系、Capan-1细胞系及来自用这种细胞系产生的肿瘤模型的肿瘤(参见例如实施例17A)。
在一些情况中，透明质酸相关疾病或病症与增加的组织间隙液压、降低的血管体积和/或增加的组织如肿瘤中水含量相关。在一个实施例中，用本发明的组合物和化合物治疗改善一或多种这些症状或者与所述疾病或病症相关的其它症状，例如改善对象随时间的存活率或生活质量，或者抑制肿瘤生长。
可以用本发明的酶、组合物和方法治疗的透明质酸相关疾病或病症包括但不限于富含透明质酸的癌症例如肿瘤，包括实体肿瘤如晚期癌症、转移癌、未分化癌症、卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和其它癌症。
举例的透明质酸相关疾病或病症还包括与升高的组织间隙液压相关的疾病，如与椎间盘压力和水肿相关的疾病，所述水肿例如由器官移植、卒中、脑创伤或其它损伤导致的水肿。举例的透明质酸相关疾病或病症包括与升高的组织间隙液压、降低的血管体积和/或增加的组织中水含量相关的疾病或病症，包括癌症、椎间盘压力和水肿。在一个实施例中，治疗透明质酸相关病症、疾病或失调包括改善、降低增加的组织间隙液压(IFP)、降低的血管体积或增加的组织中水含量之一或多种或对它们的其它有益作用。
典型地，透明质酸相关的疾病或病症与增加的HA表达例如在疾病组织例如肿瘤中的增加的HA表达相关。在一个实施例中，在对象组织例如疾病组织中形成HALO(富含蛋白聚糖包括透明质酸的细胞周基质区)。在另一个实施例中，在来自对象的组织例如疾病组织的细胞的体外培养物中检测到HALO的存在。
在一个实施例中，透明质酸相关的病症、疾病或失调与增加的组织间隙液压、降低的血管体积或增加的组织中水含量相关。在一个实施例中，治疗透明质酸相关病症、疾病或失调包括改善、降低增加的组织间隙液压(IFP)、降低的血管体积或增加的组织中水含量之一或多种或对它们的其它有益作用。
癌症，包括富含透明质酸的癌症
透明质酸在与细胞运动性相关的过程中起作用，包括发育、再生、修复、胚胎发生、胚胎学发育、伤口愈合、血管发生和肿瘤发生(Toole 1991Cell Biol.Extracell.Matrix，Hay(ed.)，Plenum Press，New York，1384-1386；Bertrand et al.1992 Int.J.Cancer 52：1-6；Knudson et al，1993 FASEB J.7：1233-1241)。另外，透明质酸水平与肿瘤进攻性相关(Ozello et al.1960 Cancer Res.20：600-604；Takeuchi et al.1976，Cancer Res.36：2133-2139；Kimata et al.1983Cancer Res.43：1347-1354)；透明质酸促进一些癌症过程，包括但不限于，肿瘤生长、存活、转移及组织间隙液压。可以用含有可溶性透明质酸酶的本发明组合物和方法治疗的举例的透明质酸相关疾病或病症是癌症，特别是富含透明质酸的癌症，例如与升高的组织间隙液压相关的富含透明质酸的癌症。
透明质酸相关癌症是与透明质酸表达、典型地升高的透明质酸表达相关的癌症，其可以例如在治疗前确定，如以下章节所述。
例如，富含透明质酸的癌症可以这样的癌症，其中癌细胞在体外颗粒排阻测定中产生HALO的癌症，如实施例6A所述，具有升高的透明质酸表达的癌症(如通过免疫染色确定，例如来自肿瘤的切片的组织学染色)，具有升高的HAS2(透明质酸合酶2)的癌症，体外不产生透明质酸酶(HYAL1)的癌症，如例如用实施例2所述的酶测定确定的那样。富含透明质酸的癌症可以通过评估透明质酸表达的任何方法鉴别，例如以下章节3(a)中提供的测定，以及测定蛋白质/mRNA表达的其它已知方法。
已鉴别了几种富含透明质酸的癌症。在一些情况中，透明质酸表达与预后不良相关，例如降低的存活率和/或无复发存活率、转移、血管发生、癌细胞侵袭进其它组织/区域以及其它预后不良指征。这种相关已经在例如富含透明质酸的肿瘤包括卵巢癌、SCC、ISC、前列腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌中观察(参见例如，Maarit et al.，Cancer Research，60：150-155(2000)；Karvinen et al.，British Journal of Dermatology，148：86-94(2003)；Lipponen et al.，Eur.Journal of Cancer，849-856(2001)；Pirinen et al.，Int.J.Cancer：95：12-17(2001)；Auvinen et al.，AmericanJournal of Pathology，156(2)：529-536(2000)；Ropponen et al.，Cancer Research，58：342-347(1998))。因此，富含透明质酸的癌症可以通过给予透明质酸降解酶如透明质酸酶而治疗，以治疗癌症的一或多种症状。富含透明质酸的肿瘤包括但不限于前列腺、乳腺、结肠、卵巢、胃、头颈部及其它肿瘤和癌症。
例如，透明质酸酶当注射进肿瘤时具有直接的抗癌作用。透明质酸酶防止移植进小鼠的肿瘤的生长(De Maeyer et al.，(1992)Int.J.Cancer 51：657-660)并且在暴露于致癌物时抑制肿瘤形成(Pawlowski et al.(1979)Int.J.Cancer 23：105-109)。透明质酸酶作为唯一治疗剂在治疗脑癌(胶质瘤)中是有效的(WO 198802261)。
因此，本发明提供了酶、含有透明质酸降解酶如修饰的可溶性透明质酸酶的组合物和组合，用于治疗癌症，典型地透明质酸相关癌症。
2.治疗透明质酸相关疾病或病症中的应用
本发明提供了治疗透明质酸相关疾病或病症的方法。所述方法包括给予所述组合物单独或与其它治疗或药剂联用，用于治疗透明质酸相关疾病或病症，包括癌症治疗、降低肿瘤体积、增加对化疗或其它癌症治疗的敏感性、增强癌症治疗或其它治疗剂的生物利用度或输送、降低组织间隙液压、增加血管体积、降低对象组织中的水含量及其它治疗。
所述方法还包括选择对象用于治疗，例如在治疗对象之前，例如确定所述对象是否具有透明质酸血管疾病或病症，例如通过使用测定透明质酸或相关分子的表达的方法，例如使用下述实施例b描述的方法进行确定。在这个实施例中，在来自对象的样品中测量一或多种标记例如透明质酸或HAS2的表达，并任选地与另一样品或标准进行比较。在测量后，确定所述疾病或病症是否是透明质酸相关疾病或病症。在一个实施例中，所述方法进一步包括治疗，例如给予含有可溶性透明质酸酶的组合物单独或者与一或多种其它治疗联用。
在本发明方法中，提供通过给予含有可溶性透明质酸酶的组合物降低患有透明质酸相关疾病或病症例如透明质酸相关癌症的对象组织中的组织间隙液压的方法。典型地，IFP的降低持续例如24、48或72小时。还提供了通过给予所述组合物增加对象组织中血管体积的方法，典型地针对血管体积持续降低例如至少24、48或72或更多小时。还提供了用所述组合物降低对象组织中的水含量的方法，其中作用典型地持续例如至少24、48或72或更多小时。还提供了用上述组合物降低对象中透明质酸表达的方法，例如降低对象组织中的细胞周基质HALO。典型地，给予后，降低持续例如至少24、48、72或更多小时。
a.透明质酸相关疾病标记物的检测(用于治疗和评估治疗作用的对象的选择)
所述方法包括选择对象用于用透明质酸降解酶治疗，评估治疗效果如治疗功效。这种方法包括检测透明质酸相关疾病标记的方法，其包括任何如下指征，即对象具有透明质酸相关疾病，对象很可能应答透明质酸降解酶治疗，和/或来自对象的样品如组织、细胞或液体含有升高的透明质酸表达。举例的检测标记的测定如下所述，包括测量来自对象的样品中的HA表达和/或相对HA表达的测定，分析透明质酸降解酶对来自对象的样品的作用的测定，及测量典型与某些透明质酸相关疾病/病症相关的读出如低透明质酸酶表达或活性、高组织间隙液压、血管体积和水含量的测定。通常，检测来自对象的样品中的蛋白质或核酸或者评估治疗对体外细胞/组织的作用的任何已知测定均可以使用。
选择用于本发明方法治疗的对象包括与不具有所述疾病或病症的对象相比或者与不具有升高的、异常的或积累的HA表达的正常组织或样品相比具有升高的、异常的或积累的透明质酸表达的对象。来自对象的任何样品或组织可以被测试并与正常样品或组织进行比较。透明质酸水平可以从任何来源测量，例如来自组织(例如经生物活检)、肿瘤、细胞或者来自血液、血清、尿或其它体液。例如，如本文它处所述，实体肿瘤中HA沉积的谱通常已分类为细胞周或间质的。升高的HA血浆水平已被观察到在具有Wilm瘤、间皮瘤和肝转移。因此，根据疾病或病症，可以测量不同样品的透明质酸水平。样品的选择属于本领域技术人员水平。
用于测量透明质酸酶底物水平的测定与疾病或病症相关并且可以基于特定疾病或病症选择。本领域技术人员熟悉检测透明质酸的方法，其包括但不限于免疫组织化学方法、ELISA法，如以下章节(i)所述。
在一个实施例中，检测标记的步骤在治疗对象之前进行，以例如确定对象是否具有适于用透明质酸降解酶治疗的透明质酸相关病症或疾病。在这个实施例中，如果标记被检测到(例如如果确定来自患者的细胞、组织或液体含有升高的透明质酸表达或者应答透明质酸降解酶)，则进行治疗步骤，其中透明质酸降解酶被给予对象。在一个实施例中，当标记未被检测到时(例如如果确定确定来自患者的细胞、组织或液体含有正常的或未升高的透明质酸表达或者不应答透明质酸降解酶)，则可以选择另一种治疗选择。
在另一个实施例中，检测标记的步骤在治疗对象之后或者在治疗对象期间(例如用透明质酸降解酶(例如可溶性修饰的透明质酸酶)(具有或不具有共给予的药剂))进行，以确定用透明质酸降解酶治疗释放对治疗疾病或病症有作用。在一个这种实施例中，标记不被检测或者被检测到其量或相对水平相比于治疗前的量/水平或者相比于另一个样品降低，持续治疗，进行另一轮治疗，或者启动另一种治疗如联合治疗。在另一个这种实施例中，如果标记被检测到与治疗前或另一个样品相同水平，可以选择另一治疗选择。
i.用于透明质酸相关疾病标记物的测定
透明质酸相关疾病或病症的标记物的测定包括测量对象的组织、细胞和/或体液例如肿瘤中的透明质酸的量(例如相对量)和/或透明质酸酶表达。这种测定包括可以检测来自对象的样品中的HA表达、透明质酸合酶2(HAS2)表达、HALO的存在(富含蛋白聚糖包括透明质酸的细胞周基质区)及透明质酸降解酶如透明质酸酶的存在的那些测定。
检测蛋白质和核酸水平的测定是本领域熟知的并且可以用于本发明方法中以测量透明质酸、透明质酸合酶或其它蛋白质和/或核酸表达。这种测定包括但不限于ELISA，SDS-PAGE，Western印迹，PCR，RT-PCR，免疫组织化学和流式细胞术。例如，来自对象的样品如组织样品(例如患者或动物模型的肿瘤的生物活检，间质样品)、液体(例如血液、尿、血浆、唾液或其它样品)、细胞或细胞样品或提取物或其它样品可以用抗HA抗体染色，例如使用组织学染色，如固定或冷冻组织切片的免疫组织化学(IHC)，以确定组织或样品中透明质酸的存在和程度(见例如实施例8.B.2)，或者免疫荧光细胞染色，pull-down测定和流式细胞术。在另一个实施例中，样品例如生物活检可以经RT-PCR测定以评估HA mRNA的量。
检测癌症中透明质酸表达的已知方法包括但不限于Lokeshwar et al.，Cancer Res.57：773-777(1997)所述的ELISA样测定，用于测量患有膀胱癌的对象的尿或膀胱组织提取物中的HA水平。为进行测定，尿或提取物包被在微孔板上(用作标准的脐带HA也包被)，随后与标记的(例如生物素化)HA结合蛋白如本文描述的那些蛋白保温(例如室温16小时)，洗涤并用抗生物素蛋白-生物素检测剂底物定量结合于孔的HA结合蛋白。这种方法是本领域公知的。在一个实施例中来自患有HA相关膀胱癌的对象的尿含有的HA水平与来自正常患者(健康对象或者具有其它消化泌尿疾病或病症的对象)的尿/提取物相比升高2-9倍，因此，如果尿中HA水平与正常对象相比升高，例如与正常对象相比升高在或大约在2倍至在或大约在9倍之间，例如升高或大约升高2、3、4、5、6、7、8或9倍，则这种标记物应被检测到。
在进一步的实施例中，肿瘤相比中体外透明质酸表达和产生可以用上述任一种方法评估。类似地，也可以通过例如ELISA、SDS-PAGE、Western印迹、PCR、RT-PCR、免疫组织化学、组织学或流式细胞术测定细胞在体外、离体或体内的透明质酸合酶2(HAS2)产生和/或表达。
在另一个实施例中，确定来自对象的样品中的透明质酸酶的量，例如在血液或血浆中，例如如实施例2所述如使用浊度测定。
在另一个实施例中，从患者分离细胞或其它组织，例如肿瘤细胞，并用于研究确定所述细胞或组织是否应答用透明质酸降解酶体外治疗，例如使用clonogenic测定或者测量细胞或组织如肿瘤细胞应答治疗的生长、增殖和/或存活的任何其它测定。在一个实施例中，使用下述实施例7D所述的研究，将来自对象的癌细胞接种在表面上，如胞外基质或蛋白质混合物，如以商品名Matrigel(BD Biosciences)出售的混合物。在这个实施例中，透明质酸相关标记是细胞或组织对给予透明质酸降解酶的敏感性。在这个实施例中，如果任何性质如细胞的增殖、生长或存活通过添加透明质酸降解酶而抑制或阻断，则确定对象可适合于用含有透明质酸降解酶的组合物治疗。
除了确定透明质酸表达水平的测定外，可以使用其它测定选择用于治疗的对象，和/或评估治疗功效和/或持续时间。组织间隙液压(IFP)可以使用合适的探针或仪器测量。例如，可以使用配有传感器头的导管以测量癌症组织或其它感兴趣组织中的IFP。导管通过手术针的inner bore，其然后插入肿瘤中心。针退出而导管保持在位置中。然后可以用合适的数据采集单元测量IFP(mmHg)(参见例如实施例6B，Ozerdem et al.(2005)Microvasc.Res.70：116-120)。其它测量IFP的方法包括wick-in-needle法(Fadnes et al(1977)Microvasc.Res.14：27-36)。
血管体积可以通过例如超声成像测量，如实施例10所述。这个方法采用高回声微气泡(hyper-echoic microbubbles)以提供被检测的强超声波反射。当被例如静脉内注射进对象或动物模型中时，微气泡由于其大小被捕获在血管空间中。评估组织水含量如肿瘤组织水含量的测定也是本领域已知的。例如，来自肿瘤的样品可以被收获、印迹、称重并急冻之后冻干。然后水重量被报道为组织湿重与干(即冻干)重之比。
肿瘤细胞体外形成细胞周基质(晕圈(halo))的能力可以用颗粒排阻测定评估(参见例如实施例6)。可以将小颗粒(福尔马林固定的红细胞)在例如聚集蛋白聚糖的存在下加入到肿瘤细胞的低密度培养物中，聚集蛋白聚糖是大的聚集的硫酸软骨素蛋白聚糖。在颗粒沉降后，可以在400x放大倍数下观察培养物，以确定肿瘤细胞是否形成任何晕圈。这可以被观察为排阻颗粒的细胞周围的面积。
ii.相对于对照样品透明质酸相关标记物的检测
对于任何检测方法，标记物(如HA表达，对透明质酸降解酶的应答性，HA合酶表达或者透明质酸酶活性)典型地与对照样品相比，从而标记物的检测典型包括确定与对照样品相比读出升高或降低。
例如，对照样品可以是另一种组织、细胞或体液，如正常组织、细胞或体液，例如与被测试样品类似的组织、细胞或体液，但是分离自不同对象，如正常对象(即不具有疾病或病症，或者不具有被测试对象类型的疾病或病症)，例如，不具有透明质酸相关疾病或病症的对象，或者来自具有相似疾病或病症但是其疾病不同样严重和/或不是透明质酸相关的或者表达相对较低透明质酸并因此与透明质酸相关性程度较低的另一个对象的类似组织。例如，当被测试的细胞、组织或液体是具有癌症的对象时，其可以与具有不太严重癌症如早期、分化或其它类型癌症的对象的组织、细胞或液体比较。在另一个实施例中，对照样品是具有已知量或相对量HA的液体、组织、提取物(例如细胞或核提取物)、核酸或肽制备物、细胞系、生物活检、标准或其它样品，如已知表达相对低水平HA的样品例如肿瘤细胞系，如本文描述的表达低水平HA的举例的肿瘤细胞系，例如HCT 116细胞系、HT29细胞系、NCI H460细胞系、DU145细胞系、Capan-1细胞系及来自用这种细胞系产生的肿瘤模型的肿瘤(参见例如实施例17A)。
应理解，特定改变例如HA的增加或降低依赖于所用测定。例如，在ELISA中，在特定波长或蛋白质数量的吸光度的增加或降低倍数(例如用标准曲线确定的)可以相对于对照表示。在PCR测定中，如RT-PCR，可以用本领域已知的方法如用标准与对照表达水平比较(例如表示为变化倍数)。
例如，当测试来自对象的样品中的透明质酸的量时，标记的检测可以确定来自对象的样品(例如癌细胞、组织或液体)中的HA量与对照样品相比是升高的，如前述段落描述的对照样品。在一个实施例中，如果组织、细胞或液体中的HA的量与对照样品相比升高或大约升高0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍或更高，则认为癌症是富含透明质酸的癌症，所述对照样品可以是例如但不限于具有已知量或相对量的HA的液体、组织、提取物(例如细胞或核提取物)、核酸或肽制备物、细胞系、生物活检、标准或其它样品，如已知表达相对低水平HA的样品例如肿瘤细胞系，如本文描述的表达低水平HA的举例的肿瘤细胞系，例如HCT 116细胞系、HT29细胞系、NCIH460细胞系、DU145细胞系、Capan-1细胞系及来自用这种细胞系产生的肿瘤模型的肿瘤(参见例如实施例17A)。
例如，为本文目的，具有富含透明质酸肿瘤的患者可以选择用透明质酸酶单独或联合第二种药剂进行治疗。在这种实施例中，肿瘤可以直接生物活检和并针对HA表达染色。在其它实施例中，可以测定样品如血液或尿样或者与特定肿瘤相关的其它体液样品。测定类型根据肿瘤类型变化，尽管预期可以使用一个以上测定以检测HA。本文针对特定肿瘤提及的测定仅仅是示例的。例如，对于膀胱癌，可以经标准ELISA程序测定尿样的透明质酸。为本文目的，可以选择显示与正常患者对照的尿相比1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多的HA的对象(参见例如Lokeshwar et al.(2000)J.Urol.，163：348-56)。在另一个实施例中，肿瘤细胞可以生物活检并例如用免疫组织化学针对HA染色(参见例如Anttila et al.(2000)Cancer Research，60：150-156；Karvinen et al.(2003)British J of Dermatology，148：86-94；Lipponen et al.(2001)Euro J Can.37：849-856)；Auvinen et al.(2000)American J of Pathology，156：529；)。通常，在这种例子中，如果观察到任何与癌细胞相关HA信号，可以认为肿瘤样品或肿瘤细胞对于HA是阳性的。作为背景染色的阴性对照，细胞可以用透明质酸酶预消化以裂解所有细胞相关HA。样品也可以与来自相同对象的正常细胞或组织进行比较。另外，在这种方法中，细胞相关透明质酸的水平可以被记录为低、中等或高。例如，如果30％，35％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或更多的肿瘤面积显示持续HA信号，则HA表达被认为是高或中等的。典型地，具有中等至高HA的对象的治疗包括在本发明中。
b.治疗癌症中的应用
如上所述，透明质酸在与癌症相关过程中起作用，并且透明质酸水平与肿瘤进攻性相关，肿瘤进攻性的各种标记及预后不良。因此，本发明提供了用透明质酸降解酶和含有透明质酸降解酶包括透明质酸酶的组合物和组合治疗透明质酸相关癌症的方法。癌症包括富透明质酸癌症及与升高的组织间隙液压相关的癌症。
透明质酸相关癌症是与透明质酸表达、典型地升高的透明质酸表达相关的癌症。在一个实施例中，透明质酸表达在来自患癌对象的样品中升高，例如细胞样品、组织、肿瘤间质、血浆、血液或其它样品，例如与来自非疾病组织、细胞、间质、血浆、血液的样品或其它样品或者来自不太严重的癌症例如早期、分化的或其它类型的癌症的样品相比升高的表达。透明质酸水平可以在治疗对象之前如上所述进行测量，例如在上述第3(a)节，经组织学或者其它已知评估多肽或mRNA的表达的方法测量。
在一个实施例中，透明质酸降解酶(例如透明质酸酶)全身给予，例如静脉内(IV)、肌肉内或通过任何其它全身途径。在另一个实施例中，透明质酸降解酶组合物局部给予，例如肿瘤内。
治疗方法包括重复给予透明质酸降解酶，例如每小时、每隔几小时、每天3次、每天2次、每天1次、每隔1天、每3天、每周、每隔1周、每3周、每月给予或其它重复给予，还包括在一段时间连续给予的方法。
在一个实施例中，透明质酸相关癌症的治疗包括以透明质酸依赖方式降低组织间隙液压。例如，静脉内给予透明质酸降解酶如透明质酸酶，特别是给予修饰的可溶性透明质酸酶(例如PEG化rHuPH20)降低在富含透明质酸(PC3)而不是透明质酸缺陷的(NCI H460)人癌异种移植物模型中的升高的组织间隙液压(见下述实施例6、8-9)。如下述实施例所述，组织间隙液压在富含透明质酸动物模型中与肿瘤大小相关。因此，不麻烦提供了治疗癌症的方法，例如通过给予透明质酸降解酶，如可溶性透明质酸酶(例如通过全身给予，包括静脉内给予)，典型地聚合物缀合的透明质酸酶，由此降低具有透明质酸相关癌症的对象中的升高的组织间隙液压。
用透明质酸降解酶如透明质酸酶治疗也可以包括增加血管体积和/或降低肿瘤中水含量，例如通过静脉内给予透明质酸酶。
除了用透明质酸降解酶单独如透明质酸酶单独治疗疾病之外，本文提供的组合物和方法也可以通过将透明质酸降解酶联合化疗剂或其它抗癌剂或治疗给予而治疗透明质酸相关癌症，例如同时或者在给予化疗剂或其它抗癌剂或治疗之前。在这个例子中，透明质酸降解酶如透明质酸酶典型增强化疗剂或其它抗癌剂穿透进入实体肿瘤，由此治疗疾病。透明质酸降解酶如透明质酸酶可以与抗癌剂肿瘤内注射或者针对弥散性癌症或难以到达肿瘤的静脉内注射。
抗癌剂及其它治疗
抗癌剂可以是化疗剂、抗体、肽或基因治疗载体、病毒或DNA。另外，透明质酸降解酶如透明质酸酶可以用于募集肿瘤细胞进入循环库，用于敏化已获得多药耐药性的先前耐化疗的(chemorefractory)肿瘤(St Croix et al.，(1998)Cancer Lett September 131(1)：35-44)。透明质酸降解酶包括透明质酸酶例如rHuPH20也可以增强生物制剂如单克隆抗体、细胞因子和其它药物输送到可积累糖胺聚糖的肿瘤。
可以在透明质酸降解酶如透明质酸酶给予之后、与其同时或之前给予的举例的抗癌剂包括但不限于阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式视黄酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；Alvocidibs；安巴腙；二霉素；阿美蒽醌；Amifostines；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；氨茴霉素；Apaziquones；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；Banoxantrones；Batabulins；巴马司他；BCG Live；贝那昔滨；苯达莫司汀；苯佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；Biricodars；比生群；比生群；Bisnafide Dimesylates；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素c；卡普睾酮；Canertinibs；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；含有聚苯丙生的卡莫司汀；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；Crisnatols；环磷酰胺；阿糖胞苷脂质体；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；达依泊汀α；柔红霉素liposomals；柔红霉素s/道诺霉素；柔红霉素s；地西他滨；地尼白介素2；右尼古地平；Dexonnaplatins；右雷佐生；地扎胍宁；地吖醌；Dibrospidiums；地诺孕素；Dinalins；Disermolides；多西他塞；Dofequidars；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；阿霉素HCL；Docorubicin HCL脂质体注射液；阿霉素；屈洛昔芬；屈他雄酮丙酸酯s；偶氮霉素；依考莫司汀；依达曲沙；Edotecarins；依氟鸟氨酸；Elacridars；依利奈法德；Elliott’s B溶液；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；Enzastaurins；依匹哌啶；表柔比星；阿法依伯汀；依地前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A铵；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；Galarubicins；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/Ozogamicins；吉罗酚；Gimatecans；Gimeracils；格洛沙腙；Glufosfamides；醋酸性瑞林；羟基脲；Ibritumomabs/Tiuxetans；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；Ilomastats；Imatinib mesylates；Imexons；Improsulfans；Indisulams；Inproquones；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2和其它白介素(包括重组白介素)；Intoplicines；Iobenguanes[131-I]；Iproplatins；Irinotecans；伊索拉定；Ixabepilones；酮曲沙；L-亚硝基羟基丙氨酸；兰瑞肽；Lapatinibs；Ledoxantrones；来曲唑；Leucovorins；Leuprolides；亮丙瑞林(Leuprorelides)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNUs；洛莫司汀；Lonafarnibs；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美坦辛；氮芥；Meclorethamines/氮芥；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美法仑lL-PAMs；美诺立尔；美雄烷；巯基嘌呤；6-巯基嘌呤；美司钠；Metesinds；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；M氯苯乙嘧胺；美妥替哌；米帕；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；Mitocarcins；Mitocromins；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；Mivobulins；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；Mubritinibs；霉酚酸；Nandrolone Phenpropionatess；奈达铂；Nelzarabines；奈莫柔比星；硝氨丙吖啶；诺考达唑；Nofetumomabs；诺加霉素；Nolatrexeds；Nortopixantrones；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；Ortataxels；Oteracils；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；Pamidronates；Patubilones；培加酶；培门冬酶；培非司亭；Peldesines；佩里霉素；Pelitrexols；培美曲塞；戊氮芥；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；Perifosines；Picoplatins；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；Pixantrones；Plevitrexeds；Plicamycid光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；Porfimers；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；螺丙醇；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡呋菌素；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；绛色霉素；Sabarubicins；沙芬戈；沙格司亭；Satraplatins；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；Sparfosates；Sparfosic Acids；稀疏霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；Squalamines；链黑菌素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；Sunitinib Malate；6-硫鸟嘌呤(6-TG)；Tacedinalines；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；Tariquidars；牛磺莫司汀；Tecogalans；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26s；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；Thiamiprines；硫代鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；Tiazofurins；噻氯咪索；替洛隆；Timcodars；噻莫西酸；替拉扎明；Topixantrones；托泊替康；托瑞米芬；Tositumomabs；曲贝替定(Ecteinascidin 743)；曲妥珠单抗；曲托龙；Tretinoins/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；Triplatin Tetranitrates；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；乌拉莫司汀；乌瑞替派；戊柔比星；Valspodars；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄霉素A(胍甲环素)；折尼铂；Zilascorbs[2-H]；净司他丁；Zoledronate；佐柔比星；和Zosuquidars，例如：
阿地白介素(例如PROLEUKIN
Figure BPA00001277192101131
)；阿仑珠单抗(例如CAMPATH
Figure BPA00001277192101132
)；阿利维A酸(例如PANRETIN
Figure BPA00001277192101133
)；别嘌呤醇(例如ZYLOPRIM)；六甲蜜胺(例如HEXALEN
Figure BPA00001277192101135
)；Amifostines(例如ETHYOL
Figure BPA00001277192101136
)；阿那曲唑(例如ARIMIDEX
Figure BPA00001277192101137
)；三氧化二砷(例如TRISENOX
Figure BPA00001277192101138
)；天冬酰胺酶(例如ELSPAR
Figure BPA00001277192101139
)；BCG Live(例如TICE
Figure BPA000012771921011310
BCG)；贝沙罗汀(例如TARGRETIN
Figure BPA000012771921011311
)；贝伐珠单抗(AVASTIN
Figure BPA000012771921011312
)；博来霉素(例如BLENOXANE
Figure BPA000012771921011313
)；Busulfanintravenous(例如BUSULFEX
Figure BPA000012771921011314
)；Busulfan orals(例如MYLERAN
Figure BPA000012771921011315
)；卡普睾酮(例如METHOSARB
Figure BPA000012771921011316
)；卡培他滨(例如XELODA
Figure BPA000012771921011317
)；卡铂(例如PARAPLATIN)；卡莫司汀(例如BCNUBiCNU
Figure BPA000012771921011320
)；含有聚苯丙生的卡莫司汀(例如GLIADELWafer)；塞来昔布(例如CELEBREX
Figure BPA000012771921011322
)；苯丁酸氮芥(例如LEUKERAN
Figure BPA000012771921011323
)；顺铂(例如PLATINOL
Figure BPA000012771921011324
)；克拉屈滨(例如LEUSTATIN
Figure BPA000012771921011325
2-CdA
Figure BPA000012771921011326
)；环磷酰胺(例如CYTOXAN
Figure BPA000012771921011327
NEOSAR
Figure BPA000012771921011328
)；阿糖胞苷(例如CYTOSAR-U
Figure BPA000012771921011329
)；阿糖胞苷脂质体(例如DepoCyt
Figure BPA000012771921011330
)；达卡巴嗪(例如DTIC-Dome)：更生霉素(例如COSMEGEN
Figure BPA00001277192101141
)；达依泊汀α(例如ARANESP
Figure BPA00001277192101142
)；柔红霉素liposomals(例如DANUOXOME)；柔红霉素s/道诺霉素(例如CERUBIDINE)；地尼白介素2(例如ONTAK
Figure BPA00001277192101145
)；右雷佐生(例如ZINECARD
Figure BPA00001277192101146
)；多西他塞(例如TAXOTERE
Figure BPA00001277192101147
)；阿霉素s(例如ADRIAMYCIN
Figure BPA00001277192101148
RUBEX
Figure BPA00001277192101149
)；多柔比星脂质体包括Docorubicin HCL脂质体注射液(例如DOXIL)；屈他雄酮丙酸酯s(例如屈他雄酮
Figure BPA000012771921011411
和MASTERONE
Figure BPA000012771921011412
注射液)；Elliott′s B溶液(例如Elliott′s B Solution
Figure BPA000012771921011413
)；表柔比星(例如ELLENCE)；阿法依伯汀(例如EPOGEN)；雌莫司汀(例如EMCYT
Figure BPA000012771921011416
)；磷酸依托泊苷(例如ETOPOPHOS)；依托泊苷VP-16(例如VEPESID
Figure BPA000012771921011418
)；依西美坦(例如AROMASIN
Figure BPA000012771921011419
)；非格司亭(例如NEUPOGEN
Figure BPA000012771921011420
)；氟尿苷(例如FUDR)；氟达拉滨(例如FLUDARA
Figure BPA000012771921011422
)；氟尿嘧啶incl.5-FUs(例如ADRUCIL)；氟维司群(例如FASLODEX
Figure BPA000012771921011424
)；吉西他滨(例如GEMZAR
Figure BPA000012771921011425
)；吉妥珠单抗/Ozogamicins(例如MYLOTARG
Figure BPA000012771921011426
)；醋酸性瑞林(例如ZOLADEX
Figure BPA000012771921011427
)；羟基脲(例如HYDREA
Figure BPA000012771921011428
)；Ibritumomabs/Tiuxetans(例如ZEVALIN)；伊达比星(例如IDAMYCIN
Figure BPA000012771921011430
)；异环磷酰胺(例如IFEX
Figure BPA000012771921011431
)；Imatinib mesylates(例如GLEEVEC
Figure BPA000012771921011432
)；干扰素α-2a(例如ROFERON-A
Figure BPA000012771921011433
)；干扰素α-2b(例如INTRON A
Figure BPA000012771921011434
)；Irinotecans(例如CAMPTOSAR)；来曲唑(例如FEMARA)；Leucovorins(例如WELLCOVORIN
Figure BPA000012771921011437
LEUCOVORIN)；左旋咪唑(例如ERGAMISOL
Figure BPA000012771921011439
)；洛莫司汀/CCNUs(例如CeeBU
Figure BPA000012771921011440
)；Meclorethamines/氮芥(例如MUSTARGEN
Figure BPA000012771921011441
)；醋酸甲地孕酮(例如MEGACF
Figure BPA000012771921011442
)；美法仑/L-PAMs(例如ALKERAN
Figure BPA000012771921011443
)；巯基嘌呤包括6-巯基嘌呤(6-MP；例如PURINETHOL)；美司钠(例如MESNEX
Figure BPA000012771921011445
)；甲氨蝶呤；甲氧沙林(例如UVADEX
Figure BPA000012771921011446
)；丝裂霉素C(例如MUTAMYCINMITOZYTREX
Figure BPA000012771921011448
)；米托坦(例如LYSODREN
Figure BPA000012771921011449
)；米托蒽醌(例如NOVANTRONE
Figure BPA000012771921011450
)；NandrolonePhenpropionatess(例如DURABOLIN-50
Figure BPA000012771921011451
)；Nofetumomabs(例如VERLUMA
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)；奥普瑞白介素(例如NEUMEGA
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)；奥沙利铂(例如ELOXATIN
Figure BPA000012771921011454
)；紫杉醇(例如PAXENE
Figure BPA000012771921011455
TAXOL)；Pamidronates(例如AREDIA
Figure BPA000012771921011457
)；培加酶(例如ADAGEN)；培门冬酶(例如ONCASPAR
Figure BPA000012771921011459
)；培非司亭(例如NEULASTA
Figure BPA000012771921011460
)；喷司他丁(例如NIPENT
Figure BPA000012771921011461
)；哌泊溴烷(例如VERCYTE
Figure BPA000012771921011462
)；Plicamycin/光神霉素(例如MITHRACIN
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)；卟吩姆钠(例如PHOTOFRIN
Figure BPA000012771921011464
)；丙卡巴肼(例如MATULANE
Figure BPA000012771921011465
)；奎纳克林(例如ATABRINE
Figure BPA00001277192101151
)；拉布立酶(例如ELITEK
Figure BPA00001277192101152
)；利妥昔单抗(例如RITUXAN)；沙格司亭(例如PROKINE
Figure BPA00001277192101154
)；链佐星(例如ZANOSAR
Figure BPA00001277192101155
)；Sunitinib Malates(例如SUTENT
Figure BPA00001277192101156
)；滑石(例如SCLEROSOL
Figure BPA00001277192101157
)；他莫昔芬(例如NOLVADEX
Figure BPA00001277192101158
)；替莫唑胺(例如TEMODAR
Figure BPA00001277192101159
)；替尼泊苷/VM-26s(例如VUMON)；睾内酯(例如TESLAC
Figure BPA000012771921011511
)；硫鸟嘌呤包括6-硫鸟嘌呤(6-TG)；塞替派(例如THIOPLEX
Figure BPA000012771921011512
)；托泊替康(例如HYCAMTIN
Figure BPA000012771921011513
)；托瑞米芬(例如FARESTON
Figure BPA000012771921011514
)；Tositumomabs(例如BEXXAR
Figure BPA000012771921011515
)；曲妥珠单抗(例如HERCEPTIN
Figure BPA000012771921011516
)；Tretinoins/ATRA(例如VESANOID
Figure BPA000012771921011517
)；乌拉莫司汀；戊柔比星(例如VALSTAR)；长春碱(例如VELBAN
Figure BPA000012771921011519
)；长春新碱(例如ONCOVIN
Figure BPA000012771921011520
)；长春瑞滨(例如NAVELBINE
Figure BPA000012771921011521
)；和Zoledronates(例如ZOMETA
Figure BPA000012771921011522
)。
在一个实施例中，透明质酸降解酶如修饰的透明质酸酶，例如PEG化rHuPH20在多西他赛(例如TAXOTERE
Figure BPA000012771921011523
)，多柔比星脂质体(例如DOXIL
Figure BPA000012771921011524
)，Sunitinib Malate(例如SUTENT
Figure BPA000012771921011525
)或贝伐珠单抗(AVASTIN
Figure BPA000012771921011526
)之一或多种给予之后、同时或之前给予对象。。
透明质酸降解酶包括透明质酸酶也可以用于增加抗常规化疗的肿瘤的敏感性。例如，透明质酸降解酶包括透明质酸酶如rHuPH20可以被给予具有与HYAL1缺陷相关的肿瘤的患者，给予量是足以增加肿瘤部位周围的扩散(例如促进化疗剂在肿瘤部位中或周围的循环和/或浓度)，抑制肿瘤细胞运动性，如通过透明质酸降解抑制，和/或降低肿瘤细胞凋亡阈值。这可以将肿瘤细胞带入失巢凋亡状态，该状态使得肿瘤细胞对化疗剂作用更易感。透明质酸降解酶如透明质酸酶的给予可以诱导先前化疗抗性胰腺、胃、结肠、卵巢和乳腺肿瘤的应答性(Baumgartner et al.(1988)Reg.Cancer Treat.1：55-58；Zanker et al.(1986)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.27：390)。
在一个实施例中，透明质酸降解酶特别是透明质酸酶用于治疗转移性和非转移性癌症，包括具有相对于非癌细胞降低的内源透明质酸酶活性的那些。透明质酸降解酶如透明质酸酶可以单独用作化疗剂或者与其它化疗剂联用。举例的癌症包括但不限于小细胞肺癌、鳞状肺细胞癌、及乳腺、卵巢、头颈部癌，或者与被抑制水平的透明质酸酶活性或降低的透明质酸分解代谢相关的任何其它癌症。
c.治疗与升高的组织间隙液压相关的其它疾病中的应用
本发明的组合物方法也可以用于治疗与高组织间隙液压相关的其它透明质酸相关疾病，包括但不限于椎间盘压力和水肿，包括由器官移植、卒中、脑创伤或本文描述的其它病症导致的水肿。
3.作为播散剂的应用
在一个实施例中，用本文描述的方法产生的透明质酸降解酶如透明质酸酶例如rHuPH20被给药以通过促进或增强药剂和/或分子体内输送到各种哺乳动物组织中而治疗透明质酸相关疾病或病症。透明质酸降解酶包括透明质酸酶可以用于促进小分子药物学制剂以及较大分子药物学制剂如蛋白质、核酸和核糖核酸以及大分子组合物的扩散及因此促进其吸收，所述大分子组合物可以含有成分的组合，所述成分包括但不限于核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、基于脂质的分子和药物。例如，当胞间隙已先前或同时暴露于透明质酸酶时，直径范围从大约10nm至大约500nm的分子和大分子复合物可以显示输送通过胞间隙的显著改善(参见例如美国专利申请号10/795,095，11/065,716和11/238,171)。
可以与透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶一起给予或在其给予之后给予的药物、治疗剂、治疗及化妆品制剂、分子及治疗包括但不限于，麻醉剂；抗代谢物，抗肿瘤药，化疗药及其它抗癌剂和抗癌治疗；抗病毒剂；抗感染剂，包括抗细菌剂及其它抗生素，抗真菌剂及其它抗感染剂；免疫调节剂；甾类和非甾类抗炎剂；β阻滞剂；拟交感神经药；ducosanoids，前列腺素类及前列腺素类似物；缩瞳药，胆碱能药剂抗胆碱酯酶；抗变应性物质及解充血药；激素制剂；生长因子；免疫抑制剂；疫苗及类毒素；免疫血清；抗体；镇痛药，抗炎剂，抗微生物剂，杀阿米巴虫药，杀毛滴虫药，抗帕金森氏病药剂，抗疟药，抗惊厥药，抗抑郁药，抗关节炎药，抗真菌剂，抗高血压药，解热药，抗寄生虫药，抗组胺药，α肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀细菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药、避孕药、化妆或美容制剂、减充血剂、利尿药、镇静剂、诊断剂、电解质、催眠药、激素制剂、高血糖药、肌肉松弛剂、肌肉紧张剂、眼科制剂、拟副交感神经药、psychic energizer agent、镇静剂(sedative agent)、睡眠诱导剂、拟交感神经药、安定药、尿道制剂(urinary agent)、阴道制剂(vaginal agent)、杀病毒剂、维生素制剂、非甾类抗炎药及血管紧张素转化酶抑制药及其组合。
4.皮下灌注术中的应用
皮下灌注术是将流体和电解质灌注到皮肤下皮，其是有用且简单的水合技术，适合于轻度至中度脱水成人患者，特别是老年人。尽管被认为是安全有效的，但是最常见的副作用是轻度皮下水肿，其可以通过局部按摩或全身利尿药而治疗。在24小时期间可以将大约3L给予两个不同部位。通常的灌注部位包括胸、腹、大腿和上肢。皮下灌注术中使用的溶液包括例如生理盐水、半生理盐水、具有盐水的葡萄糖和5％葡萄糖。氯化钾也可以加入到溶液中。向溶液中加入一或多种透明质酸降解酶如透明质酸酶可以增强流体吸收剂增加整体给予速率。因此，本发明的组合物和方法可以用于通过给予对象而治疗皮下灌注术。
5.玻璃体切割术和眼科失调和病症的应用
本发明的含有透明质酸降解酶如可溶性透明质酸酶的组合物可以用于在玻璃体切割术期间最小化视网膜脱落或撕裂。这种撕裂可以导致例如在除去玻璃体之前，玻璃体变得与视网膜解离(uncoupled)或″去插入(disinserted)″。玻璃体的这种去插入(disinsertion)或解离(uncoupling)可以使随着玻璃体被除去视网膜进一步撕裂或脱落的可能性最小化。
本发明的透明质酸降解酶组合物、包括透明质酸酶组合物及方法可以用于各种眼科应用，包括美国专利5,292,509中描述的玻璃体切割术附属应用(vitrectomy adjunct application)。高度纯化的透明质酸降解酶如透明质酸酶例如哟给你本文描述方法生产和纯化的rHuPH20的应用优选用于眼内程序以使免疫原性和毒性最小化。在一些实施例中，PEG化透明质酸酶可以用于延长玻璃体内驻留及防止局部化摄取。
透明质酸降解酶、包括透明质酸酶如本发明的含有可溶性透明质酸酶的组合物可以通过例如防止新血管形成及增加视网膜毒性材料从玻璃体的清除速率而用于治疗和/或预防眼科失调。透明质酸降解酶包括透明质酸酶可以以有效液化眼睛玻璃体肿瘤而不导致对眼睛的毒性损害的量给予。玻璃体肿瘤的液化增加了从玻璃体腔的液体交换速率。这种交换的增加除去了污染材料，污染材料的存在可导致眼科和视网膜损害。
本发明的透明质酸降解酶组合物、包括透明质酸酶组合物、及方法还可以用于降低手术后眼压。在白内障和人工晶状体手术中，透明质酸在眼中主要用作间隔物(spacer)。其还用于其它眼科手术中，如青光眼、玻璃体和视网膜手术及角膜移植中。手术后白内障患者的一个共同副作用是眼内压的显著早期、偶尔长时间的升高。这种病症有时是严重的，特别是在患有青光眼性视神经盘改变(glaucomatous optic disc changes)的患者中。透明质酸降解酶如透明质酸酶可以与透明质酸在手术前共给予眼部以降低手术后眼压。例如，透明质酸酶可以以有效降低眼内压至手术前水平的量给予，这是通过降解透明质酸而不降低其在手术期间的有效性也不导致患者副作用而实现(美国专利6,745,776)。
透明质酸降解酶如透明质酸酶也可以给予青光眼患者以从orbicular meshwork除去糖胺聚糖，并降低眼内压，以及可以用于玻璃体以促进玻璃体出血(即血液溢出进入玻璃体)的消退，这种出血可以在诸如糖尿病肾病、视网膜新血管形成、视网膜静脉阻塞、玻璃体后脱离、视网膜撕裂和眼外伤的病症中出现。玻璃体出血典型地很慢消退，其可延迟、复杂化或阻止需要通过玻璃体观察视网膜以用于诊断和/或治疗程序的程序，例如但不限于激光光凝术，其经常是诸如增生性糖尿病性视网膜病等病症的主要治疗手段。
6.基因治疗应用
大多数基因输送载体的体内功效不与体外观察到的功效相应。糖胺聚糖可以妨碍DNA和病毒载体转移和扩散到许多细胞类型。这种胞外基质材料的水平可以显著妨碍所述过程。给予透明质酸降解酶如透明质酸酶可以打开胞外基质中的通道，因此增强基因治疗的输送。例如，透明质酸降解酶如透明质酸酶可以与胶原酶一起给予以促进DNA的体内转导(Dubinsky et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81(23)：7529-33)。透明质酸降解酶包括透明质酸酶还可以增强使用腺相关病毒的基因治疗(Favre et al，(2000)Gene Therapy7(16)：1417-20)。给予例如透明质酸酶之后开放的通道是这样的大小，其典型增强更小分子如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和DNA复合物(以及其它感兴趣的治疗性和药学制剂)的扩散。但是开孔不是大得促进细胞的脱位和运动。
在一些实施例中，病毒可以被工程化以表达一或多种透明质酸降解酶如透明质酸酶，以促进其在靶组织中的复制和传播。靶组织可以是例如癌组织，其中病毒能在肿瘤中选择性复制。病毒也可以是非裂解型病毒，其中病毒在组织特异性启动子下选择性复制。随着病毒复制，透明质酸降解酶如透明质酸酶与病毒基因的共表达可以促进病毒在体内传播。
7.化妆品应用(Cosmetic applications)
透明质酸降解酶包括透明质酸酶可以被给予以除去参与脂肪团(cellulite)积累的糖胺聚糖及促进淋巴流动(lymphatic flow)。在一些实施例中，透明质酸降解酶包括人透明质酸酶如rHuPH20用于治疗脂肪团。透明质酸降解酶如透明质酸酶可以通过重复皮下注射、以软膏或乳膏形式通过经皮输送或者通过使用可注射缓释配方给予而促进糖胺聚糖的连续降解并防止它们反弹。
透明质酸降解酶包括透明质酸酶还可以用于治疗诸如“猪皮(pigskin)”水肿或“橘子皮(orange peel)”水肿。透明质酸降解酶如透明质酸酶可以实现长粘多糖链的解聚，长粘多糖链可以在真皮中积累并且导致结合水的保留以及通过毛细血管加压导致消除代谢废物的有机液体扩散缓慢。这种水及与脂肪细胞脂肪过载相关的废物的保留组成了经典的“猪皮”水肿或“橘皮”水肿。解聚可以将粘多糖长链切割成较短的链，导致消除结合水和废物并且恢复静脉和淋巴循环，最后导致局部水肿消失。
8.器官移植中的应用
器官中的透明质酸含量可以随炎症增加。在特征在于炎性免疫学损伤的不同器官的组织中已观察到透明质酸浓度增加，如肺泡炎(Nettelbladt et al.(1991)Am.Rev.Resp.Dis.139：759-762)和心肌梗塞(Waldenstrom et al.(1991)J.Clin.Invest.88(5)：1622-1628)。其它例子包括在肾(Haellgren et al.(1990)J.Exp.Med.171：2063-2076；Wells et al.(1990)Transplantation 50：240-243)、小肠(Wallander et al.(1993)Transplant.Int.6：133-137)或心脏(Haellgren et al.(1990)J Clin Invest 185：668-673)移植后异基因移植排斥；或者病毒起源的心肌炎症(Waldenstrom et al.(1993)Eur.J.Clin.Invest.23：277-282)。与器官移植相关的间质性水肿的发生是移植手术领域的严重问题。具有间质性水肿的移植物可以肿胀至功能暂时丧失的程度。在一些情况中，肿胀可以导致肾破坏，导致大出血。透明质酸降解酶包括透明质酸酶可以用于降解器官移植物中积累的糖胺聚糖。除去这种糖胺聚糖促进水从移植物中除去并因此增强器官功能。
9.脑中糖胺聚糖积累治疗中的应用
在许多脑脊髓病理病症中透明质酸水平升高。成人中脑脊髓透明质酸水平正常小于200μg/L(Laurent et al.(1996)Acta Neurol Scand September94(3)：194-206)，但是在疾病如脑膜炎、椎管狭窄、颅脑损伤和脑梗死中可以升高至超过8000μg/L的水平。透明质酸降解酶包括透明质酸酶例如rHuPH20可以用于大大降解升高的底物水平。
脑中缺乏有效淋巴也可以导致颅脑创伤后威胁生命的水肿。透明质酸积累是透明质酸合酶合成增加及降解降低的结果。透明质酸的积累可以服务于最初增在损伤组织中的水含量的有益目的以促进白细胞溢出，但是持续积累可以是致死的。给予透明质酸降解酶如透明质酸酶，如鞘内或静脉内给予患有颅脑创伤的患者可以除去组织透明质酸积累及与之相关的水。
透明质酸降解酶如透明质酸酶也可以用于治疗与脑肿瘤相关的水肿，特别是与多形性成胶质细胞瘤相关的水肿。与脑肿瘤相关的水肿产生自与肿瘤相邻的脑的非癌部分中透明质酸的积累。给予透明质酸降解酶如透明质酸酶至透明质酸积累部位(例如通过静脉内注射或者通过分流)可以通过降解这些部位的过量的透明质酸而缓解与这种恶性相关的水肿。
10.心血管疾病中糖胺聚糖积累的治疗中的应用
透明质酸降解酶包括透明质酸酶可以用于治疗一些心血管疾病。在实验性心肌梗塞后的动物模型中给予透明质酸降解酶如透明质酸酶可以降低梗塞大小(Maclean，et al(1976)Science 194(4261)：199-200)。这种情况发生的一种推测的机理是通过在局部缺血再灌注后降低透明质酸积累实现。降低梗塞大小据信由淋巴引流增加及组织氧合增加及心肌水含量降低而发生。
透明质酸降解酶包括透明质酸酶还可以用于限制来自动脉粥样硬化的冠状动脉硬化斑(coronary plaques)。这种硬化斑积累糖胺聚糖并介导巨噬细胞和泡沫细胞粘附(Kolodgie et al.(2002)Arterioscler Thromb Vasc Biol.22(10)：1642-8).
11.肺病中的应用
来自正常个体的支气管肺泡灌洗液(BAL)中的透明质酸水平通常为15ng/ml以下。但是，在呼吸窘迫病症中BAL中的透明质酸水平引人注目地升高(Bjermer et al.(1987)Br Med J(Clin Res Ed)295(6602)：803-6)。肺中增加的透明质酸可以防止氧气扩散和气体交换以及激活嗜中性粒细胞和巨噬细胞应答。透明质酸降解酶的纯化制备物如rHuPH20，如用本发明方法产生的制备物，可以通过肺或静脉内输送而输送至具有这种病症的患者以降低透明质酸水平。透明质酸降解酶包括透明质酸酶也可以给予患有与升高的糖胺聚糖相关的其它肺并发症的患者，或者增强其它共输送分子输送到肺中。
12.其它应用
在其治疗应用的进一步实施例中，透明质酸降解酶如透明质酸酶可以用作如下目的：局部坏死的解毒剂，所述局部坏死来自坏死性物质如vinka生物碱的静脉旁注射(Few et al.(1987)Amer.J.Matern.Child Nurs.12，23-26)，神经节囊肿(ganglion cysts)的治疗(Paul et al.(1997)J Hand Surg.22(2)：219-21)及由于静脉功能不全导致的组织坏死的治疗(Elder et al.(1980)Lancet648-649)。透明质酸降解酶包括透明质酸酶也可以用于治疗神经节囊肿(也称为腕关节囊肿、Bible cyst或dorsal tendon cyst)，其是手部最常见的软组织块并且是在皮肤下感觉到的液体充填的液囊。
透明质酸降解酶如透明质酸酶可以通过降解硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)而用于治疗脊髓损伤。在脊髓损伤后，星形胶质细胞产生含有CSPG的神经胶质疤(glial scar)。CSPG在抑制轴突生长中起关键作用。另外，已显示在中枢神经系统(CNS)损伤后CSPG的表达增加。透明质酸降解酶还可以用于在已知为髓核化学溶解法的方法中治疗椎间盘突出。软骨素酶ABC是裂解透明质酸酶类似底物的酶，其可以诱导腰脊柱中的椎间盘内压(intradiscal pressure)。有三种类型的椎间盘损伤。突出的椎间盘(protruded disk)是完整但凸出的椎间盘。在脱出的椎间盘(extruded disk)中，纤维环(wrapper)已经破裂且髓核(NP)已经泄露，但是仍与椎间盘连接。在分离的(sequestered)椎间盘中，NP片段已破碎脱离椎间盘并且游离在椎管中。髓核化学溶解法通常对突出和脱出的椎间盘有效，但是对分离的椎间盘损伤无效。
I.实施例
以下实施例仅用于说明而非限制本发明的范围。
实施例1.
产生表达可溶性rHuPH20的细胞系
质粒HZ24(示于SEQ ID NO：52)用于转染中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(参见例如申请10,795,095，11/065,716和11/238,171)。用于表达可溶性rHuPH20的HZ24质粒载体包含pCI载体骨架(Promega)，编码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482的DNA(SEQ ID NO：49)，ECMV病毒的内部核糖体进入位点(IRES)(Clontech)，以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体骨架还包括编码Beta-半乳糖酶抗性基因(AmpR)的DNA，复制的f1起点，巨细胞病毒即刻早期增强子/启动子区(CMV)，嵌合内含子，以及SV40晚期多腺苷酸化信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建体的DNA包含NheI位点和Kozak共有序列(其在编码人PH20的天然35个氨基酸信号序列的氨基酸位置1的蛋氨酸的DNA之前)，以及终止密码子(其位于编码对应SEQ ID NO：1所示人PH20透明质酸酶的氨基酸位置482的酪氨酸的DNA之后)，然后是BamHI限制位点。构建体pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)由此导致CMV启动子驱动的单mRNA种类，其编码人PH20的氨基酸1-482(示于SEQ ID NO：3)和小鼠二氢叶酸还原酶的氨基酸1-186(示于SEQ ID NO：53)，所述氨基酸序列由内部核糖体进入位点(IRES)分离。
未转染的DG44CHO细胞生长于用于DHFR(-)细胞的GIBCO改良的CD-CHO培养基中，所述培养基补充了4mM谷氨酸盐和18ml/L PlurionicF68/L(Gibco)，所述细胞以0.5x106细胞/ml接种在摇瓶中用于转染的制备物中。细胞生长在37℃、含5％CO2的湿化的保温箱中，以120rpm震摇。转染之前检测指数生长的未转染的DG44 CHO细胞的活力。
未转染的DG44 CHO细胞培养物的6,000,000个存活细胞经破碎以密度2×107细胞重悬于0.7mL 2x转染缓冲液(2x HeBS：40mM Hepes，pH 7.0，274mM NaCl，10mM KCl，1.4mM Na2HPO4，12mM葡聚糖)中。对于每份等分试样的重悬细胞，0.09mL(250μg)线性HZ24质粒(通过加入Cla I(New England Biolabs)消化过夜线性化，细胞/DNA溶液转入0.4cm gap BTX(Gentronics)的室温电穿孔玻璃管。利用不含质粒DNA的细胞混合物进行隐性对照电穿孔。细胞/质粒混合物利用电容器在330V、960μF或350V、960μF放电进行电穿孔。
电穿孔之后将细胞移出玻璃管并转入5mL用于DHFR(-)细胞的改良的CD-CHO培养基，其中补充了4mM谷氨酸盐和18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)，允许所述细胞在6孔组织培养板的孔中生长2天而无需选择，所述板置于37℃、含5％CO2的湿化保温箱中。
电穿孔后2天，从每个孔去除0.5mL组织培养基，利用实施例2中的微浊度测定法检测透明质酸酶活性的存在。
Figure BPA00001277192101221
Figure BPA00001277192101231
自组织培养孔收集来自转染2(350V)的细胞，计数并稀释至1×104-2×104存活细胞每mL。将细胞悬浮物的0.1mL等分试样转移到5个96孔圆底组织培养板的每一个孔。将100微升含有4mM GlutaMAXTM-1补充物并且不含次黄嘌呤和胸苷补充物的CD-CHO培养基(GIBCO)(GIBCOTM，Invitrogen Corporation)加入含有细胞的孔(终体积0.2mL)。
从5个在无甲氨蝶呤条件下生长的板鉴定10个克隆。
表4.鉴定的克隆的透明质酸酶活性
  板/孔ID   相对透明质酸酶
  1C3   261
  2C2   261
  3D3   261
  3E5   243
  3C6   174
  2G8   103
  1B9   304
  2D9   273
  4D10   302
6个HZ24克隆扩增培养并作为单细胞悬液转移到摇瓶。克隆3D3，3E5，2G8，2D9，1E11，4D10使用二维无限稀释策略铺于96孔圆底组织培养板，其中细胞沿板(down plate)1∶2稀释，跨板(cross plate)1∶3稀释，从左上角的孔中的5000个细胞开始。稀释的克隆在500个未-转染的DG44 CHO细胞每孔的背景中生长，为培养初期提供必要的生长因子。每个亚克隆做10个板，5个板含有50nM甲氨蝶呤，5个板不含甲氨蝶呤。
克隆3D3产生24个可见的亚克隆(13个未经甲氨蝶呤处理，11个经50nM甲氨蝶呤处理。在24个亚克隆的8个中检测到明显的透明质酸酶活性(＞50单位/mL)，这8个亚克隆扩增到T-25组织培养瓶中。分离自甲氨蝶呤处理方案的克隆在存在50nM甲氨蝶呤下扩增。克隆3D35M进一步在500nM甲氨蝶呤中扩增，在摇瓶中得到产生超过1,000单位/ml的克隆(克隆3D35M；或Gen1 3D35M)。随后制备3D35M细胞的master细胞库(MCB)。
实施例2.
测定可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性
样品诸如细胞培养物、纯化级分和纯化溶液中可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性利用比浊法测定，其基于可溶性沉淀物在透明质酸与血清白蛋白结合时的形成。所述活性通过将可溶性rHuPH20与透明质酸钠(透明质酸)保温一定时间(10分钟)然后通过加入酸化血清白蛋白沉淀未消化透明质酸钠来测定。所得样品的浊度在30分钟显色时间之后在640nm测定。对透明质酸钠底物的酶活性导致的浊度降低是可溶性rHuPH20透明质酸酶活性的指标。所述方法利用使用可溶性rHuPH20测定工作参照标准的稀释物产生的校准曲线来进行，样品活性测定相对该校准曲线进行。样品稀释物在酶稀释液中制备。酶稀释液通过如下方法制备：溶解33.0±0.05mg水凝胶于25.0mL 50mMPIPES反应缓冲液(140mM NaCl，50mM PIPES，pH 5.5)和25.0mL SWFI，然后将0.2mL 25％正常人血清蛋白溶液(Buminate)溶液稀释到混合物中并涡旋30秒。这在使用前2小时之内进行并储存在冰上直到需要使用。所述样品稀释到估计为1-2U/mL。通常，每步的最大稀释度不超过1∶100并且首次稀释的初始样品量不小于20μL。进行该实验的最小样品体积为：In-process Samples，FPLC级分：80μL；组织培养上清：1mL；浓缩物质80μL；纯化的或最终步骤中的物质：80μL。所述稀释物在低蛋白结合96孔板中一式三份进行，30μL的每种稀释物转移到Optilux黑/透明底板(BD BioSciences)。
在酶稀释液中制备浓度2.5U/mL的已知可溶性rHuPH20的稀释物产生标准曲线，并一式三份加入Optilux板。稀释度包括0U/mL，0.25U/mL，0.5U/mL，1.0U/mL，1.5U/mL，2.0U/mL，和2.5U/mL。“试剂空白”孔含有60μL酶稀释液，包含在板中作为隐性对照。所述板随后加盖并在37oC在微量恒温仪上加热5分钟。去除盖，振摇板10秒。震摇后，该板被送回微量恒温仪并利用热0.25mg/mL透明质酸钠溶液(将100mg透明质酸钠(LifeCore Biomedical)溶于20.0mLSWFI制备)初步处理MULTIDROP 384 Liquid Handling Device。轻轻旋转和/或在2-8℃振荡2-4小时或直至完全溶解来混合。将反应板转移到MULTIDROP 384并按下启动键将30μL透明质酸钠分配到每个孔中开始反应。从MULTIDROP 384取出板，置换板的盖，转移到微量恒温仪之前振摇10秒。该板在37℃保温10分钟。
通过用血清工作液初步处理MULTIDROP 384并将体积设置改变为240μL使得反应终止。(25mL血清母液[1体积马血清(Sigma)用9体积500mM醋酸盐缓冲溶液稀释，pH值用盐酸调节至3.1]在75mL 500mM乙酸盐缓冲液中)。将该板从微量恒温仪取出，放置到MULTIDROP 384上，将240μL血清工作液分配入各孔。取出板，在读板器上振摇10秒。再过15分钟，在640nm测定样品浊度，每份样品的透明质酸酶活性(U/ml)通过与标准曲线拟合确定。
比活性(单位/毫克)通过用透明质酸酶活性(单位/mg)除以蛋白质浓度(mg/mL)计算。
实施例3
Gen1人sPH20的制备和纯化
A.5L生物反应器方法
3D35M小瓶经解冻并从摇瓶通过1L转瓶在CD-CHO细胞培养基(Invitrogen，Carlsbad Calif.)中扩增，所述培养基补充了100nM甲氨蝶呤和GlutaMAXTM-1(Invitrogen)。细胞由转瓶转移到5升生物反应器(Braun)，接种密度4×105存活细胞每ml。设定参数为：温度37℃，pH值7.2(启动设定值)，与溶氧设定点25％，0-100cc/min气流被(air overlay)。在168小时，加入250mL补料#1培养基(CD CHO与50g/L片葡萄糖)，在216小时，加入250ml补料#2培养基(CD CHO与50g/L葡萄糖以及10mM丁酸钠)，在264小时加入250ml补料#2培养基。这个过程导致每毫升1600单位的终产率以及6×106细胞/ml的最大细胞密度。丁酸钠的加入可大幅提高可溶性rHuPH20在生产的最后阶段的产生。
来自3D35M克隆的调节培养基通过深层过滤和切向流过滤到10mMHepes pH 7.0中澄清化。可溶性rHuPH20随后通过在Q Sepharose(Pharmacia)离子交换，苯基琼脂糖(Pharmacia)疏水作用层析，苯基苯基硼酸盐(Prometics)及磷灰石层析(Biorad，Richmond，CA)上连续层析纯化。
可溶性rHuPH20结合于Q Sepharose并在相同缓冲液中在400mM NaCl洗脱。洗脱液稀释于500mM硫酸铵到硫酸铵的终浓度，并通过苯基琼脂糖凝胶(low sub)柱，在同等条件下结合苯基硼酸盐树脂。在不含硫酸铵的50mM n，n-二(羟乙基)甘氨酸中在pH 9.0洗涤后，该可溶性rHuPH20从苯基琼脂糖树脂在Hepes pH 6.9中洗脱。洗脱液在5mM磷酸二氢钾和1mM CaCl2中在pH 6.9加载在羟磷灰石树脂上，用80mM磷酸钾pH 7.4和0.1mMCaCl2洗脱。
由此产生的纯化可溶性rHuPH20具有超过65,000USP单位的比活性/mg，所述比活性由实施例2中的微浊度测定法利用USP参比标准测定。一个实例中，天然rHuPH20比活性为120,000单位/mg，而聚乙二醇化rHuPH20(如在实施例7中所述，下文)具有大约30,000单位/mg比活性。纯化的sPH20洗脱物作为从24至26分钟的单个峰从Pharmacia 5RPC苯乙烯-二乙烯苯柱利用0.1％TFA/H2O和0.1％TFA/90％乙腈/10％H2O之间的梯度洗脱，作为SDS电泳显示的单个宽61kDa带溶解，其经PNGASE-F处理减小为尖的51kDa带。N-端氨基酸序列分析表明，前导肽已被有效去除。
B.上游细胞培养物扩增入100升生物反应器细胞培养物的方法
一种放大方法用于从四个不同的3D35M细胞小瓶分别纯化可溶性rHuPH20以产生4个单独的批次的sHuPH20；HUA0406C，HUA0410C，HUA0415C和HUA0420C。每一瓶被分别扩增，并通过125L生物反应器培养，然后用柱层析纯化。整个过程中获得样本以评估酶的产量等参数。这个过程在下文的描述中说明了例如生物反应器起始和补料培养基的体积，转移细胞密度，洗涤和洗脱体积。确切的数字根据批次略有不同，并在表10至11中详述。
四瓶3D35M细胞在37℃热水浴中解冻，加入包含100nM氨甲喋呤及40mL/LGlutaMAX的CD CHO，离心所述细胞。所述细胞重悬浮在含有20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中，放入37℃，7％CO2恒温箱中。所述细胞在125mL摇瓶中扩增到40mL。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL，所述培养物以100mL培养物体积扩增入125mL转瓶。所述烧瓶在37℃，7％CO2保温。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL，所述培养物以200mL培养物体积扩增入250mL转瓶。所述烧瓶在37℃，7％CO2保温。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL，所述培养物以800mL培养物体积扩增入1L转瓶。所述烧瓶在37℃，7％CO2保温。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL，所述培养物以5L培养物体积扩增入6L转瓶。所述烧瓶在37℃，7％CO2保温。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL，所述培养物以20L培养物体积扩增入36L转瓶。所述烧瓶在37℃，7％CO2保温。
125L反应器在121℃蒸汽消毒，加入20 PSI和65L CD CHO细胞培养基。使用前，检查反应器是否污染。当在36L转瓶中细胞密度达到1.8-2.5×106细胞/mL，将20L细胞培养物从36L转瓶转移到125L生物反应器(Braun)，产生85L终体积和大约4×105细胞/mL的接种密度。参数为：温度设定点，37℃，pH值：7.2；溶氧：25％±10％；叶轮速度50转；容器压力3psi；空气喷雾1L/分；气流被：1L/分钟。该反应器每日取样用于细胞计数，pH值校正，培养基分析，蛋白质的生产和保留。营养饲料是在运行过程中添加。第6天，加入3.4L的补料1#培养基(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/LGlutaMAXTM-1)，培养温度改变为36.5℃。第9天，加入3.5L的补料#2(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸钠)，培养温度改变为36℃。第11天，加入3.7L的补料#3(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/LGlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸钠)，培养温度改变为35.5℃。反应器在第14天或当细胞活力下降到50％以下时收获。这个过程使得产生的可溶性rHuPH20具有1600单位/ml酶活性以及800万细胞/mL的最大细胞密度。在收获时，在体外和体内检测培养物中的支原体，微生物，内毒素和病毒，通过透射电子显微镜(TEM)检测病毒颗粒，并测定酶活性。
该100升细胞培养收获物通过一系列具有聚醚砜介质(Sartorius)的一次性囊式滤心过滤：通过8.0μm深度囊(depth capsule)，0.65μm深度囊，0.22μm囊，最后通过0.22μm Sartopore2000cm2滤心进入100L的无菌保鲜袋。这种培养物使用两个具有螺旋聚醚砜30kDa MWCO滤膜(Millipore)的TFF浓缩10倍，然后用10mM HEPES，25mM Na2SO4，pH 7.0进行6×缓冲液交换入20L无菌储存袋。表5提供与细胞培养，收获，浓度和缓冲液交换步骤有关的监测数据。
表5.细胞培养，收获，浓度和缓冲液交换步骤的监测数据
Figure BPA00001277192101271
Figure BPA00001277192101281
制备Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(3升树脂，高度＝20厘米，直径为14厘米)。收集洗涤样本用于测定pH，电导率和内毒素(LAL)测定。层析柱用5倍柱体积的10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5平衡。浓缩的经渗滤收获物以100cm/hr加载于Q柱。用5倍柱体积的10mM Tris，20mMNa2SO4，pH 7.5和10mM Hepes，50mM NaCl，pH 7.0洗柱。蛋白用10mMHepes，400mM NaCl，pH 7.0洗脱，通过0.22μm终滤器过滤入无菌袋。
苯基琼脂糖凝胶(Pharmacia)疏水层析在下一步进行。制备苯基琼脂糖(PS)柱(9.1L树脂，高度＝29厘米，直径＝20cm)。层析柱用5倍柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，0.1mM CaCl2，pH 7.0平衡。洗脱的蛋白补充2M硫酸铵，1M磷酸钾和1M CaCl2母液到终浓度分别为5mM，0.5M和0.1mM。蛋白以流速100cm/hr加载于PS柱上。以100cm/hr加入5mM硫酸铵，0.5M磷酸钾和0.1mMCaCl2。流出物经0.22μm终过滤进入无菌袋。
PS-纯化的蛋白加于氨基苯基硼酸盐柱(ProMedics)(6.3L树脂，高度＝20厘米，直径＝20厘米)，该柱经5倍柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵平衡。蛋白以流速100cm/hr流经柱，用5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，pH 7.0洗柱。随后用20mMn，n-二(羟乙基)甘氨酸，100mM NaCl，pH 9.0洗柱，并用50mM Hepes，100mM NaCl pH 6.9通过无菌滤器洗脱蛋白进入20L无菌袋。检测洗脱物的生物负荷，蛋白浓度和酶活性。
甲羟基磷灰石(HAP)柱(BioRad)(1.6升树脂，高度＝10厘米，直径＝14厘米)用5mM磷酸钾，100mM NaCl，0.1mM CaCl2pH 7.0平衡。收集洗涤样品，检测pH值，电导率和内毒素(LAL测定)。氨基苯基硼酸盐纯化的蛋白补充磷酸钾和CaCl2，最终得到5mM磷酸钾和0.1mM CaCl2，以流速100cm/hr加于HAP柱。用5mM磷酸钾pH 7.0，100mM NaCl，0.1mM CaCl2洗柱，然后用10mM磷酸钾pH 7.0，100mM NaCl，0.1mM CaCl2pH洗柱。蛋白用70mM磷酸钾pH 7.0洗脱，通过0.22μm滤器过滤进入5L无菌储存袋。检测洗脱物的生物负荷，蛋白浓度和酶活性。
HAP-纯化的蛋白然后经由压力槽泵压经过20nM病毒去除过滤器。所述蛋白加入DV 20压力槽和过滤器(Pall Corporation)，通过具有20nm孔的UltiporDV 20过滤器(Pall Corporation)进入无菌20L储存袋。检测所述滤出物的蛋白浓度，酶活性，低聚糖，单糖及唾液酸谱，及处理-相关杂质。滤出物中的蛋白然后利用10kD分子量截留膜(MWCO)Sartocon Slice切向流过滤(TFF)系统(Sartorius)浓缩到1mg/mL。所述过滤器首先通过用Hepes/盐溶液(10mMHepes，130mM NaCl，pH 7.0)洗涤制备，所述透出物取样测定PH及电导率。浓缩后，所述浓缩蛋白取样检测蛋白浓度及酶活性。对所述浓缩蛋白进行6×缓冲液交换进入最后的缓冲液：10mM Hepes，130mM NaCl，PH7.0。所述浓缩蛋白通过0.22μm滤纸进入20L无菌储存袋。所述蛋白取样检测蛋白浓度，酶活性，游离巯基，低聚糖谱及渗透性。
表5至11提供每个3D35M细胞批次的与上述每个纯化步骤有关的监测数据。
表6.Q琼脂糖柱数据
  酶产量(％)   65   107   87   76
表7.苯基琼脂糖柱数据
Figure BPA00001277192101301
表8.氨基苯基硼柱数据
Figure BPA00001277192101302
表9.羟基磷灰石柱数据
  白浓度(mg/mL)
  洗出液酶测定(U/mL)   14051   29089   20424   29826
  蛋白产量(％)   未测定   93   53   73
  酶产量(％)   87   118   140   104
表10.DV20过滤数据
表11.终浓度数据
Figure BPA00001277192101312
表12.缓冲液交换成终配制剂的数据
Figure BPA00001277192101313
所述纯化的及浓缩的可溶性rHuPH 20蛋白无菌填入无菌小瓶，其填充体积为5mL及1mL。所述蛋白经过0.22μm滤纸到操作员(operator)控制的泵，其用于根据重量分析的结果填充所述小瓶。所述小瓶用塞子封闭并用螺帽固定。所述封闭小瓶经目视检查杂质粒子然后标记。标记之后，所述小瓶通过浸入液氮不超过1分钟迅速冷冻并存储在≤-15℃(-20±5℃)下。
实施例4
含有可溶性人PH20(rHuPH20)的Gen2细胞的制备
实施例1描述的Gen 13D35M细胞系适应较高氨甲喋呤水平产生第2代(Gen)克隆。3D35M细胞从建立的包含氨甲喋呤的培养物接种进入包含4mM GlutaMAX-1TM和1.0μm氨甲喋呤的CD CHO介质。所述细胞通过生长并在46天中在37℃，7％CO2湿润保温箱中传代9次适应较高氨甲喋呤水平。细胞的扩增群体通过在96-孔组织培养板中有限稀释克隆出，所述板包含具有2.0μM氨甲喋呤的培养基。大约4周后，识别克隆并选择克隆3E10B用于扩增。3E10B细胞在包含4mM GlutaMAX-1TM和2.0μM氨甲喋呤的CD CHO培养基中生长20代。产生所述3E10B细胞系的细胞库(MCB)，冷冻并被用于随后的研究。
所述细胞系的扩增通过在包含4mM GlutaMAX-1TM和4.0μM氨甲喋呤的CD CHO培养基中培养3E10B细胞继续。第12代后，细胞在小瓶中作为研究细胞库(RCB)冷冻。一小瓶的所述RCB经解冻并培养在包含8.0μm氨甲喋呤的培养基中。5天后，培养基中的氨甲喋呤浓度增加到16.0μM，18天后为20.0μm。在包含20.0μm氨甲喋呤培养基中第8次传代的细胞通过在包含含有4mM GlutaMAX-1TM和20.0μM氨甲喋呤的CD CHO培养基的96-孔组织培养板中有限稀释克隆出。5-6周后识别克隆并选择克隆2B2用于在包含20.0μm氨甲喋呤的培养基中扩增。第11次传代后，在小瓶中冷冻2B细胞作为研究细胞库(RCB)。
生成的2B2细胞是二氢叶酸还原酶缺乏(dhfr-)DG 44CHO细胞，其表达可溶性重组人PH20(rHuPH)。所述可溶性PH20以大约206拷贝/细胞存在于2B2细胞中。Spe I-，Xba I-和BamH IHind III-消化的基因组2B2细胞DNA的利用rHuPH 20-特异性探针的Southern印迹分析显示以下限制性内切酶酶切消化谱：Spe I消化的DNA的一个～7.7kb的主要杂交带和四个次要杂交带(～13.9，～6.6，～5.7和～4.6kb)；Xba I消化的DNA的一个～5.0kb的主要杂交带和二个次要杂交带(～13.9和～6.5kb)；利用BamH I/Hind III消化的2B2DNA观察到的单一的～1.4kb杂交带。所述mRNA转录产物的序列分析表明所述衍生cDNA(SEQ ID NO：56)与参考序列(SEQ ID NO：47)除了一个在位置1131的碱基对不同之外是相同的，所述不同的碱基对据观察是胸腺嘧淀脱氧核苷(T)代替预期的(C)。这是沉默突变，没有影响所述氨基酸顺序。
实施例5
A.在300L生物反应器细胞培养物中制备Gen2可溶性rHuPH20
解冻一瓶HZ24-2B2小瓶并从摇床扩增到36L转瓶在CD-CHO细胞培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，所述培养基补充了20μm甲氨蝶呤和GlutaMAX-1TM(Invitrogen)。简单来说，一小瓶的细胞在37℃水浴解冻，加入培养基，离心细胞。该细胞被重新悬浮在含20mL的新鲜培养基的125mL摇瓶，并置于37℃，7％CO2培养箱内。该细胞在125mL摇瓶中扩增到40mL。当细胞密度超过1.5×106细胞/mL，培养物在125mL转瓶中扩增为100mL培养物体积。该瓶在37℃，7％CO2下保温。当细胞密度超过1.5×106细胞/mL，培养物在250mL转瓶中扩增为200mL培养物体积，该瓶在37℃，7％CO2下保温。当细胞密度超过1.5×106细胞/mL，培养物在1L转瓶中扩增为800mL培养物体积并在37℃，7％CO2下保温。当细胞密度超过1.5×106细胞/mL，培养物在6L转瓶中扩增为5000mL培养物体积并在37℃，7％CO2下保温。当细胞密度超过1.5×106细胞/mL，培养物在36L转瓶中扩增为32L培养物体积并在37℃，7％CO2下保温。
消毒400升的反应器，加入230mLCD-CHO细胞培养基。使用前，检查反应器是否污染。将大约30L细胞培养物从36L转瓶转移到400L生物反应器(Braun)，接种密度4.0×105存活细胞/mL，总体积260L。参数为：温度设定点，37℃，叶轮速度40-55RPM；容器压力3psi；空气喷雾0.5-1.5L/分；气流被：3L/分钟。该反应器每日取样用于细胞计数，pH值校正，培养基分析，蛋白质的生产和保留。营养饲料也是在运行过程中添加。第120hr(第5天)，加入10.4L的补料1#培养基(4×CD CHO+33g/L葡萄糖+160mL/LGlutaMAXTM-1+83mL/升Yeastolate+33毫克/升rHuInsulin)。第168hr(第7天)，加入10.8L的补料#2(2×CD CHO+33g/L葡萄糖+80mL/LGlutaMAXTM-1+167mL/升Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，培养温度改变为36.5℃。第216小时(第9天)，加入10.8L的补料#3(1×CD CHO+50g/L葡萄糖+50mL/LGlutaMAXTM-1+250mL/升Yeastolate+1.80g/L丁酸钠)，培养温度改变为36℃。第264hr(第11天)，加入10.8L的补料#4(1×CDCHO+33g/L葡萄糖+33mL/L GlutaMAXTM-1+250mL/升Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，培养温度改变为35.5℃。补料培养基的加入大大提高可溶性rHuPH20在生产最后阶段的产量。反应器在第14或15天或当细胞活力下降到40％以下时收获。这个过程使得产生的可溶性rHuPH20具有17,000单位/ml酶活性以及12,000,000万细胞/mL的最大细胞密度。在收获时，在体外和体内取样检测培养物中的支原体，生物负荷，内毒素和病毒，通过透射电子显微镜(TEM)检测病毒颗粒，并测定酶活性。
所述培养物通过蠕动泵经过四个平行Millistak过滤装置模块(Millipore)泵送，每个模块包含分级为4-8μm的硅藻土层和分级为1.4-1.1μm的硅藻土层，后面是纤维素膜，然后经过第二种包含分级为0.4-0.11μm的硅藻土层和分级为＜0.1微米的硅藻土层的单一Millistak过滤装置(Millipore)，然后经过0.22μ终滤器进入容量350L的无菌单一用途柔性袋。所述收获的细胞培养液补充以10EDTA和10mM Tris到pH 7.5。所述培养物用切向流过滤(TFF)仪器利用四个SartosliceTFF 30kDa分子量截留(MWCO)聚醚砜(PES)滤膜(Sartorius)浓缩10倍，然后与10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5缓冲液更换入0.22μm终滤膜进入50L无菌贮藏袋。
经浓缩和渗滤的收获物针对病毒灭活。在病毒灭活作用之前，制备10％Triton X-100，3％三(n-丁基)磷酸盐(TNBP)的溶液。经浓缩和渗滤的收获物在36L玻璃反应容器中在Q柱上纯化前即刻暴露于1％Triton X-100，0.3％TNBP 1小时。
B.纯化Gen2可溶性rHuPH20
制备Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂，H＝29cm，D＝20cm)。收集洗涤样本用于测定pH，电导率和内毒素(LAL)测定。层析柱用5倍柱体积的10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5平衡。病毒灭活后，浓缩的经渗滤收获物以100cm/hr加载于Q柱。用5倍柱体积的10mM Tris，20mMNa2SO4，pH 7.5和10mM Hepes，50mM NaCl，pH 7.0洗柱。蛋白用10mMHepes，400mM NaCl，pH 7.0洗脱，通过0.22μm终滤器过滤入无菌袋。检测洗脱样品的生物负荷，蛋白浓度和透明质酸酶活性。在交换开始和结束时读取A280吸光度。
苯基琼脂糖凝胶(Pharmacia)疏水层析在下一步进行。制备苯基琼脂糖(PS)柱(19-21L树脂，H＝29cm，D＝20cm)。收集洗涤液，取样测定pH，电导率和内毒素(LAL测定)。柱用5倍柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，0.1mM CaCl2，pH 7.0平衡。从Q琼脂糖柱洗脱的蛋白补充2M硫酸铵，1M磷酸钾和1M CaCl2母液到终浓度分别为5mM，0.5M和0.1mM。蛋白以流速100cm/hr加载于PS柱上，并收集柱流出物。柱用5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵和0.1mMCaCl2pH7.0以100cm/hr洗涤，洗出物加入收集的流出物。与柱洗出物混合后，流出物流经0.22μm终过滤进入无菌袋。取样流出物测定生物负荷，蛋白浓度和透明质酸酶活性。
制备氨基苯基硼酸盐柱(ProMedics)。收集洗涤液，取样测定pH，电导率和内毒素(LAL测定)。柱用5倍柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，0.1mM CaCl2，pH 7.0平衡。包含纯化蛋白的PS流出物以流速100cm/hr加载于氨基苯基硼酸盐柱。柱用5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵pH7.0洗涤。柱用20mM n，n-二(羟乙基)甘氨酸，0.5M硫酸铵pH9.0洗涤。柱用20mM n，n-二(羟乙基)甘氨酸，100M氯化钠pH9.0洗涤。蛋白用50mM Hepes，100mMNaCl，pH 6.9洗脱，并流经无菌滤纸进入无菌袋。取样流出物测定生物负荷，蛋白浓度和酶活性。
制备羟基磷灰石(HAP)柱(Biorad)。收集洗涤液，测定pH，电导率和内毒素(LAL测定)。柱用5倍柱体积的5mM磷酸钾，100mM NaCl，0.1mMCaCl2，pH 7.0平衡。氨基苯基硼酸盐柱纯化的蛋白补充到终浓度5mM磷酸钾和0.1mM CaCl2，以流速100cm/hr加载于HAP柱。柱用5mM磷酸钾，pH 7，100mM NaCl，0.1mM CaCl2洗涤。然后柱用10mM磷酸钾，pH 7，100mM NaCl，0.1mM CaCl2洗涤。用70mM磷酸钾，pH 7.0洗脱蛋白，流经0.22μm无菌滤纸进入无菌袋。测定洗脱样品的生物负荷，蛋白浓度和酶活性。
HAP纯化的蛋白质随后流进病毒去除过滤器。灭菌Viosart过滤器(Sartorius)通过用2L 70mM磷酸钾pH7.0洗涤首次制备。使用前，取样经过滤的缓冲液测定pH值和电导率。HAP纯化的蛋白通过蠕动泵泵过20nM病毒去除过滤器。在70mM磷酸钾，pH7.0中过滤的蛋白通过0.22μm无菌滤膜进入无菌袋。检测滤出病毒的样品的蛋白质浓度，酶活性，低聚糖，单糖和唾液酸谱。还检测该样品的过程相关的杂质。
滤出物中的蛋白随后利用10kD分子量截留(MWCO)Sartocon Slice切向流过滤(TFF)系统(Sartorius)浓缩到10mg/mL。所述过滤器首先通过用10mM组氨酸，130mM NaCl，pH 6.0洗涤制备，取样透出物测定PH及电导率。浓缩后，取样浓缩蛋白检测蛋白浓度及酶活性。对所述浓缩蛋白进行6×缓冲液交换进入最后的缓冲液：10mM组氨酸，130mM NaCl，PH7.0。缓冲液交换后，所述浓缩蛋白通过0.22μm滤纸进入20L无菌储存袋。取样所述蛋白检测蛋白浓度，酶活性，游离巯基，低聚糖谱及渗透性。
所述无菌过滤器散装蛋白然后以20mL无菌分散到30mL无菌Teflon小瓶(Nalgene)中。所述小瓶然后迅速冷冻存储在-20±5℃。
C.比较Gen1可溶性rHuPH20和Gen2可溶性rHuPH20的制备和纯化
300L生物反应器细胞培养物中Gen2可溶性rHuPH20的制备和纯化与100L生物反应器细胞培养物中Gen1可溶性rHuPH20的制备和纯化相比包含一些改变(在实施例3.B描述)。表13显示了两种方法之间示例性差异，以及简单的括大规模的改变。
Figure BPA00001277192101361
Figure BPA00001277192101371
Figure BPA00001277192101381
实施例6
用重组透明质酸酶(rHuPH20)靶向富含透明质酸的肿瘤中的透明质酸
A.富含透明质酸的肿瘤细胞在体外形成透明质酸特异性细胞周基质晕圈(halo)
利用粒子排除试验和免疫组化方法评估富含透明质酸的肿瘤细胞培养物和透明质酸-缺乏型肿瘤细胞培养物在体外形成细胞周基质(晕圈)的能力。对于gaiminutes研究，富含透明质酸的人前列腺癌(PC 3)的低密度培养物和缺乏透明质酸的人肺癌(NCI H460)的低密度培养物在细胞培养基中在37℃处理60分钟，然后在存在或缺乏0.5mg/mL牛聚集蛋白聚糖(可购得)的条件下在37℃保温60分钟，所述牛聚集蛋白聚糖是大的聚集型硫酸软骨蛋白多糖。
为了通过粒子排除进行评估，添加小粒子(5x106福尔马林-固定的红细胞(RBC)到所述培养物。所述粒子沉淀后，在400x或100x放大率观察所述培养物。
为了通过免疫组化方法评估透明质酸表达，所述培养物的亚组用生物素标记的透明质酸结合蛋白(HABP-bio)(Seikagaku，Japan)染色。洗涤去除第一试剂后，用FITC-标记的链霉抗生物素蛋白(Vector Labs，Canada)作为第二试剂。细胞核用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)试剂复染。经由装配Insight FireWire数字相机(Diagnostic Instruments，Michigan)的Nikon Eclipse TE2000U显微镜捕获显微照片。
细胞周基质晕圈作为免疫组化HA染色阳性区域以及来自粒子排除试验中被排除的粒子的区域而鉴定。结果显示在存在聚集蛋白聚糖条件下预处理过的富含透明质酸的肿瘤(PC 3)培养物中的晕圈(在典型的实验中，大致为细胞的尺寸)。相反，晕圈没有在缺乏聚集蛋白聚糖的条件下形成，也不在缺乏透明质酸的肿瘤细胞(NCI H460)的培养物中形成，提示细胞周基质的形成依赖于透明质酸表达。
为了确定靶向透明质酸能否阻断这些晕圈的形成，在37℃存在或缺乏可溶性重组人透明质酸酶组合物rHuPH20的条件下处理60分钟(加入之前)的细胞培养物中进行粒子排除试验和免疫组化实验。rHuPH20以1000酶单位每mL包含在肿瘤细胞培养物中，如利用上文实施例2所述方法测定。利用抗透明质酸抗体(可商购)进行免疫荧光染色显示与rHuPH20保温之后缺乏无透明质酸染色。与rHuPH20保温后，如上所述进行粒子测定。显微照片显示与rHuPH20保温后，(PC3)肿瘤细胞培养物中不形成晕圈。rHuPH20对缺乏透明质酸的细胞(NCI H460)培养物没有影响，其不形成有或无rHuPH20的细胞周基质。这些结果支持在体外在肿瘤细胞培养物中形成晕圈是透明质酸依赖性的。
相同的粒子排除试验利用七种不同类型的人肿瘤细胞系进行，所述细胞系在存在或缺乏rHuPH下具有不同程度的HA表达，如本实施例上文中所述。所用细胞系是BxPC3(胰腺肿瘤细胞系)，PC3(前列腺肿瘤细胞系)，MDA-MB-231(乳腺肿瘤细胞系，HCT 116(结肠肿瘤细胞系)，DU145(前列腺肿瘤细胞系)，MiaPaCa2(胰腺肿瘤细胞系)和H460(NSC肺癌细胞系)。“晕圈每细胞面积”值通过测定培养皿中平均晕圈面积(以像素或mm2为单位)，除以以像素或mm2为单位的平均细胞面积来确定。为了比较不同肿瘤类型细胞培养物中的晕圈每细胞面积，BxPC 3细胞的该值定在100，HA缺乏细胞系H460的该值定在0，通过比较确定每种细胞类型的“相对晕圈分数(relative halo fraction)”。结果示于下表14。所列举的数字代表n＝25的测量的平均值，加上或减去平均值的标准误(SEM)。
表14：肿瘤细胞培养物中rHuPH的相对晕圈分数和HA减少
  胰腺   MiaPaCa2   16.7±1.4   4.2±0.7
  NSC肺   H460   0.0±0.8   -2.3±0.3
还利用该测定法进行时间进程研究以确定将细胞短暂暴露于rHuPH20之后PC3培养物中的HA去除持续时间，然后是细胞在缺乏酶的条件下与细胞培养基保温的“chase”时间。如上所述，“晕圈每细胞面积”值是通过测量平均晕圈面积(以像素或mm2为单位)除以平均细胞面积(以像素或mm2为单位)确定的。晕圈每细胞面积在处理之前计算(时间为0)，该值设定为100％。对于每6个处理的时间点的每一个，细胞在存在1000U/mL rHuPH20的条件下保温1小时，然后洗涤去除酶并接着是chase时间，其中细胞在没有酶的条件下保温，分别共2，4，8，16，24和48小时。对于每个时间点，计算晕圈每细胞面积并通过与100％时间0值比较确定相对晕圈分数。结果列于下表15。所列出的数字代表N＝45的测量平均值，加上或减去平均值的标准误(SEM)。
表15：PC3细胞培养物中rHuPH20的HA去除时间
Figure BPA00001277192101401
B.在富含透明质酸的肿瘤模型(胫骨周PC3前列腺癌异种移植物模型)中静脉内给药rHuPH20降低远端肿瘤间质流体压力(IFP)
为了分析针富含透明质酸的肿瘤中靶向透明质酸的作用，rHuPH20系统给予胫骨周前列腺癌(PC3的)异种移植物模型。对于这个模型，在右侧胫骨骨膜附近对无胸腺雄性裸鼠接种人类前列腺癌细胞，PC3(1x106细胞，总体积为0.05mL)。所有的动物研究都遵循核准的IACUC协议进行。为评估肿瘤间质流体压力(IFP)，将Milar
Figure BPA00001277192101411
Mikro尖导管压力传感器(SPR-320s)连接于ADInstruments
Figure BPA00001277192101412
PowerLab数据采集单元和笔记本电脑以连续测定IFP(单位＝毫米汞柱(mmHg))。该系统经校准，当环境压力测量值在15-20分钟偏离不超过+/-1.0mmHg时认为稳定。为了放置探头，压力导管插入到21号针头的内孔，将针引入肿瘤中心。针头在传感器周围被撤回，而压力导管同时保留在该位置。然后利用该系统测量肿瘤中的IFP(mmHg)。
在一项示范性试验中，利用该方法在26个异种移植物模型动物中的基线远端肿瘤IFP测定揭示了肿瘤体积和IFP之间的相关性(相关系数r＝0.5652)，表明肿瘤体积增加可能导致更高的IFP。
要确定系统性rHuPH20治疗能否降低该异种移植物模型中的肿瘤IFP，将10,000单位(如在实施例2中测定)rHuPH20以100μL剂量静脉内注入三只动物的尾静脉。在给予(注射)rHuPH20之前，测定IFP约20-30分钟，建立基线IFP的测量值。然后在注射前后测定IFP。IFP在给药rHuPH20之后1-2小时后测定。静脉rHuPH20给药造成了远端肿瘤IFP降低。10分钟内，肿瘤IFP与基线相比平均降低34％。此外，肿瘤IFP的水平在1小时之中从34.06±15.9mmHg降至14.86±12.55mmHg(平均基线水平的38％，平均减少61.3％)，是最大降低。热灭活rHuPH20，将其给予动物作为对照，没有降低间质流体压力。
与透明质酸快速周转率一致，肿瘤IFP在所有小鼠中在24小时之内回到基线。重复静脉注射10,000个单位rHuPH20(其在初始剂量后48小时给予)，揭示了IFP的类似的下降(28.6％基线，平均值)。给药rHuPH20之前和之后在非荷瘤肢体中的测定显示这些组织中间质流体压力没有变化。这些数据表明，系统性静脉内给药透明质酸酶可减少远端肿瘤中的间质流体压力。
间质流体压力也通过注射透明质酸缺陷肺癌细胞(H460)在相似产生的异种移植物模型中测定。该模型中的肿瘤显示高间质流体压力，rHuPH20静脉注射的效果在该模型中与在富含透明质酸的肿瘤模型中相比不明显的多，支持rHuPH20对肿瘤间质压力的影响是透明质酸依赖性的。
实施例7
rHuPH20的PEG化
A.mPEG-SBA-30K与rHuPH20的偶联
为了产生PEG化可溶性人透明质酸酶，rHuPH20(大约60kDa的大小)共价偶联到甲氧基聚乙二醇(PEG)丁酸(mPEG-SBA-30K)的线性的N-羟基琥珀酰亚胺酯，其近似分子量为30kDa。mPEG-SBA的结构示于下图2：
图2
Figure BPA00001277192101421
制备用于PEG化rHuPH20的MPEG-SBA-30K的方法描述于例如US5,672,662)。简言之，根据以下方法制备MPEG-SBA-30K：
向丙二酸二乙酯(2当量)的二噁烷溶液在氮气气氛下逐滴加入氢化钠(2当量)和甲苯。mPEG的甲磺酸钠(1当量，MW 30kDa，Shearwater)溶解于甲苯，加入上述混合物中。由此产生的混合物回流约18小时。反应混合物被浓缩至原体积的一半，用10％NaCl水溶液提取，用1％盐酸溶液提取，混合含水提取物。所收集的水层用二氯甲烷(3×)萃取，有机层用硫酸镁干燥，过滤，蒸发至干燥。由此产生的残渣在含有氯化钠的1N氢氧化钠中溶解，搅拌混合物1小时。混合物的pH值通过加入6N盐酸调整至约3。将混合物用二氯甲烷(2×)萃取。
有机层用硫酸镁干燥，过滤，浓缩，倒入冷乙醚。沉淀物通过过滤和真空干燥收集。由此产生的化合物溶解在二噁烷中，回流8小时，然后浓缩至干燥。由此产生的残渣溶于水，用二氯甲烷(2×)提取，硫酸镁干燥，溶液通过旋转蒸发浓缩，然后倒入冷乙醚。沉淀物通过过滤和真空干燥收集。由此产生的化合物(1当量)溶解在二氯甲烷中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(2.1当量)。溶液冷却至0℃，逐滴加入二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液(2.1当量)。溶液在室温下搅拌约18个小时。反应混合物经过滤，浓缩和乙醚沉淀。沉淀物通过过滤和真空干燥收集，得到mPEG-SBA-30K。
为了制备PEG化rHuPH20，将MPEG-SBA-30K 共价偶联于rHuPH20的氨基，提供rHuPH20和mPEG之间的稳定酰胺键，如图3所示。
图3：
Figure BPA00001277192101431
对于偶联，加入MPEG-的SBA-30K粉末到rHuPH20中(浓度10mg/mL，在130mM NaCl/10mM HEPES；pH 7中)。PEG∶rHuPH20比为10∶1(摩尔比)。聚乙二醇在缓冲液中溶解后，对溶液无菌过滤(Corning 50mLTube top滤膜，聚苯乙烯，醋酸纤维素0.22μm膜)。偶联进行过夜，在寒冷房间内在4℃搅拌。
偶联后，用100,000MWCO TFF膜浓缩溶液，用130mM NaCl/10mMHEPES，pH 6.8进行缓冲液交换。由此产生的物质(对其进行酶活性测试)，如在实施例2所述，用130mM NaCl/10mM HEPES，pH 6.8稀释获得终酶活性100,000U/mL(对应大约2.5mg肽/mL)。该PEG化的rHuPH20材料以1mL填入13-mm的带brombutyl盖子的1型玻璃瓶，冷冻储存(在-80℃冰箱中冷冻过夜，然后置于-20℃冰箱中保存更长时间)。
B.分析PEG化的rHuPH20
PEG化rHuPH20通过凝胶电泳检测。实施例7A中制备的3批PEG化rHuPH20显示多条带的相同模式，代表未反应的PEG和多种MPEG-rHuPH20偶联物，其以不同的距离迁移。基于分子量标记迁移的比较，所述带代表大约90kDa至300kDa的种类，其具有3个高于240kDa标记的暗带。这些数据表明，通过mPEG-SBA-30K的共价偶联生成的PEG化rHuPH20含有PEG化rHuPH20种类的异源混合物，可能包括单，双和三PEG化蛋白质。60kDa的可见带的缺乏提示所有蛋白都与聚乙二醇反应，混合物中不存在可检测天然rHuPH20。
C.PEG化rHuPH20使得富含透明质酸的肿瘤细胞中的透明质酸特异性细胞周基质晕圈剂量依赖性减少
利用与实施例6A所述相似的方法，评估各种剂量的PEG化rHuPH20对富含透明质酸的人前列腺癌(PC3)细胞中细胞周基质(晕圈)的形成的影响。对于该测定，各种低密度PC3细胞培养物在37℃用细胞培养基单独处理(对照，0)，或PEG化rHuPH20(3，30，300，1000或3000酶单位每mL(U/mL)，利用上文实施例2所述的方法测定)60分钟。然后将培养物与0.5mg/mL牛聚集蛋白聚糖(可购得；大的聚集型硫酸软骨素蛋白多糖)在37℃保温60分钟。
为了利用HA(透明质酸)蛋白免疫组化(IHC)显示培养物中的HA量，细胞用生物素标记的透明质酸结合蛋白(HABP-bio)(Seikagaku，Japan)染色。洗涤去除第一试剂之后，利用FITC标记的抗生蛋白链菌素(Vector Labs，Canada)作为第二试剂。细胞核利用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)试剂复染。显微照片通过装配Insight FireWire数字相机(Diagnostic Instruments，Michigan)的Nikon Eclipse TE2000U显微镜捕获。
对于红细胞(RBC)粒子排除实验，将5×106福尔马林固定的血细胞添加到每个培养物。颗粒沉淀后，在100倍的放大倍率观察培养物。细胞周基质晕圈被鉴定为通过IHC HA染色阳性的区域，以及在粒子排除实验中粒子(RBC)从其中排除的区域。
“晕圈面积”是通过测量HA染色阳性(免疫组化)的像素或RBC被排除的区域的面积(mm2)来确定的。以类似方式分别测定每个实验的平均细胞面积(pixel或mm2)。“晕圈每细胞面积”通过用晕圈面积除以每个样品野的平均细胞面积来获得。“百分比晕圈”随后通过设定对照样品的晕圈面积每细胞为100％以及1000U-PH20处理的透明质酸-降解的H460细胞(来自实施例6A)的晕圈面积每细胞为0来确定。结果示于下表16。该表显示每个研究条件(PEG化rHuPH20剂量)的平均“百分比晕圈”；每个条件一式三份并且每个孔有25个复染的细胞(共计数n＝75细胞)；显示平均值的标准误(SEM)。数据显示，该研究中，PEG化rHuPH20减少晕圈的半数最大有效浓度(EC50)为3.1U/mL(0.09μg/mL)。75％的最大有效浓度(EC75)为14.1U/mL(0.4μg/mL)。
表16：聚乙二醇rHuPH20治疗的富含透明质酸的肿瘤细胞培养物中晕圈形成的剂量依赖性减少
Figure BPA00001277192101451
D.聚乙二醇rHuPH20抑制PC3细胞在体外的集落生长
要确定聚乙二醇rHuPH20是否能抑制富含透明质酸的前列腺肿瘤细胞(PC3)在体外不依赖于锚定的生长和增殖，对细胞进行三维成克隆实验。约80％满底的PC3细胞经胰酶消化，收获，在完全培养基中洗涤一次。细胞密度调整为8x104/mL细胞，悬浮于冰上的Matrigel
Figure BPA00001277192101452
(BD Biosciences，San Jose，CA)。0.025mL该细胞/Matrigel
Figure BPA00001277192101453
接种于预先用Matrigel
Figure BPA00001277192101454
以0.1mL每孔包被的48孔细胞培养板，37℃固化1小时。为连续暴露超过17天，以控制API缓冲液和各种浓度的PEG化rHuPH20，将0.6mL/孔含有API缓冲液，1，3，10和100U/mL的聚乙二醇rHuPH20添加到适宜孔的顶部。孔在37℃湿化环境中与空气中的5％CO2保温17天，包含适宜浓度的酶的新鲜处理培养基在17天中适宜时每3-4天进行置换。
第17天，集落的生长通过用连接Insight FireWire数字相机(Diagnostic Instruments，Michigan)的Nikon Eclipse TE2000U倒置显微镜捕获图像来评估。集落数和每个集落的直径(μm)用ImageJ软件(开源软件，是公众可得的，用于显示和分析图像，计算面积和像素值)以及配套的校准功能来测定(集落体积利用集落直径并利用公式：4/3πr3计算)。
测定每种条件下孔的平均集落体积，PEG化rHuPH20对集落体积的影响通过比较对照样品(API(活性药物成分)缓冲液(10mM Hepes和130mM NaCl，pH 7.0)，无酶)中的平均集落体积与存在PEG化rHuPH20下保温的样品中的平均集落体积来评估。利用如下公式计算抑制率：(平均对照体积-处理后的平均体积)/(平均对照体积)*100。
PEG化rHuPH20诱导生长的剂量依赖性抑制，通过与对照相比降低的集落体积得以证实。基于根据上述公式计算的抑制率，与和对照缓冲液保温的培养物相比，在存在1，3，10和100U/mL PEG化rHuPH20的条件下保温的培养物显示集落体积分别平均减少39％，67％，73％和75％(对于3U，10U样品p＜0.01；对于100U样品p＜0.001；n＝6)。统计学差异采用Mann-Whitney检验分析。
PEG化rHuPH20减少集落体积的IC50利用Graphpad Prism
Figure BPA00001277192101461
4 program(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)测定约为1.67U/mL。载体处理的(对照)培养物中集落平均数目为10.17±1.56每孔，100U/mLPEG化rHuPH20处理的培养物中为11.50±0.89每孔。集落数目的差异在对照和100U/mL培养物之间不明显(n＝6，p＞0.05)。这些结果表明PEG化rHuPH20可已知富含透明质酸的癌细胞的增殖和/或存活。
实施例8
PEG化rHuPH20：与天然rHuPH20相比体内作用时间增加
A.评估天然rHuPH20和PEG化rHuPH20的药效学
1.评估天然rHuPH20的药效学
90只雄性CD-1小鼠获自Charles River Laboratories。这些动物在随机化当天约3至5周龄，约17至23g。动物经尾静脉注射(静脉注射)0.398mg/kgHUA(批号HUA0703MA；利用实施例1所述的Gen1生成法产生)或0.433mg/kg HUB(批号HUB0702CA；利用实施例4所述的Gen2生成法产生)rHuPH20给药。静脉注射是缓慢推注大约30秒。给药前1，5，10，30分钟以及给药后1，2，3小时，给予PH20(HUA或HUB)的6只动物被麻醉/安乐死后采血。采集血浆样品，冷冻保存直到rHuPH20浓度测定。
rHuPH20血浆浓度使用基于96孔板酶测定法来测定。这种酶测定法是对Frost等人描述的方法(1997)(A Microtiter-Based Assay for Hyaluronidase活性Not Requiring Specialized Reagents.Analytical Biochemistry(1997)251：263-269)的改进，所述方法提供了血浆样品或组织匀浆物中rHuPH20含量的测定。首先，生物素化的HA(bHA)底物与塑料微孔板结合。标准品和样品中存在的rHuPH20在这些bHA包被的板中在37℃在优化条件下保温大约90分钟。停止酶反应后，通过先加入抗生蛋白链菌素-HRP偶联物60分钟然后利用TMB底物显示反应来检测剩余的结合bHA。由于标准品或样品中较多的rHuPH20将造成较少的bHA可结合SA-HRP，光密度(450nm)值与每份样品中的透明质酸酶活性浓度成反比。测定范围是大约0.013至1U/mL。对于50倍样品稀释因子，LLOQ约为0.625U/mL。因此，该测定法对于1∶100稀释的样品的定量下限(LLOQ)为0.625U/mL的酶。药代动力学(PK)分析利用WinNonlin Pro version 5.1(Pharsight Corp.，Mountain View，CA.)进行。PK参数利用非房室方法产生。总的统计数字用EXCEL(Microsoft Corp.，Seattle，WA)或JMP v.5.0.1(SAS Institute，Cary，NC.)计算。ANOVA使用JMP v.5.0.1进行。
开始IV输注(1分钟采集时间)立刻获得rHUPH20(HUA and HUB)峰值血浆高浓度。HUA和HUB的平均峰值浓度(Cmax)分别是1148and 1176ng/mL。HUA和HUB从峰值浓度的下降都是迅速且双相的。给药之后1-5分钟之间的初始分布阶段之后是稍慢的消除阶段。给药后30分钟血浆浓度降低到低于测定定量限(0.625U/mL)。IV注射的终末半寿期(T1/2λz)对于HUA为0.045小时(2.6分钟)，对于HUB为0.038小时(2.3分钟)。短半寿期表示雄性CD-1小鼠中rHuPH20迅速消除。
2.评估PEG化rHuPH20的药效学
单剂量PK研究在雄性IRC小鼠(Harlan)中进行以定性和比较两批PEG化rHuPH20(PEGPH20)的血浆浓度相对于时间的变化谱；批次2005-9-14(比活性38,000U/mg)和批次221-092(比活性32,000U/mg)。此外，重复周一-周四BIW(每周两次)IV注射后的PK浓度在一组实验动物中检测。
PEGPH20(如实施例7A所述制备)静脉内给药超过25g的雄性IRC小鼠；IV剂量为125,000透明质酸酶活性单位每公斤体重(U/kg)。给药以及给药后预定时间收集血液样品。由于小鼠的血容量有限，连续采集血液时采用少量采样的方案。研究动物随机化和少量采血样的时间显示于表16A。
Figure BPA00001277192101481
从收集的血样制备血浆并储存于-70℃直到分析。每份血浆样品中的透明质酸酶活性通过实施例2所述的基于微浊度微量滴定板的测定法测定。该测定法的定量下限为2.90U/mL。血浆浓度随时间变化的数据通过非隔室和隔室方法利用WinNonlin Pro version 5.1(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)分析。得到的PK参数包括AUC，Cmax，和Tmax。比较两批PEGPH20的这些参数评估PK可比性。利用总比活性35,000U/mg从U/mL转化为μg/mL。35,000U/mg是2批PEGPH20(批次221-092和2005-9-14)的平均值。
AUC和Cmax确定的系统暴露在两批PEGPH20静脉给药小鼠时是相似的。两个批次的总PK谱在大约10-11小时的延长的消除半寿期以及低于10mL/h-kg的缓慢系统清除率方面是相似的。采血时间的平均和中值血浆浓度的统计学比较显示2个批次的PEGPH20之间没有明显差异。重复BIW(周一-周四)IV给药PEGPH20共3个剂量产生可通过第一剂量的药代动力学预测的预期血浆浓度。这些结果提示PEG化的rHuPH20在静脉注射给药之后具有持续的体内酶活性，半寿期增加超过大约250倍。
B.富含透明质酸的肿瘤模型(胫骨周PC3前列腺癌异种移植物模型)中的体内活性
为了比较PEG化和天然rHuPH20在静脉内给药之后的效果，如上实施例6所示的胫骨周PC3前列腺癌异种移植物模型动物用天然和PEG化的rHuPH20治疗。
1.给药PEG化rHuPH20之后血浆中透明质酸酶的酶活性持续时间延长
两组胫骨周PC3前列腺癌异种移植物模型动物(携带PC3人前列腺癌异种移植物的无胸腺雄性动物；见上文实施例6)分别静脉内注射10,000单位PEG化的rHuPH20(如实施例7A所述制备)和天然rHuPH20。
给予10,000单位天然rHuPH20/PEG化的rHuPH20之前，以及给药之后的各个时间点从动物采血。制备血浆并利用如上文实施例2所述的酶活性测定法确定这些时间点每mL血浆的rHuPH20活性单位。结果表明给予天然rHuPH20之后血浆中酶活性半寿期低于1分钟(该实验中血浆半寿期为0.59分钟)。给予天然rHuPH20后10分钟，观察到低于5个酶单位每mL血浆。
反之，PEG化的rHuPH20显示超过24小时的血浆酶半寿期。给药10,000酶单位PEG化的rHuPH20后60分钟，观察到超过1000酶活性单位(超过注射的10％)每mL血浆。这些结果提示PEG化的rHuPH20在静脉注射给药之后具有持续的体内酶活性，其半寿期增加超过2000-倍。
2.PEG化的rHuPH20使得远端肿瘤中透明质酸减少的持续时间延长
给药天然/PEG化的rHuPH20之前以及给药后45分钟，2小时，24小时，48小时和72小时收获来自实施例8B.1描述的小鼠的胫骨周肿瘤并固定在正常缓冲的福尔马林(NBF)中。肿瘤中的透明质酸(HA)水平通过免疫组织化学(IHC)评估。为了IHC，利用生物素标记的透明质酸结合蛋白(HABP-bio)(Seikagaku，Japan)染色5μm肿瘤切片。洗涤去除以及试剂之后，利用FITC-标记的抗生蛋白链菌素(Vector Labs，Canada)作为第二试剂。细胞核用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)试剂复染。经由装配Insight FireWire数字相机(Diagnostic Instruments，Michigan)的Nikon Eclipse TE 2000U显微镜捕获显微照片。
给药rHuPH20之前，强的绿染指示肿瘤中存在HA。静脉内给药10,000单位天然rHuPH20后45分钟，肿瘤不显示任何可见的HA染色。然而，24小时之内，肿瘤中的HA水平似乎回到给药前观察到的情况，与天然rHuPH20的快速透明质酸转化率以及短半寿期一致。但是给药PEG化的rHuPH20之后，给药后2小时，48小时，和72小时都没有观察到HA染色。这些结果提示静脉内给药PEG化的rHuPH20导致给药后至少72小时在肿瘤部位具有持续的酶活性。
3.PEG化的rHuPH20导致远端肿瘤中HA降解的剂量反应
另一研究中，另外一组胫骨周PC3前列腺癌异种移植物模型动物中的动物用载体和各种剂量浓度(10，100，500，1000和10,000酶单位(U)每只小鼠)的PEG化rHuPH20处理。该治疗后3天(72小时)，收获小鼠的胫骨周肿瘤固定于正常缓冲的福尔马林。肿瘤中的透明质酸(HA)水平通过免疫组织化学(IHC)评估，如实施例8B.2所述。也对肿瘤切片进行苏木素/伊红(H&E)染色。结果显示用100，500，1000和10,000U PEG化的rHuPH20处理的动物的肿瘤切片中HA染色的剂量依赖性减少。在接受1000和10,000U PEG化的rHuPH20的动物的切片中，几乎没有观察到可见的染色。在接受500U PEG化的rHuPH20的动物的切片中，观察到散在的染色，表示该示例性研究中，HA染色仅仅在采用超过500(在该情况下，1000)U被完全去除。这些结果表明单独系统性给药PEG化的rHuPH20可减少远端肿瘤中的透明质酸至少3天。该研究中PEG化的rHuPH20的ED50(激发HA染色减少50％的剂量)是13,000酶单位每公斤(U/Kg)，对应300μg/Kg。
4.PEG化的PH20从远端PC3肿瘤去除HA的作用持续时间
在进一步的研究中，PC3的前列腺肿瘤模型动物用载体治疗十天，或用10,000U每只小鼠(约15mg/Kg)的PEG化rHuPH20治疗1，2，3，4，5，6，7，8，9或10天。治疗后，收获小鼠胫骨周肿瘤并固定在正常缓冲的福尔马林中，通过实施例8B.2所述的免疫组化评估透明质酸(HA)的表达。HA染色在所有时间点都减少，在第5天是没有可见的HA染色。
实施例9
PEG化的rHuPH20持续抑制IFP
A.PEG·rHuPH20给药导致肿瘤IFP快速、持续、剂量依赖性减少
为了比较系统性给药PEG化的rHuPH20(PEG rHuPH20)和天然rHuPH20对远端肿瘤IFP的影响，利用上文实施例6B所述的方法测定静脉内给药各种剂量的每种酶之后PC3异种移植物模型动物中的肿瘤IFP。
首先，比较肿瘤IFP中的减少，其中利用每组3只小鼠，每只鼠接受10,000单位剂量的PEG rHuPH20或天然rHuPH20。如实施例6B所述，给药天然rHuPH20的情况下，给药后，肿瘤IFP在10分钟之内平均减少34％，1小时之内平均减少61.3％。给药10,000单位的PEG rHuPH20导致注射后第一个10分钟之内类似的减少(22.4％)。但给药后1小时，PEG rHuPH20使得远端肿瘤IFP与基线相比平均减少88.6％，表明PEG化的可溶性透明质酸酶与天然酶相比具对IFP具有增加和/或持续的效果。
其次，为了确定rHuPH20对间质流体压力的影响是否是剂量依赖性的，利用10组PC3异种移植物小鼠(每组7只小鼠)进行实施例6B所述的方法，其中每个组都如上所述用100，1000，3000，7000(仅PEG化rHuPH20)或10,000单位的PEG化的或天然rHuPH20，或对照载体缓冲液处理，其经由尾静脉注射静脉内给药。IFP在给药之前，之中和之后连续测定。一直测量IFP直到给药后120分钟。
结果显示天然和PEG化的rHuPH20的静脉内注射使得远端肿瘤IFP以剂量依赖的方式减少。数个剂量的PEG化rHuPH20导致IFP在给药后1和2小时大大降低。例如，在该实施例中，120分钟后，给药1000单位的天然rHuPH20导致肿瘤IFP减少大约30％(与对照相比大约70％)，而给药相同剂量(1000单位)的PEG rHuPH20减少肿瘤IFP超过50％(大约为对照的48％)。最高剂量(3,000-10,000U/小鼠)的PEG化rHuPH20导致的IFP减少在129分钟时超过80％。IC50(PEG化的rHuPH20治疗后120分钟的％IFP抑制)为807.6U/小鼠。3个最高剂量(3000，7000和10,000U PEG化的rHuPH20/小鼠)效果在该时间点呈平台状。
B.静脉内给药PEG化的rHuPH20导致延长的肿瘤IFP抑制
为了确定PEG化的rHuPH20的体内活性持续时间是否延长(如实施例8中观察到的，即延长的肿瘤IFP抑制)，PC3异种移植物模型动物(4只动物每组)的组静脉内注射载体缓冲液或10,000单位的PEG化的rHuPH20，给药后8小时，24小时，48小时和72小时如实施例6B测定IFP。
类似的实验显示远端肿瘤IFP在给药天然rHuPH20后24小时回到对照水平。反之，该实验中，IFP在静脉内给药单剂量10,000单位PEG化的rHuPH20后8小时，24小时和48小时减少至少约50％。该实验中，平均肿瘤IFP在72小时接近对照水平。这些结果提示PEG化的rHuPH20可静脉内给药以实现远端肿瘤位点的延长的间质流体压力降低。
C.PEG化的rHuPH20给药使得肿瘤IFP减少不依赖于HA
为了证实PEG化的rHuPH20对肿瘤IFP的减少依赖于肿瘤中透明质酸(HA)的存在，在5个不同的肿瘤模型中评估对IFP的影响。为了该研究，每个肿瘤模型的动物的组通过用适宜细胞系接种雄性无胸腺裸(nu/nu)小鼠产生：PC3(如上所述，例如实施例6)；BxPC3(人胰腺癌细胞系)；Mat LyLu(来自大鼠前列腺癌的Dunning系列的大鼠前列腺癌)；Du145(人激素抵抗型前列腺癌细胞系)；和NCI H460(人大细胞肺癌细胞系)，接种在后肢，胫骨周，如对于PC3模型所述(见上文实施例6)。
如下文实施例17中所述，分离自这些小鼠的肿瘤通过免疫组化(IHC)评估HA表达程度的差异。IHC对肿瘤切片进行，并利用一种评分系统，其中“+++”分数表示视野中超过80％浓染，“+/-“表示稀疏染色，“-“表示无可见染色。如实施例17和下表17所示，该研究显示肿瘤中HA水平的范围是+++到+/-。
来自PC3前列腺肿瘤模型，BxPC3胰腺癌肿瘤模型，Mat LyLu前列腺肿瘤模型，Du145人前列腺肿瘤模型，和NCI H460肺癌模型的动物的肿瘤达到400-800mm3经静脉内注射15mg/Kg(10,000U每只小鼠)PEG化的rHuPH20或对照缓冲液(API(活性药物成分)缓冲液(10mM Hepes和130mM NaCl，pH7.0)，无酶)。这些模型中每一个的肿瘤HA相对量如实施例17A所述测定，示于下表17。
如实施例6B所述给药之前、之中和之后连续测定IFP。IFP测定持续到给药后120分钟。下表17显示每个肿瘤模型在120分钟时IFP的大约相对减少(与利用对照缓冲液的治疗相比)。对于这些数字，比较接受PEG化的rHuPH20的动物与接受对照缓冲液的动物中的IFP。结果表明PEG化的rHuPH20的静脉内给药以HA依赖性方式减少远端肿瘤中的IFP。
表17：PEG化的rHuPH20对肿瘤IFP的减少有赖于肿瘤中的HA量
  肿瘤模型   相对肿瘤HA  大约相对IFP减少
  PC3   +++  84％
  BxPC3   +/++  30％
  Mat LyLu   +  25％
  Du145   +/-  19％
  NCI H460   +/-  16％
实施例10
静脉内给药rHuPH20导致远端肿瘤中血管体积增加(PEG化的rHuPH20的持续的效果)
利用反式2维超声成像(Transverse 2-dimensional ultrasound imaging)测定实施例6中所述异种移植物模型的胫骨周肿瘤中给药rHuPH20前后的血管体积。
利用VisualSonics Vevo 770
Figure BPA00001277192101531
high resolution ultrasound(U/S)(VisualSonics，Inc.，Toronto，Ontario，Canada)，Contrast模式，获得肿瘤中血管体积的相对测定。Contrast模式图像获取过程中，非靶向的氮/过氟丁烷填充的MicroMarker
Figure BPA00001277192101532
micro-bubbles(MBs)(VisualSonics，Inc.)(尚未但将由于其大小留在血管区中)通过尾静脉注射静脉内给药。MB是高回声的，由此提供强的超声波反射并具有中值直径2.3-2.9mm。由此，MB在注射后局限于血管区。利用以下公式计算相对血管体积，其中用MB注射(B)后的超声信号强度减去MB注射前(A)的超声信号强度，每目的肿瘤区(ROI)：
血管体积(τ1)＝[(B-A)/ROI]
相对血管体积改变是时间点(例如给药rHuPH20之前和之后)的血管体积差异(如利用上述公式计算的)，根据如下公式计算：
血管体积改变＝Vasc Vol(τ2)-Vasc Vol(τ1)
利用该方法，在静脉内给药可溶性人透明质酸酶(天然或PEG化的)到异种移植物模型动物之后8小时，24小时，48小时h和72小时测定胫骨周肿瘤中的血管体积，如上文实施例6和9所述。给药天然rHuPH20后的8和24小时，血管体积在注射单独的缓冲液之后的情况高3-4倍。给药PEG化的rHuPH20后48小时，肿瘤血管体积与注射单独的缓冲液之后观察到的情况相比仍增加3倍。这些结果表明系统性给药PEG化的rHuPH20可实现肿瘤血管的持续“酶减压”，导致血管体积增加。
肿瘤血管的酶减压也通过免疫组化(IHC)显示血管来评估。收获来自没有经过载体缓冲液或10,000单位PEG化的rHuPH20处理的组(每组3值PC3异种移植物模型动物)的胫骨周肿瘤，固定在福尔马林中并包埋在石蜡中。为了检测血管，利用大鼠抗小鼠CD31抗体(Pharmingen，San Diego)染色肿瘤切片。用一级抗体洗涤之后，用HRP-偶联的兔抗大鼠IgG(Vector Labs，Canada)染色切片。用二级抗体洗涤之后，利用|DAB底物显示CD31染色。细胞核用苏木素复染。微血管区利用ImageJ开源软件电脑定量，该软件是公众可得的程序，用于显示和分析图像，计算面积和像素值。这种情况下，利用该程序测定CD31阳性微血管中的面积。结果显示对照处理的动物的肿瘤切片中CD31+微血管平均面积为大约200平方微米(μm2)，48小时前接受静脉内剂量的PEG化的rHuPH20的小鼠的肿瘤切片为大约700μm2。这种超过3倍的增加支持了PEG化的rHuPH20的给药实现肿瘤血管的持续酶减压。
实施例11
静脉内给药PEG化的rHuPH20导致肿瘤水含量持续降低
静脉内给药10,000单位PEG·rHuPH20或单独的载体缓冲液之后的各个时间点，在PC3异种移植物动物(每组9只小鼠)中测定肿瘤水含量，如上述实施例所述。给药后2，8，24，48，72，96和120小时测定水含量。
为了测定水含量，对PC3肿瘤片进行收获，装瓶，称重和速冻。样品随后置于冻干仪中，干燥超过48小时并称重。将水含量报告为组织湿重与干重的比例。结果显示在所有时间点，湿/干重比例在接受PEG rHuPH20的小鼠中相对于接受载体缓冲液注射的动物而言明显降低。
相对H2O扩散率(ADC)-给予动物天然rHuPH20，PEG·rHuPH20，或载体缓冲液，利用Diffusion Weighted MRI随时间测定表观扩散系数(ADCs)(见例如，Park MJ et.al，Korean J Radiol.2007(5)：390-6，The role of diffusion-weighted imaging and the apparent diffusion coefficient(ADC)values for breast tumors)。ADC值反映肿瘤水含量。给药之后48和72小时，PEG·rHuPH20治疗后的平均H2O表观扩散系数(ADC)与用单独的载体缓冲液治疗相比在统计学上不同。水ADC减少反映了用静脉内PEG化rHuPH20治疗的动物中的肿瘤的水扩散/translational运动减少。因此，在这些动物中在48和72小时肿瘤中的水扩散明显减少。由此，肿瘤中的水扩散在这些动物中在48和72小时相对于对照明显减少。该结果表明静脉内给药PEG化rHuPH20后间质体积分数降低和/或间质流体曲率(tortuosity)降低至少72小时。
实施例12
确定唾液酸和单糖含量
用三氟乙酸水解之后，可溶性rHuPH20的唾液酸和单糖含量可通过反相液相层析(RPLC)评估。一个实例中，测定纯化的透明质酸酶批次#HUB0701E(1.2mg/mL；基本如实施例5所述制备和纯化)的唾液酸和单糖含量。简而言之，用40％(v/v)三氟乙酸在100℃水解一式两份的100μg样品4小时。水解之后，干燥样品并重悬于300μL水。每份重悬的样品的45μL等分试样转移到新的试管中干燥，每个试管中加入10μL 10mg/mL乙酸钠溶液。释放的单糖通过加入50μL含30mg/mL 2-氨苯甲酸，20mg/mL氰基硼氢化钠，大约40mg/mL乙酸钠和20mg/mL硼酸的甲醇溶液进行荧光标记。混合物在80℃在暗处标记30分钟。衍生反应通过加入440μL流动相A(0.2％(v/v)n-丁胺，0.5％(v/v)磷酸，1％(v/v)四氢呋喃)淬灭。水作为基质空白也经水解并如对透明质酸酶样品所述进行衍生化作为阴性对照。释放的单糖通过RPLC利用十八基(C18)反相柱(4.6x 250mm，5μm颗粒大小；J.T.Baker)分离并通过荧光检测来监测(360nm激发，425nm发射)。单糖含量的定量通过比较透明质酸酶样品的测报告系谱和包括N-D-葡糖胺(GlcN)，N-D-半乳糖胺(GalN)，半乳糖，岩藻糖和甘露糖的单糖标准物的层析谱来进行。表18代表每个透明质酸酶分子每种单糖的摩尔比。
表18.可溶性rHuPH20的单糖含量
Figure BPA00001277192101561
*GalN结果低于检测限
实施例13
3D35M和2B2细胞的可溶性rHuPH20的C-末端异源性
对两批sHuPH20进行C末端测序，其中一批在100L生物反应器(批次HUA0505MA)中制备并纯化自3D35M细胞，另一批在300L生物反应器(批次HUB0701EB)中制备并纯化自2B2细胞。所述批次分别用内切蛋白酶Asp-N消化，所述蛋白酶特异性在天冬氨酸和半胱氨酸的N末端肽健切割。从SEQ IDNO：4的位置431的天冬氨酸处释放可溶性rHuPH20的C末端片段。该C末端片段经分离并定性，确定批次HUA0505MA和批次HUB0701EB中每个群体的序列和丰度。
观察到从3D35M细胞和2B2细胞产生的可溶性rHuPH20制备物显示异源性，并在C末端序列中包含不同的肽(表19和20)。该异源性可能是表达的447个氨基酸的肽(SEQ ID NO：4)经存在细胞培养基或其他溶液中的肽酶在制备和纯化过程中的C末端切割导致的。可溶性rHuPH20制备物中的多肽具有的氨基酸序列对应SEQ ID NO：4所示可溶性rHuPH20序列的氨基酸1-447，1-446，1-445，1-444和1-443。这些多肽的每一个的完整氨基酸序列示于SEQ IDNOS：4-8。入表19和20所示，来自3D35M细胞and 2B2细胞的可溶性rHuPH20制备物中的每种多肽的丰度不同。
表19.分析来自批次HUA0505MA的C末端片段
Figure BPA00001277192101562
Figure BPA00001277192101571
表20分析来自批次HUB0701EB的C末端片段
Figure BPA00001277192101572
实施例14.
前列腺癌模型中PEG化的rHuPH20和细胞毒剂静脉内给药后的抗肿瘤效果
共同给药PEG化的rHuPH20和细胞毒药剂多西他赛(Taxotere
Figure BPA00001277192101573
SanofiAventis)以及脂质体多柔比星(Doxil
Figure BPA00001277192101574
Ortho Biotech)的抗肿瘤效果利用激素抵抗型前列腺癌异种移植物模型和骨转移模型评估。
A.前列腺癌异种移植物模型
为了建立PC3胫骨周激素抵抗型前列腺癌异种移植物模型，无胸腺雄性裸鼠在右侧胫骨骨膜附近肌内接种人PC3前列腺癌细胞(1x106细胞每只小鼠，总体积0.05mL)，产生平均间质流体压力34±16mmHg的肿瘤。允许肿瘤生长到平均肿瘤体积400-500mm3，然后开始利用细胞毒药剂/PEG化的rHuPH20，单独的细胞毒药剂或单独的PEG化的rHuPH20的治疗。肿瘤生长利用VisualSonics Imaging Micro-ultrasound系统监测。
一组小鼠在第0和7天静脉内给药10mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192101581
(多西他赛)和10,000U/小鼠PEG化的rHuPH20。首先用注射器抽取0.1mL Taxotere
Figure BPA00001277192101582
(多西他赛)，然后是0.1mL PEG化的rHuPH20，然后立刻将0.2mL溶液注入小鼠尾静脉。这些小鼠也在地3和10天接受另外剂量的10,000U/小鼠PEG化的rHuPH20(0.2mL静脉内注射)。对照组小鼠(G2)地0和7天静脉内接受10mg/kg多西他赛Q7Dx2。另一组对照小鼠在地0和7天静脉内接受30mg/kg多西他赛Q7Dx2。另一组对照小鼠在第0，3，7和10天静脉内给药10,000U/小鼠PEG化的rHuPH20。最后一个对照组仅接受API缓冲液，也包含在研究中(G1)。肿瘤体积在各时间点测定(图1和表21)，观察1500mm3肿瘤体积下的存活百分比。表22显示共同给药Taxotere
Figure BPA00001277192101583
(多西他赛)和PEG化的rHuPH20对存货的影响的分析。中值存活时间(MST)(天)通过每组中给予各个动物的1500mm3肿瘤体积下的中值时间计算。％T/C通过％T/C＝(T/C)x100计算，其中T是治疗组1500mm3肿瘤体积下的中值存活时间，C是API缓冲对照组1500mm3肿瘤体积下的中值存活时间。根据National Cancer Institute(NCI)标准，％T/C超过125％的产品被认为具有活性。生存期延长(ILS)是抗肿瘤活性的一个指标，通过[(T-C)/C]x100计算，其中(T-C)是治疗组(T)和对照组(C)1500mm3肿瘤体积下的中值存活时间的差值。根据NCI标准，％ILS超过25％的产品有效。
共同给药Taxotere
Figure BPA00001277192101584
(多西他赛)和PEG化的rHuPH20在73天之中产生协同肿瘤生长抑制效果，其明显优于单独给药多西他赛10mg/kg Q7Dx2或单独给药PEG化的rHuPH20，存活时间延长(定义为达到肿瘤体积1500mm3的时间)。
表21.共同给药Taxotere
Figure BPA00001277192101585
(多西他赛)和PEG化的rHuPH20对肿瘤体积的影响
Figure BPA00001277192101586
Figure BPA00001277192101591
表22.共同给药Taxotere
Figure BPA00001277192101592
(多西他赛)和PEG化的rHuPH20对存活的影响
Figure BPA00001277192101593
为了评估共同给药PEG化的rHuPH20和脂质体多柔比星的抗肿瘤效果，携带PC3肿瘤的小鼠地0，7和14天静脉内给药6mg/kg Doxil
Figure BPA00001277192101594
脂质体多柔比星和10,000U/小鼠PEG化的rHuPH20。首先用注射器抽取0.1mLDoxil
Figure BPA00001277192101595
脂质体多柔比星，然后是0.1mL PEG化的rHuPH20，随后立即将0.2mL溶液注入小鼠尾静脉。这些小鼠在第3，5，10和12天还接受额外剂量的0.2mL 10,000U/小鼠PEG化的rHuPH20。第0，7和14天对照组小鼠静脉内给药6mg/kg Doxil脂质体多柔比星。另一组对照小鼠在第0，3，5，7，10，12和14天给药0.2mL 10,000U/小鼠PEG化的rHuPH20。最后一个对照组仅仅接受API缓冲液，也包含在研究中。在各个时间点观察肿瘤体积(图3和表23)。观察到共同给药PEG化的rHuPH20和脂质体多柔比星的抗肿瘤效果在统计学上显著优于单独给药脂质体多柔比星。
表23.共同给药Doxil
Figure BPA00001277192101597
脂质体多柔比星和PEG化的rHuPH20对肿瘤体积的影响
Figure BPA00001277192101598
Figure BPA00001277192101601
B.PC-3M-luc-C6骨转移模型
PC-3M-luc-C6骨转移模型如Jenkins et al.(Clin Exp Metast(2003)20：745-756)所述在裸鼠中建立。由于PC-3M-luc-C6细胞具有生物荧光，除了监测小鼠存活，还可对小鼠拍照显示PC-3M-luc-C6转移。简而言之，7-10周龄nu/nu雄性小鼠(Charles River Laboratories)在第0天经麻醉心内注射悬浮于50μL无菌DPBS的3×106PC-3M-luc-C6细胞(生物发光人前列腺癌细胞系)。通过非手术方式注入小鼠左心室提高PC-3M-luc-C6细胞转移的能力。肿瘤细胞心内注射流经肺，作为扩散细胞进入总体循环从而允许在动物多个组织中的转移定植的方法。满意的注入左心室可在数分钟内通过生物发光成像(BLI)检测，并通过整个动物中即刻但瞬间的系统生物发光鉴定，如小鼠的完全蓝色信号BLI所示。不成功的植入产生更为局限的信号，通常仅在动物胸部随时间分离和持续。第0和11天胸部显示高生物发光信号的动物从实验排除。第0天成功心内注入PC-3Mluc-C6细胞(n＝10-13小鼠/组)的小鼠每周拍照两次持续达4周，随后跟踪存活情况直到第49天以及超过该时间点。所有小鼠中，早期多组织转移指征见于细胞注射后14天内。观察到的转移模式表示小鼠胸、下颌和/或腿中出现病灶。
第14天，对小鼠进行多种治疗方案之一。一组对照小鼠仅在第14，16，18，21，23，25，28，30，和32天给药API缓冲液(10mM Hepes和130mM NaCl，pH 7.0)。第14和21天，其他两组小鼠接受30mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192101602
(多西他赛)Q7Dx2，或第14，21和28天接受10mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192101603
(多西他赛)Q7Dx3。另一组小鼠在第14，16，18，21，23，25，28，30，32和35天静脉内给药10,000U/小鼠PEG化的rHuPH20。另外两组小鼠接受混合PEG化的rHuPH20/Taxotere(多西他赛)或依次给药PEG化的rHuPH20和Taxotere
Figure BPA00001277192101612
(多西他赛)。这些组中的第一组在注射后第14，21和28天静脉内给药10mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192101613
(多西他赛)和10,000U/小鼠PEG化的rHuPH20。首先用注射器抽取0.1mLTaxotere(多西他赛)，然后是0.1mL PEG化的rHuPH20，然后立即将0.2mL溶液注入小鼠尾静脉。这些小鼠也在第16，18，23，25，30和32天接受另外剂量的0.2mL 10,000U/小鼠PEG化的rHuPH20。这些组中的第二组接受相同剂量，但接受的是10mg/kg Taxotere(多西他赛)/10,000U PEG化的rHuPH20混合物，10,000单位PEG化的rHuPH20剂量在给药10mg/kgTaxotere
Figure BPA00001277192101616
(多西他赛)之前2小时给药。
第0，11，15，18，22，25和29天，如前所述对小鼠成像(Jenkins et al.(2003)Clin Exp Metast 20：745-756)，利用IVIS
Figure BPA00001277192101617
Imaging System(Xenogen)，通过Living Image
Figure BPA00001277192101618
software(Xenogen)分析，显示生物发光PC-3M-luc-C6转移。第0和11天的初始信号通过随后的图像(到第29天)证实，几乎所有转移为点都显示生物发光随时间之间增加。小鼠下颌区体内生物发光信号对应牙髓，下颚或颈淋巴结中的微小转移。下肢体内信号对应胫骨或股骨中鉴定的转移灶。体内胸部信号与定植到心脏、肺和胸腔的胸膜表面的残余肿瘤细胞相关。小鼠图像表明第0天成功的系统注射一剂显示第29天的体内转移证据包含在治疗组的分析中。
第14和21天静脉内给药30mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192101619
(多西他赛)表示最高剂量水平MTD(最大耐受剂量)。从第11-29天获得的图像表明药物对治疗小鼠中所有转移位点具有明显抑制效果。第11天的图像显示小鼠具有代表性转移模式，其随时间逐渐消失，如在地29天可在11只第29天存活的小鼠中的10只中检测到生物发光强度所示。类似的趋势，但程度较低的发光减少见于10mg/kg Taxotere
Figure BPA000012771921016110
(多西他赛)治疗小鼠的图像中，其中在肿瘤细胞注射后第29天存活的12只小鼠中有9只显示发光。反之，对照PEG化的rHuPH20治疗的小鼠显示整个动物生物发光随后relapse的证据，如从6只存活小鼠第29天的图像中的信号反弹所示。第29天，接受混合PEG化的rHuPH20/Taxotere
Figure BPA000012771921016111
(多西他赛)的小鼠和接受依次给药的PEG化的rHuPH20和Taxotere
Figure BPA000012771921016112
(多西他赛)的小鼠显示BLI信号量和强度减少水平未变，表明肿瘤稳定播散到骨位点。具体地，接受依次剂量的PEG化的rHuPH20和Taxotere
Figure BPA00001277192101621
(多西他赛)的4只小鼠在第29天完全没有信号，表明可能治愈或长期存活效果。
每组小鼠在心内注射PC-3M-luc-C6后第49天的存活率示于表24。观察到共同给药10,000单位PEG化的rHuPH20和10mg/kgTaxotere
Figure BPA00001277192101622
(多西他赛)导致比单独用10mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192101623
(多西他赛)治疗更强的抗肿瘤活性。
表24.PC-3M-luc-C6骨转移模型中共同给药PEG化的rHuPH20和Taxotere
Figure BPA00001277192101624
(多西他赛)对存活的影响
Figure BPA00001277192101625
实施例15.
毒性研究-单独的PEG化的rHuPH20以及与多西他赛联用
对单独的PEG化的rHuPH20以及与Taxotere
Figure BPA00001277192101626
(多西他赛)联用的毒性研究中，给药裸鼠各种剂量的PEG化的rHuPH20与10mg/kg Taxotere
Figure BPA00001277192101627
(多西他赛)。对照组小鼠接受单独的PEG化的rHuPH20，单独的Taxotere
Figure BPA00001277192101628
(多西他赛)或单独的API缓冲液也包含在该研究中。表25显示对每组小鼠的治疗方案。对于毒性研究，体重和生活(in life)观察在研究过程中监测达26天。完整血液化学以及差异性血清临床化学基于外部合作研究机构BioQuant Inc(San Diego，CA)的全血和血清样品评估。
表26和27以及图4和5显示给药单独的PEG化的rHuPH20，PEG化的rHuPH20/Taxotere
Figure BPA00001277192101631
(多西他赛)以及单独的Taxotere
Figure BPA00001277192101632
(多西他赛)之后体重的改变。表27和图6显示给药单独的PEG化的rHuPH20，PEG化的rHuPH20/Taxotere
Figure BPA00001277192101633
(多西他赛)和单独的Taxotere
Figure BPA00001277192101634
(多西他赛)的小鼠血液中粒细胞的数目，表28和图7显示给药单独的PEG化的rHuPH20，PEG化的rHuPH20/Taxotere
Figure BPA00001277192101635
(多西他赛)和单独的Taxotere
Figure BPA00001277192101636
(多西他赛)。健康小鼠血液中粒细胞数目的正常范围是1.2-6.8×103细胞/μL，正常血清白蛋白范围是2.5-4.8g/dL。观察到共同给药多西他赛h和PEG化的rHuPH20耐受良好，中性粒细胞减少没有明显增加(如粒细胞没有明显减少所示)并且在最大耐受剂量(MTD)30mg/kg时与单独的多西他赛治疗相比耐受更好。给药单独的达30,000U/小鼠的PEG化的rHuPH20也耐受良好。
表25.PEG化的rHuPH20/Taxotere毒性研究的治疗方案
Figure BPA00001277192101637
表26.给药单独的PEG化的rHuPH20之后体重的改变
Figure BPA00001277192101642
表27.给药PEG化的rHuPH20/Taxotere
Figure BPA00001277192101643
(多西他赛)或单独的Taxotere(多西他赛)之后体重的改变
Figure BPA00001277192101645
Figure BPA00001277192101651
表28.给药PEG化的rHuPH20/Taxotere
Figure BPA00001277192101652
(多西他赛)或单独的Taxotere
Figure BPA00001277192101653
(多西他赛)之后小鼠血液中的粒细胞数目
Figure BPA00001277192101654
Figure BPA00001277192101661
表29.给药PEG化的rHuPH20/Taxotere
Figure BPA00001277192101662
(多西他赛)或单独的Taxotere
Figure BPA00001277192101663
(多西他赛)之后小鼠中的白蛋白水平
Figure BPA00001277192101664
Figure BPA00001277192101671
实施例16
单独的PEG化的rHuPH20在PC3异种移植物模型中的抗肿瘤活性
为了证实单独的PEG化的rHuPH20的抗肿瘤活性，利用上文实施例中所述的PC3异种移植物模型测定重复和持续给药之后肿瘤的生长。
A.重复静脉内给药PEG化的rHuPH20在PC3人前列腺癌模型中产生抗肿瘤效果
PC3人前列腺癌模型如上所述产生。无胸腺雄性裸鼠在邻近右侧胫骨骨膜处肌内(IM)接种人PC3前列腺癌细胞(1x106细胞每只小鼠，总体积0.05mL)产生具有高间质流体压力的肿瘤。允许肿瘤生长到平均体积为400-500mm3，然后开始用对照载体和各种酶单位(U)量的PEGPH20静脉内治疗，如下所述。使用5组小鼠。对照载体给药组1(11只动物)；1000U PEG化的rHuPH20给药组2(8只动物)中的每一只；3,000U PEG化的rHuPH20给药组3(8只动物)中的每一只；10,000U PEG化的rHuPH20给药组4(8只动物)中的每一只；30,000U PEG化的给药组5(11只动物)中的每一只。PEG化的rHuPH20或对照载体给予每只动物，每周3次(Q3W)，隔天(EOD)给予，周一，周三和周五，共8个剂量：第0天1个剂量，然后第3，5，7，10，12，14和17天给药。
在第2，4，7，11，14和18天测定每组动物在研究过程中的肿瘤体积(mm3)，利用VisualSonic超声系统以及利用超声成像软件程序。数据显示予图8和表30。图8中的误差条表示标准误，其也显示于表30。结果显示每个剂量的重复静脉内PEG化的rHuPH20导致肿瘤生长减小，如与对照相比每个治疗后时间点的较小肿瘤体积所示。
表30：重复系统性给药PEG化的rHuPH20减少PC3肿瘤模型中的肿瘤生长
Figure BPA00001277192101672
Figure BPA00001277192101681
为了证实经治疗动物中肿瘤中的HA去除，每个组的的动物的肿瘤均被分离、固定和切片，如上文实施例8B.2所述。染色5μm切片，如该实施例所述。为了免疫组化分析，利用生物素标记的透明质酸结合蛋白(HABP-bio)(Seikagaku，Japan)染色5μm肿瘤切片。洗涤去除第一试剂之后，利用FITC-标记的抗生蛋白链菌素(Vector Labs，Canada)作为第二试剂。细胞核用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)试剂复染。经由偶联Insight FireWire数字相机(Diagnostic Instruments，Michigan)的Nikon Eclipse TE 2000U显微镜捕获显微照片。结果显示每个治疗组动物的肿瘤中没有可见的染色，表明系统性给药1,000，3,000，10,000和30,000U PEG化的rHuPH20去除该人前列腺动物模型中远端肿瘤中的所有可检测透明质酸。
B.持续系统性暴露于PEG化的rHuPH20减小肿瘤体积
如上所述通过在右侧胫骨骨膜附近用人PC3前列腺癌细胞(1x106细胞每只小鼠，总体积0.05mL)肌内接种无胸腺裸鼠产生10只携带PC-3胫骨周肿瘤的小鼠。携带肿瘤体积大约300mm3的PC-3胫骨周肿瘤的小鼠皮下植入Alza泵(Alzet
Figure BPA00001277192101682
微量渗透泵，模型号.2002，Durect Corporation，Cupertino，CA)，其中含有对照缓冲液(API缓冲液)(5只动物-对照组)，或含有PEG化的rHuPH20(5只动物)，其为大约20,000酶单位(U)每0.2ml体积(以0.7mg/小鼠(35mg/Kg)在12天中给予每只小鼠)。对于每个组，14天中，泵每小时递送0.5微升，对于用PEG化的rHuPH20治疗的组而言相当于50U每四傲视；1,200U每天。
治疗前1天、研究结束时第12天通过利用VisualSonic超声系统以及利用超声成像软件程序捕获图像来测定肿瘤体积(mm3)。结果示于下表31。如该表所示，对照组中有一只小鼠在研究结束前死亡。
表31：连续给药PEG化的rHuPH20减小PC3肿瘤体积
Figure BPA00001277192101691
如表31所示，持续静脉内暴露于PEG化的rHuPH20(共20,000U，在12天中)与对照动物相比减小肿瘤生长。在第12天在对照组和PEG化的rHuPH20治疗组之间观察到肿瘤体积的明显差异(p＜0.0015)。因此，连续给药PEG化的rHuPH20在人前列腺肿瘤异种移植物模型中具有抗肿瘤效果。
小鼠体重在第-1，0，4，6，8和11天测定。结果示于下表32。
表32：连续给药对照缓冲液或PEG化的rHuPH20后的体重
Figure BPA00001277192101692
*Avg＝平均值；BW(g)＝体重(g)；％Ch＝与第0天比的改变百分比；fd＝被发现死亡。
实施例17
PEG化rHuPH20在多种表达HA的肿瘤中的体内降低HA的活性和抗肿瘤活性
A.全身施用PEG化rHuPH20在多种表达HA的肿瘤中去除HA
在静脉施用载体或PEG化rHuPH20(10,000U/小鼠＝15mg/Kg)之后2小时，如上述实施例8B.2所述测定了多种动物肿瘤模型(列于下文表33)的肿瘤内透明质酸(HA)的表达。如下文所述，从各种癌细胞系建立所述模型。
(i)细胞系
用于制备动物肿瘤模型的癌细胞系列于下文表33。人激素抵抗型前列腺癌细胞系(PC3、DU145)；人胰腺癌细胞系(MIAPACA II、BXPC3)；人乳腺癌细胞系(MDA MB 231)；人结肠癌细胞系(HCT116、HT29)和人非小细胞肺癌细胞系(NCI H460)购自ATCC(Manassas，VA)。Dunning大鼠前列腺癌细胞系(Mat LyLu)获赠自Department of Medicine，Physiology and Oncology，McGill University Health Centre(Montreal，Quebec，H3A 1A1 Canada)。小鼠乳腺细胞系(4T1-GFP)获赠自Sidney Kimmel Cancer Center(SKCC，San Diego，CA)。人胰腺癌细胞系Capan-1H2B，获赠自Sidney Kimmel Cancer Center(SKCC，San Diego，CA)。
PC3细胞培养于Ham′s F12K培养基(Mediatech Inc.)，含2mM L-谷氨酰胺，调整至含有1.5g/L碳酸氢钠，含有10％胎牛血清(FBS)。MIA PACA II细胞培养于Dulbecco改良的Eagle培养基，含有10％FBS(Mediatech Inc.)。Mat LyLu细胞培养于RPMI 1640，含有10％FBS，2mM L-谷氨酰胺和250nM地塞米松。其他细胞培养于RPMI 1640培养基，含有10％FBS。如上述实施例8所述产生PC3人前列腺癌动物模型。选择肿瘤体积已经达到大约400-800mm3的动物，然后静脉注射载体或PEG化rHuPH20(10,000U/小鼠＝15mg/Kg)进行处理。
(ii)动物肿瘤模型
PC3和Du145人前列腺异种移植物模型
如下所述，分别使用PC3和Du145细胞产生PC3和Du145异种移植物肿瘤模型。将达到大约80％汇合的肿瘤细胞胰蛋白酶化，收集，在HBSS(Hank平衡盐溶液，Mediatech Inc.)中洗涤一次，并以2x107细胞/mL垂悬于HBSS中的50％Matrigel
Figure BPA00001277192101711
内，置于冰上，直至接种于动物。给无胸腺雄性裸鼠肌肉内(IM)接种0.05mL的这种细胞悬液，注射于左后肢胫骨周边(接近胫骨骨膜)。当动物的肿瘤体积看似达到400至500mm3，采用VisualSonics超声确定实际肿瘤体积，采用两个垂直轴维度。
将动物随机分为2组，每组3-4只动物，并分别静脉注射载体(API缓冲液)和PEG化rHuPH20(10,000U/小鼠＝大约15mg/Kg)。处理后2小时收集肿瘤组织并固定于10％中性缓冲福尔马林溶液(NBF)中，用于进一步的组织学检查。
MIAPACA II、BXPC3(人胰腺癌模型)、HCT116、HT29(人结肠癌模型)和NCI H460(人非小细胞肺癌模型)
分别使用MIAPACA II、BXPC3、HCT116、HT29和NCI H460细胞如下产生MIAPACA II、BXPC3、HCT116、HT29和NCI H460异种移植物肿瘤模型。将达到大约80％汇合的肿瘤细胞胰蛋白酶化，收集，在HBSS(Hank平衡盐溶液，Mediatech Inc.)中洗涤一次，并以2x107细胞/mL垂悬于HBSS内，置于冰上，直至接种于动物。给无胸腺雌性裸鼠肌肉内(IM)接种0.05mL的这种细胞悬液，注射于左后肢胫骨周边(接近胫骨骨膜)。当动物的肿瘤体积看似达到400至500mm3，采用VisualSonics超声确定实际肿瘤体积。将动物随机分为2组，每组3-4只动物，并分别静脉注射载体(API缓冲液)和PEG化rHuPH20(10,000U/小鼠＝大约15mg/Kg)。处理后2小时收集肿瘤组织并固定于10％中性缓冲福尔马林溶液(NBF)中，用于进一步的组织学检查。
MDA MB 231人乳腺癌异种移植物模型
使用MDA MB 231细胞系如下产生MDA MB 231人乳腺肿瘤异种移植物模型。将达到大约80％汇合的肿瘤细胞胰蛋白酶化，收集，在HBSS(Hank平衡盐溶液，Mediatech Inc.)中洗涤一次，并以4x107细胞/mL垂悬于HBSS溶液中的50％ Matrigel
Figure BPA00001277192101721
内，置于冰上，直至接种。给无胸腺雌性裸鼠在乳腺脂肪垫处同位接种0.05mL这种细胞-Matrigel
Figure BPA00001277192101722
悬液。由于肿瘤的获得量较差，因此进行肿瘤组织移植以产生携带更多肿瘤的动物用于研究。选择肿瘤体积超过500mm3的动物并切除这些动物的肿瘤，在无菌培养基中漂洗，并用刀片切碎成1mm的立方体。然后使用套管针将这些肿瘤组织植入雌性裸鼠的乳腺脂肪垫内。以测径器每周两次测量实体瘤块的长度(L)和宽度(W)，如下计算肿瘤体积(TV)：(LxW2)/2。当它们的体积达到大约1000mm3，将动物随机分为2组，每组5只小鼠，并给这2组动物分别静脉注射载体或PEG化rHuPH20(3000U/小鼠＝大约4.5mg/Kg)。处理后3天收集肿瘤组织并固定于10％中性缓冲福尔马林溶液(NBF)中，用于进一步的组织学检查。
Capan-1人胰腺肿瘤异种移植物模型
使用Capan-1 HB2细胞系如下产生Capan-1人胰腺异种移植物肿瘤模型。将达到大约80％汇合的肿瘤细胞胰蛋白酶化，收集，在HBSS(Hank平衡盐溶液，Mediatech Inc.)中洗涤一次，并以5x107细胞/mL垂悬于HBSS溶液，置于冰上，直至接种。给无胸腺雌性裸鼠皮下接种0.1mL这种细胞悬液。以测径器每周两次测量实体瘤块的长度(L)和宽度(W)，如下计算肿瘤体积(TV)：(LxW2)/2。当它们的肿瘤体积达到大约500-700mm3，将动物随机分为2组，每组3-4只小鼠，并给这些组的动物分别静脉注射载体(API缓冲液)和PEG化rHuPH20(5000U/小鼠＝大约7.5mg/Kg)。处理后3天收集肿瘤组织并固定于10％中性缓冲福尔马林溶液(NBF)中，用于进一步的组织学检查。
4T1-GFP乳腺癌肿瘤模型
使用4T1-GFP细胞系如下产生4T1-GFP乳腺癌模型。将达到大约80％汇合的4T1-GFP肿瘤细胞胰蛋白酶化，收集，在HBSS(Hank平衡盐溶液，Mediatech Inc.)中洗涤一次，并以2x106细胞/mL垂悬于HBSS内，置于冰上，直至接种。给雌性Balb/c小鼠在乳腺脂肪垫处同位接种0.05mL这种细胞悬液。以测径器每周两次测量实体瘤块的长度(L)和宽度(W)，如下计算肿瘤体积(TV)：(LxW2)/2。当肿瘤体积达到大约500-700mm3，将动物随机分为2组，每组3-4只小鼠，并给这些组分别静脉注射载体和PEG化rHuPH20(10,000U/小鼠＝大约15mg/Kg)。处理后2小时收集肿瘤组织并固定于10％中性缓冲福尔马林溶液(NBF)中，用于进一步的组织学检查。
Mat LyLu大鼠前列腺肿瘤模型
使用Mat LyLu细胞系如下产生Mat LyLu肿瘤模型。将达到大约80％汇合的肿瘤细胞胰蛋白酶化，收集，在HBSS(Hank平衡盐溶液，Mediatech Inc.)中洗涤一次，并以1x106细胞/mL垂悬于HBSS内，置于冰上，直至接种。给无胸腺雄性裸鼠肌肉内接种大鼠Mat LyLu前列腺癌细胞(2x105细胞/小鼠，总体积为0.04mL)接近右侧胫骨骨膜。当肿瘤体积看似达到400至500mm3，采用VisualSonics超声确定实际体积。将动物随机分为2组，每组3-4只小鼠，并给它们分别静脉注射载体和PEG化rHuPH20。处理后2小时收集肿瘤组织并固定于10％中性缓冲福尔马林溶液(NBF)中，用于进一步的组织学检查。
(iii)免疫组织化学
将来自各动物模型(实施例17A(ii)，见上)的经固定的肿瘤切成5μm的切片。为了测定所收集的肿瘤内的透明质酸(HA)的量，使用透明质酸结合蛋白(HABP-bio)(Seikagaku，Japan)对切片进行染色。经洗涤去除第一试剂后，使用FITC标记的抗生蛋白链菌素(Vector Labs，Canada)或德克萨斯红标记的抗生蛋白链菌素(用于4T1-GFP肿瘤切片；Vector Labs，Canada)作为第二试剂。使用DAPI(二脒基苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole))试剂复染细胞核。使用装配了Insight FireWire数字相机(Diagnostic Instruments，Michigan)的Nikon Eclipse TE2000U显微镜拍摄显微图像。
根据切片(肿瘤区域和相关基质区域)内的荧光强度的水平对切片内的HA表达进行分级，所采用的评分系统的范围从+++(视野内超过80％为强染色)至+/-(稀疏染色)至-(无可见染色)。结果显示于下表33。该表指明了用于产生小鼠异种移植物模型的各种细胞系的名称、肿瘤的类型以及自其分离到所述细胞系的物种。指明了以载体和PEG化rHuPH20处理后各种肿瘤类型模型的HA表达程度。结果表明，在表达HA的肿瘤中，以PEG化rHuPH20处理均降低了HA表达。如表中所示，HT29肿瘤切片和Capan-1肿瘤切片(来自注射载体的动物)在PEG化之前表现为细胞周围区域染色阴性，基质染色阳性。
表33：全身施用PEG化rHuPH20之后表达HA的肿瘤内透明质酸(HA)表达的降低
*细胞周围区域染色阴性；基质染色阳性
B.PEG化rHuPH20在示例性富含HA的肿瘤中以剂量依赖性形式去除肿瘤HA
以载体和各种剂量(10、100、1,000、3,000和10,000酶单位(U)/小鼠)的PEG化rHuPH20处理如上所述产生的一种示例性富含HA(++)的肿瘤模型(4T1-GFP)的动物。施用这一处理后3天(72小时)，收集来自所述小鼠的胫周肿瘤并固定于标准缓冲福尔马林。通过如实施例17A所述的免疫组织化学(IHC)方法(见上)，使用抗生物素蛋白-德克萨斯红作为第二试剂，测定肿瘤内的透明质酸(HA)水平。肿瘤切片还进行苏木素/曙红(H&E)染色。结果显示来自以100、1,000、3,000和10,000U PEG化rHuPH20处理的动物的肿瘤切片内HA染色呈剂量依赖性降低。在来自接受1,000、3,000和10,000U PEG化rHuPH20处理的动物的切片中，没有观察到可见的染色。这些结果表明，单次全身施用PEG化rHuPH20可将乳腺远端肿瘤模型内的透明质酸降低至少3天。
C.施用PEG化rHuPH20在富含HA的肿瘤模型中抑制肿瘤生长并增加存活
为了证实反复施用PEG化rHuPH20本身可在多种肿瘤模型系统中产生抗肿瘤效应，测定了使用前述实施例中所列的细胞系产生的三种不同小鼠肿瘤模型的肿瘤生长和存活率。在这些研究中，以PEG化rHuPH20处理两种不同的前列腺癌模型(PC3(HA+++，在实施例17A中确定，见上)和Mat LyLu(HA+，在实施例17A中确定，见上))和一种乳腺癌模型(4T1-GFP(HA++，在实施例17A中确定，见上)。
在这些研究中，分别给总共6组小鼠(每一肿瘤模型有一个对照组和实验组)(n＝6-8只动物/组)施用如下所述剂量的PEG化rHuPH20并测定肿瘤体积和存活率。使用VisualSonics成像微超声系统在处理前测定各组的肿瘤生长并在处理过程中对此进行监测。将1500mm3终点肿瘤体积等同为垂死状态(见下文)，由此测定PEG化rHuPH20处理对动物存活的影响。
如前所述产生PC3人前列腺癌模型。给无胸腺雄性裸鼠在接近右侧胫骨骨膜处肌肉内接种人PC3前列腺癌细胞(1x106细胞/小鼠，总体积为0.05mL)以产生具有高间隙液压力的肿瘤。待肿瘤生长至平均肿瘤体积为400-500mm3之后开始静脉施用3,000酶单位(U)/小鼠的PEG化rHuPH20或对照载体(API-缓冲液)。n＝7只小鼠/组。在Q3dx9方案的每个第三天(每三天一次，共9个剂量)，即第0、3、6、9、12、15、18、21和24天，处理动物。
如上所述，通过给BALB/c雌性小鼠在乳腺脂肪垫同位接种4T1-GFP乳腺癌细胞(5x105细胞/小鼠，总体积为0.05mL)产生4T1-GFP乳腺肿瘤模型。待肿瘤生长至平均肿瘤体积为100mm3之后开始静脉施用。处理如下：隔日一次(EOD)共6个剂量(Q2dx6方案)，即在第0、2、4、7、9和11天，给小鼠注射API-缓冲液(对照组)或3,000酶单位(U)/小鼠的PEG化rHuPH20。n＝6-8只小鼠/组。
对于Mat LyLu前列腺肿瘤模型，给无胸腺雄性裸鼠在接近右侧胫骨骨膜处肌肉内接种大鼠Mat LyLu前列腺癌细胞(2x105细胞/小鼠，总体积为0.04mL)以产生具有高间隙液压力的肿瘤。待肿瘤生长至平均肿瘤体积为100mm3之后开始处理。给动物静脉注射API-缓冲液(对照组)或3000U PEG化rHuPH20进行处理。n＝6-8只动物/组。隔日施用该剂量，每周3次，在周一、周三和周五(Q2dx6)，即在第0、2、4、7、9和11天。但对照组的Mat LyLu肿瘤在第11天之前已经达到临界体积或超过2,000mm3，因此出于人道主义原因将其处死。
对于各组携带PC3肿瘤的小鼠，使用VisualSonics(VS)成像微超声系统监测肿瘤生长。使用测径器测量携带4T-1和Mat LyLu肿瘤的动物的肿瘤生长。用测径器测量的二维直径测量值获得一系类肿瘤体积，其中使用了公式0.4(axb2)，其中“a”是肿瘤的长径，而“b”是与之垂直的短径。
本研究依照时间测定了肿瘤体积和存活率，在以下部分中讨论本研究的结果。以下第(i)节给出了肿瘤体积数据，并显示于表33-36和图9的上图。以下第(ii)节给出了存活数据，并显示于表38和图9的下图。
(i)肿瘤体积效应
VS-超声和测径器测量的肿瘤体积以mm3表示。对于两组(对照和3000U PEG-rHuPH20)携带PC3肿瘤的动物，在第-1、3、6、10、13、17、20、24、27、31、34、38、41和45天取得测量值。结果显示于表34。如下所述，肿瘤达到1500mm3以上的动物，出于人道主义原因被处死。因此，对于PC3模型，在第27天之后未做测量，因为100％的动物均已达到这一肿瘤重量。对于两组携带4T1-GFP的肿瘤，在第0、2、4、7、9、11、14、16、18和21天取得测径器测量值。结果显示于表35。对于两组携带Mat Ly Lu的肿瘤，在第0、2、4、7和9天取得测径器测量值。结果显示于表36。
表34.对PC3前列腺肿瘤模型反复全身施用PEG化rHuPH20随时间对肿瘤体积的影响
Figure BPA00001277192101761
  第17天   1606.10   168.80   783.10   86.90
  第20天   1930.10   242.00   1009.30   134.10
  第24天   2450.20   239.20   1065.50   153.80
  第27天   2926.20   281.70   1205.50   193.10
  第31天   N/A   N/A   1364.90   231.80
  第34天   N/A   N/A   1520.80   268.10
  第38天   N/A   N/A   1714.40   321.90
  第41天   N/A   N/A   1963.80   379.90
*NA＝不适用-所有动物均因肿瘤体积超过1500mm3而被处死。
表35.对4T1乳腺肿瘤模型反复全身施用PEG化rHuPH20随时间对肿瘤体积的影响
Figure BPA00001277192101771
表36.对Mat LyLu前列腺肿瘤模型反复全身施用PEG化rHuPH20随时间对肿瘤体积的影响
Figure BPA00001277192101772
  第2天   355.70   35.20   208.00   56.90
  第4天   853.00   29.80   470.90   61.20
  第7天   2248.80   96.50   1518.90   158.10
  第9天   3571.00   305.40   2384.40   382.10
正如肿瘤体积测量值所表明的那样，反复静脉施用PEG化rHuPH20降低了各种模型的肿瘤生长，与肿瘤内的HA的量相关(在实施例17A中确定，见上)。例如，在每一肿瘤模型中，PEG化rHuPH20处理组与对照组之间在肿瘤体积上具有显著差异(在PC3前列腺癌模型中第27天p＝0.001；在4T1乳腺癌模型中第14天p＝0.04；而在Mat LyLu前列腺癌模型中第9天p＝0.02)。
采用如下方程式计算各个肿瘤模型的肿瘤生长抑制(TGI)百分数：
％TGI＝[1-(Tn-T0)÷(Cn-C0)]x100％
其中“Tn”是最后一剂PEG化rHuPH20之后第“n”天(在此，对于PC3、4T1和Mat LyLu模型分别为第27天、第14天和第9天)处理组(接受PEG化rHuPH20的动物)的平均肿瘤体积；“T0”是该处理组在第0天治疗之前的平均肿瘤体积；“Cn”是相应的对照组在第“n”天(在此，对于PC3、4T1和MatLyLu模型分别为第27天、第14天和第9天；是最后一剂载体之后的时间)的平均肿瘤体积；而“C0”是对照组在第0天治疗之前的平均肿瘤体积。通过计算肿瘤体积达到1,500mm3的平均时间而得出相应肿瘤模型达到肿瘤体积(TTV)的时间。
表37.肿瘤生长抑制作用
Figure BPA00001277192101781
如表37所证实的那样，本研究的结果显示，在PC3前列腺、4T1乳腺和Mat LyLu前列腺肿瘤模型中，全身施用PEG化rHuPH20分别造成了70％、60％和34％的肿瘤生长抑制(TGI)(分别在施用后的第27天、第14天和第9天)。
如图9和表34-37所证实的那样，肿瘤体积效应与肿瘤HA表达水平(在实施例17A中确定，见上)相关。例如，在肿瘤的相对HA表达最高的模型(PC3(HA+++))中，PEG化rHuPH20使得肿瘤体积减小得最多(TGI＝70％)，而在肿瘤的相对HA表达最低的模型(Mat LyLu(HA+))中，PEG化rHuPH20使得肿瘤体积减小得最少(TGI＝34％)。4T1-GFP模型表现出的相对HA水平为++(实施例17A，见上)，肿瘤体积的减小居中(TGI＝60％)。
(ii)对存活的影响
通过确定各组在各时间点的“存活”动物的百分数来评估全身反复施用PEG化rHuPH20在各模型中对存活的影响。对于本研究，将大于或等于1500mm3的肿瘤体积选定为终点，其被视为类似于濒死(非存活)状态。因此，肿瘤体积低于1500mm3的动物被认为是存活，而肿瘤达到1500mm3或更高的动物视为死亡。
图9(下图)给出了反复施用PEG化rHuPH20对各种模型的存活的影响。如图9(下图)所证实的那样，与对照处理相比，PEG化rHuPH20处理分别使得PC3、4T1-GFP和Mat LyLu肿瘤模型达到所指定的垂死状态的时间延迟2倍、1.7倍和1.5倍。因此，对存活的影响也与肿瘤内的相对HA表达(实施例17A测量，见上)相关。
各动物组的中位存活时间(MST)以天表示，被确定为各组内的小鼠达到所指定的1500mm3肿瘤体积终点之前的中位时间。为各模型计算出PEG化rHuPH20与对照相比的ILS(寿命增加)百分数(一种抗肿瘤活性的测量法)，采用了以下方程式：
％ILS＝[(T-C)/C]x100
其中“T”是PEG化rHuPH20处理组的MST，而“C”是对照组的MST。根据National Cancer Institute(NCI)的标准，ILS百分数高于25％的治疗被认为是有效的。结果总结于以下表38。
表38：中位存活时间和寿命增加
Figure BPA00001277192101791
  MST   ILS   MST   ILS   MST   ILS
  对照   16.13   N/A   16.57   N/A   5.67   N/A
  3000U PEG-PH20   31.83   97％   28.66   73％   8.83   56％
N/A＝不适用
如以上表38所示，全身施用PEG化rHuPH20在PC3前列腺、4T1乳腺和Mat LyLu前列腺肿瘤模型分别导致了97％、73％和56％的寿命增加(ILS)，也与以上实施例17A所测量到的肿瘤内相对HA水平相关(分别为+++、++和+)。
这些结果证实，在多种富含HA的肿瘤模型中，反复全身施用PEG化的可溶性透明质酸酶本身是一种有效的抗肿瘤治疗，且其抗肿瘤效果的程度与肿瘤内的HA表达相关。
(iii)降低肿瘤内的HA
进一步地，在末次PEG化rHuPH20处理或对照处理后收集肿瘤，对肿瘤组织的透明质酸进行免疫组织化学检测。对于本研究，在末次处理(第20天)后72小时收集PC-3肿瘤，在末次处理(第14天)后72小时收集4T1-GFP肿瘤，在末次处理(第12天)后24小时收集Mat LyLu肿瘤。将所收集的肿瘤固定于标准缓冲福尔马林(NBF)，切成5μm的切片，并使用生物素标记的透明质酸结合蛋白(HABP-bio)(Seikagaku，Japan)染色。洗涤去除第一试剂后，使用FITC标记的抗生蛋白链菌素(Vector Labs，Canada)(对PC-3和Mat LyLu肿瘤)或德克萨斯红标记的抗生蛋白链菌素作为第二试剂。使用DAPI(二脒基苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole))试剂复染细胞核。使用装配了Insight Fire Wire数字相机(Diagnostic Instruments，Michigan)或具有同样成像系统的ZEISS overhead scope(Carl Zeiss，Inc.)的Nikon Eclipse TE2000U倒置荧光显微镜拍摄显微图像。结果显示，对照组肿瘤中有强HA染色，但在来自已经以PEG化rHuPH20处理的动物的肿瘤内没有可检测到的透明质酸染色，证实这种处理导致肿瘤的透明质酸持续降低。
实施例18
PEG化的rHuPH20的血脑屏障渗透性和脑肿瘤模型的治疗
进行该研究以证明PEG化的rHuPH20可减少动物模型中脑肿瘤内的透明质酸(HA)并可提高结合放疗的存活。
A.脑肿瘤模型
为产生脑肿瘤模型，如下所述，用各组中每个小鼠的立体定位框架(stereotaxic frame)将2μl Hanks培养基中的4x104PC3细胞注射入右大脑半球。
B.通过静脉内施用的PEG化rHuPH20的血脑屏障渗透性和脑HA的降解
进行此研究以证明静脉施用的PEG化的rHuPH20可降解脑肿瘤中的HA。将3,000酶单位(U)的PEG化rHuPH20，和对照缓冲液(API)经静脉内施用于上述实施例18A所述的不同组的脑肿瘤模型动物。4小时后处死所述动物。随后收集脑并对其进行切片用于分析。
为评估所述肿瘤模型动物中经调和的(compromised)血脑屏障(BBB)，对该动物的亚群进行了BBB渗透性测定。为进行此测定，在处死前1小时将0.1mL的2％Evan’s Blue Dye经静脉内注射到这些小鼠的尾部静脉中。制作大脑切片并按如下所述进行可视化。在大脑切片中的蓝色染色表明白蛋白的存在，其是与Evans Blue形成复合物的大的血清蛋白(67kDa)，表明升高了的BBB渗透性(BBB的相对“泄露”).
为评估治疗后的脑肿瘤中的HA的量，将脑切片与生物素标记的乙酰透明质酸结合蛋白(HABP-bio)(Seikagaku，Japan)温育。在洗涤以去除该第一试剂后，使用FITC-标记的链霉抗生物素(Vector Labs，Canada)作为第二试剂。用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)试剂对核进行复染。也进行了苏木精/曙红染色以鉴定脑中的肿瘤。通过装配Insight FireWire数码相机(Diagnostic Instruments，Michigan)的Nikon Eclipse TE2000U显微镜或者具有相同的图片拍摄体系的Leitz高架镜(overhead scope)来拍摄显微照片。
结果在对照动物中显示出强HA染色(API缓冲液)，但在注射了PEG化的rHuPH20的动物中却没有可检测的HA染色，证明此酶在静脉施用时可用于减少脑肿瘤中的HA。
C.在PEG化rHuPH20治疗后的动物存活
为评估单独用PEG化rHuPH20治疗后的脑肿瘤模型动物的存活，将20只PC3脑肿瘤模型小鼠(上述实施例18A所述)保留至注射后12天。在所述小鼠的尾部静脉注射5000酶单位(U)的PEG化rHuPH20(10只小鼠)、或API缓冲液(10之对照小鼠)，每周2次注射4周。
通过监测动物的死亡来监测所述动物随时间的存活率。图10所示的结果表明经PEG化rHuPH20治疗的动物和对照动物之间没有显著的存活变化.
D.PEG化rHuPH20结合放疗对存活的影响
为评估用PEG化rHuPH20结合辐射的治疗后脑肿瘤模型动物的存活，使用3组PC3脑肿瘤模型小鼠(上述实施例18A所述)。
为进行此研究，在接种后第13天基于体重将27只具肿瘤的小鼠分为3组(A、B和C)。对每一组，在接种PC3细胞后第13天开始给药。使用q3d x 4模式(每个第三天，总共4次)对每个治疗/对照进行施用。在每次施用时，单独给予对照组A组100μL API缓冲液的静脉内注射。B组用全脑辐射(5Gy)进行治疗。结合治疗组C组用5000酶单位的PEG化rHuPH20(在100μL API缓冲液中)治疗，4小时后接着进行全脑辐射(3Gy)。此用药模式在下表39中列出。
表39.用药模式
Figure BPA00001277192101821
*PEGPH20在辐射前4小时施用
**WBR，全脑辐射
通过监测动物的死亡来监测每组中动物随时间的存活。图11和表40中所列的结果表明，结合治疗(辐射和PEG化rHuPH20；C组)比起对照(无治疗)其存活有所改善(高达45％的较长存活)，并且结合治疗(辐射和PEG化rHuPH20；C组)比起单独辐射(B组)其存活有所改善(高达10％的较长存活)。
表40.
Figure BPA00001277192101822
Figure BPA00001277192101831
实施例19
PEG化rHuPH20在动物中的药物代谢动力学特性
PEG化rHuPH20的药物代谢动力学特性(如上述实施例7所述用mPEG-SBA-30K进行)在来自Harlan的ICR小鼠(Indianapolis，Indiana)、大鼠、和食蟹猴中通过在静脉施用所述药剂后的许多时间点测量血液样品中的血浆透明质酸酶来进行评估。
在小鼠中，该研究进行了70小时。在此研究的“0时刻”，对来自Harlan的每只重19-25克的ICR雌性小鼠，通过侧面尾部静脉注射大约3000U纯化的PEG化rHuPH20，其已被稀释为0.5mg/ml。在大多数情况下，在治疗后5分钟用玻璃毛细管从眼眶后静脉丛取血用于随后的评估。继而将动物放回其笼内。在施用PEG化rHuPH20后的各个时间点，对短暂用5％异氟醚麻醉的动物用玻璃毛细管从眼眶后静脉丛取血液样品。将来自每个样品的血液与EDTA在紫盖(purple-top)的Microtainer血液收集管中混合以防止凝结。在台式离心机上将该管以5000rpm离心15分钟，并将血浆转移到新的Eppendorf管。在进行测定以确定透明质酸酶活性前，将血浆冷冻在-20℃。
为在各个时间点确定血浆透明质酸酶活性，对血浆进行如上述实施例2中所述的标准微浊度平板测定，以测量该血浆中的透明质酸酶活性的量。由于小鼠中的总血液体积较低，在该研究期间仅对每个动物进行2或3次的血液提取。因此，将药物代谢动力学曲线在总的时间期间对多个动物进行拟合。PK曲线拟合使用GraphPad Prism
Figure BPA00001277192101832
(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)软件或WinNonLin软件(PharsightCorporation，Mountain View，CA)来完成。
在大鼠和食蟹猴中进行类似的研究。在大鼠中，该研究进行96小时。在类似于上述对小鼠的研究中，向大鼠施用125,000U/kg(大约4mg/kg)的PEG化rHuPH20。在各个时间点使用如上述实施例2中所述的标准微浊度平板测定来监测血浆透明质酸酶活性。每个时间点评估3只大鼠。在食蟹猴中，进行了MPI 28天静脉内用药的研究，其中将PEG化rHuPH20以逐渐升高的剂量0.5、2.0和6.0mg/kg向2只雌性猴施用。使所述猴在随后的用药前清除所有的PEG化rHuPH20。在96小时内的各个时间点使用如上述实施例2中所述的标准微浊度平板测定来监测血浆透明质酸酶活性。对小鼠、大鼠和食蟹猴的PEG化rHuPH20静脉内用药的对比在表41中列出。
表41
Figure BPA00001277192101841
将药物代谢动力学回归曲线与得出的数据进行拟合，并使用下式在GraphPad Prism
Figure BPA00001277192101842
(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)中确定血浆半衰期(T1/2)
使用非线性回归的Prism软件来确定血浆半衰期。用于静脉内注射后半衰期曲线拟合的标准化的公式是：
Cp＝C0exp(-kel)t
其中kel＝0.693/T1/2
t＝测试环节(article)施用后的时间
C0是理论起始值
Cp是在时间t所测的值
使用下述等式：
一元指数衰变：
Y＝跨度1*exp(-kelX)+平台；
其中kel是衰变速率常数等于0.693/T1/2而平台是在衰变接近无穷大时的渐近值。
二元指数衰变：
Y＝跨度1*exp(-k1elX)+跨度2*exp(-k2elX)+平台；
其中k1el和k2el分别是跨度1和跨度2的衰变常数，而平台是在衰变接近无穷大时的渐近值。
得自浓度-时间数据的二室模型(2-compartment modeling)的上述研究的结果在下表42中列出，其中对PK参数的描述在表43中列出，T1/2α是分布相半衰期，T1/2β是消除相半衰期，而MRT是平均停留时间。在小鼠中，血浆中酶的α相(分布相)半衰期和β相(消除相)半衰期分别是0.696小时和19.23小时。小鼠中的结果在图12中呈现，其中观察到血浆透明质酸酶的起始快速降解(分布相)随后是缓慢的随时间逐渐衰变(消除相)。在大鼠中，血浆中酶的α相(分布相)半衰期和β相(消除相)半衰期分别是1.13小时和7.48小时。在食蟹猴中，血浆中酶的α相(分布相)半衰期和β相(消除相)半衰期分别是1.13小时和21.75小时。
表42.小鼠、大鼠和食蟹猴中PEG-rHuPH20的中值PK参数(得自浓度-时间数据的二室模型)
  小鼠   大鼠   食蟹猴
  体重(kg)   0.026   0.292   1.920
  BSA(m2)   0.0079   0.0419   0.1539
  V1(mL/kg)   38.44   72.00   55.83
  k10(l/hr)   0.161   0.384   0.046
  k12(l/hr)   0.65   0.15   0.31
  k21(l/hr)   0.22   0.15   0.40
  CL(mL/h-kg)   6.20   30.33   2.54
  CL2(mL/h-kg)   24.91   11.52   17.60
  V2(mL/kg)   112.03   85.66   17.63
  T1/2α(h)   0.696   1.13   1.13
  T1/2β(h)   19.23   7.48   21.75
  MRT(h)   24.32   5.81   30.76
表43.PK参数描述
 PK参数  描述
 CL1  从中央室清除(mL/h-kg)
 CL2或QD  分布速率(mL/h-kg)
 k10  消除速率常数(h-1)
 k12  从中央室到外周室的分布速率常数(h-1)
 k21  从外周室到中央室的分布速率常数(h-1)
 V1  中央室的体积(mL/kg)
 V2  外周室的体积(mL/kg)
实施例20
PEGPH20的单一剂量静脉内施用后血浆透明质酸酶水平的药物代谢动力学分析
在PEGPH20的单一剂量施用后于来自Harlan的ICR小鼠(Indianapolis，Indiana)和Sprague-Dawley大鼠(Harlan)中进行药物代谢动力学(PK)研究。在如下所述注射PEGPH20后，通过使用经修改的如实施例2中所述的浊度计测定测量透明质酸酶活性来确定PEGPH20的血浆水平。简短来说，将含有透明质酸酶的血浆样品与透明质酸盐(HA)温育60分钟。通过加入酸化的血清使未消化的HA沉淀。在30分钟的发展期之后于640nm测量所得样品的浊度，而所得的浊度是所存在的透明质酸酶活性的量度。该测定在阻抑血浆中内源溶酶体透明质酸酶活性的pH值条件下运行，所述血浆中内源溶酶体透明质酸酶活性通常在酸性pH展现活性。PEGPH20浓度表示为由校准曲线内插(interpolate)的透明质酸酶活性的单位(U)/mL，或者表示为用PEGPH20 log的比活性(以U/mg)计算的μg/mL。一般对于大鼠来说，定量值的较低水平是10U/mL且该测定适用于测量高达100u/mL的透明质酸酶活性。
A.小鼠
雄性ICR小鼠(3只/组)接受单一IV剂量(125,000U/kg；3.3mg/kg)的PEGPH20并且从用药后5分钟到24小时以选定的间隔收集血浆样品。如上所述分析血浆样品的透明质酸酶活性。结果显示在IV注射后，PEGPH20的血浆浓度以两相的方式下降。初始的迅速下降代表了来自体循环的分布且其后跟随的较缓慢的降低代表消除相。得自透明质酸酶活性随时间的非室分析(non-compartmental analysis)的药物代谢动力学参数在表44中列出。该数值是得自使用非室分析的3只小鼠的平均值。该数据显示PEGPH20的消除半衰期(t1/2λz)是大约10小时。分布的平均值(Vz)是大约122mL/kg，其大约是小鼠中预期血浆体积的两倍(即50mL/kg；Davies和Morris 1993)，提示PEGPH20并未广泛分布于外周组织。
Figure BPA00001277192101871
PK＝药物代谢动力学；U＝酶活性单位；IV＝静脉内；C0＝对0时刻后插值的血浆浓度；Cmax＝最大观测血浆浓度；t1/2λz＝末端半衰期；AUC0-∞＝自0时刻并对无穷大外插的浓度对时间曲线下的区域；Vz＝分布的体积；Vss＝在稳态的分布体积；CL＝完全清除；MRT＝平均停留时间
B.大鼠
雄性Sprague-Dawley大鼠(3只/组)接受单一IV剂量(125,000U/kg；3mg/kg)的PEGPH20并且从用药后5分钟到96小时以选定的间隔收集血浆样品。如上所述分析血浆样品的透明质酸酶活性。结果显示在IV注射后，PEGPH20的血浆浓度以两相的方式下降。初始的迅速下降代表了来自体循环的分布且其后跟随的较缓慢的降低代表消除相。得自透明质酸酶活性随时间的非室分析的药物代谢动力学参数在表45中列出。该数值是得自使用非室分析的3只小鼠的平均值。该数据显示PEGPH20的消除半衰期(t1/2λz)是大约8小时，其比小鼠中所观测到的更迅速。这也反映在比小鼠中所观察到的更短的平均价停留时间(MRT)和更快的完全清除(CL)中。分布的平均值(Vz)是大约296mL/kg，其大于大鼠中预期的血浆体积(即31mL/kg；Davies和Morris 1993)，并近似于大鼠中预期的胞外液的体积(即297mL/kg；Davies和Morris 1993)。
Figure BPA00001277192101881
PK＝药物代谢动力学；U＝酶活性单位；IV＝静脉内s；C0＝对0时刻后插值的血浆浓度；Cmax＝最大观测血浆浓度；t1/2λz＝末端半衰期；AUC0-∞＝自0时刻并对无穷大外插的浓度对时间曲线下的区域；Vz＝分布的体积；Vss＝在稳态的分布体积；CL＝完全清除；MRT＝平均停留时间
C.总结
在小鼠和大鼠内的单一静脉内剂量研究中，血浆透明质酸酶活性以两相的方式下降，具有快速的初始分布相和较缓慢的消除相。平均消除半衰期(t1/2)在小鼠中是大约10小时而在大鼠中是大约8。分布的平均体积(Vz)对小鼠是122mL/kg，表明PEGPH20在小鼠中并未广泛分布到外周组织内。平均Vz在大鼠中较高为296mL/kg。
实施例21
在食蟹猴中单一静脉内剂量施用后，PEGPH20的剂量范围和药物代谢动力学研究
在以各种剂量范围施用单一剂量后，于食蟹猴中进行药物代谢动力学(PK)研究。在如下所述注射PEGPH20后，通过使用经修改的如实施例20中所述的浊度计测定测量透明质酸酶活性来确定PEGPH20的血浆水平。如对大鼠一样，定量值的较低水平是10U/mL且该测定适用于测量高达100u/mL的透明质酸酶活性。
雄性食蟹猴(1至5只/组)以1mg/kg(38,000U/kg)、3mg/kg(114,000U/kg)、6mg/kg(228,000U/kg)、12.5mg/kg(412,500U/kg)和33mg/kg(1,089,000U/kg)的浓度范围接受单一IV剂量的PEGPH20，并且从用药后0.5到72小时以选定的间隔收集血浆样品。如上所述分析血浆样品的透明质酸酶活性。结果显示血浆浓度的下降是单相的因为在用药后0.5小时的第一个血液收集未获取快速分布相。得自透明质酸酶活性随时间的非室分析的药物代谢动力学参数在表46中列出。如该表所示，该数据是得自使用非室分析的1至5只猴的平均值。
该数据显示PEGPH20的消除半衰期(t1/2λz)的范围是39至53小时(1.6至2.2天)。该长半衰期缘于大约1.0mL/h kg的缓慢的体清除。最大血浆浓度是通过对紧随IV注射之后的时间外插值而确定的[C0]，末端消除速率kλz，以及完全清除(CL)提供了对分布体积(Vz)的评估。平均Vz的范围是由70至93mL/kg，其大约是猴中预期血浆体积的两倍(即45mL/kg；Davies和Morris1993)，表明PEGPH20并未广泛分布于外周组织。
使用血浆浓度-时间曲线下的区域、外插值的最大浓度[C0]、以及观测到的Cmax来检验剂量的线性。Log-变换的PK参数与log-变换的IV剂量之间的关联反映了具有斜率等于1.0的线性关系，表明猴中PEGPH20的PK与剂量成呈线性关系。身体暴露与观测到的最大血浆浓度成比例地随着剂量的升高而升高。
PK＝药物代谢动力学；U＝酶活性单位；IV＝静脉内s；C0＝对0时刻后插值的血浆浓度；Cmax＝最大观测血浆浓度；t1/2λz＝末端半衰期；AUC0-∞＝自0时刻并对无穷大外插的浓度对时间曲线下的区域；Vz＝分布的体积；Vss＝在稳态的分布体积；CL＝完全清除；MRT＝平均停留时间
总结
在猴内的单一静脉内剂量研究中，血浆透明质酸酶活性以两相的方式下降，具有快速的初始分布相和较缓慢的消除相。在猴中平均消除半衰期(t1/2)是大约40至53小时。平均分部体积(Vz)对猴是70至93mL/kg，表明PEGPH20并未广泛分布于周围组织中。在评估数个PEGPH20剂量水平的猴研究中，最大观测血浆浓度(Cmax)以及血浆浓度对时间的曲线下的面积(AUC)随着增加的PEGPH20剂量而线性增加。
实施例22
重复剂量
给Sprague-Dawley大鼠(Harlan)和短尾猴重复施用PEGPH20之后，进行药物代谢动力学(PK)和/或毒理学(TK)研究。如实施例20所述，确定血浆透明质酸酶水平。
A.大鼠
给Sprague-Dawley大鼠静脉施用PEGPH20之后进行为期4周的重复剂量毒性研究。给四组大鼠(3只大鼠/性别/组)分别每周两次静脉施用载体(10mM Hepes pH 7.0+130mM NaCl)或0.5、5或25mg/kg的PEGPH20，连续四周。给药后第1和25天在预先确定的时间从各个动物收集血样。如实施例20所述分析血浆样品的透明质酸酶活性。采用血浆浓度对时间的数据的非分区模型产生各个静脉施用剂量的毒物动力学参数。所产生的TK参数见表47。在每周两次静脉施用PEGPH20后分析血浆浓度与时间，发现暴露(Cmax和AUC)随着PEGPH20剂量的增加而增加。在所评价的剂量范围内，毒物动力学大致呈线性。清除半衰期(t1/2)随着PEGPH20剂量的增加而增加。在任何给定的剂量水平和给药天，性别之间的暴露大体相似。重复静脉施用PEGPH20后，在5mg/kg和25mg/kg剂量组中，第25天与第1天相比，AUC倾向于增加。不过，在任一剂量组中，第25天的AUC暴露仍不到第1天观察到的暴露的2倍。在任一剂量组中，通过Cmax确定的暴露从第1天至第25天保持稳定。
Figure BPA00001277192101911
Figure BPA00001277192101921
TK＝毒物动力学；IV＝静脉；U＝酶活性单位；Cmax＝观察到的最大血浆浓度；t1/2＝清除半衰期；AUC0-t＝血浆浓度与时间曲线从0时间到末次测量时间点的曲线下面积
大鼠对每周两次静脉施用耐受良好。体重有短暂的下降，在按剂量给药期间结束时向研究前水平恢复。这一效应可归因于PEGPH20的药理学，因为细胞外透明质酸及其结合的水减少了。活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)轻度延长，但凝血酶原时间没有改变。大体尸检或显微镜检查在所检查的任何组织内均未发现出血。因此，鉴于APTT延长是大鼠体内的不良反应这一评估，大鼠体内的无可观察到的不良反应的水平(NOAEL)被定义为5mg/kg/剂。未观察到摄食或行为改变。由于除了观察到APTT延长之外，未观察到其他的测试物相关发现，25mg/kg/剂可被指定为NOAEL。
B.猴
1.重复剂量毒性研究
在研究的第1、3、8、11、15、22、25和29天，雌性短尾猴(N＝3)接受6mg/kg(198,000-222,000U/kg)静脉施用的PEGPH20。在第1、3、8、11和25天，在施用后，以0.083至96小时的选定间隔收集血浆样品。采用如实施例20所述的微浊度板测定法分析血浆样品的透明质酸酶活性。采用血浆浓度对时间的数据的非分区模型产生各个静脉施用剂量的毒物动力学参数。每一剂量独立于前一顺序的剂量建模。结果显示于表48。给雌猴重复静脉施用PEGPH20后，对血浆浓度对时间的数据进行TK分析，发现在静脉注射剂量为6mg/kg(～210,000U/kg)的PEGPH20之后，血浆浓度的下降是双相的。起初是浓度快速下降，随后浓度随时间缓慢降低。分布容量(Vz)的估计值提示PEGPH20没有广泛分布至周围组织。PEGPH20的全身清除缓慢，经在第1、3、8和11研究日测定，平均速度在0.9至1.6mL/h-kg的范围内。长清除半衰期(t1/2λz)是导致清除缓慢的原因。观察到的PEGPH20平均清除半衰期(t1/2λz)在28至64小时(1.2至2.7天)。在第25研究日，在3只动物中的2只中观察到PEGPH20的加速清除。再次测定了第25研究日收集的血浆样品以确认PEGPH20的浓度，并报告平均浓度。
Figure BPA00001277192101931
Figure BPA00001277192101941
TK＝毒物动力学；IV＝静脉；U＝酶活性单位；C0＝逆推至0时间的血浆浓度；ND＝未确定；Cmax＝观察到的最大血浆浓度；t1/2λz＝终末半衰期；AUC0-∞＝血浆浓度与时间曲线从0时间至外推至无穷大的曲线下面积；Vz＝分布容量；Vss＝稳态分布容量；CL＝绝对清除；MRT＝平均滞留时间
2.四周重复静脉剂量毒性研究
给短尾猴静脉施用PEGPH20后进行四周的重复剂量毒性研究。4组猴子(雌雄各6只，但接受0.2mg/kg/剂的PEGPH20那组例外，其为雌雄各4只)分别接受静脉每周两次的载体、0.2、2.0或10.5mg/kg/剂的PEGPH20，连续4周。在给药前的第1和25天和给药后的0.5、1、2、4、8、12、24、48和72小时收集血样。在给药前的第4、8、11、15、18和22天和给药后的2分钟收集额外的血样。采用实施例20所述的浊度分析法分析血浆样品的透明质酸酶活性。采用血浆浓度对时间的数据的非分区模型产生各个静脉施用剂量的毒物动力学参数。结果显示于表49。在给猴子每周两次静脉施用PEGPH20连续4周后对血浆浓度与时间数据进行TK分析，证实暴露(Cmax和AUC)随着PEGPH20剂量的增加而增加。在所评价的剂量范围内，毒物动力学大致呈线性。清除半衰期(t1/2)随着PEGPH20剂量的增加而增加。在重复给药后，在低剂量和中等剂量的雄性动物中t1/2降低。低剂量的暴露数据也显示了重复给药后缺少暴露的动物。在任何给定的剂量水平和给药天，性别之间的暴露大体相似。重复静脉施用PEGPH20后，在2mg/kg和10.5mg/kg剂量组中，第25天与第1天相比，Cmax和AUC倾向于增加。不过，在任一剂量组中，第25天的AUC暴露仍不到第1天观察到的暴露的2倍。在第25研究日观察到0.2mg/kg组的8只动物中有3只缺乏PEGPH20的暴露。
TK＝毒物动力学；IV＝静脉；U＝酶活性单位；Cmax＝观察到的最大血浆浓度；t1/2＝清除半衰期；AUC0-t＝血浆浓度与时间曲线从0时间到末次测量时间点的曲线下面积
猴子也对每周两次静脉施用耐受良好。与大鼠一样，体重有短暂的下降，在按剂量给药期间结束时向研究前水平恢复。与大鼠不同的是，没有出现APTT延长，凝血参数的改变仅限于出现短暂的剂量依赖性血浆纤维蛋白原升高，这与对施用PEGPH20的短暂急性期应答是一致的。在猴中观察到肢体关节的改变，膝关节和肘关节部位出现剂量相关性的活动范围减小，停药后出现部分或全部恢复。此外，放射学检查发现单独一个高剂量组动物出现软组织量(骨骼肌)中度减少。这与PEGPH20从组织中去除透明质酸及其结合的细胞外水的药理学效应是一致的。膝关节或骨骼肌没有相关的组织病理学改变，膝关节本身也没有异常的放射学发现。未观察到摄食或行为改变。由于未观察到其他的测试物相关发现，将10.5mg/kg/剂的高剂量指定为猴的NOAEL。
C.小结
猴子重复静脉施用，其中在为期29天的时间内施用剂量为6mg/kg(大约210,000U/kg)的PEGPH20共8次，整个研究期间的暴露(通过Cmax和AUC值评估)相似。PEGPH20的全身清除(CL)缓慢，平均速度为0.9至1.6mL/h kg。缓慢的清除归因于范围在28至64小时(第1.2至2.7天)的长清除半衰期。
大鼠和猴子的毒理学研究(其中动物接受每周两次不同剂量的PEGPH20连续4周)显示，暴露(Cmax和AUC值)随剂量增加而线性增加，而清除半衰期随剂量增加而增加。大鼠的清除半衰期平均值的范围在大约3小时(0.5mg/kg剂量)至24小时(25mg/kg剂量)，猴子在17小时(0.2mg/kg剂量)至78小时(10.5mg/kg剂量)。在这两个物种中，在任何给定的剂量水平和给药天，性别之间的暴露大体相似。但在第25天观察到0.2mg/kg组的8只动物中有3只缺乏PEGPH20的暴露。在大鼠中，在5mg/kg和25mg/kg剂量组中，第25天与第1天相比，AUC倾向于增加。不过，在任一剂量组中，第25天的AUC暴露仍不到第1天观察到的暴露的2倍。在任一剂量组中，通过Cmax确定的暴露从第1天至第25天保持稳定。在大鼠中，在任一剂量组中，通过Cmax确定的暴露从第1天至第25天保持稳定。在猴子中，在2mg/kg和10.5mg/kg剂量组中，第25天与第1天相比，Cmax和AUC倾向于增加。与大鼠类似，在任一剂量组中，第25天的AUC暴露仍不到第1天观察到的暴露的2倍。
实施例23
异速换算模型(Allometric Scaling model)
如实施例20所述的小鼠、大鼠和猴子的单一剂量静脉施用药物代谢动力学研究形成了可用于主要保留在血管系统内的大分子的异速换算模型的基础，使用该模型来估计用于人的PEGPH20药理学活性剂量(PAD)和给药频率。鉴于PEGPH20是大分子(分子量估计在100-270kDa之间)，通常用于小分子的物种间换算因子技术并不适用于被限制在血管内区室的分子。
根据在小鼠、大鼠和猴子中观察到的PK参数，通过相对于动物的体表面积和动物的体重对这些参数进行异速换算，进行异速建模。使用所产生的物种间异速关系为人计算/预测出初步PK参数。所计算的参数是全身清除(CL)、外周清除(CL2)、中心区室的容积(V1)、外周区室的容积(V2)、自中心区室的清除率常数(k10)、和中心与外周区室之间的分布速度常数(k12和k21)。基于全身暴露随静脉给药剂量的增加而成比例增加这一假设，使用2-区室模型模拟静脉给药剂量水平为1500、3,000、6,000、12,000、24,000和48,000U/kg的PEGPH20之后，PEGPH20在人体内的浓度-时间分布图。检查了以周一/周四或周一/周五方案每周两次(BIW)的剂量施用，证实临床剂量≥1,500U/kg(50μg/kg)，并预测出周一/周四BIW剂量方案可将阈值血浆浓度(Ctrough)维持在≥10U/mL的药理学有效浓度以上。
0.05mg/kg的人类剂量与常用的1/10啮齿类剂量的安全系数相一致，其中5mg/kg的剂量水平被定义为大鼠的NOAEL。猴子研究中的最低剂量为0.2mg/kg，最高剂量为10.5mg/kg。分别考虑到这两种剂量水平，并注意到它们均无相关的不良反应，0.05mg/kg的人类剂量相对于给灵长类施用的剂量而言代表了4倍和210倍的安全系数。
对于本领域人员而言，改变将是显然的，因此本发明仅以所附权利要求书的范围来限定。
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Claims (129)

1.配制为药物的可溶性透明质酸酶组合物的用途，其中所述药物用于维持透明质酸酶在血浆中的血浆水平在至少3U/ml的水平达至少一周，以治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症，其中所述组合物包含足以维持所述水平的量的偶联于聚合物的可溶性透明质酸酶。
2.用于治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症的药物组合物，包含以如下量配制的可溶性透明质酸酶，所述的量足以维持透明质酸酶在血浆中的血浆水平在至少3U/mL的水平达至少一周，其中所述可溶性透明质酸酶偶联于聚合物。
3.权利要求1的用途或权利要求2的组合物，其中所述组合物每周给药至少两次超过至少一周。
4.权利要求1-3之一的用途或组合物，其中：
所述组合物包含至少或大约2.0mg-60mg偶联于聚合物的可溶性透明质酸酶；
所述偶联于聚合物的可溶性透明质酸酶具有的比活性为至少或大约20,000U/mg，25,000U/mg，30,000U/mg，31,000U/mg，32,000U/mg，33,000U/mg，34,000U/mg，35,000U/mg，36,000U/mg，37,000U/mg，38,000U/mg，39,000U/mg，40,000U/mg，45,000U/mg，50,000U/mg，55,000U/mg，60,000U/mg或更高。
5.权利要求1-4之一的用途或组合物，其中所述组合物每次给药至少10mL。
6.权利要求1-5之一的用途或组合物，其中所述组合物配制为用于口服，静脉内(IV)，皮下，肌内，肿瘤内，真皮内，局部，透皮，经直肠或表皮下给药。
7.权利要求1-6之一的用途或组合物，其中所述组合物配制为用于静脉内给药。
8.权利要求1-7之一的用途或组合物，其中所述组合物还包含组氨酸和/或NaCl。
9.权利要求8的用途或组合物，其中所述组合物配制为包含或包含大约10mM组氨酸和/或包含或包含大约130mM NaCl。
10.权利要求1-9之一的用途或组合物，其中所述组合物具有是或是大约6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1或7.2的pH。
11.权利要求10的用途或组合物，其具有是或是大约6.5的pH。
12.权利要求1-11之一的用途或组合物，其中透明质酸酶的血浆水平至少为或大约3U/mL-12U/mL。
13.权利要求1-11之一的用途或组合物，其中透明质酸酶的血浆水平至少或至少约5U/mL，6U/mL，7U/mL，8U/mL，9U/mL，10U/mL，15U/mL，20U/mL，30U/mL，40U/mL，45U/mL或50U/mL。
14.权利要求1-13之一的用途或组合物，其中透明质酸酶的血浆水平至少或约10U/mL.
15.权利要求1-14之一的用途或组合物，其中所述聚合物是唾液酸化或PEG化部分。
16.权利要求1-15之一的用途或组合物，其中所述透明质酸酶底物是透明质酸。
17.权利要求1-16之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶是可溶性PH20。
18.权利要求17的用途或组合物，其中所述PH20选自羊、小鼠、猴、牛、细菌及人PH20。
19.权利要求17或18的用途或组合物，其中所述可溶形式的PH20是已经截短除去C-末端GPI的可溶性PH20。
20.权利要求1-19之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶具有包括在SEQ ID NO：1中的氨基酸序列或与包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少大约91％氨基酸序列同一性的序列，由此所述可溶性透明质酸酶是可溶性，N-糖基化的及具有中性活性(neutral active)。
21.权利要求1-20之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶包括在氨基酸残基467到483或在氨基酸残基467到483之间的氨基酸残基截短的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
22.权利要求1-21之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶包括在选自下组的氨基酸残基截短的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482和483。
23.权利要求22的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶在CHO细胞中分泌。
24.权利要求1-23之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸36-467，36-468，36-469，36-470，36-471，36-472，36-473，36-474，36-475，36-476，36-477，36-478，36-479，36-480，36-481，36-482，或36-483所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1的氨基酸36-467，36-468，36-469，36-470，36-471，36-472，36-473，36-474，36-475，36-476，36-477，36-478，36-479，36-480，36-481，36-482，或36-483所示的氨基酸序列具有至少大约91％氨基酸序列同一性。
25.权利要求1-24之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶选自包含SEQ ID NO：4-9及46-48之一所示的氨基酸序列的多肽，其等位基因变体，种变体及其他变体。
26.权利要求1-25之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶是编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的核酸序列编码的多肽。
27.权利要求1-26之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶选自编码SEQ ID NO：4-9之一所示的氨基酸序列的核酸序列编码的多肽。
28.权利要求1-27之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶通过在CHO细胞中表达产生。
29.权利要求28的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶命名为rHuPH20。
30.权利要求1-29之一的用途或组合物，其中所述可溶性透明质酸酶是糖基化的。
31.权利要求1-30之一的用途或组合物，其中所述偶联于可溶性透明质酸酶的聚合物包含PEG化部分(PEG)。
32.权利要求31的用途或组合物，其中所述聚合物选自：甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(5kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-丁醛(mPEG-丁醛)(30kDa)，甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)(30kDa)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(10kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(20kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(60kDa分支的)；生物素-聚(乙二醇)-N-琥珀酰亚胺酯(生物素-PEG-NHS)(5kDa生物素化的)；聚(乙二醇)-p-硝基苯基碳酸酯(PEG-p-硝基苯基-碳酸酯)(30kDa)；或聚(乙二醇)-丙醛(PEG-丙醛)(30kDa)。
33.权利要求32的用途或组合物，其中所述PEG是分支或线性PEG。
34.权利要求33的用途或组合物，其中所述PEG是线性PEG。
35.权利要求31-34之一的用途或组合物，其中所述PEG是甲氧基-PEG(mPEG)。
36.权利要求35的用途或组合物，其中所述PEG是甲氧基聚(乙二醇)丁酸的线性N-羟基琥珀酰亚胺酯。
37.权利要求35或36的用途或组合物，其中所述PEG具有30或大约30千道尔顿的分子量。
38.含有可溶性透明质酸酶的组合物，所述可溶性透明质酸酶的量足以将透明质酸酶的血浆浓度维持在至少3U/mL的水平达至少一周，其中所述可溶性透明质酸酶与聚合物偶联。
39.权利要求38的组合物，其中所述组合物每周给药至少两次、超过至少一周。
40.权利要求38或39的组合物，其中：
所述组合物包含至少或约2.0mg-60mg与聚合物偶联的可溶性透明质酸酶，并且
所述与聚合物偶联的可溶性透明质酸酶的比活度为至少或大约20,000U/mg，25,000U/mg，30,000U/mg，31,000U/mg，32,000U/mg，33,000U/mg，34,000U/mg，35,000U/mg，36,000U/mg，37,000U/mg，38,000U/mg，39,000U/mg，40,000U/mg，45,000U/mg，50,000U/mg，55,000U/mg，60,000U/mg或更高。
41.权利要求38-40之一的组合物，其中所述组合物每次给药至少10mL。
42.权利要求38-41之一的组合物，其中所述组合物可以配制为用于口服，静脉内(IV)，皮下，肌内，肿瘤内，真皮内，局部，透皮，经直肠或者表皮下给药。
43.权利要求38-42之一的组合物，其中所述组合物可以配制为用于静脉内给药。
44.权利要求38-43之一的组合物，还包含组氨酸和/或NaCl。
45.权利要求44的组合物，所述组合物配制为包含或包含约10mM组氨酸和/或130mM NaCl。
46.权利要求38-45之一的组合物，其中所述组合物具有是或是大约6.0，6.1.，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1或7.2的pH。
47.权利要求46的组合物，其具有是或是大约6.5的pH。
48.权利要求38-47之一的组合物，其中透明质酸酶的血浆药物学活性水平是至少或大约3U/mL-12U/mL。
49.权利要求38-48之一的组合物，其中所述聚合物是唾液酸化或PEG化部分。
50.一种组合，包含：
含有可溶性透明质酸酶的组合物，所述可溶性透明质酸酶的量足以将血浆中透明质酸酶的血浆水平维持在至少3U/mL的水平达至少一周，其中可溶性透明质酸酶与聚合物偶联；和
包含用于治疗透明质酸相关疾病或病症的第二种药剂的第二种组合物。
51.权利要求50的组合，其中所述包含可溶性透明质酸酶的组合物给药至少每周两次超过至少一周。
52.权利要求50或51的组合，其中：
所述包含可溶性透明质酸酶的组合物含有至少或约2.0mg-60mg与聚合物偶联的可溶性透明质酸酶，并且
所述与聚合物偶联的可溶性透明质酸酶的比活度为至少或大约20,000U/mg，25,000U/mg，30,000U/mg，31,000U/mg，32,000U/mg，33,000U/mg，34,000U/mg，35,000U/mg，36,000U/mg，37,000U/mg，38,000U/mg，39,000U/mg，40,000U/mg，45,000U/mg，50,000U/mg，55,000U/mg，60,000U/mg或更高。
53.权利要求50-52之一的组合，其中所述第一种和第二种组合物共同配制或分别提供。
54.权利要求50-53之一的组合，其中所述聚合物是唾液酸化或PEG化部分。
55.权利要求之一的组合50-54，其中所述第二种药剂是抗癌剂或抗癌治疗。
56.权利要求55的组合，其中所述抗癌剂或抗癌治疗选自：化疗剂，放射治疗，抗体，肽，基因治疗载体，病毒和核酸。
57.权利要求50-56之一的组合，其中：
所述第二种药剂是抗癌剂，选自阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式视黄酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；Alvocidibs；安巴腙；二霉素；阿美蒽醌；Amifostines；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；氨茴霉素；Apaziquones；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；Banoxantrones；Batabulins；巴马司他；BCG Live；贝那昔滨；苯达莫司汀；苯佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；Biricodars；比生群；比生群；Bisnafide Dimesylates；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素c；卡普睾酮；Canertinibs；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；含有聚苯丙生的卡莫司汀；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；Crisnatols；环磷酰胺；阿糖胞苷liposomals；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；达依泊汀α；柔红霉素liposomals；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素2；右尼古地平；Dexonnaplatins；右雷佐生；地扎胍宁；地吖醌；Dibrospidiums；地诺孕素；Dinalins；Disermolides；多西他塞；Dofequidars；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；多柔比星HCL；Docorubicin HCL脂质体注射液；阿霉素；屈洛昔芬；屈他雄酮丙酸酯；偶氮霉素；依考莫司汀；依达曲沙；Edotecarins；依氟鸟氨酸；Elacridars；依利奈法德；Elliott’s B溶液；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；Enzastaurins；依匹哌啶；表柔比星；阿法依伯汀；依地前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A铵；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；Galarubicins；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/Ozogamicins；吉罗酚；Gimatecans；Gimeracils；格洛沙腙；Glufosfamides；醋酸性瑞林；羟基脲；Ibritumomabs/Tiuxetans；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；Ilomastats；Imatinib mesylates；Imexons；Improsulfans；Indisulams；Inproquones；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2及其它白介素(包括重组白介素)；Intoplicines；Iobenguanes[131-I]；Iproplatins；Irinotecans；伊索拉定；Ixabepilones；酮曲沙；L-亚硝基羟基丙氨酸；兰瑞肽；Lapatinibs；Ledoxantrones；来曲唑；Leucovorins；Leuprolides；(Leuprorelides)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNUs；洛莫司汀；Lonafarnibs；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美坦辛；氮芥；Meclorethamines/氮芥；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美法仑lL-PAMs；美诺立尔；美雄烷；巯基嘌呤；6-巯基嘌呤；美司钠；Metesinds；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；M氯苯乙嘧胺；美妥替哌；米帕；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；Mitocarcins；Mitocromins；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；Mivobulins；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；Mubritinibs；霉酚酸；Nandrolone Phenpropionates；奈达铂；Nelzarabines；奈莫柔比星；硝氨丙吖啶；诺考达唑；Nofetumomabs；诺加霉素；Nolatrexeds；Nortopixantrones；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；Ortataxels；Oteracils；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；Pamidronates；Patubilones；培加酶；培门冬酶；培非司亭；Peldesines；佩里霉素；Pelitrexols；培美曲塞；戊氮芥；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；Perifosines；Picoplatins；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；Pixantrones；Plevitrexeds；Plicamycid光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；Porfimers；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；螺丙醇；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡呋菌素；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；绛色霉素；Sabarubicins；沙芬戈；沙格司亭；Satraplatins；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；Sparfosates；Sparfosic Acids；稀疏霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；Squalamines；链黑菌素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；Sunitinib Malate；6-硫代鸟嘌呤(6-TG)；Tacedinalines；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；Tariquidars；牛磺莫司汀；Tecogalans；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26s；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；Thiamiprines；硫代鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；Tiazofurins；噻氯咪索；替洛隆；Timcodars；噻莫西酸；替拉扎明；Topixantrones；托泊替康；托瑞米芬；Tositumomabs；曲贝替定(Ecteinascidin 743)；曲妥珠单抗；曲托龙；Tretinoins/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；TriplatinTetranitrates；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；乌拉莫司汀；乌瑞替派；戊柔比星；Valspodars；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄霉素A(胍甲环素)；折尼铂；Zilascorbs[2-H]；净司他丁；Zoledronate；佐柔比星；和Zosuquidars。
58.治疗其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症的方法，所述方法包括给予对象每周一次以上、预定周数的足以保持血浆中透明质酸酶的药理学活性水平为至少大约为或者为3U/mL的量的可溶性透明质酸酶，以防止所述底物重新合成为治疗前水平，其中
透明质酸酶通过与聚合物偶联修饰，并且
所述预定周数是超过一周。
59.权利要求58的方法，其中所述预定周数是至少2周。
60.权利要求58或59的方法，其中所述预定周数是2周，3周或4周。
61.权利要求58-60之一的方法，其中在预定周数之后，中断给药第一段预定时间，然后恢复给药至少1周。
62.权利要求61的方法，其中所述第一段预定时间是至少一周。
63.权利要求61或62的方法，其中所述第一段预定时间是1周，2周，3周或4周。
64.权利要求61-63之一的方法，其中在第一段预定时间后，可溶性透明质酸酶进一步被给予对象每周一次以上、预定周数，其量为足以保持血浆中透明质酸酶的药理学活性水平为至少大约为或者为3U/mL，以防止所述底物重新合成为治疗前水平。
65.权利要求61-64的方法，其中所述给药及给药中断的循环重复多次。
66.权利要求58-65之一的方法，其中所述透明质酸酶以足以维持透明质酸酶的血浆药物学活性水平在至少或大约3U/mL-12U/mL的量给予。
67.权利要求58-65之一的方法，其中所述透明质酸酶给药的量足以维持透明质酸酶的血浆药物学活性水平在至少或大约5U/mL，6U/mL，7U/mL，8U/mL，9U/mL，10U/mL，15U/mL，20U/mL，30U/mL，40U/mL，45U/mL，50U/mL或更高。
68.权利要求58-67之一的方法，其中所述透明质酸酶给药的量足以维持透明质酸酶的血浆药物学活性水平在至少或大约10U/mL。
69.权利要求58-68之一的方法，其中所述透明质酸酶每周给药2次。
70.权利要求68-69之一的方法，其中给予的透明质酸酶的量选自0.02mg/kg(对象体重)，0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.06mg/kg，0.07mg/kg，0.08mg/kg，0.09mg/kg，0.1mg/kg，0.15mg/kg，0.2mg/kg，0.25mg/kg，0.30mg/kg，0.35mg/kg，0.40mg/kg，0.45mg/kg，0.5mg/kg，0.55mg.kg，0.6mg/kg，0.7mg/kg，0.8mg/kg，0.9mg/kg，1.0mg/kg，1.1mg/kg，1.2mg/kg，1.3mg/kg，1.4mg/kg，1.5mg/kg或更高。
71.权利要求58-70之一的方法，其中给予的透明质酸酶的量选自0.05mg/kg-0.8mg/kg。
72.权利要求58-71之一的方法，其中给予的透明质酸酶的量是或是大约50,000单位(U)；60,000 U；70,000 U；80,000 U；90,000 U；100,000 U；200,000 U；300,000 U；400,000 U；500,000 U；600,000 U；700,000 U；800,000 U；900,000 U；1,000,000 U；1,500,000 U；2,000,000 U；2,500,000 U；3,000,000 U；3,500,000 U；4,000,000U或更高。
73.权利要求58-72之一的方法，其中所述透明质酸酶底物是透明质酸。
74.权利要求58-73之一的方法，其中在治疗之前测定来自对象的样品中的透明质酸表达。
75.治疗对象中透明质酸相关疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)测定来自对象的样品中的透明质酸的表达或透明质酸(hyaluron)；和
(b)(b)如果来自对象的样品中的透明质酸表达或透明质酸(hyaluron)升高或者处于指示疾病或病症的水平，给予对象含有可溶性透明质酸酶的组合物，其中所述可溶性透明质酸酶通过与聚合物偶联来修饰。
76.权利要求74或75的方法，其中来自对象的样品是组织或体液。
77.权利要求74-76之一的方法，其中来自对象的样品是血液样品，肿瘤活检样品，脑脊液，尿液，汗液，精液或唾液样品。
78.权利要求58-77之一的方法，还包括：
将用于治疗所述疾病或病症的第二种不同药剂给予所述对象。
79.权利要求78的方法，其中所述第二种药剂以及含有可溶性透明质酸酶的组合物在单个组合物中给予。
80.权利要求78的方法，其中所述第二种药剂以及含有可溶性透明质酸酶的组合物分开给予。
81.权利要求80的方法，其中所述第二种药剂以及含有可溶性透明质酸酶的组合物同时、相继或以任何顺序间歇给予。
82.权利要求81的方法，其中所述第二种药剂在给予含有可溶性透明质酸酶的组合物之后给予。
83.权利要求82的方法，其中所述第二种药剂可以在给药周期中第一次给予可溶性透明质酸酶之后给予，并且任选在一或多次个后续可溶性透明质酸酶给药后。
84.权利要求83的方法，其中所述第二种药剂在可溶性透明质酸酶的每一次后续给药之后给予。
85.权利要求83的方法，其中所述第二种药剂在可溶性透明质酸酶的每两次随后的给药之后给予。
86.权利要求83的方法，其中所述第二种药剂每周给予一次，每2周给予一次，每3周给予一次或每个月给予一次。
87.权利要求82-86之一的方法，其中所述第二种药剂在给予含有可溶性透明质酸酶的组合物之后至少0.5分钟，至少1分钟，至少5分钟，至少15分钟，至少30分钟，至少1小时或1小时以上给予。
88.权利要求82-86之一的方法，其中所述第二种药剂在给予含有可溶性透明质酸酶的组合物之后至少或2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，14小时，16小时，18小时，20小时，22小时或24小时给予。
89.权利要求82-86之一的方法，其中所述第二种药剂在给予含有可溶性透明质酸酶的组合物之后至少48小时给药。
90.权利要求82-86之一的方法，其中所述第二种药剂在给予含有可溶性透明质酸酶的组合物之后至少72小时给药。
91.权利要求58-90之一的方法，其中所述聚合物是唾液酸化或PEG化部分。
92.权利要求1-91之一的方法，其中所述第二种药剂是抗癌剂或抗癌治疗。
93.权利要求92的方法，其中所述抗癌剂或抗癌治疗选自：化疗剂，放射治疗，抗体，肽，基因治疗载体，病毒和核酸。
94.权利要求1-93之一的方法，其中：
所述第二种药剂是抗癌剂，选自阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式视黄酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；Alvocidibs；安巴腙；二霉素；阿美蒽醌；Amifostines；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；氨茴霉素；Apaziquones；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；Banoxantrones；Batabulins；巴马司他；BCG Live；贝那昔滨；苯达莫司汀；苯佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；Biricodars；比生群；比生群；Bisnafide Dimesylates；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素c；卡普睾酮；Canertinibs；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；含有聚苯丙生的卡莫司汀；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；Crisnatols；环磷酰胺；阿糖胞苷liposomals；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；达依泊汀α；柔红霉素liposomals；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素2；右尼古地平；Dexonnaplatins；右雷佐生；地扎胍宁；地吖醌；Dibrospidiums；地诺孕素；Dinalins；Disermolides；多西他塞；Dofequidars；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；多柔比星HCL；Docorubicin HCL脂质体注射液；阿霉素；屈洛昔芬；屈他雄酮丙酸酯；偶氮霉素；依考莫司汀；依达曲沙；Edotecarins；依氟鸟氨酸；Elacridars；依利奈法德；Elliott’s B溶液；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；Enzastaurins；依匹哌啶；表柔比星；阿法依伯汀；依地前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A铵；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；Galarubicins；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/Ozogamicins；吉罗酚；Gimatecans；Gimeracils；格洛沙腙；Glufosfamides；醋酸性瑞林；羟基脲；Ibritumomabs/Tiuxetans；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；Ilomastats；Imatinib mesylates；Imexons；Improsulfans；Indisulams；Inproquones；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2及其它白介素(包括重组白介素)；Intoplicines；Iobenguanes[131-I]；Iproplatins；Irinotecans；伊索拉定；Ixabepilones；酮曲沙；L-亚硝基羟基丙氨酸；兰瑞肽；Lapatinibs；Ledoxantrones；来曲唑；Leucovorins；Leuprolides；(Leuprorelides)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNUs；洛莫司汀；Lonafarnibs；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美坦辛；氮芥；Meclorethamines/氮芥；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美法仑lL-PAMs；美诺立尔；美雄烷；巯基嘌呤；6-巯基嘌呤；美司钠；Metesinds；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；M氯苯乙嘧胺；美妥替哌；米帕；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；Mitocarcins；Mitocromins；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；Mivobulins；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；Mubritinibs；霉酚酸；Nandrolone Phenpropionates；奈达铂；Nelzarabines；奈莫柔比星；硝氨丙吖啶；诺考达唑；Nofetumomabs；诺加霉素；Nolatrexeds；Nortopixantrones；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；Ortataxels；Oteracils；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；Pamidronates；Patubilones；培加酶；培门冬酶；培非司亭；Peldesines；佩里霉素；Pelitrexols；培美曲塞；戊氮芥；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；Perifosines；Picoplatins；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；Pixantrones；Plevitrexeds；Plicamycid光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；Porfimers；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；螺丙醇；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡呋菌素；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；绛色霉素；Sabarubicins；沙芬戈；沙格司亭；Satraplatins；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；Sparfosates；Sparfosic Acids；稀疏霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；Squalamines；链黑菌素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；Sunitinib Malate；6-硫代鸟嘌呤(6-TG)；Tacedinalines；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；Tariquidars；牛磺莫司汀；Tecogalans；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26s；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；Thiamiprines；硫代鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；Tiazofurins；噻氯咪索；替洛隆；Timcodars；噻莫西酸；替拉扎明；Topixantrones；托泊替康；托瑞米芬；Tositumomabs；曲贝替定(Ecteinascidin 743)；曲妥珠单抗；曲托龙；Tretinoins/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；Triplatin Tetranitrates；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；乌拉莫司汀；乌瑞替派；戊柔比星；Valspodars；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄霉素A(胍甲环素)；折尼铂；Zilascorbs[2-H]；净司他丁；Zoledronate；佐柔比星；和Zosuquidars。
95.权利要求58-94之一的方法，其中所述可溶性透明质酸酶和/或第二种药剂可局部或系统给药。
96.权利要求95的方法，其中所述可溶性透明质酸酶和/或第二种药剂经口服，静脉内(IV)，皮下，肌内，肿瘤内，真皮内，局部，透皮，经直肠或经表皮下给药。
97.权利要求96的方法，其中所述可溶性透明质酸酶和/或第二种药剂经静脉内给药。
98.权利要求96的方法，其中所述可溶性透明质酸酶和/或第二种药剂经肿瘤内给药。
99.权利要求74-98之一的方法，还包括将来自对象的样品中透明质酸的表达与对照样品或标准品中的表达进行比较。
100.权利要求58-99之一的方法，其中透明质酸酶底物累积的疾病或病症与高间质液压力有关。
101.权利要求58-100之一的方法58-100，其中通过本发明方法治疗的疾病或病症是椎间盘压力，癌症或者水肿。
102.权利要求101的方法，其中所述疾病或病症是水肿，所述水肿由器官移植，卒中或脑外伤所引起。
103.权利要求101的方法，其中所述疾病或病症是癌症，所述癌症是一种肿瘤。
104.权利要求103的方法，其中所述疾病或病症是一种实性肿瘤。
105.权利要求104的方法，其中所述肿瘤与相同组织类型的非癌组织相比或者与相同肿瘤类型的非转移肿瘤相比，具有增加的透明质酸的细胞和/或基质表达。
106.权利要求101的方法，其中：
所述疾病或者病症选自晚期癌症，转移癌和/或未分化癌中的任何一种或多种。
107.权利要求58-106之一的方法，其中：
所述疾病或者病症选自卵巢癌，原位癌(ISC)，鳞状细胞癌(SCC)，前列腺癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，乳腺癌脑癌或者结肠癌中的一或多种。
108.权利要求58-107之一的方法，其中：
所述可溶性透明质酸酶是一种可溶性PH20。
109.权利要求108的方法，其中所述PH20选自羊、小鼠、猴、牛、细菌及人PH20。
110.权利要求108或109的方法，其中所述可溶形式的PH20是已经截短除去C-末端GPI的可溶性PH20。
111.权利要求58-110之一的方法，其中所述可溶性透明质酸酶具有包括在SEQ ID NO：1中的氨基酸序列或与包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少大约91％氨基酸序列同一性的序列，由此所述可溶性透明质酸酶是可溶性，N-糖基化的及具有中性活性。
112.权利要求58-111之一的方法，其中所述可溶性透明质酸酶包括在氨基酸残基467到483或在氨基酸残基467到483之间的氨基酸残基截短的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
113.权利要求58-112之一的方法，所述可溶性透明质酸酶包括在选自下组的氨基酸残基截短的SEQ ID NO：1的氨基酸顺序：467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482和483。
114.权利要求58-113之一的方法，其中所述可溶性透明质酸酶在CHO细胞中分泌。
115.权利要求58-114之一的方法，其中所述可溶性透明质酸酶具有SEQID NO：1的氨基酸36-467，36-468，36-469，36-470，36-471，36-472，36-473，36-474，36-475，36-476，36-477，36-478，36-479，36-480，36-481，36-482，或36-483所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1的氨基酸36-467，36-468，36-469，36-470，36-471，36-472，36-473，36-474，36-475，36-476，36-477，36-478，36-479，36-480，36-481，36-482或36-483所示的氨基酸序列具有至少大约91％氨基酸序列同一性。
116.权利要求58-115之一的方法，其中所述可溶性透明质酸酶选自包含SEQ ID NO：4-9和46-48之一所示氨基酸序列的多肽，及其等位变体，种变体及其他及其他变体。
117.权利要求58-116之一的方法，其中所述可溶性透明质酸酶是编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的核酸序列编码的多肽。
118.权利要求58-117之一的方法，其中所述可溶性透明质酸酶选自编码SEQ ID NO：4-9之一所示的氨基酸序列的核酸序列编码的多肽。
119.权利要求118的方法，其中所述可溶性透明质酸酶通过在CHO细胞中表达产生。
120.权利要求119的方法，其中所述可溶性透明质酸酶命名为rHuPH20。
121.权利要求58-120之一的方法，其中所述可溶性透明质酸酶是糖基化的。
122.权利要求58-121之一的方法，其中所述偶联于可溶性透明质酸酶的聚合物包含PEG化部分(PEG)。
123.权利要求122的方法，其中所述聚合物选自：甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(5kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-丁醛(mPEG-丁醛)(30kDa)，甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)(30kDa)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(10kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(20kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(60kDa分支的)；生物素-聚(乙二醇)-N-琥珀酰亚胺酯(生物素-PEG-NHS)(5kDa生物素化的)；聚(乙二醇)-p-硝基苯基碳酸酯(PEG-p-硝基苯基-碳酸酯)(30kDa)；或聚(乙二醇)-丙醛(PEG-丙醛)(30kDa)。
124.权利要求123的方法，其中所述PEG是分支或线性PEG。
125.权利要求124的方法，其中所述PEG是线性PEG。
126.权利要求122-125之一的方法，其中所述PEG是甲氧基-PEG(mPEG)。
127.权利要求126的方法，其中所述PEG是甲氧基聚(乙二醇)丁酸的线性N-羟基琥珀酰亚胺酯。
128.权利要求126或127的方法，其中所述PEG具有30或大约30kDa的分子量。
129.权利要求58-128之一的方法，其中所述治疗实现对象中肿瘤大小的减小。
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