CN104768535A - 用于透明质酸酶的稳定剂和包括透明质酸酶的液体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括透明质酸酶和用于透明质酸酶的稳定剂的稳定液体制剂，更具体地涉及通过将稳定剂添加至透明质酸酶而得到的稳定液体制剂。

Description

用于透明质酸酶的稳定剂和包括透明质酸酶的液体制剂
技术领域
本发明涉及包含透明质酸酶和用于透明质酸酶的稳定剂的稳定液体制剂，其优势在于其可以在延长的时段中在液态稳定地保持其酶活性，并且其施用简单从而其可被有效地使用。
背景技术
透明质酸酶，其是用于降解透明质酸的酶的统称，一开始被Duran-Reynals称作扩散因子，但是后来，因为观察到其展示对透明质酸(HA)强的活性，所以被称为透明质酸酶(HAase)。根据其作用机制，该酶被归类为分布在睾丸、溶酶体和蜂毒中的透明质酸盐4-聚糖水解酶(EC 3.2.1.35)、存在于水蛭中的透明质酸盐3-聚糖水解酶(EC 3.2.1.36)、和存在于细菌中的透明质酸盐裂解酶(EC4.2.2.1)。
尤其，因为睾丸中的透明质酸酶(PH-20)结合至精子顶体部分上的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点，所以它们是通过降解卵子外侧厚的外壁层而导致受精的关键的酶。已知透明质酸(HA)、软骨素和硫酸软骨素中存在的N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸之间的β(1-4)键通过PH-20的作用而水解。这些酶的分子通式是C2455H3775N617O704S21和它们的分子量是53870.9g/mol。人的包括HYAL1、HYAL2、HYAL3和PH-20/SPAM1的六个基因与该酶相关。
自从20世纪50年代，已经广泛评述了透明质酸酶的大量应用。第一个应用是皮下注射肠胃外流体，并且另外它们已经在整形外科、眼科、整形外科手术、牙科、口腔外科手术、妇科和耳鼻喉科外科手术中用于渗透和阻滞麻醉以增加类固醇类和局部麻醉剂的分散，和用于体液的分散而不形成凝聚比如血肿、防止腹膜粘合、防止结石形成、和治疗不育。
目前市面可用的透明质酸酶是提取自绵羊睾丸然后进行冻干。将这些未处理的透明质酸酶以适当的浓度融化，填入小瓶然后冻干成它们的制成品。由此制造的透明质酸酶包含过多量的外源蛋白。所以，通过现有方法获得的透明质酸酶不仅仅具有当转化成溶液时它们稳定性的问题，而且也从实践角度留下它们应用的巨大问题，这是因为，由于它们的稳定性随着时间的推移降低，因而它们的生理学活性下降。
发明内容
本发明人发明了本发明以提供取代现有冻干透明质酸酶制剂的液体制剂，现有的冻干透明质酸酶制剂不仅仅具有当转化成溶液时它们稳定性的问题，而且也从实践角度留下它们应用的巨大问题，这是因为，由于它们的稳定性随着时间的推移降低，因而它们的生理学活性下降。
本发明涉及包含透明质酸酶的液体制剂，以解决现有冻干制剂由于它们的稳定性和杂质而带来的问题，以及当从现有材料制备成液体形式时，由于它们稳定性随着时间的推移降低因而生理学活性下降的问题。
本发明的另一目的是提供制备具有改善的稳定性、包含透明质酸酶的液体制剂的方法。
本发明的再一目的是提供增加透明质酸酶的纯度和稳定性的纯化方法。
本发明的再一目的是提供用于包含透明质酸酶的制剂的稳定剂。
本发明涉及包含高纯度透明质酸酶的液体制剂，更优选地涉及包含纯度为95％或更高并且比活性是70,000IU/mg或更高的透明质酸酶的液体制剂。
本发明的液体制剂可包含稳定剂，所述稳定剂包含：(a)约1至50mM的缓冲剂，以提供pH 4.5至6.0；(b)0.001至0.5v/v％的非离子表面活性剂；和(c)0.1至5mM的螯合剂或碱金属和碱土金属氯化物。
此外，本发明涉及改善包含透明质酸酶、优选高纯度透明质酸酶的制剂的稳定性的稳定剂。
透明质酸酶可以是未纯化的透明质酸酶，或纯化的透明质酸酶。根据本发明的用于透明质酸酶的稳定剂包含：(a)约1至50mM的缓冲剂，以提供pH 4.5至6.0；(b)0.001至0.5v/v％的非离子表面活性剂；和(c)0.1至5mM的螯合剂或碱金属和碱土金属氯化物。
此外，本发明涉及获得具有改善的纯度和稳定性的透明质酸酶的方法，所述透明质酸酶通过选自由亲和性色谱、离子交换色谱和凝胶过滤组成的组的一种或多种方法对包含透明质酸酶的材料进行纯化来获得。
附图说明
图1显示根据本发明的实施例1的使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱纯化图；
图2显示根据本发明的实施例2的使用Mono S的阳离子交换色谱纯化图；
图3显示根据本发明的实施例3的使用DEAE琼脂糖的阴离子交换色谱纯化图；
图4显示根据本发明的实施例4的使用肝素琼脂糖的亲和性色谱纯化图；
图5显示根据本发明的实施例5的第一盐析材料的第五次纯化之后的GPC(凝胶渗透色谱)分析；
图6显示根据本发明的实施例5的第二盐析材料的第五次纯化之后的GPC(凝胶渗透色谱)分析；
图7显示根据本发明的实施例5的Hdase材料的第五次纯化之后的GPC(凝胶渗透色谱)分析；
图8显示根据本发明的透明质酸酶的纯化方法和使用未纯化的或纯化的透明质酸酶的制备液体制剂的方法的图。
具体实施方式
下文，更详细描述本发明。
本发明涉及包含透明质酸酶的液体制剂，其中透明质酸酶的纯度为95％或更高并且比活性是70,000IU/mg或更高。
根据本发明的透明质酸酶可以是通常源自哺乳动物(例如人、母牛、绵羊和猪)的睾丸的酶。通常市面上可用的透明质酸酶是通过将哺乳动物的睾丸进行盐析然后冻干、或者通过在盐析之后去热原然后冻干而获得。例如，以下材料可以用作纯化方法的源材料：盐析一次然后冻干的哺乳动物的睾丸材料、盐析两次然后冻干的睾丸材料，或盐析两次、去热原然后冻干的睾丸材料。现有的透明质酸酶通过从绵羊睾丸两次盐析、冻干、透析、去热原、然后冷冻干燥来提取，并且提取的物质掺混大量的透明质酸酶之外的蛋白质。
市面上可用的粗品状态的冻干透明质酸酶包含大量的杂质，因此它们的纯度低，并且当制备成液体制剂时，它们的稳定性低。此外，冻干制剂不方便，因为在使用之前其应制备成液体形式。所以，亟需一种包含透明质酸酶、优选高纯度的透明质酸酶的具有卓越的稳定性的液体制剂。
在根据本发明的液体制剂中包含的透明质酸酶包含纯度为95％或更高并且比活性是70,000IU/mg或更高的透明质酸酶，通过选自由亲和性色谱、离子交换色谱和凝胶过滤组成的组中的一种方法或两种以上组合的方法来对酶的粗原料进行纯化。
通过英国药典专论(British Pharmacopoeia Monograph)的“用于注射的透明质酸酶(Hyaluronidase for injection)”中阐释的试验来测量根据本发明纯化的透明质酸酶的活性。本说明书中，当根据英国药典专论的“用于注射的透明质酸酶”中阐释的试验测量的透明质酸酶的活性(含量或比活性)与储存之前测量的它们的初始活性(100％)相比为至少90％或更高、例如90％至115％时，可认为保持了透明质酸酶的稳定性。至于评估稳定性的标准，尽管英国药典专论的“用于注射的透明质酸酶”中的试验阐释了测量标准温度为37℃，pH 6.4和时间为20分钟作为测量透明质酸酶的活性的条件，但是在本说明书中测量可在36.5℃至37.5℃范围的温度、pH 6.39至6.41的范围、20分钟的储存时间等条件下进行。
通过实施根据本发明的纯化方法获得的透明质酸酶确保可获得具有高生物酶活性的蛋白质。因此，本发明提供了具有这样的比活性的高纯度酶，使得透明质酸酶的生物活性是70,000IU/mg或更高，优选地90,000IU/mg或更高。
根据本发明的包含透明质酸酶的液体制剂不仅仅确保了根据上述试验测量标准的稳定性，而且也可以如下方式在延长的时段中保持稳定：当储存在2至8℃的温度条件下0至29周时，透明质酸酶的含量保持在90％或更高。
此外，已经使用大鼠通过过敏性休克应答试验和消极皮肤过敏反应试验作为抗原性试验，确认本发明高度纯化的透明质酸酶是安全的。
关于用于根据本发明的纯化方法的来源材料，可使用从哺乳动物的睾丸分离的材料本身、通过将材料盐析获得的产物、通过将材料盐析然后使其去热原获得的产物，或冻干形式的材料或产物。例如，盐析一次然后冻干的哺乳动物的睾丸材料、盐析两次然后冻干的睾丸材料，或盐析两次、去热原然后冻干的睾丸材料可用作纯化方法的来源材料。
在根据本发明纯化方法的一种实施方式中，透明质酸酶可以通过使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和使用肝素琼脂糖的亲和性色谱对材料进行纯化而获得。优选地，它们可以通过实施使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、使用肝素琼脂糖的亲和性色谱、以及凝胶过滤而纯化。
优选地，阳离子交换色谱可以是使用Mono S或SP琼脂糖和CM琼脂糖的阳离子交换色谱，阴离子交换色谱可以是使用DEAE琼脂糖或Q琼脂糖的阴离子交换色谱。
亲和性色谱和离子交换色谱可通过常规方法进行，例如包括上样、平衡、冲洗、洗脱和再生过程。就用于每个过程使用的溶液而言，有平衡液(基础溶液)，和通过向平衡液添加其他组分而制备的冲洗液、洗脱液和再生液。每个过程使用的平衡液和冲洗液、洗脱液和再生液的优选例子阐释在下表中。
表1
可用于色谱的溶液
关于根据本发明的纯化方法，优选地可在进行色谱之后进行凝胶过滤，并且凝胶过滤的例子可包括使用Sephacryl树脂、Superdex和Superose的凝胶过滤。在本发明的一种实施方式中，凝胶过滤可通过常规方法进行，例如可用1至50mM的醋酸钠、0.1至5mM的碱金属或碱土金属、0.001～0.5v/v％的非离子表面活性剂和pH 4.5～5.5的平衡液进行。
根据本发明的一种实施方式，使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱可使用平衡液、冲洗液、洗脱液和再生缓冲液作为缓冲液。甘氨酸可用作平衡缓冲液，并且优选地，1至50mM的甘氨酸可用作平衡缓冲液且其优选pH是8.0至11.0。离子表面活性剂可用作冲洗缓冲液，优选地可以以0.1至0.5v/v％的量使用，最优选地可以以0.3％的量使用。氯化钠可用作洗脱缓冲液，优选地可使用35至200mM的氯化钠。
根据本发明的一种实施方式，阳离子交换色谱可使用缓冲液，并且平衡液、洗脱液和再生缓冲液可用作缓冲液。平衡缓冲液包括磷酸钠，并且螯合剂和非离子表面活性剂可用作平衡缓冲液，并且优选地可包括1至50mM的磷酸钠、0.1至5mM的螯合剂和0.001至0.5v/v％的非离子表面活性剂，并且其优选pH是5.5至6.5。氯化钠可用作洗脱缓冲液，最优选地可使用35至200mM的氯化钠。
根据本发明的一种实施方式，对于阴离子交换色谱，平衡液、上样后平衡液和再生缓冲液可用作缓冲液。磷酸钾可用作平衡缓冲液，优选地可使用1至50mM的磷酸钾，且其优选pH是6.5至7.5。氯化钠可用作上样后平衡缓冲液，并且优选地可使用50至100mM的氯化钠。
根据本发明的一种实施方式，关于使用肝素琼脂糖的亲和性色谱，平衡液、冲洗液、洗脱液和再生缓冲液可用作缓冲液。包含醋酸钠、螯合剂和非离子表面活性剂的平衡缓冲液可用作平衡缓冲液，优选地可使用1至50mM的醋酸钠、0.1至5mM的螯合剂和0.001至0.5v/v％的非离子表面活性剂，并且其优选pH是4.0至5.5。氯化钠可用作洗脱缓冲液，并且优选地可使用200至700mM的氯化钠。
各自纯化之后获得的浓缩物中酶的比活性的范围显示在下表2中。
表2
根据本发明的液体制剂可经肠胃外施用路径施用，例如其可通过注射进行肠胃外施用。
液体制剂除了透明质酸酶之外，还可进一步包含氯化钠和乳糖作为赋形剂，并且其可包括但不限于药学上可接受的赋形剂、稀释剂等。
此外，本发明的另一方面涉及用于透明质酸酶的稳定剂，更具体地涉及一种稳定剂，其包含：约1至50mM的缓冲剂，以提供pH 4.5至6.0；0.001至0.5％的非离子表面活性剂；和0.1至5mM的螯合剂或碱金属和碱土金属氯化物。
稳定剂适用的透明质酸酶可以是未纯化的透明质酸酶或纯化的透明质酸酶，并且优选纯化的透明质酸酶。
透明质酸酶可以是通常源自哺乳动物例如人、母牛、绵羊和猪的睾丸的酶，或通过将源自哺乳动物的透明质酸酶转导至微生物或动物细胞或植物细胞中而表达的重组透明质酸酶。重组透明质酸酶的生产方法与微生物、或动物或植物细胞中根据哺乳动物基因的重组方法的常规生产方法相同，并且示意性方法描述在Frost等，1997，BBRC，236，10-15；Lin等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，10071-10075；Reitinger等，2008，Protein Expression and Purification(蛋白表达和纯化)，57，226-233；Kordowicz等，欧洲专利WO2000/077221中。
透明质酸酶包括通过将哺乳动物的睾丸盐析一次然后冻干获得的酶、通过将睾丸盐析两次然后冻干获得的酶、通过将睾丸盐析两次、去热原然后冻干获得的酶等。此外，透明质酸酶可以是通过选自由亲和性色谱、离子交换色谱和凝胶过滤组成的组中的一种方法或两种以上组合的方法进行纯化的酶，并且优选地可以是通过上述纯化方法纯化并且纯度为95％或更高并且比活性是70,000IU/mg或更高的透明质酸酶。纯化方法如上面所描述。
关于根据本发明的液体制剂的稳定性，pH条件是主要的因素之一，无论其中使用何种缓冲剂，pH调整在包括约4.0至约7.0、优选约4.5至约6.0的值之中，例如选自由4.5、4.7、5.0、5.5、5.7和6.0组成的组的值之中。可使用本领域已知的酸或碱进行调整，或通过使用缓冲剂组分的适当的混合物，或通过这两种方式来获得pH。
适于本发明的药学上可接受的缓冲液可包括但不限于选自由琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、丙二酸盐缓冲液、MES(2-(N-吗啉基)乙烷磺酸)缓冲液、Tris缓冲液和甘氨酸缓冲液组成的组中的一种或两种以上组合的缓冲剂。优选的缓冲剂的浓度可考虑目标溶液的期望pH条件和要使用的缓冲剂的类型适当的确定，例如可以是1至50mM，优选10至30mM。
稳定剂的非离子表面活性剂可以是聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(Tween)。例如，其可以选自由聚山梨醇酯20(Tween 20)、聚山梨醇酯80(Tween 80)和Triton X-100组成的组。
螯合剂指包含两个或更多个能够与单个金属离子形成配位键的电子供体原子的分子，并且优选可以是乙二胺四乙酸(EDTA)。螯合剂的浓度可以是0.1mM至5mM，优选0.5mM至1mM。
碱金属和碱土金属氯化物可以是MgCl2。MgCl2的浓度可以是0.1mM至5mM，优选0.5mM至5mM。
稳定剂的例子可包括MgCl2、非离子表面活性剂和缓冲剂，以提供pH 4.0至6.0，或包括EDTA、非离子表面活性剂和缓冲剂，以提供pH 4.0至6.0。
第一次纯化的亲和性色谱可使用缓冲液，并且平衡液、冲洗液、洗脱液和再生缓冲液可用作缓冲液。甘氨酸可用作平衡缓冲液，优选地，1至50mM的甘氨酸可用作平衡缓冲液，并且其优选pH是8.0至11.0。离子表面活性剂可用作冲洗缓冲液，优选地其可以以0.1至0.5％的量使用，最优选地其可以以0.3％的量使用。氯化钠可用作洗脱缓冲液，并且优选地可使用35至200mM的氯化钠。
第二次纯化的阳离子交换色谱可使用缓冲液，并且平衡液、洗脱液和再生缓冲液可用作缓冲液。平衡缓冲液可包括磷酸钠、EDTA和Tween 80，优选地可包括1至50mM的磷酸钠、0.1至5mM的EDTA和0.001至0.5％的Tween80，并且其优选pH是5.5至6.5。氯化钠可用作洗脱缓冲液，最优选可使用35至200mM的氯化钠。
第三次纯化的阴离子交换色谱可使用缓冲液，并且平衡液、上样后平衡液和洗脱缓冲液可用作缓冲液。磷酸钾可用作平衡缓冲液，优选地可使用1至50mM的磷酸钾，并且其优选pH是6.5至7.5。氯化钠可用作上样后平衡缓冲液，并且优选地可使用50至100mM的氯化钠。
第四次纯化的亲和性色谱可使用缓冲液，并且平衡液、冲洗液、洗脱液和再生缓冲液可用作缓冲液。平衡缓冲液可包括醋酸钠、EDTA和Tween 80，优选地可使用1至50mM的醋酸钠、0.1至5mM的EDTA和0.001至0.5％的Tween80，并且其优选pH是4.0至5.5。氯化钠可用作洗脱缓冲液，并且优选地可使用200至700mM的氯化钠。
第五次纯化的凝胶过滤可使用缓冲液，并且平衡缓冲液可用作缓冲液。平衡缓冲液可包括醋酸钠、MgCl2和Tween 80，优选地可使用1至50mM的醋酸钠、0.1至5mM的MgCl2和0.001至0.5％的Tween 80，并且其优选pH是4.5至5.5。液体制剂指任何形式的水溶液和任何类型的悬液，并且其特征在于经皮下路径施用。
根据本发明的具体实施方式的液体制剂可以以如下的方式将其活性保持延长的时段：即使当在2至8℃的温度条件下储存多达29周时，使得透明质酸酶的含量保持在90％或更高；因此，这就可解决由于稳定性随着时间的推移下降而造成的生理学活性降低的现有问题。
在本发明的具体实施方式中，透明质酸酶的纯化方法包括下述步骤：通过从绵羊睾丸提取并冻干透明质酸酶从而制备来源材料；利用使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱进行的来源材料的第一次纯化步骤；第一次纯化之后使用阳离子交换色谱的第二次纯化步骤；第二次纯化之后使用阴离子交换色谱的第三次纯化步骤；第三次纯化之后使用亲和性色谱的第四次纯化步骤；和第四次纯化之后使用凝胶过滤的第五次纯化步骤，在每个步骤中使用的具体缓冲液的类型和其优选的范围如上述考虑到液体制剂所描述的那样。
根据本发明的液体制剂可经肠胃外施用路径施用，例如其可以经注射而进行肠胃外施用。
除了透明质酸酶，液体制剂可进一步包含氯化钠和乳糖作为赋形剂，并且其可包括但不限于药学上可接受的赋形剂、稀释剂等。
此外，本发明的另一方面涉及透明质酸酶的稳定剂，更具体地涉及一种稳定剂，其包含：约1至50mM的缓冲剂，以提供pH 4.5至6.0；0.001至0.5v/v％的非离子表面活性剂；和0.1至5mM的螯合剂或碱金属和碱土金属氯化物。
稳定剂适用的透明质酸酶可以是未纯化的透明质酸酶或纯化的透明质酸酶，并且优选纯化的透明质酸酶。
透明质酸酶可以是通常源自哺乳动物例如人、母牛、绵羊和猪的睾丸的酶，或通过将源自哺乳动物的透明质酸酶转导至微生物或动物细胞或植物细胞中而表达的重组透明质酸酶。重组透明质酸酶的生产方法与微生物、或动物或植物细胞中根据哺乳动物基因的重组方法的常规生产方法相同，并且示意性方法描述在Frost等，1997，BBRC，236，10-15；Lin等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，10071-10075；Reitinger等，2008，Protein Expression and Purification(蛋白表达与纯化)，57，226-233；Kordowicz等，欧洲专利WO2000/077221中。
透明质酸酶包括通过将哺乳动物的睾丸盐析一次并冻干获得的酶、通过将睾丸盐析两次然后冻干获得的酶、通过将睾丸盐析两次、去热原然后冻干获得的酶等。此外，透明质酸酶可以是通过选自由亲和性色谱、离子交换色谱和凝胶过滤组成的组中的一种或两种以上组合的方法而纯化的酶，并且优选地可以是通过上述纯化方法纯化并且纯度为95％或更高并且比活性是70,000IU/mg或更高的透明质酸酶。纯化方法如上面所描述。
关于根据本发明的液体制剂的稳定性，pH条件是主要的因素之一，无论其中使用何种缓冲剂，pH调整在包括约4.0至约7.0、优选约4.5至约6.0的值之中，例如选自由4.5、4.7、5.0、5.5、5.7和6.0组成的组的值之中。可使用本领域已知的酸或碱进行调整，或通过使用缓冲剂组分的适当的混合物，或通过这两种方式来获得pH。
适于本发明的药学上可接受的缓冲液可包括但不限于选自由琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、丙二酸盐缓冲液、MES(2-(N-吗啉基)乙烷磺酸)缓冲液、Tris缓冲液和甘氨酸缓冲液组成的组中的一种或两种以上组合的缓冲剂。优选的缓冲剂的浓度可考虑目标溶液的期望pH条件和要使用的缓冲剂的类型适当的确定，例如可以是1至50mM，优选10至30mM。
稳定剂的非离子表面活性剂可以是聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(Tween)。例如，其可以选自由聚山梨醇酯20(Tween 20)、聚山梨醇酯80(Tween 80)和Triton X-100组成的组。
螯合剂指包含两个或更多个能够与单个金属离子形成配位键的电子供体原子的分子，并且优选可以是乙二胺四乙酸(EDTA)。螯合剂的浓度可以是0.1mM至5mM，优选0.5mM至1mM。
碱金属和碱土金属氯化物可以是MgCl2。MgCl2的浓度可以是0.1mM至5mM，优选0.5mM至5mM。
稳定剂的例子可包括MgCl2、非离子表面活性剂和缓冲剂，以提供pH 4.0至6.0，或包括EDTA、非离子表面活性剂和缓冲剂，以提供pH 4.0至6.0。
第一次纯化的亲和性色谱可使用缓冲液，并且平衡液、冲洗液、洗脱液和再生缓冲液可用作缓冲液。甘氨酸可用作平衡缓冲液，优选1至50mM的甘氨酸可用作平衡缓冲液，并且其优选pH是8.0至11.0。离子表面活性剂可用作冲洗缓冲液，优选地可以以0.1至0.5v/v％的量使用，最优选可以以0.3％的量使用。氯化钠可用作洗脱缓冲液，并且优选地可使用35至200mM的氯化钠。
第二次纯化的阳离子交换色谱可使用缓冲液，并且平衡液、洗脱液和再生缓冲液可用作缓冲液。平衡缓冲液可包括磷酸钠、EDTA和Tween 80，优选可包括1至50mM的磷酸钠、0.1至5mM的EDTA和0.001至0.5％的Tween 80，并且其优选pH是5.5至6.5。氯化钠可用作洗脱缓冲液，最优选可使用35至200mM的氯化钠。
第三次纯化的阴离子交换色谱可使用缓冲液，并且平衡液、上样后平衡液和洗脱缓冲液可用作缓冲液。磷酸钾可用作平衡缓冲液，优选可使用1至50mM的磷酸钾，并且其优选pH是6.5至7.5。氯化钠可用作上样后平衡缓冲液，并且优选地可使用50至100mM的氯化钠。
第四次纯化的亲和性色谱可使用缓冲液，并且平衡液、冲洗液、洗脱液和再生缓冲液可用作缓冲液。平衡缓冲液可包括醋酸钠、EDTA和Tween 80，优选可使用1至50mM的醋酸钠、0.1至5mM的EDTA和0.001至0.5％的Tween80，并且其优选pH是4.0至5.5。氯化钠可用作洗脱缓冲液，并且优选地可使用200至700mM的氯化钠。
第五次纯化的凝胶过滤可使用缓冲液，并且平衡缓冲液可用作缓冲液。平衡缓冲液可包括醋酸钠、MgCl2和Tween 80，优选可使用1至50mM的醋酸钠、0.1至5mM的MgCl2和0.001至0.5％的Tween 80，并且其优选pH是4.5至5.5。液体制剂指任何形式的水溶液和任何类型的悬液，并且其特征在于经皮下路径施用。
根据本发明的具体实施方式的液体制剂可以以如下的方式将其活性保持延长的时段：即使当在2至8℃的温度条件下储存多达29周时，使得透明质酸酶的含量保持在90％或更高；因此，这就可解决由于稳定性随着时间的推移下降而造成的生理学活性降低的现有问题。
在本发明的具体实施方式中，透明质酸酶的纯化方法包括下述步骤：通过从绵羊睾丸提取并冻干透明质酸酶从而制备来源材料；通过使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱进行的来源材料的第一次纯化步骤；第一次纯化之后使用阳离子交换色谱的第二次纯化步骤；第二次纯化之后使用阴离子交换色谱的第三次纯化步骤；第三次纯化之后使用亲和性色谱的第四次纯化步骤；和第四次纯化之后使用凝胶过滤的第五次纯化步骤，在每个步骤中使用的具体缓冲液的类型和其优选的范围如上述考虑到液体制剂所描述的那样。
按照根据本发明的高纯度透明质酸酶的高度纯化方法，可改善先前制造的透明质酸酶的纯度。
此外，按照根据本发明的高纯度透明质酸酶注射，其稳定性可通过去除外源蛋白而确保，稳定性是先前制造的透明质酸酶中存在的问题。
此外，除了纯化透明质酸酶之外进一步还包括稳定剂的液体制剂的优势在于，其可稳定将其活性保持长的时段并且其能被简单地施用。
下文，参考下述实施例更详细地描述本发明。但是，它们仅仅是为了阐释本发明，本发明的范围不受这些实施例限制。
实施例1：使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱(第一次纯化)
在该实验中用于纯化透明质酸酶的材料如下表3中所显示，1)将之前的过程得到的睾丸进行第一次盐析之后冻干的材料(第一盐析材料)，2)第二次盐析之后冻干的材料(第二盐析材料)，和3)去热原之后冻干的材料(材料名称：透明质酸酶(以下称为Hdase)Shanghai Liamim Co.)，并将其用于随后的5-步纯化方法中。
表3
第一盐析材料 第二盐析材料 Hdase
含量(IU/mg) 约100～140 约360～400 约800～1100
比活性(IU/mg蛋白) 约330～470 约1,200～1,330 约1,330～1,830
色谱过程由上样、平衡、冲洗、洗脱和再生过程组成。第一次纯化使用的亲和性色谱和其中使用的缓冲液如下表4。
表4
对于透明质酸酶的第一次纯化，使用蓝色琼脂糖6快速流(Blue Sepharose6Fast Flow)作为树脂，用其填充内径为1.6cm的柱直到树脂的高度为10cm。将1g的透明质酸酶材料溶解在500mL(2mg/mL)的平衡缓冲液(10mM甘氨酸，pH 10.0)中，并且使用过滤之后的滤渣作为分析的样品。
将透明质酸酶样品上样到柱上，采用的上样速率是2.0mL/分钟。然后，用平衡缓冲液使柱平衡并且用冲洗缓冲液(碱缓冲液中的0.3％辛酸钠)冲洗。平衡之后的步骤是以3.0mL/分钟的流速分析。冲洗之后，用平衡缓冲液再次使树脂平衡并且用洗脱缓冲液(碱缓冲液中的135mM盐)洗脱，以收集流出的溶液。因为透明质酸酶非常容易在碱性条件下丧失其活性，因此通过添加pH调节剂将收集的溶液的pH调整至6.0至7.0，并且当完成洗脱时，用再生缓冲液(碱缓冲液中的1M盐)将柱进行再生。分析结果显示在图1中。纯化之后获得的产率和比活性显示在下表8中。
实施例2：使用Mono S的阳离子交换色谱(第二次纯化)
采用阳离子交换色谱作为第二次纯化。使用表5中阐释的缓冲液，进行样品上样、平衡、冲洗、洗脱和再生过程。
表5
对于透明质酸酶的第二次纯化，使用Mono S作为树脂，用其填充内径为1.6cm的柱直到树脂的高度为10cm。将首先从实施例1纯化的样品用平衡缓冲液(10mM磷酸氢二钠、1mM EDTA、0.1％Tween 80，pH 6.0)稀释3倍然后用作分析的样品。
将透明质酸酶样品上样到柱上，采用的上样速率是2.0mL/分钟。然后，用平衡缓冲液使柱平衡，平衡之后的步骤是以3.0mL/分钟的流速分析。平衡之后，用冲洗缓冲液(碱缓冲液中的80mM盐)冲洗树脂。冲洗树脂之后，用洗脱缓冲液(碱缓冲液中的125mM盐)洗脱，以收集流出的溶液。当完成洗脱时，用再生缓冲液(碱缓冲液中的1M盐)将柱进行再生。分析结果显示在图2中。纯化之后获得的产率和比活性显示在下表8中。
实施例3：使用DEAE琼脂糖的阴离子交换色谱(第三次纯化)
采用阴离子交换色谱作为第三次纯化。使用表6中给出的缓冲液，进行样品上样、平衡和再生过程。
表6
对于透明质酸酶的第三次纯化，使用DEAE琼脂糖作为树脂，用其填充内径为1.6cm的柱直到树脂的高度为5cm。将从实施例2二次纯化的样品用平衡缓冲液(5mM磷酸氢二钾，pH 7.1)稀释1.67倍然后用作分析的样品。
将透明质酸酶样品上样到柱上，采用的上样速率是2.0mL/分钟。然后，用上样后平衡缓冲液(碱缓冲液中的75mM盐)使柱平衡，并且平衡之后的步骤是以3.0mL/分钟的流速分析。平衡之后，用再生缓冲液(碱缓冲液中的1M盐)将树脂进行再生，而不用任何分离的洗脱步骤。在第三次纯化中，不用任何分离的洗脱步骤(流过(F/T)溶液)，上样期间未与树脂结合而流出的溶液视为纯化的透明质酸酶洗出液。分析结果显示在图3中。纯化之后获得的产率和比活性显示在下表8中。
实施例4：使用肝素琼脂糖的亲和性色谱(第四次纯化)
采用亲和性色谱作为第四次纯化。使用表7中给出的缓冲液，进行样品上样、平衡、冲洗、洗脱和再生过程。
表7
对于通过阴离子交换色谱第三次纯化的透明质酸酶的第四次纯化，使用肝素琼脂糖6快速流(Heparin Sepharose 6fast flow)作为树脂，用其填充内径为1.0cm的柱直到树脂的高度成为10cm。将10x浓度的平衡缓冲液(200mM醋酸钠、10mM EDTA、1.0％Tween 80，pH 4.5)以第三次纯化样品体积的1/9的量添加至实施例3中第三次纯化的样品，然后用作分析的样品。
将透明质酸酶样品上样到柱上，采用的上样速率是0.5mL/分钟。然后，用平衡缓冲液使柱平衡(20mM醋酸钠、1mM EDTA、0.1％Tween 80，pH 4.5)，并且用冲洗缓冲液(碱缓冲液中的200mM盐)冲洗。平衡之后的步骤是以1.0mL/分钟的流速分析。冲洗之后，用洗脱缓冲液(碱缓冲液中的500mM盐)洗脱树脂，以收集流出的溶液。当完成洗脱时，用再生缓冲液(碱缓冲液中的1M盐)将柱进行再生。从该实验中所得的纯化图显示在图4中。纯化之后获得的产率和比活性显示在下表8中。
实施例5：使用Sephacryl树脂的凝胶过滤(第五次纯化)
采用凝胶过滤作为第五次纯化，并且其中使用的平衡液是包含10mM醋酸钠、1mM MgCl2、0.01％Tween 80并且pH 5.0的溶液。
对于第四次纯化的透明质酸酶的通过凝胶过滤的第五次纯化，使用Sephacryl S-200作为树脂，用其填充内径为1.6cm的柱直到树脂的高度为90cm。将实施例4中第四次纯化的样品溶液浓缩至树脂体积的1％左右，然后用作分析的样品。
将透明质酸酶样品上样到柱上，采用的上样速率是0.1mL/分钟。然后，对流出的平衡缓冲液(10mM醋酸钠、1mM MgCl2、0.01％Tween 80，pH 5.0)进行分类过程。以0.1mL/分钟的流速分析，并且收集通过洗脱流出的溶液。纯化之后获得的产率和比活性显示在下表8中。
针对上述三种不同的透明质酸酶样品在第五次纯化之后的纯度测试结果显示在图5至7和表8中。表8中给出的蛋白质产率指包含透明质酸酶的所有蛋白质的纯化产率。如图5至7中所显示，透明质酸酶之外的二聚体或聚合物未显示在第五次纯化之后根据GPC文档的色谱图中，并且其比活性(IU/mg蛋白质)是90,000IU/mg蛋白质或更高，其纯度(GPC)是95％或更高。
表8
如图5至7和表8中所显示，确认了即使在上述五-步纯化中使用不同的起始材料(第一盐析材料、第二盐析材料和Hdase)时，完成第五次纯化之后获得的终浓缩物的比活性是90,000IU/mg蛋白质或更高且其纯度是95％或更高。这些结果意味着无论是否使用任何步骤的透明质酸酶材料，可通过上面五-步纯化法实现上述结果并且终浓缩物除了透明质酸酶之外几乎不包含二聚体或多聚体。
实施例6：稳定性测试(不添加稳定剂)
6-1：第一次纯化之后洗脱浓缩物的稳定性测试
在根据实施例1使用亲和性色谱对第一盐析材料、第二盐析材料和Hdase进行第一次纯化之后获得的每个洗脱浓缩物的pH被调整至6.0和7.0之间，然后将其以一定量分散并且储存在4℃。在每个时间点，测量透明质酸酶的含量，结果显示在下表9中。
在每个时间点，根据英国药典专论的“用于注射的透明质酸酶”中阐释的试验测试透明质酸酶的酶活性(或含量)。在整个说明书中，透明质酸酶的稳定性指根据英国药典专论的“用于注射的透明质酸酶”中阐释的试验测量的透明质酸酶的活性(含量或比活性)。
每个测试条件下的酶活性(或含量)表示为在每个时间点测量的比活性或活性相比于表8中给出的0周时的比活性或活性(设为100)的百分数值，并且显示在下表9中。
表9
如上表9中可见，对于通过将比活性彼此不同的三种材料进行第一次纯化而获得的洗脱浓缩物在4℃进行含量稳定性测试，确认了所有三种材料到29周为止显示它们含量的极少下降。第一次纯化之后获得的洗出液仅仅被调整降低至pH 6.0至7.0，而没有任何其他稳定剂。同时，表9中超过100％的含量值是通过与标准产品相比的生理学活性测量(比如酶活性测量)获得，认为是由于宽范围的测试结果产生的测量误差，如在生物物质(疫苗、重组蛋白(细胞因子、单克隆抗体等)、类毒素等)的滴度测试中可见。
6-2：通过稀释第一次纯化之后的脱浓缩物获得的低浓度溶液的稳定性测 试
将根据实施例1对Hdase材料第一次纯化之后获得的洗脱浓缩物稀释至约1,500IU/mL(＝100％)，然后分散并储存在4℃。然后，如在下表10中可见，在每个时间点测量其含量。1,500IU/mL的浓度与具有透明质酸酶作为材料的产品的浓度相同。
每次测量时的含量表示为在具体的储存时间点测量的酶活性相比于在0周时的酶活性(设为100％)的百分数值，并且显示在下表10中。根据下述数学式计算酶比活性：
表10
储存时间 酶活性比(％) 酶比活性(IU/mg)
0周 100.0 21,103
10周 112.0 20,568
12周 102.8 21,033
13周 99.6 20,968
16周 103.2 20,869
20周 112.1 21,153
29周 108.7 21,532
如在上表10中可见，第一次纯化之后获得的洗脱浓缩物(即使是1,500IU/mL的浓度)在29周内显示它们含量的极少降低。
所以，无论材料的含量如何，三种材料的第一次纯化之后的浓缩物在4℃29周内是稳定的，并且同样地，在低浓度(1500IU/mL)下4℃29周内是稳定的。
6-3：通过第二次纯化和第四次纯化的一步纯化之后获得的洗脱浓缩物的 稳定性测试
每个Hdase材料经受第二次纯化或第四次纯化的一步纯化，然后测试每个浓缩物的稳定性。第二次纯化和第四次纯化中的每一个基本上根据实施例2和实施例4进行，并且Hdase是实施例1中阐释的第一次纯化之前的样品。所获得的洗脱浓缩物的储存温度分别设置为4℃、25℃和37℃，然后在每个时间点测量透明质酸酶的含量并且在每个时间点获得它们的酶含量(酶活性比)，如下表11所示。
表11
酶活性比(％，含量)
此外，为了研究储存长的时段时透明质酸酶的含量范围，将通过第二次纯化获得的浓缩物储存在4℃29周并且在每个时间点测量透明质酸酶的含量。结果显示在下表12中。
表12
天 酶活性比(％) 酶比活性(IU/mg)
0周 100.0 12,647
10周 100.1 12,423
12周 103.6 12,856
13周 97.7 12,498
16周 98.3 12,563
20周 103.0 12,893
29周 98.8 12,143
如在表11和表12中所显示，不仅第一次纯化之后的浓缩物，通过第二次纯化而纯化一次的浓缩物在4℃29周也是稳定的。
实施例7：稳定剂的条件
用于稳定剂条件测试的浓缩物是纯度为95％或更高的透明质酸酶，其是实施例5中Hdase材料的第五次纯化之后获得的产物，然后将其调整至浓度1,500IU/mL(＝100％)并且用于根据表中分别阐释的条件制备溶液。
7-1：稳定性组分
将纯度为95％或更高的透明质酸酶调整至1,500IU/mL(＝100％)并且用于根据下表13中阐释的条件制备溶液，然后储存在4℃并且测试，以测量透明质酸酶在每个时间点的含量。结果，如下表13中所阐释，含量下降。
表13
*基础缓冲液：10Mm醋酸钠
将相同的透明质酸酶调整至1,500IU/mL(＝100％)并且用于根据下表14的条件制备溶液，然后储存在4℃并且测试，以测量透明质酸酶在每个时间点的含量。因此获得表15的结果。
表14
类别 EDTA/MgCl2 表面活性剂 pH
条件1 1mM EDTA 0.01v/v％Tween 80 pH 4.5
条件2 1mM EDTA 0.01v/v％Tween 80 pH 5.0
条件3 1mM EDTA 0.01v/v％Tween 80 pH 6.0
条件4 1mM MgCl2 0.01v/v％Tween 80 pH 4.5
条件5 1mM MgCl2 0.01v/v％Tween 80 pH 5.0
条件6 1mM MgCl2 0.01v/v％Tween 80 pH 6.0
表15
酶活性比(％)
条件 0周(％) 3周(％) 4周(％) 14周(％) 23周(％)
条件1 100 103.8 102.9 103.9 104.6
条件2 100 103.9 96.9 98.8 99.8
条件3 100 103 102.1 103.6 104.2
条件4 100 100.5 99.8 101.5 101.2
条件5 100 99.1 98.9 105.2 106
条件6 100 101.3 101.8 103.6 102.3
从上面的结果，确认了透明质酸酶的稳定性组分是EDTA或MgCl2+Tween 80+pH 4.5至6.0的组合条件。
7-2：稳定剂浓度条件
稳定性测试中使用的透明质酸酶是纯化至超过95％的透明质酸酶，并且测试浓度调整至1,500IU/mL(＝100％)。采用下表16中阐释的条件进行制备，并且进行稳定性测试。EDTA、MgCl2和Tween 80的浓度稀释两倍和十倍，并且在4℃和25℃的储存条件下进行稳定性测试。
表16
类别 EDTA/MgCl2 Tween 80 pH 储存温度
条件1 0.5mM EDTA 0.005％ 5.0 4℃
条件2 0.1mM EDTA 0.001％ 5.0 4℃
条件3 0.5mM MgCl2 0.005％ 5.0 4℃
条件4 0.1mM MgCl2 0.001％ 5.0 4℃
条件5 0.5mM EDTA 0.005％ 5.0 25℃
条件6 0.1mM EDTA 0.001％ 5.0 25℃
条件7 0.5mM MgCl2 0.005％ 5.0 25℃
条件8 0.1mM MgCl2 0.001％ 5.0 25℃
测试结果显示在下表17中。
表17
酶活性比(％)
含量(％) 0周 3周 6周 10周 15周 20周 26周
条件1 100.0 99.3 99.5 99.6 97.7 98.9 98.6
条件2 100.0 100.4 99.6 97.3 76.3 67.8 61.8
条件3 100.0 100.5 100.4 100.7 96.0 100.4 100.7
条件4 100.0 99.1 102.4 102.8 72.0 75.6 71.1
条件5 100.0 98.7 90.8 83.8 70.3 59.9 57.1
条件6 100.0 93.3 75.1 62.2 57.9 50.9 51.8
条件7 100.0 98.5 113.0 93.9 68.5 67.2 60.5
条件8 100.0 96.8 77.6 66.6 57.7 71.0 56.1
如在上表中可见，透明质酸酶在条件1和条件3下稳定约26周，并且其稳定性在其他条件下显示下降趋势。
实施例8
8.1：用于Hdase样品的稳定剂测试
就还未进行实施例1中阐释的第一次纯化的未纯化Hdase样品而言，用EDTA或MgCl2+Tween 80+pH 5.0测试其稳定性。将现有的透明质酸酶产物中使用的样品(透明质酸酶，含量约800～1100IU/mg)分别溶解在下表18中阐释的用于注射的缓冲液或水(WFI)中而变成1,500IU/mL(＝100％)之后，在4℃、25℃和37℃的储存条件下进行其稳定性测试。
表18
缓冲液1 5mM醋酸钠、1mM EDTA、0.01％Tween 80，pH 5.0
缓冲液2 5mM醋酸钠、1mM MgCl2、0.01％Tween 80，pH 5.0
测试结果显示在下表19中。
表19
酶活性比(％)
如上表19中可见，当与溶解在其他缓冲液(EDTA或MgCl2+Tween 80+pH 5.0)中的材料比较时，溶解在WFI中的材料显示含量快速下降，并且可从该结果得出结论，即EDTA或MgCl2+Tween 80+pH 5.0的组合物有助于透明质酸酶的稳定性(4℃)。
8-2：用于根据实施例2至5的纯化的浓缩物的稳定剂测试
将通过根据实施例2至5按顺序进行的每个步骤获得的每个浓缩物使用每个纯化步骤的平衡缓冲液稀释至1,500IU/mL(＝100％)，并且在4℃和37℃的储存条件下进行其稳定性测试。结果显示在下表20中。
表20：酶活性比(％)
如表20中可见，在观察期间透明质酸酶的含量没有降低。
8-3：在从根据实施例2至5纯化之后获得的浓缩物中通过透析去除 EDTA/MgCl 2 之后获得的样品的稳定性测试
为了在去除EDTA或MgCl2之后研究当它们用于纯化步骤时的稳定性作用，将根据实施例2至5纯化之后获得的每个浓缩物稀释至1,500IU/mL(＝100％)，使用下表21中阐释的去除了EDTA/MgCl2的缓冲液进行透析。其后，在4℃和37℃的储存条件下进行其稳定性测试，并且结果显示在下表22中。在4℃和37℃，含量降低。
表21
用于透析的缓冲液组合物
第二次纯化 10mM磷酸氢二钠、0.1％Tween 80，pH 5.0
第三次纯化 5mM磷酸氢二钾，pH 5.0
第四次纯化 20mM醋酸钠、0.1％Tween 80，pH 5.0
第五次纯化 10mM醋酸钠、0.01％Tween 80，pH 5.0
表22：酶活性比(％)
就高纯度透明质酸酶而言，在使用大鼠的过敏性休克反应和被动皮肤过敏反应试验中没有出现问题，所以确保了其稳定性。所以，高纯度透明质酸酶作为注射剂有价值，原因是其纯度大于目前市面上可获得的注射剂并且其具有卓越的稳定性。

Claims (25)

1.一种液体制剂，其包括透明质酸酶，所述透明质酸酶的纯度是95％或更高并且比活性是70,000IU/mg或更高。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂是可注射的制剂。
3.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂具有稳定性，以使得相对于透明质酸酶的初始酶活性100，透明质酸酶的活性在2至8℃的温度条件下保持为高达90％或更高。
4.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂进一步包括稳定剂，所述稳定剂含有：缓冲剂，以提供pH 4.0至6.0；0.001至0.5v/v％的非离子表面活性剂；和0.1至5mM的螯合剂或MgCl2。
5.根据权利要求4所述的液体制剂，其中所述螯合剂是EDTA。
6.根据权利要求4所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂是聚氧乙烯-山梨醇酐脂肪酸酯。
7.根据权利要求6所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和Triton X-100组成的组。
8.根据权利要求4所述的液体制剂，其中所述缓冲剂选自由琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、丙二酸盐缓冲液、2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)缓冲液、Tris缓冲液和甘氨酸缓冲液组成的组。
9.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述透明质酸酶源自绵羊、母牛、猪或人。
10.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述透明质酸酶是通过将哺乳动物的透明质酸酶基因转导至微生物、动物细胞或植物细胞中而产生的重组透明质酸酶。
11.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述透明质酸酶通过选自由亲和性色谱、离子交换色谱和凝胶过滤组成的组的一种或多种方法，从包含透明质酸酶的材料进行纯化。
12.根据权利要求11所述的液体制剂，其中所述亲和性色谱是使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱、或使用肝素琼脂糖的亲和性色谱。
13.根据权利要求12所述的液体制剂，其中所述透明质酸酶是通过依次进行使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、以及使用肝素琼脂糖的亲和性色谱而纯化。
14.根据权利要求13所述的液体制剂，其中所述透明质酸酶是通过依次进行使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、使用肝素琼脂糖的亲和性色谱、以及凝胶过滤而纯化。
15.一种用于透明质酸酶的稳定剂，其包括：缓冲剂，以提供pH 4.0至6.0；0.001至0.5v/v％的非离子表面活性剂；和0.1至5mM的螯合剂或MgCl2。
16.根据权利要求15所述的稳定剂，其中所述螯合剂是EDTA。
17.根据权利要求15所述的稳定剂，其中所述非离子表面活性剂是聚氧乙烯-山梨醇酐脂肪酸酯。
18.根据权利要求17所述的稳定剂，其中所述非离子表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和Triton X-100组成的组。
19.根据权利要求15所述的稳定剂，其中所述缓冲剂选自由琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、丙二酸盐缓冲液、MES(2-(N-吗啉基)乙烷磺酸)缓冲液、Tris缓冲液和甘氨酸缓冲液组成的组。
20.根据权利要求15所述的稳定剂，其中所述透明质酸酶是未纯化的酶或纯化的酶。
21.根据权利要求20所述的稳定剂，其中所述透明质酸酶通过选自由亲和性色谱、离子交换色谱和凝胶过滤组成的组的一种或多种方法，从包含透明质酸酶的材料进行纯化。
22.根据权利要求21所述的稳定剂，其中所述亲和性色谱是使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱、或使用肝素琼脂糖的亲和性色谱。
23.根据权利要求22所述的稳定剂，其中所述透明质酸酶是通过依次进行使用蓝色琼脂糖的亲和性色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、使用肝素琼脂糖的亲和性色谱、以及凝胶过滤而纯化。
24.根据权利要求15所述的稳定剂，其中所述透明质酸酶源自绵羊、母牛、猪或人。
25.根据权利要求15所述的稳定剂，其中所述透明质酸酶是通过将哺乳动物的透明质酸酶基因转导至微生物、动物细胞或植物细胞中而产生的重组透明质酸酶。
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