KR20140058721A - 고순도 히알루로니다아제의 정제방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명을 고순도의 히알루로니다아제를 얻기 위한 정제방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 장시간 동안 액상으로 안정하게 효소활성을 유지할 수 있는 고순도 히알루로니다아제를 얻는 정제방법에 관한 것이다.

Description

고순도 히알루로니다아제의 정제방법{PURIFICATION METHOD OF hyaluronidase}
본 발명을 고순도의 히알루로니다아제를 얻기 위한 정제방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 장시간 동안 액상으로 안정하게 효소활성을 유지할 수 있는 고순도 히알루로니다아제를 얻는 정제방법에 관한 것이다.
히알루론산을 저분자화하는 효소의 총칭인 히알루로니다아제는 Duran-Reynals에 의하여 처음에는 확산 인자로써 알려졌으나, 그 후 히알루론산(hyaluronic acid, HA)에 강력한 활성을 나타나는 것이 관찰되어 히알루로니다아제(hyaluronidase, HAase)라 불리게 되었다. 이 효소는 그 작용기전에 따라 고환, 리소좀 및 벌독에 분포하는 히알루로네이트 4-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.1.35), 거머리에 존재하는 히알루로네이트 3-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.1.36)와 세균에 존재하는 히알루로네이트 라이아제(EC 4.2.2.1)로 분류된다.
특히 고환에서의 히알루로니다아제(PH-20)는 정자의 첨체 부분의 글리코실포스파티딜이노시톨 고정부위(Glycosylphosphatidylinositol, GPI anchor)에 부착되어 있어서, 난자 외부의 두꺼운 외벽층을 분해하여 수정을 일으키는 중요한 효소이다. PH-20의 작용으로 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)과 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트에 존재하는 D-글루쿠로닉 산과 N-아세틸-D-글루코사민의 β(1-4) 결합을 가수 분해하는 것으로 알려져 있다. 이 효소들의 일반적인 분자식은 C2455H3775N617O704S21이며, 분자량(Mol. mass)은 53870.9 g/mol이다. 사람의 경우, HYAL1, HYAL2, HYAL3, 및 PH-20/SPAM1 등을 포함한 6개의 유전자가 이 효소와 연관되어 있다.
1950년대부터 히알루로니다아제의 광범위한 사용에 대하여 포괄적으로 검토되었는데, 최초의 사용은 수액제의 피하주입이었으며, 그 외의 정형외과, 안과, 성형외과, 치과, 구강외과, 부인과 및 이비인후과의 수술에서 국소 마취제 및 스테로이드의 확산을 증가시키기 위하여 침윤 및 차단 마취에 사용, 혈종과 같이 체액이 모인 것을 분산, 복막 유착의 방지, 결석 생성 방지 및 불임의 치료 등에 사용되고 있다.
현재 시판되고 있는 히알루로니다아제는 양(ovine)의 고환에서 추출한 후 동결건조하여 원료로 사용하고 있다. 이러한 가공되지 않은 히알루로니다아제를 적정농도로 녹여 바이알에 충전하여 동결건조하는 방법으로 제품화하고 있다. 제품화된 히알루로니다아제에는 이물 단백질이 과량 포함되어 있는 실정이다. 따라서, 종래의 방법으로 얻어진 히알루로니다아제는, 용액으로 하였을 경우의 안정성에도 문제가 있을 뿐 아니라, 시간에 따른 안정성의 저하로 생리활성이 감소하며 이로 인해 그 이용에는 실용적인 관점에서 보았을 때에 많은 문제를 남기고 있었다.
본 발명의 목적은 가공되지 않은 히알루로니다아제 제품에서 이물단백질을 제거하여 순도 95% 이상의 히알루로니다아제로 정제할 수 있는 고도정제 히알루로니다아제의 정제방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 용액으로 하였을 경우 안정성에도 문제가 없을 뿐 아니라, 시간에 따른 안정성의 저하가 거의 없어 액상제제를 제조할 수 있는 고순도 히알루로니다아제의 얻는 정제방법에 관한 것이다.
본 발명은 종래 안정성 및 불순물 등의 이유로 동결건조 제제의 문제점, 및 기존 원료를 액상으로 제조 시 시간에 따른 안정성의 저하로 생리활성이 감소하는 문제점을 해소하고자, 히알루로니다아제를 함유하는 액상 제제에 관한 것이다.
본 발명은 히알루로니다아제-함유 원료를, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 및 겔여과법으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 정제하는 단계를 포함하는, 고순도 히알루로니다아제를 얻는 정제방법에 관한 것으로서, 더욱 바람직하게는 순도 95% 이상이고 비활성도가 70,000 IU/mg 이상인 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 얻는 고순도 히알루로니다아제의 정제방법이다.
본 발명의 정제방법은 더욱 바람직하게는 순차적으로 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피, 양이온교환 크로마토그래피, 음이온교환 크로마토그래피 및 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 공정을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 정제방법으로 얻어진 히알루로니다아제는, 순도 95% 이상이고 비활성도가 70,000 IU/mg 이상인 고순도 및 고안정성을 갖는 히알루로니다아제일 수 있다. 더욱 구체적으로 상기 얻어진 히알루로니다아제는 2 내지 8℃ 온도조건에서 히알루로니다아제의 활성이 최초 효소활성 100% 기준 대비90% 이상 유지하는 안정성을 갖는 것이다.
본 발명에 따른 정제방법으로 얻어진 히알루로니다아제는 안정성과 순도가 높아 이를 액상제제로 제조할 수 있으며, 액상제제의 안정성을 더욱 높이고자 (a) pH 4.5 내지 6.0을 제공하는 약 1 내지 50 mM의 완충제, (b) 0.001 내지 0.5%의 비이온성 계면활성제 및 (c) 0.1 내지 5 mM 킬레이팅제 또는 알칼리금속 및 알칼리토금속의 염화물을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
또한, 본 발명은 히알루로니다아제를 함유하는 원료를 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 및 겔여과법으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 정제하여 순도 및 안정성이 향상된 히알루로니다아제를 얻은 방법에 관한 것이다.
상기 히알루로니다아제-함유 원료는 정제 되지 않은 원료, 또는 일부 정제된 히알루로니다아제-함유 원료일 수 있다.
상기 히알루로니다아제는 통상 포유류 동물 유래, 예를 들면 사람, 소, 양, 돼지 등의 고환에서 유래된 효소이거나, 포유류 유래 히알루로니다아제를 미생물 또는 동물세포 또는 식물세포에 도입하여 발현된 재조합 히알루로니다아제 일 수도 있다. 재조합 히알루로니다아제의 생산방법은 통상의 포유류 유전자의 재조합 방법에 따라 미생물 또는 동물세포 또는 식물세포에서 생산하는 방법과 동일하며, 예시적인 방법은 Frost et al., 1997, BBRC, 236, 10-15; Lin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10071-10075; Reitinger et al., 2008, Protein Expression and Purification, 57, 226-233; Kordowicz et al., European patent, WO2000/077221 등에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 히알루로니다아제는 통상 포유류 동물 유래, 예를 들면 사람, 소, 양, 돼지 등의 고환에서 유래된 효소일 수 있다. 통상 시판되는 히알루로니다아제는 포유류의 고환을 염석처리를 하여 동결건조하거나, 염석처리 후 발열물질을 제거하고 동결건조한 형태이다. 예를 들면, 포유류 고환에서 1회 염석처리 후 동결건조한 원료, 고환에서 2회 염석처리 후 동결건조한 원료, 고환에서 2회 염석처리하고 발열물질을 제거한 후 동결건조한 원료 등을 정제공정에 원료로 사용할 수 있다. 종래 히알루로니다아제는 양(ovine)의 고환에서 두 차례의 염석처리(salting out)를 진행 한 후 동결건조(lyophilization), 투석(dialysis), 발열물질제거(depyrogenation) 및 동결건조의 과정을 거쳐 추출이 되며, 추출된 것에는 히알루로니다아제 외에 다량의 단백이 혼합되어 있다.
시판되는 동결건조된 조원료(crude) 상태의 히알루로니다아제는 불순물을 다량 포함하여 순도가 낮고, 액상제제로 제조 시 안정성이 낮으며, 동결건조 제제는 사용 시 액상으로 제조하여야 하는 번거로움이 있으므로 히알루로니다아제의 액상제제, 바람직하게는 고순도의 히알루로니다아제를 포함하는 안정성이 우수한 액상제제가 절실히 필요한 실정이다.
본 발명에 따른 액상제제에 포함된 히알루로니다아제는 효소의 조원료를 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 및 겔여과법으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합된 방법으로 정제되어 순도 95% 이상이고 비활성도가 70,000 IU/mg 이상인 히알루로니다아제를 포함한다.
본 발명에 따라 정제된 히알루로니다아제의 활성 측정은 British Pharmacopoeia Monograph "Hyaluronidase for injection"의 Assay에 따라 시험한다. 본 명세서에서 히알루로니다아제의 안정성은 상기 British Pharmacopoeia Monograph "Hyaluronidase for injection"의 Assay에 따라 측정된 히알루로니다아제의 활성(함량 또는 비활성도)이 저장 전 초기 상태의 활성기준(=100%)으로 적어도 90%이상, 예를 들면 90% 내지 115% 일 때 안정함을 유지하는 것을 의미한다. 상기 안정성을 평가하기 위한 기준으로서 히알루로니다아제의 활성 측정조건은 British Pharmacopoeia Monograph "Hyaluronidase for injection"의 Assay 측정기준 온도 37℃,pH 6.4및 시간 20분이나, 본 명세서에서는 온도 36.5℃ 내지 37.5℃ 범위, pH 6.39 내지 6.41 범위 및 저장시간 20분 내외에서 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 정제공정을 수행하여 얻은 히알루로니다아제는 높은 생물학적 효소 활성을 갖는 단백질이 수득될 수 있도록 보장한다. 따라서, 본 발명은 히알루로니다아제의 생물학적 활성이 70,000 IU/mg 이상, 바람직하게는 90,000 IU/mg 이상으로 나타나는 비활성을 가진 고순도의 효소를 제공한다.
본 발명에 따른 히알루로니다아제를 포함하는 액상제제는 상기 Assay측정기준에 따라 안정성을 확보할 뿐만 아니라, 2 내지 8℃ 온도조건에서 0 내지 29주 보관 시 히알루로니다아제의 함량이 90% 이상 유지하여, 장기간 동안 안정하게 유지된다.
또한, 본 발명의 고도로 정제된 히알루로니다아제는 랫드를 이용한 항원성 시험으로서 아나필락시스 쇼크 반응 시험 및 수동 피부 아나필락시스 반응 시험을 수행하여 안전성(safety)이 확인된 것이다.
본 발명에 따른 정제법의 일예에서, 상기 히알루로니다아제는 순차적으로 원료를 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피, 양이온교환 크로마토그래피, 음이온교환 크로마토그래피 및 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제된 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 히알루로니다아제-함유 원료를 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피, 양이온교환 크로마토그래피, 음이온교환 크로마토그래피, 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 겔여과법을 수행하여 정제된 것일 수 있다.
상기 양이온교환 크로마토그래피는 바람직하게 Mono S 또는 SP 세파로스 및 CM 세파로스를 이용한 양이온교환 크로마토그래피 일 수 있으며, 상기 음이온교환 크로마토그래피는 DEAE 세파로스 또는 Q 세파로스를 이용한 음이온교환 크로마토그래피 일 수 있다.
상기 친화성 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 예를 들면 시료 탑재(loading), 평형화(Equilibration), 세척, 용출 및 재생 과정을 포함한다. 상기 크로마토그래피법의 각 공정에 사용 가능 한 용액으로는 평형화 용액(기본 용액)과 세척, 용출 및 재생 용액은 상기 평형화 용액에 성분을 추가하여 제조하여 사용한다. 각 공정에 사용 가능한 평형화 용액, 세척, 용출 및 재생 용액의 바람직한 예를 다음 표에 표시한다.
크로마토그래피에 적용가능한 용액
버퍼종류 바람직한 범위
블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 평형화버퍼 (글리신) 1 ~50 mM
세척버퍼(계면활성제) 0.1 ~ 0.5%
용출버퍼 (염화나트륨) 35 ~ 200 mM
버퍼 pH pH 8.0 ~ 11.0
양이온교환 크로마토그래피 평형화버퍼 (인산나트륨) 1 ~50 mM
평형화버퍼 (킬레이팅제) 0.1 ~ 5 mM
평형화버퍼 (계면활성제) 0.001 ~ 0.5%
용출버퍼 (염화나트륨) 35 ~ 200 mM
버퍼 pH pH 5.5 ~ 6.5
음이온교환 크로마토그래피 평형화버퍼 (인산칼륨) 1 ~50 mM
평형화버퍼 (염화나트륨) 50 ~ 100 mM
버퍼 pH pH 6.5 ~ 7.5
헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 평형화버퍼 (초산나트륨) 1 ~50 mM
평형화버퍼 (킬레이팅제) 0.1 ~ 5 mM
평형화버퍼 (계면활성제) 0.001 ~ 0.5%
용출버퍼 (염화나트륨) 200 ~ 700 mM
버퍼 pH pH 4.0 ~ 5.5
본 발명에 따른 정제방법은 바람직하게는 크로마토그래피를 수행한 후에 겔여과법을 수행할 수 있으며, 겔여과법의 예로는 세파크릴 수지, 수퍼덱스 및 수퍼로스를 이용한 겔여과법 일 수 있다. 본 발명의 일예에서, 겔여과법은 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 예를 들면 초산 나트륨 1 내지 50 mM, 알칼리금속 및 알칼리토금속 0.1 내지 5 mM, 비이온성 계면활성제 0.001 ~ 0.5% 및 pH 4.5 내지 5.5인 평형화 용액으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일예에 따라, 상기 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피는 완충액으로 평형화, 세척, 용출, 재생 완충액이 사용될 수 있다. 평형화 완충액으로 글리신(Glycine)이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 50 mM의 글리신이 평형화 완충액으로 사용될 수 있으며, 바람직한 pH는 8.0 내지 11.0이다. 세척 용액으로는 이온성 계면활성제(Ionic detergent)가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 0.5%의 계면활성제가 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.3%의 계면활성제가 사용될 수 있다. 용출 완충액으로는 염화나트륨이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 35 내지 200 mM의 염화나트륨이 사용될 수 있다.
본 발명의 일예에 따라, 상기 양이온교환 크로마토그래피에서는 완충액이 사용될 수 있으며, 완충액으로 평형화, 용출, 재생 완충액이 사용될 수 있다. 평형화 완충액으로 인산나트륨, 킬레이팅제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 평형화 완충액이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 50 mM 인산나트륨, 0.1 내지 5 mM 킬레이팅제, 0.001 내지 0.5% 비이온성 계면활성제가 포함할 수 있으며, 바람직한 pH는 5.5 내지 6.5이다. 용출 완충액으로는 염화나트륨이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 35 내지 200 mM 염화나트륨이 사용될 수 있다.
본 발명의 일예에 따라, 상기 음이온교환 크로마토그래피에서, 완충액으로 평형화, 탑재 후 평형화, 재생 완충액이 사용될 수 있다. 평형화 완충액으로 인산칼륨이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 50 mM의 인산칼륨이 사용될 수 있으며, 바람직한 pH는 6.5 내지 7.5이다. 탑재 후 평형화 완충액으로 염화나트륨이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 100mM 염화나트륨이 사용될 수 있다.
본 발명의 일예에 따라, 상기 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피에서, 완충액으로 평형화, 세척, 용출, 재생 완충액이 사용될 수 있다. 평형화 완충액으로 초산나트륨, 킬레이팅제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 평형화 완충액이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 50 mM 초산나트륨, 0.1 내지 5 mM 킬레이팅제, 0.001 내지 0.5% 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있으며, 바람직한 pH는 4.0 내지 5.5이다. 용출 완충액으로는 염화나트륨이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 200 내지 700 mM 염화나트륨이 사용될 수 있다.
본 발명의 일예에 따라, 상기 겔여과법에서는 완충액으로는 평형화 완충액이 사용될 수 있다. 평형화 완충액으로 초산나트륨, MgCl2 및 트윈80을 포함하는 평형화 완충액이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 50 mM 초산나트륨, 0.1 내지 5 mM MgCl2, 0.001 내지 0.5%의 트윈80이 사용될 수 있으며, 바람직한 pH는 4.5 내지 5.5이다. 상기 액상제제는 임의의 형태의 수용액 및 임의의 종류의 현탁액을 의미하며, 피하투여 경로로 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 일예에서, 히알루로니다아제의 정제방법은 포유류의 고환에서 추출한 후 동결건조된 히알루로니다아제 원료를 마련하는 단계; 상기 원료를 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 1차 정제하는 단계; 상기 1차 정제 후 양이온교환 크로마토그래피를 이용하여 2차 정제하는 단계; 상기 2차 정제 후 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 3차 정제하는 단계; 상기 3차 정제 후 친화성 크로마토그래피를 이용하여 4차 정제하는 단계; 및 상기 4차 정제 후 겔여과법으로 5차 정제하는 단계를 포함하는 히알루로니다아제의 정제 방법에 관한 것이다.
각각의 정제 후에 얻어진 원액의 효소의 비활성도의 범위는 다음 표 2에 나타낸다.
정제 공정 원료 1차
정제		 2차
정제		 3차
정제		 4차
정제		 5차
정제
비활성도(IU/mg) 300 ~ 1830 7,000 ~ 25,000 20,000 ~ 55,000 25,000 ~ 75,000 50,000 ~ 110,000 70,000 ~
본 발명에 따라 얻어진 히알루로니다아제는 비경구 투여경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면 주사제로서 비경구로 투여될 수 있다.
본 발명에 따라 얻어진 히알루로니다아제는 동결건조제제로 제조될 수 있으나 투여의 편의성을 고려하면 액상제제로 제조되는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명은 종래 안정성 및 불순물 등의 이유로 동결건조 제제의 문제점 및 기존원료를 액상제제로 제조 시 시간에 따른 안정성의 저하로 생리활성이 감소하는 문제점을 해소한 히알루로니다아제를 함유하는 액상 제제를 제공할 수 있다.
상기 액상제제에는 히알루로니다아제 외에 부형제로 염화나트륨 및 유당 등이 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 아니하고 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 다른 구현예는 히알루로니다아제를 함유하는 액상제제는 추가로 안정화제를 더욱 포함할 수 있으며, 더욱 자세하게는 상기 안정화제는pH 4.5 내지 6.0을 제공하는 약 1 내지 50 mM의 완충제, 0.001 내지 0.5%의 비이온성 계면활성제 및 0.1 내지 5 mM 킬레이팅제 또는 알칼리금속 및 알칼리토금속의 염화물을 포함하는 안정화제일 수 있다.
본 발명에 따른 액상제제의 안정화는 pH 조건이 주요한 인자 중 하나이며, 이는 사용되는 완충제와 무관하게, pH는 약 4.0 내지 약 7,0 바람직하게는 약 4.5 내지 약 6.0를 포함하는 값, 예를 들면 4.5, 4.7, 5.0, 5.5, 5.7, 및 6.0로 이루어지는 군으로부터 선택된 값에서 조절된다. 상기 pH는 당해 분야에 공지된 산 또는 염기를 사용한 조정에 의해, 또는 완충제 성분들의 적절한 혼합물 사용에 의해, 또는 둘 다에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 적합한 약학적으로 허용되는 완충액은 숙시네이트 완충액, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액, 말론산염 완충액, MES(2-(N-Morpholino)ethanesulphonic acid) 완충액, 트리스 완충액 및 글리신 완충액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 조합한 완충제를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 완충제의 바람직한 농도는 사용대상 용액의 목적하는 pH 조건과 사용하는 완충제 종류를 고려하여 적절히 설정할 수 있으며, 예를 들면 1 내지 50 mM, 바람직하게는 10 내지 30 mM이다.
상기 안정화제의 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(트윈, Tween)일 수 있다. 예를 들면, 폴리솔베이트20(트윈20), 폴리솔베이트80(트윈80) 및 Triton X-100 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 킬레이팅제는 단일 금속 이온에 대하여 배위 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 전자 공여 원자를 포함하는 분자를 의미하는 것으로, 바람직하게는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)일 수 있다. 상기 킬레이팅제의 농도로는 0.1 mM 내지 5 mM 농도, 바람직하게는 0.5 mM 내지 1 mM일 수 있다.
상기 알칼리금속 및 알칼리토금속염화물로는 MgCl2일 수 있다. 상기 MgCl2는 0.1 mM 내지 5 mM 농도, 바람직하게는 0.5 mM내지 5 mM일 수 있다.
상기 안정화제의 구현예로는 MgCl2, 비이온성 계면활성제, pH 4.0 내지 6.0을 제공하는 완충제를 포함하거나 EDTA, 비이온성 계면활성제, pH 4.0 내지 6.0을 제공하는 완충제를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적 일예에 따른 액상제제는 2 내지 8℃ 온도조건에서 29주까지 보관하여도 히알루로니다아제의 함량이 90% 이상 유지하여, 장시간 동안 안정하게 활성을 유지할 수 있는 장점이 있어 시간에 따른 안정성의 저하로 생리활성이 감소하는 종래의 문제점을 해결할 수 있다.
본 발명에 따른 고도정제 히알루로니다아제의 고도정제방법에 의하면, 기존 제품화된 히알루로니다아제의 순도를 높일 수 있으며, 본 발명에 따른 고도정제 히알루로니다아제를 함유하는 액상제제는 기존 제품화된 히알루로니다아제가 가지고 있던 문제점인 이물단백질을 제거함으로써 안전성을 확보할 수 있다. 또한 상기 정제된 히알루로니다아제에 안정화제를 추가로 포함하는 액상제제는 장시간 동안 안정하게 활성을 유지할 수 있고 투여방법이 간단한 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피의 정제 차트를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따라 모노 S를 이용한 양이온교환 크로마토그래피의 정제 차트를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에 따라 DEAE 세파로스를 이용한 음이온교환 크로마토그래피의 정제 차트를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에 따라 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피의 정제 차트를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 5에 따라 1차 염석처리 원료의 5차 정제 후의 GPC(gel permeation chromatography) 분석을 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 실시예 5에 따라 2차 염석처리 원료의 5차 정제 후의 GPC(gel permeation chromatography) 분석을 나타낸 것이다.
도7는 본 발명의 실시예 5에 따라 Hdase원료의 5차 정제 후의 GPC(gel permeation chromatography) 분석을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일예에 따라 히알루로니다아제 정제 방법에 대한 제조 공정도로 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피(1차 정제법)
본 실험에서 히알루로니다아제 정제에 사용한 원료는 하기 표3에 나타난 바와 같이, 1) 상기 종래의 과정 중 고환에서 첫 번째 염석처리 후 동결건조한 원료(1차 염석처리 원료), 2) 두 번째 염석처리 후 동결건조한 원료(2차 염석처리 원료), 3) 발열물질을 제거한 후 동결건조한 원료(원료명: Hyaluronidase(이하 Hdase), Shanghai Liamim社)이며, 이후 5단계의 정제 과정에 투입하였다.
1차 염석처리 원료 2차 염석처리
원료		 Hdase
함량 (IU/mg) 약 100 ~ 140 약 360 ~ 400 약 800 ~ 1100
비활성도(IU/ 단백질mg) 약 330 ~ 470 약 1,200 ~ 1,330 약 1,330 ~ 1,830
크로마토그래피 공정은 시료 탑재(loading), 평형화(Equilibration), 세척, 용출 및 재생 과정으로 이루어진다. 1차 정제는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하였고, 사용한 완충액은 하기 표 4와 같다.
구분 기본성분 추가성분
평형화 완충액
(base buffer)		 10 mM Glycine, pH 10.0 -
세척 완충액 0.3% Sodium caprylate
용출 완충액 135 mM NaCl
재생 완충액 1 M NaCl
히알루로니다아제를 1차 정제하기 위해, 레진(resin)으로서 블루 세파로스 6 Fast Flow(Blue sepharose 6 Fast Flow)를 사용하였고, 칼럼으로서 내경 1.6 cm에 레진을 높이 10 cm가 되게 충진하여 사용하였다. 히알루로니다아제 원료 1 g을 평형화 완충액 500 mL(10 mM Glycine, pH 10.0)에 용해(2 mg/mL)하고 여과한 후의 필터여액을 분석시료로 사용하였다.
상기 히알루로니다아제 시료를 칼럼에 탑재하였으며 이때 로딩 유속은 2.0 mL/min으로 적용하였다. 그런 후에, 평형화 완충액으로 상기 칼럼을 평형화시키고, 세척 완충액(0.3% Sodium caprylate in base buffer)으로 세척하였다. 평형화 이후 단계는3.0 mL/min의 유속으로 분석하였다. 상기 세척 후에 평형화 완충액으로 레진을 다시 평형화시키고, 용출 완충액(135 mM salt in base buffer)으로 용출하여 흘러나오는 용액을 수집하였다. 염기성 조건에서 히알루로니다아제의 활성을 잃기 쉬우므로 수집한 용액에 pH 조절제를 첨가하여 pH 6.0 내지 7.0으로 조절하고, 용출이 완료되면 재생 완충액(1 M salt in base buffer)으로 칼럼을 재생시켰다. 분석 결과는 도 1에 도시된 바와 같다. 정제 후 얻어지는 수율 및 비활성도는 하기 표 8에 나타내었다.
< 실시예 2> 모노 S를 이용한 양이온교환 크로마토그래피(2차 정제법)
2차 정제로는 양이온교환 크로마토그래피를 이용하였고, 하기 표 5의 완충액을 사용하여 시료 탑재, 평형화, 세척, 용출 및 재생 과정을 수행하였다.
구분 기본성분 추가성분
평형화 완충액
(base buffer)		 10 mM Sodium phosphate dibasic,
1 mM EDTA, 0.1% Tween80, pH 6.0		 -
세척 완충액 80 mM NaCl
용출 완충액 125 mM NaCl
재생 완충액 1 M NaCl
히알루로니다아제를 2차 정제하기 위해, 레진(resin)으로서 모노 S(Mono S)를 사용하였고, 칼럼으로서 내경 1.6 cm에 레진을 높이 10 cm가 되게 충진하여 사용하였다. 실시예 1에서 1차 정제한 시료를 평형화 완충액(10 mM Sodium phosphate dibasic, 1 mM EDTA, 0.1% Tween 80, pH 6.0)으로 3배 희석하여 분석시료로 사용하였다.
상기 히알루로니다아제 시료를 칼럼에 탑재하였으며 이때 로딩 유속은 2.0 mL/min으로 적용하였다. 그런 후에, 평형화 완충액으로 상기 칼럼을 평형화시키고, 평형화 이후 단계는3.0 mL/min의 유속으로 분석하였다. 상기 평형화 후에, 세척 완충액(80 mM salt in base buffer)으로 세척하였다. 레진을 세척한 후 용출 완충액(125 mM salt in base buffer)으로 용출하여 흘러나오는 용액을 수집하였다. 용출이 완료되면 재생완충액(1 M salt in base buffer)으로 칼럼을 재생시켰다. 분석 결과는 도 2에 도시된 바와 같다. 정제 후 얻어지는 수율 및 비활성도는 하기 표 8에 나타내었다.
< 실시예 3> DEAE 세파로스를 이용한 음이온교환 크로마토그래피(3차 정제법)
3차 정제로는 음이온교환 크로마토그래피를 이용하였고, 하기 표 6의 완충액을 사용하여 시료 탑재, 평형화 및 재생 과정을 수행하였다.
구분 기본성분 추가성분
평형화 완충액
(base buffer)		 5 mM Potassium phosphate dibasic, pH 7.1 -
탑재 후
평형화 완충액		 75 mM NaCl
재생 완충액 1 M NaCl
히알루로니다아제를 3차 정제하기 위해, 레진(resin)으로서 DEAE 세파로스를(DEAE sepharose) 사용하였고, 칼럼으로서 내경 1.6 cm에 레진을 높이 5 cm가 되게 충진하여 사용하였다. 실시예 2에서 2차 정제한 시료를 평형화 완충액(5 mM Potassium phosphate dibasic, pH 7.1)으로 1.67배 희석하여 분석시료로 사용하였다.
상기 히알루로니다아제 시료를 칼럼에 탑재하였으며 이때 로딩 유속은 2.0 mL/min으로 적용하였다. 그런 후에, 탑재 후 평형화 완충액(75 mM salt in base buffer)으로 상기 칼럼을 평형화시키고, 평형화 이후 단계는3.0 mL/min의 유속으로 분석하였다. 상기 평형화 후에 별도의 용출단계 없이 재생 완충액(1 M salt in base buffer)으로 재생하였다. 3차 정제에서는 별도 용출 단계 없이 로딩 중에 수지에 결합되지 않고 흘러나오는 용액(flow through(F/T)용액)을 정제된 히알루로니다아제 용출액으로 간주하였다. 분석 결과는 도 3에 도시된 바와 같다. 정제 후 얻어지는 수율 및 비활성도는 하기 표 8에 나타내었다.
< 실시예 4> 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피(4차 정제법)
4차 정제로는 친화성 크로마토그래피를 이용하였고, 하기 표 7의 완충액을 사용하여 시료 탑재, 평형화, 세척, 용출 및 재생 과정을 수행하였다.
구분 기본성분 추가성분
평형화 완충액
(base buffer)		 20 mM Sodium acetate,
1 mM EDTA, 0.1% Tween80,
pH 4.5		 -
세척 완충액 200 mM NaCl
용출 완충액 500 mM NaCl
재생 완충액 1 M NaCl
상기 3차 음이온교환 크로마토그래피로 정제된 히알루로니다아제를 4차 정제하기 위해, 레진(resin)으로서 헤파린 세파로스 6 fast flow(Heparin sepharose 6 fast flow)를 사용하였고, 칼럼으로서 내경 1.0 cm에 레진을 높이 10 cm가 되게 충진하여 사용하였다. 실시예 3에서 3차 정제한 시료에 10x conc.평형화 완충액(200 mM Sodium acetate, 10 mM EDTA, 1.0% Tween80, pH 4.5)를 3차 정제한 시료 부피의 1/9만큼 첨가하여 분석시료로 사용하였다.
상기 히알루로니다아제 시료를 칼럼에 탑재하였으며, 이때 로딩 유속은0.5 mL/min으로 적용하였다. 그런 후에, 평형화 완충액(20 mM Sodium acetate, 1 mM EDTA, 0.1% Tween 80, pH 4.5)으로 상기 칼럼을 평형화시키고, 세척 완충액(200 mM salt in base buffer)으로 세척하였다. 평형화 이후 단계는1.0 mL/min의 유속으로 분석하였다. 상기 세척 후에 용출 완충액(500 mM salt in base buffer)으로 용출하여 흘러나오는 용액을 수집하였다. 용출이 완료되면 재생 완충액(1 M salt in base buffer)으로 칼럼을 재생시켰다. 본 실험에 의한 정제차트를 도 4에 나타냈다. 정제 후 얻어지는 수율 및 비활성도는 하기 표 8에 나타내었다.
< 실시예 5> 세파크릴 수지를 이용한 겔여과법 (5차 정제법)
5차 정제로는 겔여과법을 이용하였고, 사용한 평형화 용액은 10 mM Sodium acetate, 1 mM MgCl2, 0.01% Tween 80, pH 5.0을 포함하는 용액이다.
상기 4차 정제된 히알루로니다아제를 겔여과법으로 5차 정제하기 위해, 레진으로서 세파크릴 S-200(Sephacryl S-200)을 사용하였고, 칼럼으로서 내경 1.6 cm에 레진을 높이 90 cm가 되게 충진하여 사용하였다. 실시예 4에서 4차 정제한 시료 용액을 수지부피의 1% 정도로 농축하여 분석시료로 사용하였다.
상기 히알루로니다아제 시료를 칼럼에 탑재하였으며 이때 로딩 유속은 0.1 mL/min으로 적용하였다. 그런 후에, 평형화 완충액(10 mM Sodium acetate, 1 mM MgCl2, 0.01% Tween80, pH 5.0)을 흘려주면서 분급처리를 수행하였다. 0.1 mL/min의 유속으로 분석하였고, 용출하여 흘러나오는 용액을 수집하였다. 정제 후 얻어지는 수율 및 비활성도는 하기 표 8에 나타내었다.
상기 세 가지 다른 히알루로니다아제 시료에 대한 5차 정제 후의 순도 시험결과를 도 5 내지 7 및 표 8에 나타내었다. 하기 표 8에서 단백 수율은 히알루로니다아제를 포함하는 모든 단백질의 정제수율이다. 도 5 내지 7에 나타낸 바와 같이, 5차 정제 후 GPC 자료에 의하면 하알루로니다아제 이외 다른 이량체 또는 중합체는 크로마토그램에 나타나지 않았으며, 비활성도(specific activity, IU/mg of protein)는 90,000 IU/mg of protein 이상이고, 순도(GPC)는 95% 이상이었다.
정제 공정 원료 1차
정제		 2차
정제		 3차
정제		 4차
정제		 5차
정제
1차 염석처리 원료 히알루로니다제 함량 수율(%) 100.0 87.8 78.7 73.9 72.3 33.8
단백 수율(%) 100.0 5.2 1.3 1.3 0.7 0.2
비활성도(IU/mg) 408 7,649 25,965 25,615 54,612 93,664
2차 염석처리 원료 히알루로니다제 함량 수율(%) 100.0 89.5 72.5 64.3 60.5 30.8
단백 수율(%) 100.0 6.0 1.7 1.4 0.9 0.3
비활성도(IU/mg) 1,174 15,083 53,741 55,866 72,258 115,266
Hdase 히알루로니다제 함량 수율(%) 100.0 82.2 70.7 70.5 63.5 25.4
단백 수율(%) 100.0 5.0 1.3 1.2 0.9 0.4
비활성도(IU/mg) 1,362 21,189 51,679 70,581 105,774 111,494
도 5 내지 7 및 표 8에 나타난 바와 같이, 출발물질이 서로 다른 원료(1차 염석처리 원료, 2차 염석처리 원료, Hdase)를 상기 5단계의 정제방법으로 진행하여도 5차 정제완료 후 얻어진 최종 원액의 비활성도는 90,000 IU/mg of protein이상이며, 순도는 95% 이상의 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 이는 어떠한 단계의 히알루로니다아제 원료를 사용하여도 상기 5단계의 정제방법으로 상기 결과를 얻을 수 있음을 의미하며, 최종 원액에는 히알루로니다아제 외에 이량체 또는 다량체가 거의 없음을 의미한다.
< 실시예 6> 안정성 시험 ( 안정화제 미 첨가)
6-1: 1차 정제 후 용출 원액의 안정성 시험
상기 실시예 1에 따라, 1차 염석처리 원료, 2차 염석처리 원료 및 Hdase에 대한 친화성 크로마토그래피로 1차 정제한 후에 얻어진 각각의 용출원액을 pH 6.0 내지 7.0으로 조정한 후, 일정량으로 분주하여 4℃ 보관하고 각 시점에서 히알루로니다아제의 함량을 확인하여 그 결과를 하기 표 9에 나타냈다.
각 시점에서 히알루로니다아제의 효소활성(또는 함량)은 British Pharmacopoeia Monograph "Hyaluronidase for injection"의 Assay에 따라 시험한다. 본 명세서에서 히알루로니다아제의 안정성은 상기 British Pharmacopoeia Monograph "Hyaluronidase for injection"의 Assay에 따라 측정된 히알루로니다아제의 활성(함량 또는 비활성도)이다.
각 시험조건에서 효소활성(또는 함량)은 표 8에 기재된 0주차의 비활성도 또는 활성도를 100으로 기준으로 해서, 각 시점에서 측정된 비활성도 또는 활성도를 대비하여 표시한 퍼센트 수치이며, 이를 하기 표 9에 나타냈다.
Figure pat00001
경과시간 1차 염석처리 원료
효소 활성비(%)		 2차 염석처리 원료
효소 활성비 (%)		 Hdase
효소 활성비 (%)
0주 100.0 100.0 100.0
10주 100.9 101.9 112.1
12주 98.2 99.6 103.1
13주 100.2 98.8 100.7
16주 99.8 102.1 103.9
20주 100.4 100.4 113.0
29주 100.1 99.8 109.4
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 비활성도가 다른 세가지 원료를 1차 정제한 후 얻어진 용출 원액에 대해 4℃에서의 함량 안정성 확인한 결과, 세 가지 원료 모두 29주까지 함량의 감소가 거의 없음을 확인하였다. 1차 정제 후 얻은 용출액에는 다른 안정화제 없이 pH만 6.0 내지 7.0으로 낮춘 상태이다. 또한 상기 표 9에서 함량이 100%가 넘는 수치는 표준품과 비교하는 효소 활성 측정 방법과 같은 생리활성 측정방법은 생물학적 제제(vaccine, recombinant protein(cytokine, monoclonal antibody 등), toxoid, 등)의 역가 시험과 같이 시험 결과의 변화폭이 커서 발행하는 측정상 오차로 생각된다.
6-2: 1차 정제 후 용출 원액을 희석하여 얻은 저농도 용액의 안정성 시험
Hdase원료를 실시예 1에 따라 1차 정제 후 얻은 용출 원액을 약 1,500 IU/mL(=100%)이 되도록 희석하여 분주하고, 4℃에서 보관하여 하기 표 10과 같이 각 시점에서 함량을 확인하였다. 1,500 IU/mL의 농도는 히알루로니다아제를 원료로 한 제품의 농도와 같다.
각 시험의 함량은 0주차 효소활성을 100%로 정하여 그 기준에 대비하여 표시한 각 보관시간의 특정 시점의 효소활성을 퍼센트로 표시하여 하기 표 10에 나타냈다. 효소 비활성도는 하기 수학식에 따라 계산되었다.
Figure pat00002
보관기간 효소 활성비(%) 효소 비활성도 (IU/mg)
0주 100.0 21,103
10주 112.0 20,568
12주 102.8 21,033
13주 99.6 20,968
16주 103.2 20,869
20주 112.1 21,153
29주 108.7 21,532
상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 1차 정제 후 얻은 용출원액에 대해 1,500 IU/mL의 농도에서도 29주간 함량의 감소가 없음을 확인하였다.
따라서, 원료의 함량에 상관없이 세 가지 원료의 1차 정제 후 원액은 4?에서 29주간 안정함을 확인하였고, 저농도(1500 IU/mL)에서도 4℃에서 29주간 안정함을 확인하였다.
6-3: 2차 정제법 및 4차 정제법으로 한 단계 정제 후 얻은 용출 원액의 안정성 시험
Hdase 원료에서의 각각 2차 정제법 및 4차 정제법의 한 단계 정제법만 수행한 후에 각 원액에 대한 안정성을 시험하였다. 2차 정제법 및 4차 정제법은 각각 실질적으로 실시예 2 및 실시예 4에 따라 수행하였으며, Hdase 는 실시예 1에서 기재한 1차 정제 전의 시료이다. 얻어진 용출원액의 보관온도를 각각 4℃, 25℃, 37℃로 설정하고 각 시점에서 히알루로니다아제의 함량을 측정하여 하기 표 11과 같이 각 시점에서 효소 함량(효소활성비)을 확인하였다.
효소 활성비(%. 함량)
구분 0일 6일 20일
2차 정제법 함량(%) 4℃ 100.0 103.4 105.8
25℃ 100.0 98.2 99.3
37℃ 100.0 101.9 102.2
4차 정제법 함량(%) 4℃ 100.0 104.1 91
25℃ 100.0 91.0 85.4
37℃ 100.0 95.3 81.5
또한, 장기간 보관한 경우의 히알루로니다아제의 함량변화를 추가적으로 시험하고자, 상기 2차 정제법을 수행하여 얻은 원액을 4℃에서 29주간 보관하고 각 시점에서 히알루로니다아제의 함량을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타냈다.
일자 효소 활성비 (%) 효소비활성도 (IU/mg)
0주 100.0 12,647
10주 100.1 12,423
12주 103.6 12,856
13주 97.7 12,498
16주 98.3 12,563
20주 103.0 12,893
29주 98.8 12,143
상기 표 11 및 표 12에 나타난 바와 같이, 1차 정제한 후의 원액 외에도 2차 정제법으로 한 단계 정제한 원액에서도 4℃에서 29주간 안정함을 확인하였다.
< 실시예 7> 안정화제 조건 실험
안정화제 조건 시험에 사용한 원액은 Hdase 원료에 대해 실시예 5의 5차 정제 후 산물인 95% 이상의 순도를 갖는 히알루로니다아제를 1,500 IU/mL(=100%)의 농도로 맞추어 각각의 표에 기재된 조건에 따라 용액을 제조하였다.
7-1 : 안정화 성분 확인
95% 이상의 순도를 갖는 히알루로니다아제를 1,500 IU/mL(=100%)의 농도로 맞추어 하기 표 13에 기재된 조건에 따라 용액을 제조하고, 이를 4℃에서 보관하여 각 시점의 히알루로니다아제 함량을 확인하였고, 하기 표 13와 같이 함량 감소를 보여주었다.
번호　 EDTA MgCl2 금속염 Tween 80 pH 효소활성비
0주 1주
1 -　 -　 -　 -　 5.0 100 60.4
2 -　 -　 -　 -　 7.0 100 53.0
3 1mM -　 -　 -　 5.0 100 47.6
4 -　 1mM -　 -　 5.0 100 52.1
5 -　 -　 -　 0.10% 5.0 100 65.5
6 -　 -　 -　 0.01% 5.0 100 54.7
7 -　 -　 NaCl (150 mM) 0.01% 5.0 100 71.7
8 -　 -　 CaCl2 (1 mM) 0.01% 5.0 100 66.6
9 -　 -　 MnCl2 (1 mM) 0.01% 5.0 100 74.1
* 기본 완충액 : 10 Mm Sodium acetate
동일한 히알루로니다아제를 1,500 IU/mL(=100%)로 맞추어 아래 표 14의 조건에 따라 용액을 조제하고 이를 4℃에 보관하여 각 시점에서 히알루로니다아제 함량을 확인하였고 표 15의 결과를 얻었다.
구분 EDTA/MgCl2 계면활성제 pH
조건 1 1 mM EDTA 0.01% Tween80 pH 4.5
조건 2 1 mM EDTA 0.01% Tween80 pH 5.0
조건 3 1 mM EDTA 0.01% Tween80 pH 6.0
조건 4 1 mM MgCl2 0.01% Tween80 pH 4.5
조건 5 1 mM MgCl2 0.01% Tween80 pH 5.0
조건 6 1 mM MgCl2 0.01% Tween80 pH 6.0
효소 활성비(%)
조건 0 주 (%) 3주(%) 4주(%) 14주(%) 23주(%)
조건 1 100 103.8 102.9 103.9 104.6
조건 2 100 103.9 96.9 98.8 99.8
조건 3 100 103 102.1 103.6 104.2
조건 4 100 100.5 99.8 101.5 101.2
조건 5 100 99.1 98.9 105.2 106
조건 6 100 101.3 101.8 103.6 102.3
상기 결과로부터 히알루로니다아제의 안정화 성분으로는 EDTA 또는 MgCl2 + Tween80 + pH 4.5 내지 6.0의 조합된 조건임을 확인하였다.
7-2: 안정화제 농도 조건 시험
안정성 시험에 사용된 히알루로니다아제는 95% 이상 정제된 것이며, 실험 농도는 1,500 IU/mL(=100%) 되도록 하였고 하기 표 16 조건으로 조제하여 안정성 시험을 진행하였다. EDTA, MgCl2, Tween80의 농도를 2배 및 10배 희석하여 4℃, 25℃ 보관조건에서 안정성 시험을 진행하였다.
구분 EDTA/MgCl2 Tween80 pH 보관온도
조건 1 0.5 mM EDTA 0.005% 5.0 4℃
조건 2 0.1 mM EDTA 0.001% 5.0 4℃
조건 3 0.5 mM MgCl2 0.005% 5.0 4℃
조건 4 0.1 mM MgCl2 0.001% 5.0 4℃
조건 5 0.5 mM EDTA 0.005% 5.0 25℃
조건 6 0.1 mM EDTA 0.001% 5.0 25℃
조건 7 0.5 mM MgCl2 0.005% 5.0 25℃
조건 8 0.1 mM MgCl2 0.001% 5.0 25℃
실험결과를 하기 표 17에 나타냈다
효소 활성비(%)
함량 (%) 0 주 3주 6주 10주 15주 20주 26주
조건 1 100.0 99.3 99.5 99.6 97.7 98.9 98.6
조건 2 100.0 100.4 99.6 97.3 76.3 67.8 61.8
조건 3 100.0 100.5 100.4 100.7 96.0 100.4 100.7
조건 4 100.0 99.1 102.4 102.8 72.0 75.6 71.1
조건 5 100.0 98.7 90.8 83.8 70.3 59.9 57.1
조건 6 100.0 93.3 75.1 62.2 57.9 50.9 51.8
조건 7 100.0 98.5 113.0 93.9 68.5 67.2 60.5
조건 8 100.0 96.8 77.6 66.6 57.7 71.0 56.1
상기 표에서 나타낸 바와 같이, 조건 1및 조건 3에서 약 26주간 히알루로니다아제의 안정성을 확인하였고, 그 외의 조건에서는 감소하는 경향을 보였다.
< 실시예 8>
8-1: 안정화제의 Hdase 시료에 대한 시험
실시예 1에 기재된, 1차 정제도 수행되지 않은 미정제Hdase 시료에 대해, EDTA 또는MgCl2 + Tween80 + pH 5.0에 대한 안정성을 실험하였다. 기존 히알루로니다아제 제품에 사용되는 원료(Hyaluronidase, 함량 약 800 ~ 1100 IU/mg)를 하기 표 18의 각각의 완충액 또는 주사용수 (Water For Injection, WFI)에 1,500 IU/mL(=100%)이 되도록 녹인 후 4℃, 25℃, 37℃ 보관조건에서 안정성 시험을 진행하였다.
완충액 1 5 mM Sodium acetate, 1 mM EDTA, 0.01% Tween80, pH 5.0
완충액 2 5 mM Sodium acetate, 1 mM MgCl2, 0.01% Tween80, pH 5.0
실험결과는 하기의 표 19에 나타내었다.
효소 활성비(%)
함량 (%) 보관온도 0일 2일 6일 20일 37일 60일
완충액 1 4℃ 100.0 99.3 94.4 98.4 99.9 100.8
25℃ 100.0 102.3 106.9 87.6 88.5 90.1
37℃ 100.0 88.2 47.9 6.1 1.1 -
완충액 2 4℃ 100.0 98.8 105.0 103.9 109.1 103.2
25℃ 100.0 106.1 99.5 97.4 94.5 100.3
37℃ 100.0 90.4 74.0 32.9 16.9 2.2
WFI 4℃ 100.0 90.3 78.6 50.6 37.6 21.8
25℃ 100.0 90.3 68.6 41.6 20.3 4.3
37℃ 100.0 45.7 25.9 3.9 0.9 -
상기 표 19에 나타난 바와 같이, WFI에 용해된 원료가 다른 완충액 (EDTA 또는 MgCl2 + Tween80 + pH 5.0)에 용해된 원료보다 함량이 급격히 감소하는 것을 확인하였고, 이는 EDTA 또는 MgCl2 + Tween80 + pH 5.0조성이 히알루로니다아제 안정성에 기여함을 확인할 수 있었다(4℃).
8-2: 안정화제의 실시예 2 내지 5에 따른 정제 원액에 대한 시험
실시예 2 내지 5에 따라 순차적으로 수행한 각 단계에서 얻어진 각 원액을 각각의 정제 단계의 평형화 완충액을 이용해 1,500 IU/mL(=100%)로 희석하고 4℃, 37℃ 보관조건에서 안정성 시험을 진행하였고, 그 결과를 하기 표 20에 나타내었다.
효소 활성비(%)
구분 보관온도 0일 9일 20일 37일 60일
실시예 2 4℃ 100.0 103.3 101.3 99.6 99.6
37℃ 100.0 100.9 102.5 100.8 101.3
실시예 3 4℃ 100.0 103.0 97.3 96.8 94.6
37℃ 100.0 102.3 99.4 97.6 90.3
실시예 4 4℃ 100.0 99.1 100.1 102.3 101.1
37℃ 100.0 99.6 99.8 100.0 98.6
실시예 5 4℃ 100.0 102.6 100.4 99.4 103.2
37℃ 100.0 100.8 99.6 97.3 98.8
표 20에 나타난 바와 같이, 관찰기간 동안 히알루로니다아제의 함량은 감소되지 않았다.
8-3: 실시예 2 내지 5에 따라 정제후 얻어진 원액을 투석하여 EDTA / MgCl 2 를 제거한 후 얻어진 시료에 대한 안정화 시험
정제단계에서 EDTA 또는 MgCl2가 사용된 경우 이를 다시 제거한 후에, 상기 성분의 안정화 효과 유무를 확인하고자, 실시예 2 내지 5에 따라 정제 후 각각 얻어진 원액을 1,500 IU/mL(=100%)로 희석하고, 하기 표 21의 EDTA/MgCl2가 제거된 버퍼를 이용하여 투석 후 4℃, 37℃ 보관조건에서 안정성 시험을 진행하였고, 그 결과를 하기 표 22에 나타내었으며, 4℃ 및 37℃에서 모두 함량이 감소함을 확인하였다.
투석용 완충액 조성
2차 정제물 10 mM Sodium phosphate dibasic, 0.1% Tween80, pH 5.0
3차 정제물 5 mM Potassium phosphate dibasic, pH 5.0
4차 정제물 20 mM Sodium acetate, 0.1% Tween80, pH 5.0
5차 정제물 10 mM Sodium acetate, 0.01% Tween80, pH 5.0
효소 활성비(%)
구분 보관온도 0일 9일 20일
2차 정제물 4℃ 100.0 84.8 67.9
37℃ 100.0 73.4 48.7
3차 정제물 4℃ 100.0 81.8 63.7
37℃ 100.0 53.2 28.1
4차 정제물 4℃ 100.0 87.7 69.0
37℃ 100.0 77.4 39.3
5차 정제물 4℃ 100.0 80.9 67.3
37℃ 100.0 71.9 47.5
고도정제 히알루로니다아제에 대하여 랫드에 대한 아나필락시스 쇼크 반응 및 수동 피부 아나필락시스 반응 시험에서 문제점이 발생하지 않아 안정성이 확보되었다. 따라서 고도정제 히알루로니다아제는 현재 시판중이 주사제보다 순도가 높고 안전성이 우수한 주사제로서 가치가 있다.

Claims (15)

  1. 히알루로니다아제-함유 원료를, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 및 겔여과법으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정으로 정제하는 단계를 포함하는, 순도 95% 이상이고 비활성도가 70,000 IU/mg 이상인 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 얻는 정제방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 얻어진 히알루로니다아제는 2 내지 8℃ 온도조건에서 히알루로니다아제의 활성이 최초 효소활성 100%기준 대비 90% 이상 유지하는 안정성을 갖는 정제방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 히알루로니다아제-함유 원료는 양, 소, 돼지 또는 사람 유래인 정제방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 히알루로니다아제-함유 원료는 포유류 히알루로니다아제 유전자를 미생물, 동물세포 또는 식물세포에 도입하여 생산되는 재조합 히알루로니다아제-함유 원료인 정제방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 히알루로니다아제-함유 원료는 포유류의 고환에서 분리된 원료, 상기 원료를 염석처리하여 얻어진 산물, 또는 상기 원료를 염석처리하고 발열물질을 제거한 후 얻어진 산물인 정제방법.
  6. 제1 항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피는 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피, 또는 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피인 정제방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 정제방법은 순차적으로 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피, 양이온교환 크로마토그래피, 음이온교환 크로마토그래피 및 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 공정을 포함하는 정제방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 순차적으로 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피, 양이온교환 크로마토그래피, 음이온교환 크로마토그래피, 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 겔여과법으로 정제된 것인 정제방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 양이온교환 크로마토그래피는 Mono S, SP 세파로스, 또는 CM 세파로스를 이용한 양이온교환 크로마토그래피인 정제방법.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 음이온교환 크로마토그래피는 DEAE 세파로스 또는 Q 세파로스를 이용한 음이온교환 크로마토그래피인 정제방법.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피는 글리신 1 내지 50 mM의 글리신을 포함하고 pH 8.0 내지 11.0을 갖는 평형화 완충액을 사용하여 수행되는 것인 정제방법.
  12. 제 7항에 있어서, 상기 양이온교환 크로마토그래피는 1 내지 50 mM의 인산나트륨, 0.1 내지 5 mM의 킬레이팅제 및 0.001 내지 0.5%의 비이온성 계면활성제를 포함하고 pH 5.5 내지 6.5을 갖는 평형화 완충액을 사용하여 수행되는 것인 정제방법.
  13. 제 7항에 있어서, 상기 음이온교환 크로마토그래피는 1 내지 50 mM의 인산칼륨 및 50 내지 100 mM의 염화나트륨을 포함하고 pH 6.5 내지 7.5을 갖는 평형화 완충액을 사용하여 수행되는 것인 정제방법.
  14. 제 7항에 있어서, 상기 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피는 1 내지 50 mM의 초산나트륨, 0.1 내지 5 mM의 킬레이팅제 및 0.001 내지 0.5%의 비이온성 계면활성제를 포함하고 pH 4.0 내지 5.5을 갖는 평형화 완충액을 사용하여 수행되는 것인 정제방법.
  15. 제 8항에 있어서, 상기 겔여과법은 초산 나트륨 1 내지 50 mM, 알칼리금속 및 알칼리토금속 0.1 내지 5 mM, 비이온성 계면활성제 0.001 ~ 0.5% 및 pH 4.5 내지 5.5인 평형화 용액으로 수행되는 것인 정제방법.
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