JP2023522966A

JP2023522966A - 修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、製造方法、医薬組成物およびそれらの使用

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Publication number: JP2023522966A
Application number: JP2022564185A
Authority: JP
Inventors: バーガードギュンター; ボーエンケライナー; ベンソンスヴェン; ローレンツレンツ; シェレンベルガーフィリップ
Original assignee: ファーマクトホールディングアーゲー
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2023-06-01
Also published as: CN115702242A; WO2021213623A1; US20230167428A1; EP4139448A1

Abstract

本発明は、修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、その製造方法、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含む医薬組成物およびその使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、その製造方法、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含む医薬組成物およびその使用に関する。

ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの必須成分であり、定量的に有意な間質バリアの成分である。ヒアルロニダーゼは、Ｄ－グルクロン酸およびＮ－アセチルグルコサミン中のヒアルロン酸を切断する加水分解酵素であり、間質性マトリックスの透過性を増加させる。ヒアルロニダーゼは自然界に広く分布している。ヒトでは、６つの異なるヒアルロニダーゼ、ＨＹＡＬ１－４、ＨＹＡＬ－Ｐ１およびＰＨ－２０が同定されており、ＰＨ－２０は最も強い生物学的活性を発揮すると考えられている。

今日、動物由来のウシまたはヒツジの精巣ヒアルロニダーゼならびに合成ヒアルロニダーゼは、血管外遊出の治療のため、またはヒアルロン酸系フィラーの審美的注射に関連する合併症の管理のために、補助剤として臨床的に適用され、薬物のバイオアベイラビリティを増やしている。

動物由来のヒアルロニダーゼは、動物の疾患、例えば海綿状脳症を伝染させるリスクを与えるが、ヒトおよび細菌性の組換えヒアルロニダーゼは、より高い純度を示し、薬学的リスクを減らす。

臨床的需要を満たすために、本発明の目的は、医薬用途に適し、特に適切な高純度、および／または適切な比活性、適切な安定性ならびに溶解性を示し、同時に時間および費用の効果の高い製造方法を示すヒアルロニダーゼポリペプチドを提供することである。

前述の目的は、特許請求される発明の主題によって少なくとも部分的に解決される。利点（好ましい実施形態）は、以下の詳細な説明および／または添付の図面ならびに従属請求項に記載されている。

したがって、本発明の第１の態様は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む、またはそれからなる修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドに関し、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、配列番号７のＣ末端ＨＩＳタグおよび配列番号５のＮ末端Ｓｔｒｅｐタグを含むことを特徴としている。

本発明の第２の態様は、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドをエンコードする核酸に関し、好ましくは、核酸は、配列番号２を含む、またはそれからなる。

本発明の第３の態様は、ベクターおよび本発明の核酸を含む、組換え発現ベクターに関する。

本発明の第４の態様は、本発明の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関し、好ましくは宿主細胞が大腸菌である。

本発明の第５の態様は、精製細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの製造方法であって、以下の工程、
ａ．形質転換された本発明の宿主細胞を、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを発現するのに適した増殖条件下で、適した増殖培地中で培養すること、
ｂ．工程ａ）の培養された形質転換宿主細胞を採取すること、
ｃ．工程ｂ）の採取した宿主細胞を溶解し、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含む得られた宿主細胞内容物から、得られた宿主細胞断片を分離すること、および、
ｄ．ＨＩＳアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィーを用いて、工程ｃ）の得られた宿主細胞内容物を精製して、本発明の精製細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを得ること、
を含む、またはこれらの工程からなる方法に関する。

本発明の第６の態様は、本発明の製造方法に従って得られる、配列番号１の少なくとも９０％の配列同一性を含む、またはそれからなる修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドに関する。

本発明の第７の態様は、治療有効量の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物に関する。

本発明の第８の態様は、好ましくはホモ接合性家族性高コレステロール血症（黄色腫症）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症および糖尿病性足病変からなる群から選択される、ヒアルロナン関連および／またはプロテオグリカン関連の疾患または障害を治療する方法であって、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、または本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。

先に開示された本発明の本発明の態様は、結果として得られる特徴の組み合わせが当業者にとって合理的である限り、従属請求項に記載された、または以下の詳細な説明および／または添付の図面に開示されたその好ましい発明の実施形態の任意の可能な（サブ）コンビネーションを含むことができる。

本発明のさらなる特徴および利点は、添付の図面から明らかになるだろう。

図１は、本発明の組換え発現ベクターのベクターマッププラスミドを表す。図２は、様々な濃度の参照タンパク質（ウシ血清アルブミン、ｓｙｎ：ＢＳＡ）バンド、ラダータンパク質バンドおよび様々な濃度の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼのバンドを含む、ＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析後の染色ゲルのスキャンを表す。図３は、大腸菌陽性対照（図３ａ）、ＬＢプレート陰性対照（図３ｂ）、および本発明のｄ０１６試料（図３ｃ）を含む４日間にわたるＬＢ寒天プレートの画像を表す。

以下により詳細に記載されるように、本発明の種々の態様の発明者らは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む、またはそれからなり、配列番号７のＣ末端ＨＩＳタグおよび配列番号５のＮ末端Ｓｔｒｅｐタグを含むことを特徴とする本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドが、９８．８％超の高純度（実施例のセクション１．４．１を参照のこと）および１，５００，０００Ｕ／ｍｇの高比活性（実施例のセクション１．４．２を参照のこと）を示すことを見出した。

これとは対照的に、ウシヒアルロニダーゼなどの比較となるヒアルロニダーゼは、広範囲でより低い、すなわち３００～１５，０００Ｕ／ｍｇの範囲の比活性を示す（実施例のセクション２．３を参照のこと）。ヒトヒアルロニダーゼの中で最も活性であると考えられるＰＨ２０も、より低い、すなわち４０，０００および５０，０００Ｕ／ｍｇの範囲の比活性を示す。また、ストレプトマイセス・コガネイエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｏｇａｎｅｉｅｎｓｉｓ）由来の細菌性ヒアルロニダーゼの比活性も、ＰＨ２０の比活性と同程度であるため、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼの比活性よりも低い。

さらに、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼは、適切な安定性および溶解性を示し、これを以下の実施例のセクション１．４．５に示す。（エキソ）ペプチダーゼに対する安定性（半減期）を含む安定性の増加は、配列番号７のそれぞれのＣ末端ＨＩＳタグおよび配列番号５のそれぞれのＮ末端Ｓｔｒｅｐタグの使用に起因し得る。それぞれのタグはまた、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼの溶解性を、野生型ヒアルロニダーゼと比較して増加させ得る（配列番号３を参照、野生型ヒアルロニダーゼをエンコードするＤＮＡは配列番号４を参照）。安定性および溶解性の増加により、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼは、医薬組成物、特に非経口注射組成物を製剤化するために好ましい。

したがって、精製修飾細菌性ヒアルロニダーゼを提供するための本発明の製造方法は、実験室規模で既に比較的高い収率および同時に高い純度および高い比活性を提供し、製造工程の点から見て、時間および費用の効果がある。

本発明の文脈において、「配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む、またはそれからなる本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドであって、配列番号７のＣ末端ＨＩＳタグおよび配列番号５のＮ末端Ｓｔｒｅｐタグを含むことを特徴とするヒアルロニダーゼポリペプチド」という表現は、「本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド」、「本発明の細菌性ヒアルロニダーゼ」または「本発明のヒアルロニダーゼ」と同義に使用され、この表現は、本発明のヒアルロニダーゼが配列番号１の配列の少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％を含むこと、または配列番号１の１００％からなること、および本発明のヒアルロニダーゼが、配列番号７のＣ末端ＨＩＳタグおよび配列番号５のＮ末端Ｓｔｒｅｐタグを同時に示すことを意味する。本発明のヒアルロニダーゼの配列が配列番号１の１００％からなる場合、本発明のヒアルロニダーゼも同義的に「ｄ０１６」と呼ばれる。

したがって、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ、好ましくはｄ０１６は、医薬組成物における使用に適している。

提示された比較的高い比活性、純度、安定性、溶解性および安全性プロファイルを考慮すると、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ、好ましくはｄ０１６は、ヒアルロナン関連および／またはプロテオグリカン関連の疾患または障害の治療または予防における使用に適している。本発明者らは、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ、好ましくはｄ０１６が、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（黄色腫症）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症または糖尿病性足病変の治療または予防における使用に特に適していることを見出した。

ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）は、１００万人に１人の有病率の遺伝性希少疾患である。家族性高コレステロール血症の一形態としては、脂質代謝異常である。ＨｏＦＨを有する患者は、血液中のコレステロール画分である低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の著しい増加に起因して、皮膚および腱の沈着物、いわゆる黄色腫（黄色がかった球状の脂質沈着物）を有し、目立ってしまう。脂質は血管壁にも沈着し、平均余命の著しい短縮を伴う重度のアテローム性動脈硬化症の早期発症を引き起こす。患者は、幼児期に、約５歳から既に最初の心臓発作を患い、毎週脂質アフェレーシスを受け、最高用量の同時投薬を受けなければならないが、残念ながら平均余命はわずか約３０年である。

ＨｏＦＨは、はるかに高頻度のヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）とは区別されるべきであり、ＨｅＦＨは、有意に高い初期心血管事象のリスクにも関連するが、あまり劇的ではない。この遺伝性疾患の有病率は、１：２００～１：５００と推定される。ここでも、動脈硬化の徴候、すなわち血管疾患によって引き起こされる疾患および症状、例えば末梢動脈閉塞性疾患、心臓発作に至るまでの冠動脈の狭窄、脳卒中を若齢で発症し得るが、疾患のホモ接合性変種での発症よりも遅く、程度は低い。

本発明の細菌性ヒアルロニダーゼは、アテローム性プラークおよび動脈硬化性血管壁における組織細胞外マトリックス（ＥＣＭ）およびコンドロイチン－６－硫酸および他のプロテオグリカンレベルに対するその低減効果の観点から、ＨｏＦＨおよびＨｅＦＨの治療および／または予防に有効である。したがって、治療有効量の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ、好ましくはｄ０１６の投与は、狭窄プラークのサイズ減少および血管壁の弾性の増加をもたらす。

糖尿病性足病変（ＤＦＳ）は、糖尿病における無痛感覚性ニューロパシーおよび／または末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＶＫ）に基づく病理学的変化の症候群である。これは、２型糖尿病患者において最も一般的であり、治癒不良の足の創傷の高いリスクに関連する。糖尿病患者の約１５％は、無痛（感覚性ニューロパシーに起因する）の治癒不良の足の創傷を生涯中に発症する。毎年、糖尿病患者の約４％が新たに創傷を発症し、０．１％が土踏まずの崩壊により、いわゆるシャルコー足を発症する。

糖尿病性足病変のＰＡＶＫ側面を考慮すると、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼは、アテローム性プラークおよび動脈硬化性血管壁における組織細胞外マトリックス（ＥＣＭ）およびコンドロイチン－６－硫酸および他のプロテオグリカンレベルに対するその低減効果を示すことによって、糖尿病性足病変の治療および／または予防に有効である。したがって、それは、狭窄プラークのサイズ減少および血管壁の弾性の増加をもたらす。さらに、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼは、糖尿病性足病変のニューロパシー性の側面に効果を有する。これに関して、それは、慢性多発性神経炎によって引き起こされる神経鞘領域に存在する、増加したヒアルロン酸濃度を低下させる。ミエリン鞘の絶縁機能の妨害に基づく関連する神経伝達障害は減少し、神経伝達能力が再び増加する。

加えて、本発明は、第２の態様として、第１の態様の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドをエンコードする核酸を提供する。本発明の第１の態様に関して開示されたすべての特徴および実施形態は、結果として得られる特徴の組み合わせが当業者にとって合理的である限り、単独または（サブ）コンビネーションで、その好ましい実施形態のそれぞれを含む本発明の第２の態様と組み合わせることができる。

第２の本発明の態様の好ましい実施形態によれば、核酸は、配列番号２を含む、またはそれからなる。本発明のヒアルロニダーゼのＣ末端ＨＩＳタグをエンコードする核酸配列は、好ましくは配列番号８であり、本発明のヒアルロニダーゼのＮ末端Ｓｔｒｅｐタグをエンコードする核酸配列は、好ましくは配列番号６である。本発明の核酸は、適切な任意の方法に従って調製され得る。例示的な方法は、以下の実施例セクション１．１．１に記載されている。

本発明の文脈において、「本発明の核酸」という表現は、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ、好ましくはｄ０１６をエンコードする核酸を指す。本発明の核酸は、好ましくは配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を含む、またはそれからなり、好ましくは本発明の核酸は、１００％配列番号２からなる。

本発明の第３の態様によれば、組換え発現ベクターは、本発明の第２の態様の核酸を含む。本発明の第１または第２の態様に関して開示されたすべての特徴および実施形態は、結果として得られる特徴の組み合わせが当業者にとって合理的である限り、単独または（サブ）コンビネーションで、その好ましい実施形態のそれぞれを含む本発明の第３の態様と組み合わせることができる。

本発明の第３の態様の組換え発現ベクターは、任意の適切な方法に従って調製され得る。例示的な方法は、以下の実施例セクション１．１．１に記載されている。本発明の組換え発現ベクターは、配列番号２を含むかまたはそれからなる本発明の核酸、任意の適切なベクター、例えばｐＥＴ－２８ａＤＮＡベクター、特にＮｃｏＩ／ＢｌｐＩ制限部位を使用するｐＥＴ２８ａを含む。本発明の組換え発現ベクターは、プラスミドの形態などの任意の適切な形態であり得る。

本発明の第４の態様によれば、本発明の第３の態様の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。本発明の第１～第３の態様に関して開示されたすべての特徴および実施形態は、結果として得られる特徴の組み合わせが当業者にとって合理的である限り、単独または（サブ）コンビネーションで、その好ましい実施形態のそれぞれを含む本発明の第４の態様と組み合わせることができる。

本発明の第４の態様の宿主細胞は、適切な任意の方法に従って調製され得る。例示的な方法は、以下の実施例セクション１．１．２に記載されている。本発明の宿主細胞は、任意の適切な宿主細胞から選択され得る。好ましくは、宿主細胞は、比較的高い収率の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ、好ましくはｄ０１６を提供する、大腸菌細胞、より好ましくは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞から選択される。

本発明の第５の態様は、第１の発明の態様による精製細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの製造方法を提供する。本発明の第１～第４の態様に関して開示されたすべての特徴および実施形態は、結果として得られる特徴の組み合わせが当業者にとって合理的である限り、単独または（サブ）コンビネーションで、その好ましい実施形態のそれぞれを含む本発明の第５の態様と組み合わせることができる。

本発明の製造方法は、従来のシェーカーフラスコを使用して実験室規模で実施することができ、または発酵槽での使用のために規模を拡大することができる。発酵槽製造への規模拡大を考慮して、プロセス工程は、高密度増殖、発現のオンセット／オフセット、混合速度および時間、ならびに適用可能な温度を考慮して最適化することができる。本発明者らは、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ、好ましくはｄ０１６の高い比活性を考慮すると、既にシェーカーフラスコを使用する実験室規模が、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（黄色腫症）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症または糖尿病性足病変の治療および／または予防に使用するための有意な量（年間量）の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ、好ましくはｄ０１６を製造するのに十分であることを見出した。

本発明の第５の態様の製造方法は、以下の工程を含むか、またはそれらからなる。

工程ａ）第４の本発明の態様による形質転換された宿主細胞を、第１の本発明の態様による本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを発現するのに好適な増殖条件下で、好適な増殖培地中で培養すること。一例として、テリフィックブロス（ＴＢ）培地を使用することができる。それぞれのブロス培地は、カナマイシンなどの適切な抗生物質および／またはリン酸カリウム緩衝液などの緩衝成分によって補充され得る。増殖培地はまた、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などの適切な発現誘導物質を含む。実験室規模によれば、細胞増殖およびタンパク質発現は、シェーカー培養フラスコ内で適切な温度、好ましくは２８～３０℃、および好ましくは１８０ｒｐｍの振盪で、１８～２０時間行われ得る。

工程ｂ）工程ａ）の培養された形質転換宿主細胞を採取すること。形質転換宿主細胞を適切な増殖条件下で培養した後、宿主細胞を適切な方法で回収する。実験室規模によれば、好ましくはパイロジェンフリーの滅菌チューブを使用して、増殖培地を含有する採取された宿主細胞を回収する。この採取された増殖培地は、遠心分離後にいわゆるペレットに凝集する宿主細胞から培地を分離するために、好ましくは４，０００ｒｃｆで、好ましくは４℃の低温で少なくとも３０分間遠心分離することが好ましい。上清を廃棄し、採取用チューブを好ましくは密封し、低温、好ましくは０℃未満、より好ましくは－８０℃で保存する。

工程ｃ）工程ｂ）の採取した宿主細胞を溶解し、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含む得られた宿主細胞内容物から、得られた宿主細胞断片を分離すること。実験室規模によれば、宿主細胞は、遠心分離後に凝集ペレットを形成し、一般に、適切な培地、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；室温で２８０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＫＣｌ、１５．１ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、４．９ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４を含有、ｐＨ＝７．４）などの適切な緩衝培地に、好ましくはボルテックスすることによって再懸濁および混合される。宿主細胞は、超音波処理などの任意の適切な方法によって溶解される。培地内で適切な温度を維持するために、超音波処理は、好ましくは低温で行われ、より好ましくは培地を超音波処理しながらチューブを氷で囲む。得られた宿主細胞断片を、好適な方法を用いて、好ましくは遠心分離によって、より好ましくは低温、例えば４℃で少なくとも３０分間、例えば４，０００ｒｃｆで遠心分離することによって、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドから分離する。本発明の細菌性ヒアルロニダーゼを含む上清を、好ましくは新しいチューブに移し、場合により１回以上の遠心分離工程をさらに行う。次いで、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼを含む得られた上清を精製工程ｄ）に使用する。

工程ｄ）ＨＩＳアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィーを用いて、工程ｃ）の得られた宿主細胞内容物を精製して、精製された本発明の第１の態様の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを得ること。好ましくは、ＨＩＳアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィーは続いて行われ、順序は交換可能であり、すなわちＨＩＳアフィニティークロマトグラフィー精製が最初に行われ、続いてＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィーが行われるか、またはその逆である。以下では、１つの例示的な実施形態として、最初にＨＩＳアフィニティークロマトグラフィーを行い、次いでＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィーを行う連続精製を説明する。ＨＩＳアフィニティークロマトグラフィーカラムは一般にＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィーカラムよりも安価であることを考慮すると、ＨＩＳアフィニティークロマトグラフィーを最初に行う場合では、より費用対効果の高い方法での高純度収率が達成され得る。

本発明によれば、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼのＣ末端ＨＩＳタグ（配列番号１のアミノ酸７３５から７４０、配列番号７も参照のこと）に結合するために、任意の適切なＨＩＳアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。実験室規模によれば、一例として、１つ以上の適切な重力ＨＩＳ精製カラムを一般的なＰＢＳ下流緩衝液に平衡化する。工程ｃ）の後に得られる各チューブの内容物は、１つ以上のＨＩＳカラムに分配される。場合により、ＨＩＳ精製手順は、１回、２回またはそれ以上、好ましくは２回繰り返される。次いで、充填された１つ以上のＨＩＳカラムは、好ましくは、適切な洗浄媒体、例えば１０ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液で洗浄された後、適切な溶出媒体、例えば１５０ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液で溶出される。一般に、同じ生成フラスコ（チューブ）に由来する１つ以上のＨＩＳカラムの溶出液を合わせ、好ましくは一般的な下流緩衝液ＰＢＳで３５ｍｌに希釈する。好ましくは、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼを含む精製溶出液試料を次いで、低温下、好ましくは氷上でその後のＳＴＲＥＰ精製まで保存する。

本発明によれば、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼのＮ末端ＳＴＲＥＰタグ（配列番号１のアミノ酸３から１０、配列番号５も参照のこと）に結合するために、任意の適切なＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。実験室規模に応じて、好ましくは１つ以上の適切なシリンジベースのＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用することができる。一例として、１回以上のシリンジベースのＳＴＲＥＰ精製工程が、より好ましくは５ｍｌ／分未満の流量で実施される。ＳＴＲＥＰカラム（床体積５ｍｌ）を一般的に洗浄し、２×２５ｍｌの一般的な下流緩衝液ＰＢＳで平衡化する。ＨＩＳ精製から得られた適切な量の溶出液試料を適用し、ＳＴＲＥＰカラムに流す。次いで、充填されたＳＴＲＥＰカラムは、好ましくは適切な量の一般的な下流ＰＢＳ緩衝液で洗浄され、あらゆる残留汚染タンパク質を除去する。適切な溶出媒体、例えば２．５ｍＭのｄ－デスチオビオチン含有ＰＢＳ緩衝液を適用することによって、目的のタンパク質、すなわち本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼは、好ましくは新鮮な、滅菌パイロジェンフリーのチューブに溶出される。このチューブを低温、例えば氷上で保存するか、または凍結乾燥して、精製された本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼの乾燥保存可能な生成物を得る。ＳＴＲＥＰカラムは、先行技術による適切な再生後に再利用することができる。

場合により、溶出液の緩衝液は、溶出液を遠心分離して本発明の細菌性ヒアルロニダーゼを凝集させること、上清を廃棄すること、および凝集した本発明の細菌性ヒアルロニダーゼをトリスＨＣＬＮａＣｌなどの異なる緩衝媒体に再懸濁することを含む、適切な方法によって交換され得る。好ましい実施形態によれば、再懸濁した本発明の細菌性ヒアルロニダーゼは、低温下、例えば氷上で研磨などのさらなる後処理のために保存される。

好ましい実施形態によれば、本発明の精製工程は、１つ以上の適切な研磨工程をさらに含んで、工程ｄ）における本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの最後の不純物を除去し、したがって、その純度を高める。実験室規模によると、１回以上のエンドトキシン除去工程、例えばポリミキシンＢベースのエンドトキシン除去工程；１回以上の滅菌濾過工程、および１回以上の粒子除去工程を実施することができる。

本発明によれば、実験室規模のタンパク質収量は、結果としてＨＩＳ精製後に０．０９～０．１３ｍｇ／ｍｌ、二重ＨＩＳ／ＳＴＲＥＰ精製およびその後の研磨精製工程後に０．０４～０．０６ｍｇ／ｍｌになった（下記の実施例セクション１．３．４項を参照）。この収量は、発酵規模の製造時に著しく増加すると予想される。

本発明の第６の態様によれば、修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、好ましくは配列番号１からなり、本発明の第５の態様による製造方法によって得られ得る、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドが提供される。本発明の第１～第５の態様に関して開示されたすべての特徴および実施形態は、結果として得られる特徴の組み合わせが当業者にとって合理的である限り、単独または（サブ）コンビネーションで、その好ましい実施形態のそれぞれを含む本発明の第６の態様と組み合わせることができる。

本発明の第７の態様によれば、治療有効量の本発明の第１または第６の態様による本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。本発明の第１～第６の態様に関して開示されたすべての特徴および実施形態は、結果として得られる特徴の組み合わせが当業者にとって合理的である限り、単独または（サブ）コンビネーションで、その好ましい実施形態のそれぞれを含む本発明の第７の態様と組み合わせることができる。

一般に、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼの治療有効量は、医薬組成物の治療的用途に依存する。本発明によれば、「治療活性量」という用語は、医薬組成物またはその医薬単位用量中の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの量、好ましくは配列番号１からなる本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの量が、好ましくはホモ接合性家族性高コレステロール血症（黄色腫症）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症または糖尿病性足病変からなる群から選択される、ヒアルロナン関連および／またはプロテオグリカン関連の疾患または障害の治療または予防に適していることを意味する。

一例として、医薬組成物が静脈内適用のための非経口液体組成物である場合、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼは、１５，０００～１，５００，０００Ｕ／ｍＬの間の治療有効量で１～１０、好ましくは２または５ｍＬを含むバイアル内の濃縮物として提供され得る。好ましい実施形態によれば、本発明の医薬組成物の単位用量は、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを２００Ｕ／ｋｇ／日～３０，０００Ｕ／ｋｇ／日の濃度範囲で含む。本発明の細菌性ヒアルロニダーゼの半減期を増加させるために、投与スキームは、好ましくはエキソプロテイナーゼおよび／またはエンドプロテイナーゼを飽和させるための本発明のヒアルロニダーゼの適切なボーラス量、その後続く治療有効単位用量の量の投与を含み得る。好ましくは、静脈内投与の場合、後続の単位用量は、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼのボーラス投与後１時間以内、あるいは３０分以内、または１５分以内、または５分以内に投与される。

前述にもかかわらず、本発明の医薬組成物は、任意の適切な適用形態、例えば固体、半固体または液体の適用形態で存在することができる。治療有効量は、それに応じて計算されるべきである。一例として、本発明の医薬組成物の固体形態は、乾燥または凍結乾燥形態として提供され得る。本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドに加えて、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、例えば増量剤、緩衝剤、等張性調整剤、崩壊温度調整剤、溶媒および／または共溶媒、可溶化剤、防腐剤、酸化防止剤、抗菌剤およびキレート剤、湿潤剤、凝集／懸濁化剤の群から選択される１つ以上の成分、ならびに場合により、プロテイナーゼ阻害剤、例えばメタロプロテイナーゼ阻害剤、ジペプチジル－４エキソペプチダーゼ阻害剤（ｓｙｎ：ＤＰＰ－４阻害剤またはグリプチン）、またはヒアルロナン結合タンパク質２プロテアーゼ阻害剤から選択される１つ以上を含むことができる。

本発明によれば、適切な増量剤は、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、ラフィノース、グリシン、ヒスチジンまたはポリビニルピロリドン（Ｋ４０）を含み得る。適切な緩衝剤は、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリス塩基６５、トリスアセテート、またはトリスＨＣｌ６５を含み得る。適切な等張性調整剤は、デキストロースを含み得る。適切な崩壊温度調整剤は、デキストラン、フィコール、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプンであり得る。適切な溶媒は、好ましくは注射用水から選択され、非水性水混和性剤、例えばエタノール、グリセリン、プロピレングリコールおよびｎ－ラクタミドを共溶媒として使用することができる。適切な可溶化剤は、適切な界面活性剤および共溶媒から選択され得る。適切な界面活性剤の数少ない例は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、レシチン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）である。可溶化剤として適切な共溶媒の例は、プロピレングリコール、グリセリン、エタノール、ポリエチレングリコール（３００および４００）、ソルビトール、ジメチルアセトアミドおよびクレモフォールＥＬである。適切な防腐剤は、パラベン、例えばベンジルアルコール（０．９％～１．５％）、メチルパラベン（０．１８％～０．２％）、プロピルパラベン（０．０２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％～０．０２％）およびチオメルサール（０．００１％～０．０１％）から選択され得る。好適な酸化防止剤は、好ましくはアスコルビン酸、亜硫酸塩、例えば亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、チオ尿素、アセチルシステイン、アスコルビン酸エステル、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロールから選択される。適切な抗菌剤は、フェノール、メタ－クレゾール、ベンジルアルコール、パラベン（メチル、プロピル、ブチル）、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、フェニル水銀塩（酢酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩）から選択される。適切なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸塩から選択される。適切な湿潤剤は、好ましくはグリセリン、アルコールおよびプロピレングリコールから選択される。適切な凝集／懸濁化剤は、電解質、例えば塩化カリウム／ナトリウム、クエン酸カリウム／ナトリウムもしくは酢酸カリウム／ナトリウム、または界面活性剤および親水性コロイド、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、アカシア、ゼラチン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンから選択される。プロテイナーゼ阻害剤は、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼの半減期を延長することができ、したがって、使用されるヒアルロニダーゼの総量を減らすか、または治療有効性を向上させることができる。エデト酸カルシウム二ナトリウムは、メタロプロテアーゼを広く阻害するために使用され得る。ビルダグリプチンまたはリナグリプチンは、ＤＰＰ－４エキソペプチダーゼを特異的に阻害するために使用され得、プロリンを有する配列を切断することができる。アプロプチンは、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）を阻害するのに適する可能性があり、広範囲のセリンプロテアーゼを阻害するのに適する可能性がある。

凍結乾燥医薬組成物の場合、１つ以上の賦形剤は、適切な増量剤、緩衝剤、等張性調整剤、崩壊温度調整剤、およびプロテイナーゼ阻害剤から選択され得る。本発明の医薬組成物が非経口注射剤として適用される場合、１つ以上の医薬賦形剤は、溶媒、可溶化剤、共溶媒、防腐剤、湿潤剤／界面活性剤、凝集／懸濁化剤およびプロテイナーゼ阻害剤から選択され得る。

あるいは、それぞれの１つ以上のプロテイナーゼ阻害剤は、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼを含む本発明の医薬組成物に別々に投与されてもよい。別々の投与の場合、１つ以上の適切なプロテイナーゼ阻害剤は、一般に、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼの前に、またはそれと同時に、エキソペプチダーゼおよび／またはエンドペプチダーゼを効果的に阻害するのに適した量で投与される。

本発明のヒアルロニダーゼを含む本発明の医薬組成物が、ボーラス投与とそれに続くその後の単位用量投与の形態で投与される場合、プロテアーゼ阻害剤は、本発明の医薬組成物のボーラスおよび場合によりその後の単位用量に含まれ得る。プロテイナーゼ阻害剤の身体負荷を軽減するために、好ましくはボーラス投与のみが適切な１つ以上のプロテアーゼ阻害剤を含むか、または１つ以上のプロテアーゼ阻害剤の別個の投与が、本発明のヒアルロニダーゼを含む本発明の医薬組成物のボーラス投与の前、または同時に投与される。

代替的な例として、本発明の医薬組成物の液体形態は、好適な懸濁媒体中、好ましくは非経口適用のための好適な懸濁媒体中、より好ましくは静脈内適用のための好適な懸濁媒体中の本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの懸濁液として提供され得る。医薬組成物は、非経口適用前に希釈される濃縮物の形態であってもよい。非経口注射剤用の医薬組成物は、可溶化剤、共溶媒、防腐剤、湿潤剤／界面活性剤、凝集／懸濁化剤およびプロテイナーゼ阻害剤の群から選択される１つ以上の賦形剤を含み得る。

一例として、非経口注射用の本発明の医薬組成物の液体形態（希釈後）は、０．９％ＮａＣｌ溶液、リンガー溶液、または乳酸ナトリウム－塩化ナトリウム溶液を含む。

一般に、本発明の医薬組成物は、経口、経鼻、経皮、直腸、静脈内または筋肉内適用に適し得る。経口適用の場合、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドは、好ましくは適切な腸溶コーティングと共に製剤化されて、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼの腸液中での分解を回避／低減する。本発明の医薬組成物の静脈内適用は、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドが初回通過効果なしに、直接血管空間に提供されるので特に好ましく、これは、好ましくはホモ接合性家族性高コレステロール血症（黄色腫症）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症および糖尿病性足病変からなる群から選択されるヒアルロナン関連および／またはプロテオグリカン関連の疾患または障害の治療または予防での使用に特に好ましい。この場合、エキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼは、本発明の細菌性ヒアルロニダーゼのボーラス適用の使用および／または同じ医薬組成物または別の医薬組成物中のプロテイナーゼ阻害剤のさらなる投与によって阻害され得る。

好ましくはホモ接合性家族性高コレステロール血症（黄色腫症）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症および糖尿病性足病変からなる群から選択されるヒアルロナン関連および／またはプロテオグリカン関連の疾患または障害を治療する方法は、第１もしくは第６の態様による本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、または第７の態様による本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含むか、またはそれからなる。

本発明を、例示的な実施形態に基づいて以下に説明するが、これは例示としての役割を果たすにすぎず、本保護権の範囲を限定するものではない。

本発明のさらなる特徴および利点は、添付の図面を参照して、本発明の態様の例示的な実施形態の以下の説明から明らかになるだろう。

例示的な実施形態および／または添付の図面に関して以下に開示される特徴のすべては、結果として得られる特徴の組み合わせが当業者にとって合理的である限り、単独でまたは任意のサブコンビネーションで、その好ましい実施形態の特徴を含む本発明の態様の特徴と組み合わせることができる。

装置（一般）
１．ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＭｕｌｔｉｆｕｇｅＸ３Ｒ（ＳＮ：４２３４３２５９）
２．ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５９２０Ｒ（ＳＮ：５９４８ＨＲ９０２４３３）
３．ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｎｏｖａ４３００（ＳＮ：５９０５４４１１５）
４．ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｎｏｖａ４３００（ＳＮ：７９１０６０８６４）
５．Ｊｅｎｗａｙ６３０５分光光度計（ＳＮ：６８９９３）
６．ＡＲＣＴＩＫＯＵＬＴＦ４２０－８０℃フリーザ（ＳＮ：２０１８０２６２１５３）
７．ＬｉｅｂｈｅｒｒＧＸ８２３－２０Ｍフリーザ（ＳＮ：５０．６３６．６９０．７）
８．ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡｒｉｕｍＭｉｎｉＵＶＵｌｔｒａｐｕｒｅＷａｔｅｒ（ＳＮ：３６８０２２８８）
９．ＶＷＲＶａｐｏｕｒＬｉｎｅ１３５－Ｂオートクレーブ（ＭＮ：１２１７５０２０）
１０．２４ｘ２ｍｌのブロック（ＳＮ：１９１１６５）を備える、ＰｅｑｌａｂＴＳ－１００サーモシェーカー（ＳＮ：４３０８０５０３７）
１１．ＩＫＡＶｏｒｔｅｘ２Ｓ０００（ＳＮ：１００４５１１９８）
１２．ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＭｉｎｉ３００ＶＰｌｕｓ電源（ＳＮ：１９０１１８１２０）
１３．ＩＫＡＲｏｃｋｅｒ２Ｄベーシックシェーカー（ＳＮ：１００５７４２５４）
１４．Ｋｅｒｎ精密天秤ＡＢＪ３２０－４ＮＭ（ＳＮ：ＷＢ１８ＡＭ００６３）
１５．ＫｅｒｎＰＢＳ４２００－２Ｍ天秤（ＳＮ：ＷＢ１７Ｍ００２３）
１６．ＡＱＵＡＬＹＴＩＣｐＨ－ＭｅｔｅｒＳＤＡＬ１０ＰＨ（ＳＮ：ＡＪ．１２８４２）
１７．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５００－５０００μｌピペット（ＳＮ：Ｇ４４１３９Ｉ）
１８．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ１００－１０００μｌピペット（ＳＮ：Ｊ３７８２８Ｂ）
１９．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ１００－１０００μｌピペット（ＳＮ：Ｈ４１８１５Ｄ）
２０．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ１０－１００μｌピペット（ＳＮ：Ｈ３９０５７Ｄ）
２１．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ１０－１００μｌピペット（ＳＮ：Ｈ３９１４５Ｄ）
２２．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ０．１－１０μｌピペット（ＳＮ：４００５５５Ａ）
２３．コンバータＵＷ２２００（ＳＮ：５９９．００１２５４３３．００６）およびＫＥ７６ホーンを備えたＢａｎｄｅｌｉｎＳｏｎｏｐｌｕｓＧＭ２２００．２発電機（ＳＮ：３７１４．００１２５４３２．００５）
２４．ＥｐｓｏｎＷｏｒｋｆｏｒｃｅＰｒｏＷＦ－４７２０（モデルＣ５８２Ａ）（ＳＮ：＊Ｘ２ＴＵ０４６３７６＊）
２５．ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＮａｎｏＤｒｏｐＬｉｔｅ（ＳＮ：５１４９）

材料／化学物質（一般）
１．グリセリン（ＣＡＳ：５６－８１－５）
２．寒天（ＣＡＳ：９００２－１８－０）
３．酵母抽出物（ＣＡＳ：８０１３－０１－２）
４．イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドＩＰＴＧ（ＣＡＳ：３６７－９３－１）
５．植物性ペプトン（ＣＡＳ：９１０７９－４６－８）
６．塩化ナトリウムＮａＣｌ（ＣＡＳ：７６４７－１４－５）
７．塩化カリウムＫＣｌ（ＣＡＳ：７４４７－４０－７）
８．カナマイシン溶液（ＣＡＳ：２５３８９－９４－０）
９．リン酸ナトリウム一塩基性ＮａＨ２ＰＯ４（ＣＡＳ：１３４７２－３５－０）
１０．リン酸ナトリウム二塩基性Ｎａ２ＨＰＯ４（ＣＡＳ：７５５８－７９－４）
１１．リン酸カリウム一塩基性ＫＨ２ＰＯ４（ＣＡＳ：７７７８－７７－０）
１２．リン酸カリウム二塩基性Ｋ２ＨＰＯ４（ＣＡＳ：７７５８－１１－４）
１３．イミダゾール（ＣＡＳ：２８８－３２－４）
１４．ｄ－デスチオビオチン（ＣＡＳ：５３３－４８－２）
１５．塩酸ＨＣｌ（ＣＡＳ：７６４７－０１－０）
１６．水酸化ナトリウムＮａＯＨ（ＣＡＳ：１３１０－７３－２）
１７．トリス塩基（ＣＡＳ：７７－８６－１）
１８．ＨｉｓＧｒａｖｉＴｒａｐＴＡＬＯＮ（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＧＥ２９－０００５－９４）
１９．ＳｔｒｅｐＴｒａｐ（商標）ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＧＥ２８－９０７５－４７）
２０．ウシ血清アルブミンＢＳＡ（ＣＡＳ：９０４８－４６－８）
２１．ヒアルロン酸（ＣＡＳ：９０６７－３２－７）
２２．酢酸ナトリウムＮａＯＡｃ（ＣＡＳ：６１３１－９０－４）
２３．２×ＬＡＥＭＭＬＩ緩衝液（β－メルカプトエタノールＣＡＳ：６０－２４－２、ドデシル硫酸ナトリウムＣＡＳ：１５１－２１－３）
２４．Ｔｒｉｓ－ＭＯＰＳＳＤＳ泳動用緩衝液（ドデシル硫酸ナトリウムＣＡＳ：１５１－２１－３、ＴｒｉｓＣＡＳ：７７－８６－１、ＥＤＴＡＣＡＳ：６０－００－４、ＭＯＰＳＣＡＳ：１１３２－６１－２）
２５．メタノールＭｅＯＨ（ＣＡＳ：６７－５６－１）
２６．ＣｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーＲ－２５０（ＣＡＳ：６１０４－５９－２）
２７．ウシヒアルロニダーゼＴｙｐＩ－Ｓ（ＣＡＳ：３７３２６－３３－３）

１：配列番号１の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの製造
１．１調製
１．１．１遺伝子合成およびサブクローニング－ｐＥＴ２８ａ（＋）
配列番号１の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼをエンコードする配列番号２のｄ０１６遺伝子配列を、配列番号４の肺炎連鎖球菌の野生型配列を切断し、２段階アフィニティークロマトグラフィー精製のために配列番号８のＣ末端ＨＩＳタグ遺伝子配列および配列番号６のＮ末端Ｓｔｒｅｐタグ遺伝子配列を付加することによって設計した。設計により、両方のタグは、指定された薬物コンパートメントである血管空間において溶解性を増加させ、（エキソ）ペプチダーゼから保護するために、最終酵素産物上に残るように指定された。遺伝子構築物の合成、ＮｃｏＩ／ＢｌｐＩ制限部位を使用したｐＥＴ２８ａへのクローニングは、組換え発現ベクターをもたらす（ｓｙｎ．：ｄ０１６インサートを含むｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターを含むプラスミド）。ｐＥＴ２８ａ（＋）およびインサートｄ０１６のベクターマッププラスミドを図１に示す。

１．１．２大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へのプラスミド形質転換
プラスミドを、供給元のプロトコル（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）に従って４２℃での熱ショックによって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞の宿主細胞に形質転換した。本発明の宿主細胞の陽性形質転換体の選択を、ｐＥＴ２８ａがエンコードする耐性に従って、５０μｇ／ｍｌカナマイシン抗生物質を含む溶原性ブロス（ＬＢ）寒天プレート上で行った。プレートを室温で４８時間増殖させた。

１．１．３溶原性ブロス（ＬＢ培地およびグリセロール原液調製物における本発明の宿主細胞の形質転換培養（－８０℃保存）
本発明の宿主細胞の単一クローンをプレートから採取し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃で一晩培養した。滅菌した５０％グリセロール溶液を用いて滅菌パイロジェンフリーチューブを調製した。滅菌層流条件下で、一晩増殖させた液体培養物（１２～１４時間）を、５０％の液体培養体積および５０％の調製グリセロール溶液を含有するマスタークローン保存チューブで希釈した。マスタークローンを－８０℃で保存した。ｄ０１６の本発明の宿主細胞培養のすべてのバッチは、このマスタークローンに由来する。

１．２製造
１．２．１ＬＢ培地への前培養播種および一晩増殖（３７℃）
（植物性）ＬＢ培地（オートクレーブ処理）を用いて、２つの２５０ｍｌ培養フラスコ（オートクレーブ処理）を調製した。潜在的な細菌汚染物質の増殖を防ぐために、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した。前培養物の調製／ハンドリングは、常に滅菌層流条件下で行った。６５ｍｌのカナマイシン含有（植物性）ＬＢ培地を含む１つのフラスコに、マスタークローン保存チューブからの試料を単一ピペットチップ（オートクレーブ処理）によって播種した。第２のフラスコを、マスタークローンの細胞を含まないピペットチップを含む陰性対照として使用した。前培養チューブを層流下で通気性膜によって密封し、インキュベーションシェーカーに送達した。細胞を３７℃で一晩（１２～１４時間）、１８０ｒｐｍで増殖させた。マスタークローン保存チューブはプロセス全体を通して密封され、層流条件下でのみ開封した。播種後、マスタークローンチューブを密封し、－８０℃で保存した。

１．２．２テリフィックブロス（ＴＢ）培地への主要な培養物播種、一晩（２８～３０℃）のイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導発現
通気性スクリューキャップを備えた１４個の５００ｍｌバッフル付きフラスコをオートクレーブ処理し、それぞれにリン酸カリウム緩衝液（個別にオートクレーブ処理、最終濃度９．４ｇ／ｌＫ_２ＨＰＯ_４および２．２ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４）を含有する２００ｍｌの（植物性）ＴＢ培地（オートクレーブ処理、植物性ペプトン１２ｇ／ｌ、酵母抽出物２４ｇ／ｌ、グリセロール８ｍｌ／ｌ）を充填した。潜在的な細菌汚染物質の増殖を防ぐために、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した。５ｍｌピペットチップ（オートクレーブ処理）を使用して、１２個のフラスコに４ｍｌの前培養物を個別に播種した。４ｍｌの対照前培養物を含む残りの２つのフラスコを対照として使用した。主培養物の調製は、常に滅菌層流条件下で行った。増殖条件を３７℃、１８０ｒｐｍに設定したインキュベーションシェーカーにフラスコを移す前に、すべてのフラスコキャップをしっかりとねじ込んだ。３～４時間および０．７～１．１の増殖ＯＤ６００の後、すべてのフラスコを室温に平衡化した。２００μｌの１００ｍＭＩＰＴＧ原液でタンパク質産生を誘導した。最後に、すべてのフラスコ（汚染対照を含む）を第２のインキュベーターシェーカー内に２８～３０℃（１８０ｒｐｍ）で１８～２０時間置いた。

１．２．３培養物回収および細胞ペレット保存（－８０℃）
１８～２０時間の規定の増殖期間の後、培養フラスコをインキュベーションシェーカーから取り出した。対照フラスコを点検して、バッチ内で汚染物質の増殖が起こらなかったことを確認した。対照は、それ以上処理しなかった。パイロジェンフリーの滅菌５０ｍｌチューブを使用して、１２個すべての培養フラスコを回収した。各フラスコの３×５０ｍｌを回収し、残りの量を廃棄した。すべてのチューブを４０００ｒｃｆ、４℃で３０～４５分間遠心分離した。上清を廃棄し、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼを含むペレットを含有するすべてのチューブを密封し、下流処理で使用するために－８０℃で保存した。

１．３下流処理
１．３．１採取／前処理：超音波処理による細胞溶解、遠心分離による断片除去
ペレットを、１０ｍｌの一般的な下流緩衝液ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、室温で２８０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＫＣｌ、１５．１ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、４．９ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４を含有、ｐＨ＝７．４）にボルテックスによって再懸濁した。同じフラスコ起点の３本のチューブを超音波処理のために合わせ（３６本のチューブを１２本のチューブへと組み合わせた）、処理するまで氷上で保存した。超音波処理器を６０％振幅、２秒間オン４秒間オフサイクルに設定した。各チューブを個別に超音波処理し、１００ｍｌガラス瓶中の氷水で囲み、すべての試料について一定の低温を確保した。すべての試料の超音波処理後、チューブを４０００ｒｃｆおよび４℃で４５分間遠心分離した。上清を、有意な量の細胞断片材料が移動しないことを確認しながら、新しい滅菌パイロジェンフリーの５０ｍｌチューブに移した。４０００ｒｃｆおよび４℃で４５分間の遠心分離のさらなるラウンドを行って、残留細胞断片を除去した。本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼを含む得られた上清を、ＨＩＳ精製に直接使用した。

１．３．２精製Ｉ：ＨＩＳアフィニティークロマトグラフィー、その後の溶出液の短時間保存（氷上）
１８個の重力ＨＩＳ精製カラムを一般的なＰＢＳ下流緩衝液に平衡化した。各遠心分離チューブの内容物を３つのＨＩＳカラムに分配した。精製手順を単一バッチについて２回繰り返した（バッチあたり２×１８カラム＝３６カラム精製）。未処理のチューブを常に氷上で保存した。各チューブのうち、３×９ｍｌの上清試料を、チューブ内に残っている残留細胞ペレットを動揺させないように、ピペッティングによって３つの独立したＨＩＳカラムに慎重に移した。次いで、充填したカラムを１０ｍｌの１０ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液で洗浄した後、新しい滅菌パイロジェンフリーのチューブで調製した６ｍｌの１５０ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液で溶出した。同じ生成フラスコを起点にする３つのカラムの溶出液を合わせ（合計３６本の精製溶出液を１２本のチューブへと組み合わせた）、一般的な下流緩衝液ＰＢＳによって３５ｍｌに希釈した。本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼの精製された試料を、以下のＳＴＲＥＰ精製まで氷上で保存した。ＨＩＳ精製カラムを、１２ｍｌの３００ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液を適用することによって洗浄し、１２ｍｌの超純水、続いて１２ｍｌの一般的な下流緩衝液ＰＢＳによって２回目の実施のために準備した。

１．３．３精製ＩＩ：ＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィー、緩衝液交換（トリスＨＣｌＮａＣｌ）、溶出液の短時間保存（氷上）
本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼのＨＩＳ精製タンパク質試料を含むすべてのチューブを、ＳＴＲＥＰ精製プロセス全体が完了するまで氷上で保存した。ＨＩＳ精製からの組み合わせた溶出液試料の各々について、５ｍｌ／分未満の流速を有するシリンジベースのＳＴＲＥＰ精製工程の２回の反復を各プロセスで実施した（ＨＩＳ精製からの１２本の組み合わせチューブを２４個のＳＴＲＥＰカラムで処理した）。ＳＴＲＥＰカラム（床体積５ｍｌ）を洗浄し、２×２５ｍｌの一般的な下流緩衝液ＰＢＳで平衡化した。１７．５ｍｌの溶出液試料を適用し、カラムを通した。次いで、充填されたカラムは、５０ｍｌの一般的な下流ＰＢＳ緩衝液で洗浄され、あらゆる残留汚染タンパク質を除去した。２０ｍｌの２．５ｍＭｄ－デスチオビオチン含有ＰＢＳ緩衝液を適用することによって、目的のタンパク質を新鮮な滅菌パイロジェンフリーのチューブに溶出し、これを氷上で常に保存した。カラムを１５ｍｌの超純水、続いて１５ｍｌの０．５ＭＮａＯＨ、続いて１５ｍｌの超純水、最後に２５ｍｌの一般的な下流ＰＢＳ緩衝液によって再生した。この段階で、次の試料を同様に充填し、精製した。単一のＳＴＲＥＰカラムを１２回の精製実施、すなわちバッチの半分に使用した。全バッチの精製後、ＳａｒｔｏｒｉｕｓＶｉｖａＳｐｉｎ２０５０ｋＤａ遠心濃縮器を介して緩衝液交換を行った。各ＶｉｖａＳｐｉｎに２０ｍｌのＳＴＲＥＰ溶出液を充填した。４０００ｒｃｆ、４℃で４５分間の遠心分離によって、試料を１ｍｌ未満に濃縮した。本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼの精製タンパク質をＶｉｖａＳｐｉｎｓに回収し、トリスＨＣｌＮａＣｌ（室温で５０ｍＭトリス、１５４ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）を２０ｍｌまで添加することによって緩衝液交換した。この遠心濃縮およびトリスＨＣｌＮａＣｌによる２０ｍｌまでの再希釈の手順を、その時点から３回行って、ＣｏＡの仕様を満たした。最後の遠心分離後、ＶｉｖａＳｐｉｎを２０ｍｌではなく５ｍｌに充填した。次いで、各ＶｉｖａＳｐｉｎを慎重に再懸濁し、５ｍｌをパイロジェンフリーの滅菌チューブ内に取り出した。５ｍｌのトリスＨＣｌＮａＣｌによるさらに２回の再懸濁を実施して、ＶｉｖａＳｐｉｎｓからの所望のタンパク質の良好な回収を確実にした。各々１５ｍｌ緩衝液交換した、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼのタンパク質を含有する１２本すべてのチューブを、研磨工程のために氷上に維持した。

１．３．４任意選択の研磨：エンドトキシン（ＬＰＳ除去）、粒子除去（濾過）、滅菌濾過、長期保存（－１５℃）
研磨のために、２回のポリミキシンＢベースのエンドトキシン除去工程、２回の滅菌濾過工程および１回の粒子除去工程を行った。準備において、すべての緩衝液交換タンパク質を滅菌パイロジェンフリーの０．２２μｍＰＥＳフィルターに通した。濾液を新鮮な滅菌パイロジェンフリーのチューブ内で氷上で保存した。以下の工程を無菌層流条件下で実施した。各試料に対して、（２つの個別の）固定化ポリミキシンＢカラム（供給元ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）でのエンドトキシン除去を２回連続して実施した。各カラムを合計１５ｍｌの供給された再生緩衝液で洗浄して残留エンドトキシンを除去し、続いて合計１８ｍｌの供給された平衡化緩衝液（リン酸系）で洗浄して再生緩衝液のすべてを除去した。さらに、合計１５ｍｌのトリスＨＣｌＮａＣｌを適用して、リン酸緩衝液をさらに除去した。１５ｍｌの滅菌濾過試料を第１のカラムに充填し、新しい滅菌パイロジェンフリーチューブに集めた。本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼの残りのタンパク質を集め、収率を高めるために、５ｍｌのトリスＨＣｌ／ＮａＣｌをカラムに適用し、フロースルーを同じチューブに集めた。新鮮な第２のカラムを使用してプロセスを繰り返した。両方のエンドトキシン除去カラムを、合計１０ｍｌの再生緩衝液、続いて合計１０ｍｌの平衡化緩衝液、最後に続いて合計１５ｍｌのトリスＨＣｌＮａＣｌによって、バッチ実施中に複数回簡単に再生した。（全バッチについて）合計して２つのエンドトキシン除去カラムのセットを使用した。エンドトキシン除去カラムを３回の試料実施後に再生した。これらのエンドトキシン除去手順をすべての試料について行い、得られた試料を氷上で保存した。次いで、試料を新鮮な滅菌パイロジェンフリーのチューブに収集し、３０００ｒｃｆで１０℃で２０分間遠心分離するために、層流下で新鮮なＳａｒｔｏｒｉｕｓＶｉｖａＳｐｉｎ２０１００ｋＤａ遠心濃縮器に移した。層流条件下で、ＶｉｖａＳｐｉｎフロースルーを再懸濁し、新鮮な滅菌パイロジェンフリーのチューブに集めた。（各試料について個別に）すべてのフロースルーを集めた後、層流の内側で滅菌パイロジェンフリー０．２２μｍＰＥＳフィルターによる滅菌濾過をもう１ラウンド行った。パイロジェンフリーピペットチップを使用して、試料アリコートを作製して、２８０ｎｍ吸収によって最終試料中のタンパク質の濃度を測定した。この濃度データに基づいて、合わせた生成物をトリスＨＣｌＮａＣｌによって約０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。バッチの最終生成物から複数の少量アリコートを、滅菌パイロジェンフリーチューブ中でのバッチ分析のために調製した。本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６を含む最終生成物およびアリコート化されたすべてのバッチ分析試料を、パラフィルムによってしっかりとねじ止めし、密封した後、－１５℃で保存した。

大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ（＋）シェーカーフラスコ発現からのタンパク質収量［ｍｇ／ｍｌ］を、ＨＩＳおよびＳＴＲＥＰ精製後のタンパク質の量［ｍｇ］を、タンパク質発現中の培養物体積［ｍｌ］を基準にして２８０ｎｍでの吸収（１３２５９０ｍｏｌ－１ｃｍ－１の計算された吸収係数および８４５１６Ｄａの計算された質量）を介して測定することによって決定した。

したがって、得られた収量は約０．０９～０．１３ｍｇ／ｍｌであった（ＨＩＳ精製後）。ＨＩＳ精製、ＳＴＲＥＰ精製および研磨後の最終収量は約０．０４～０．０６ｍｇ／ｍｌであった。

１．４バッチ分析
１．４．１タンパク質純度：ＣｏｍａｓｓｉｅＲ－２５０染色による最終バッチ純度のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
タンパク質純度の分析のために、単一バッチ分析アリコートを解凍し、２８０ｎｍの吸光度によって濃度を確認した。このデータに基づいて、０．１μｇ／２５μｌ～１６μｇ／２５μｌの濃度の試料を作成して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで純度を分析した。各希釈物に２５μｌの２×ＬＡＭＭＥＬＩ緩衝液を添加し、ピペッティングによって穏やかに混合した。次いで、ゲルマトリックスを通して均一な透過を改善するために、試料を充填前に６０℃で２０分間インキュベーションすることによって変性させた。その後、２０℃および６０００ｒｃｆで１分間の遠心分離を行い、凝縮物を試料体積に戻した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＧｅｌＢｏｘを途中までＧｅｎＳｃｒｉｐｔＴｒｉｓ－ＭＯＰＳＳＤＳ泳動緩衝液で満たし、すぐに使用できるＳｕｒｅＰａｇｅゲルを安全ストリップの除去後に導入した。次いで、内部空間をＴｒｉｓ－ＭＯＰＳＳＤＳ泳動緩衝液で完全に満たし、コームを穏やかに除去した。１００μｌのＴｒｉｓ－ＭＯＰＳＳＤＳを複数回ピペッティングすることによって個々のローディングチャンバ（ゲルあたり１２）を洗浄し、グリセロールを除去した。すべての変性および調製された試料（５０μｌ）を充填し（ゲルあたり１１）、追加のチャンバを使用して５μｌのＮＥＢＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎｌａｄｄｅｒを適用した。ＧｅｌＢｏｘを密封し、ラダーの最小バンドがゲルの枯渇に近づくまで（６０～９０分）電源（１２０Ｖ）に接続した。電源を切り、ゲルをチャンバから取り出した。ゲルカセットを開封した後、ゲルを、染色溶液（５０％ＭｅＯＨ、４０％超純水、１０％酢酸、１．０ｇ／ｌＣｏｍａｓｓｉｅＲ－２５０）で１ｃｍレベルまで充填した染色ボックス内に置いた。ゲルをロッカーシェーカーで一晩染色した。染色溶液を翌朝に除去した。

ゲルを脱塩水で洗浄し、推定７０～９０℃までマイクロ波中で加熱した。次いで、ゲルをシェーカーに２０分間移した。バンドが明確に見え、バックグラウンドシグナルが有意に減少するまでプロセスを繰り返した。最後の工程として、脱色スキャン（１２００ｄｐｉ）を行い（図２参照）、レーンあたり０．１μｇから１６μｇまでの試料において試料汚染バンドの可視性を監視することによって、検出限界に基づいて純度を評価した。検出限界は、既知量（０．２μｇおよび０．１μｇ）の参照タンパク質（ＢＳＡ）によって検証した。

図２は、０．２μｇおよび０．１μｇの濃度のＢＳＡタンパク質、ラダー参照バンド、ならびに１６μｇ、８μｇ、４μｇ、２μｇの濃度の本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼを含む試験バッチのスキャンを表す。本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼのタンパク質は、８０ｋＤａおよび１００ｋＤａのラダー参照バンドの間を移動し、これにより、本発明のタンパク質が正しいサイズであることが確認される。

汚染バンドは、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼの充填濃度（０．１－１６μｇ）のいずれにおいても検出できず、これは、単一の汚染タンパク質の理論純度が９８．８％超であることを示している。この発見は、レーンあたり０．２μｇでの検出限界に基づいているが、分析されたタンパク質およびＢＳＡも、レーンあたり０．１μｇで既に検出され得る。

材料：
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＧｅｎＢｏｘＭｉｎｉ電気泳動槽（Ｌ００７８０）
ＮＥＢＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ（Ｐ７７１２）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＳｕｒｅＰａｇｅゲル１０ｘ８１２％（Ｍ００６６８）
ＰｅｑｌａｂＴＳ－１００サーモシェーカー（装置参照）
ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＭｉｎｉ３００ＶＰｌｕｓ電源（装置参照）
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＮａｎｏＤｒｏｐｌｉｔｅ（装置参照）
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＴｒｉｓ－ＭＯＰＳＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｍ００１３８）
Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＧＥ）ＢＳＡ（０５４７０）
Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＬＡＥＭＭＬＩ２ｘ緩衝液（Ｓ３４０１）
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペット（装置参照）
Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｎａｌｇｅｎｅ）染色ボックス（Ｚ３５８２９０）
Ｃａｒｌ－Ｒｏｔｈメタノール（ＫＫ３９．２）
Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーＲ－２５０（２７８１６－２５Ｇ）
ＥｐｓｏｎＷｏｒｋｆｏｒｃｅＰｒｏＷＦ－４７２０（装置参照）
ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡｒｉｕｍＭｉｎｉＰｌｕｓ（装置参照）
ＩＫＡＲｏｃｋｅｒ２Ｄベーシックシェーカー

１．４．２タンパク質活性：比活性測定
ＵＳＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＵＳＰ）によれば、ヒアルロニダーゼの単位活性は、ＵＳＰＮａｔｉｏｎａｌＦｏｒｍｕｌａｒｙＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｔａｎｄａｒｄｓによる較正によって決定される。単位活性を以下のように定義した：「一単位は、この生成物の各ロットと同時にアッセイされるＵＳＰ参照標準ヒアルロニダーゼの６００ｎｍでの吸光度の変化（濁度の変化）に基づく」。

この標準物質はもはや購入できないので、供給元であるＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈは、以前に較正された参照酵素を使用する方法を導き出した。新しい単位の定義は以下の通りである：「一単位は、３７℃、ｐＨ５．７において毎分０．３３０のＡ６００ｎｍの変化を引き起こす（４５分アッセイ）」。

さらに：「ＵＳＰヒアルロニダーゼ標準で定義された活性を用いて見出された結果と最も近接して合わせるために、新しい単位定義において０．３３０の吸光度値の変化を選択した。その結果、中止されたＵＳＰベースの単位定義および新しい単位であるＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ単位定義は、約１：１の変換係数を示すことになる（古い一単位は新しい一単位とほぼ等しいことになる）」。活性単位の定義に関する情報源はまた、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍｌ？ＴａｂｌｅＰａｇｅ＝１１１６７９３５５の下で導出可能である。

本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼの活性単位を測定するための濁度アッセイを、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈプロトコル（すべてのアッセイ緩衝液の同一の調製、反応パラメータおよび測定手順を含む）に従って行った。任意の変更された手順を以下に説明する。

また、このように記載されたＵＳＰに基づく比活性分析を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製の「参照」のヒアルロニダーゼに対してさらに較正して、個々の測定から生じる偏差を除去した。この参照酵素（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈウシヒアルロニダーゼＴｙｐＩ－Ｓ［Ｈ３５０６］）を種々の濃度で使用して、測定された透過率（ブランクＡ６００－試料Ａ６００）をＵ／ｍｇに変換するための標準曲線（線形フィット）を作成した。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈは、上記のプロトコルに従って比活性を決定した。

標準物質（３．１６Ｕ／１．５ｍｌ反応物－６．５５Ｕ／１．５ｍｌ反応物）は希釈手順によって調製した。比活性を測定するために、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ（ｓｙｎ：ｄ０１６）の各試料を（必要に応じて）０．１ｍｇ／ｍｌの濃度までトリスＨＣｌＮａＣｌ中に希釈した。濃度をＡ２８０測定によって確認し、同定された偏差を使用して、対応する比活性測定値を補正した。

その後、試料をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈアッセイの酵素希釈緩衝液に４００倍希釈し、当該１１．７μｌの希釈試料を反応１．５ｍｌ当たり使用して、１．５ｍｌの反応当たり２．９３ｎｇのｄ０１６を得た（以下の表１参照）。２．９３ｎｇの酵素の希釈手順は、上記の標準範囲の吸光度内になるように経験に基づいて決定した。

したがって、最終反応（各反応に１１．７μｌを使用）における本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６の量は、２．９３ｎｇ／反応に相当する。

吸光度測定のために、４５分間反応物の２５０μｌを１．２５ｍｌの沈殿緩衝液（ｐＨ＝３．７５）と合わせ、分光光度計でＡ６００について測定した。この値を使用して透過率を計算し、前述のプロトコルに従って値を比活性に変換した。

濁度方法の詳細は、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈの以下のウェブサイトに記載されている：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／Ｓｉｇｍａ／Ｇｅｎｅｒａｌ＿Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／２／ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ．ｐｄｆ

ＵＳＰ単位の定義に従って決定されたＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈウシヒアルロニダーゼに関して、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６Ｓは、以下の表２に示さすようにそれぞれの比活性をもたらした：

したがって、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼの一般的な比活性は、１．５Ｍｉｏ．ＵＳＰＵ／ｍｇ＋／－１５０ｋＵＳＰＵ／ｍｇの範囲である。これは、２５．０００カタール／ｋｇ＋／－２．５００カタール／ｋｇに等しい。

材料：
Ｊｅｎｗａｙ６３０５分光光度計（装置参照）
Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）セミマイクロＵＶキュベット（Ｚ６２８０２６）
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペット（装置参照）
ＰｅｑｌａｂＴＳ－１００サーモシェーカー（装置参照）
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＮａｎｏＤｒｏｐｌｉｔｅ（装置参照）
Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）３８１０Ｘマイクロチューブ（Ｚ６０６３４０）
Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＧＥ）ＢＳＡ（０５４７０）
Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈヒアルロン酸（５３７４７）
Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈウシヒアルロニダーゼＴｙｐＩ－Ｓ（Ｈ３５０６）
Ｃａｒｌ－Ｒｏｔｈ酢酸（３７３８．２）
Ｃａｒｌ－ＲｏｔｈＨＣｌ（Ｐ０７４．４）
Ｃａｒｌ－ＲｏｔｈＮａＯＨ（９３５６．１）
ＣａｒｌＲｏｔｈ酢酸ナトリウム（３８５６．１）
ＣａｒｌＲｏｔｈリン酸ナトリウム一塩基性（２３７０．３）
ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡｒｉｕｍＭｉｎｉＰｌｕｓ（装置参照）

１．４．３エンドトキシン定量化
エンドトキシン定量化のために、供給元のＧｅｎＳｃｒｉｐｔによる試験キットＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ（商標）ＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃＬＡＬＥｎｄｏｔｏｘｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｌ００３５０）を、製造業者のプロトコルに従って使用した。キットには、エンドトキシン標準物質、エンドトキシンフリー水、ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅ、発色基質、色安定剤、エンドトキシンフリーピペットチップおよびチューブ、ならびにチューブラックが含まれていた。すべての包装を超純水で洗浄し、構成要素を層流下で滅菌した。粉末／凍結乾燥の構成要素を再構成し、製造業者のプロトコルに従って保存した。供給されたキットのエンドトキシン標準物質を希釈することにより、４つのエンドトキシン測定用標準物質を調製した（０．１ＥＵ／ｍｌ、０．２５ＥＵ／ｍｌ、０．５ＥＵ／ｍｌ、１．０ＥＵ／ｍｌ）。標準物質を使用して、各試料の吸収をＥＵ／ｍｌ単位の濃度に変換することができる基準曲線を作成した。すべてのバッチ試料測定中に、それぞれの標準物質を並行して分析した。バッチ分析のために、単一バッチ分析アリコートを氷上で解凍し、チューブを消毒し、超純水で洗浄し、層流に移した。１００μｌの未希釈バッチ試料、ブランクとしての１００μｌのエンドトキシンフリー水、および０．１ＥＵ／ｍｌ～１．０ＥＵ／ｍｌのエンドトキシン濃度を有する４つの標準物質を一回の分析実施に使用した。すべての試料ハンドリングは、滅菌層流条件下で行った。以下の工程を実施した。
１．十分に混合した標準物質、ブランクおよび試料をＬＡＬと共に３７℃で１２分間インキュベートする
２．発色反応のための基質溶液を添加し、３７℃で６分間インキュベートする
３．穏やかに混合しながら各測定バイアルに３つの色安定剤溶液を段階的に添加する
４．分光光度計での５４５ｎｍの吸収測定のために、最終反応溶液をキュベットに移す。ブランクからのバックグラウンドをすべてのバッチの試料測定値から差し引いて、標準曲線をプロットした。ＥＵ／ｍｌでの試料のエンドトキシン濃度を標準曲線から外挿した。最終バッチ生成物／アリコート濃度０．１ｍｇ／ｍｌを考慮して、エンドトキシンレベルをＥＵ／生成物ｍｇとしてさらに記載した。

１．４．４無菌試験
植物性ＬＢ寒天（大豆ペプトン１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）を超純水を用いて調製し、オートクレーブ処理した。高温の瓶を滅菌ペトリ皿と共にエタノール滅菌層流内に置いた。抗生物質を増殖培地に添加せずにプレートに注いだ。無菌試験のために、単一バッチ分析アリコートを取り出し、氷上で解凍した。プレートを凝固させ、冷却した後、単一バッチ分析アリコートを、滅菌パイロジェンフリーピペットチップを備えるピペットで単一プレート上に移し、滅菌Ｌａｚｙ－Ｌ－Ｓｐｒｅａｄｅｒによって広げた。滅菌濾過したトリスＨＣｌＮａＣｌを含むプレートは、環境性汚染について試験するための対照として機能させた。形質転換されていない大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を含むプレートは、陽性対照として機能させた。プレートは閉じたが、密封せずに空気交換を可能にした。環境性無菌を確実にするために、製品無菌試験用のプレートを層流内に４日間保持して、何らかの増殖を点検した（時間枠は、層流での処理中の環境性汚染速度に応じて適応させてもよい）。製品の無菌は、目に見える増殖がないことで確認する。

図３は、大腸菌陽性対照（図３ａ）、ＬＢプレート陰性対照（図３ｂ）、および本発明のｄ０１６試料（図３ｃ）を含む４日間にわたるＬＢ寒天プレートの画像を表す。本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６は、４日間にわたって抗生物質フリーの植物性ＬＢ寒天プレート中でいかなる増殖も示さず、したがって、無菌であると見なされるべきである。

したがって、本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６は、医薬組成物、特に滅菌品質を必要とする医薬組成物、例えば静脈内適用に使用することができる。

材料：
ＣａｒｌＲｏｔｈ植物性ペプトン（２８３２．２）
ＣａｒｌＲｏｔｈＮａＣｌ（３９５７．３）
ＣａｒｌＲｏｔｈ酵母抽出物（２３６３．３）
ＣａｒｌＲｏｔｈ寒天（６４９４．１）
ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（無菌）ペトリ皿（Ｐ５９８１）
ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（無菌）Ｌａｚｙ－Ｌ－Ｓｐｒｅａｄｅｒｓ（Ｚ３７６７７９）
ＣａｒｌＲｏｔｈ（ＳｏｒｅｎｓｏｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）パイロジェンフリー１０００μｌフィルターチップ（９７７３．１）
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペット（装置参照）

１．４．５安定性および溶解性、凍結－融解試験
本発明の試料の安定性および溶解性を試験するために、複数の濃度の精製タンパク質の比活性測定を経時的に行った。複数の試料希釈液を、０．２ｍｇ／ｍｌ（生成物の２００％最終原液）、０．１ｍｇ／ｍｌ（生成物の目標最終原液）および０．０１ｍｇ／ｍｌ（目標の適用のための低濃度用量）で、滅菌濾過したトリスＨＣｌＮａＣｌ中で調製した。本発明のタンパク質濃度は、２８０ｎｍ吸収を用いて測定した。それぞれの希釈物は、適切な保存およびハンドリング条件を表す－１５℃、２～８℃および２５℃で保存した。比活性測定のためのアリコートを、安定性試験の開始時、１日後、２日後、３日後、１週間後、２週間後および４週間後に取り出した。すべてのアリコートを、０．９％の薬用生理食塩水のイオン強度に等しい、１５４ｍＭのＮａＣｌ濃度を含むトリスＨＣｌＮａＣｌ中で保存した。また、アリコートは測定まで氷上で保存した。測定は、活性測定プロトコルに従って行った。

さらに、凍結－融解試験を実施して、凍結－融解プロセス中に生成物溶液がどのように氷結晶形成に耐えるかをベンチマークテストした。試料の－８０℃での凍結および融解を５回繰り返す間、各サイクル後にアリコートを取り出して活性を測定した。一般的な安定性および溶解性の結果は、試料濃度が－１５℃、２～８℃および２５℃で０．１ｍｇ／ｍｌを超える場合、比活性は７日間まで全体的に低下しないことを実証した。試料の凍結回数が２回未満であれば、－８０℃凍結－融解サイクルの凍結－融解安定性は、比活性を低下させない。試料保存濃度は、１回の凍結－融解サイクル中、ならびに－１５℃および２～８℃での１日の保存中に５～１５％のタンパク質の損失を示した。これはおそらく吸着によるものである。２５℃で０．２ｍｇ／ｍｌを超える濃度を有する試料は、７日間にわたって濃度減少を示さないようである。

結果は、最終生成物が、絶対的な安定性を確実にするために、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌを超える濃度でタンパク質低結合チューブに保存され、２回以上凍結すべきでないことを示している。測定は、１５０～１５００μｌの少ない充填量の小さなマイクロチューブ（１．５ｍｌ）中で行った。これは、５０ｍｌチューブ内での生成物の保存と比較して、はるかに小さい体積対表面比率をもたらす。したがって、上記の結果は、市販品よりも吸着効果に依存する可能性が非常に高くなる。

材料：
Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＴｒｉｓ（ＴＲＩＳ－ＲＯ）
Ｃａｒｌ－ＲｏｔｈＨＣｌ（Ｐ０７４．４）
ＣａｒｌＲｏｔｈＮａＣｌ（３９５７．３）
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＮａｎｏＤｒｏｐｌｉｔｅ（装置参照）
Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）３８１０Ｘマイクロチューブ（Ｚ６０６３４０）
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペット（装置参照）

２：先行技術のヒアルロニダーゼペプチドと本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼ（ｓｙｎ：ｄ０１６）との比活性の比較
２．１ストレプトマイセス・コガネイエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｏｇａｎｅｉｅｎｓｉｓ）（ｓｙｎ：Ｍｅｓｓｉｎａヒアルロニダーゼ）由来の細菌性ヒアルロニダーゼと本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼとの比活性の比較
「ペリプラズムの可溶性部分におけるｒＨｙａｌ＿Ｓｋは、このように、発酵によって産生される自家Ｈｙａｌよりも６７０～７５０倍高い、非常に高い機能活性（４００００単位／ｍｇ超）を有する約２ｇ／Ｌの培養培地の最終濃度で産生された」（Ｍｅｓｓｉｎａｅｔａｌ．，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｂａｃｔｅｒｉａｌｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅａｎｄｉｔｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｆｏｒｍ」、ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｉｅｓ（ＦＥＢＳ）Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌｕｍｅ５９０，Ｉｓｓｕｅ１４，Ｊｕｌｙ２０１６，ｐｐ．２１８０－２１８９を参照のこと。）。

したがって、ストレプトマイセス・コガネイエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｏｇａｎｅｉｅｎｓｉｓ）由来の細菌性Ｍｅｓｓｉｎａヒアルロニダーゼのｍｇあたりの比活性は、４０，０００Ｕ／ｍｇ超、すなわち４０，０００Ｕ／ｍｇ～５０，０００Ｕ／ｍｇである。

実施例１．４．２に示す本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６の比活性は、１，５００，０００Ｕ／ｍｇである。

したがって、タンパク質１ｍｇ当たりの本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６の比活性は、比較するＭｅｓｓｉｎａヒアルロニダーゼの比活性の約３０倍～３７．５倍である。

２．２ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼと本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６との比較
「ヒトＰＨ２０の活性、Ｈｉｓタグ（カタログ番号ＰＨ０－Ｈ５２２５）は、比濁アッセイ（４５分アッセイ）でＨＡを加水分解する能力で測定される。その比活性は、４０，０００Ｕ／ｍｇ超である。（単位定義：ヒアルロニダーゼ活性の１単位は、３７℃、ｐＨ５．３５、２．０ｍＬの反応混合物において毎分０．３３０のＡ６００の変化を引き起こす）」。－ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／Ｐ５６３－Ｈｕｍａｎ－ＰＨ２０－－ＳＰＡＭ１－Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｈｉｓ－Ｔａｇ．ｈｔｍｌ、を参照のこと。

したがって、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのｍｇあたりの比活性は、４０，０００Ｕ／ｍｇ超、すなわち４０，０００Ｕ／ｍｇ～５０，０００Ｕ／ｍｇである。

したがって、タンパク質１ｍｇ当たりの本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６の比活性は、比較するヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼの比活性の約３０倍～３７．５倍である。

２．３ウシヒアルロニダーゼと本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６との比較
「ヒアルロニダーゼはヒアルロナンを分解し、癌の進行中に不適切に調節されることが分かっている。これらの酵素は、ヒアルロン酸、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸のβ－Ｎ－アセチルヘキソサミン－［１→４］グリコシド結合をランダムに切断する。単位定義：１単位は、２．０ｍＬの反応混合物中、ｐＨ５．３５、３７℃で毎分０．３３０の６００ｎｍでの透過率％の変化を引き起こす（４５分アッセイ）」。－Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼの供給元を参照のこと。
ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ、Ｉ－Ｓ型、凍結乾燥粉末、４００～１，０００Ｕ／ｍｇ固体、
マウス胚細胞培養に適したウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ、ＩＶ－Ｓ型、粉末、７５０～３，０００Ｕ／ｍｇ固体、
ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ、ＩＶ－Ｓ型、凍結乾燥粉末（本質的に無塩）、７５０～３，０００Ｕ／ｍｇ、
ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ、ＶＩＩＩ型、凍結乾燥粉末、３００～１，０００Ｕｍｇ、
ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ、ＶＩ－Ｓ型、凍結乾燥粉末、３０００～１５，０００Ｕ／ｍｇ。

したがって、ウシヒアルロニダーゼの比活性は、３００～１５，０００Ｕ／ｍｇの広範囲にわたる。

したがって、タンパク質１ｍｇ当たりの本発明の修飾細菌性ヒアルロニダーゼｄ０１６の比活性は、比較するウシヒアロニダーゼの比活性の約１００倍～５，０００倍である。

Claims

配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む、またはそれからなる修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドであって、前記ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号７のＣ末端ＨＩＳタグおよび配列番号５のＮ末端Ｓｔｒｅｐタグを含むことを特徴とする、修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド。
好ましくはホモ接合性家族性高コレステロール血症（黄色腫症）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症および糖尿病性足病変からなる群から選択されるヒアルロナン関連および／またはプロテオグリカン関連の疾患または障害の治療または予防に使用するための、請求項１に記載の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド。
請求項１に記載の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドをエンコードする核酸であって、好ましくは配列番号２を含、またはそれからなる、核酸。
発現ベクターと請求項３に記載の核酸とを含む、組換え発現ベクター。
請求項４に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞であって、好ましくは宿主細胞が大腸菌である、宿主細胞。
請求項１または２に記載の精製細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの製造方法であって、以下の工程、
ａ．請求項５に記載の形質転換された宿主細胞を、請求項１または２に記載の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを発現するのに適した増殖条件下で、適した増殖培地中で培養すること、
ｂ．工程ａ）の培養された形質転換宿主細胞を採取すること、
ｃ．工程ｂ）の採取した宿主細胞を溶解し、前記細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含む得られた宿主細胞内容物から、得られた宿主細胞断片を分離すること、および、
ｄ．ＨＩＳアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＴＲＥＰアフィニティークロマトグラフィーを用いて、工程ｃ）の得られた宿主細胞内容物を精製して、請求項１または２に記載の細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの精製された形態を得ること、
を含む、またはこれらの工程からなる、方法。
前記宿主細胞が大腸菌、好ましくは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞である、請求項６に記載の精製細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドの製造方法。
請求項６または７に記載の製造方法に従って得られる、配列番号１を含む、またはそれからなる、修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド。
治療有効量の請求項１、２および８のいずれか一項に記載の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
前記組成物の単位用量が、前記修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチドを２００Ｕ／ｋｇ／日～３０，０００Ｕ／ｋｇ／日の量で含む、請求項９に記載の医薬組成物。
前記組成物が、固体、半固体または液体の適用形態から選択される、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
前記組成物が、経口、経鼻、経皮、直腸、静脈内または筋肉内の適用に適している、請求項９～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
好ましくはホモ接合性家族性高コレステロール血症（黄色腫症）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症および糖尿病性足病変からなる群から選択される、ヒアルロナン関連および／またはプロテオグリカン関連の疾患または障害の治療または予防に使用するための、請求項９～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
請求項１、２および８のいずれか一項に記載の修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、または請求項９～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、またはそれからなる、ヒアルロナン関連および／またはプロテオグリカン関連の疾患または障害の治療方法。
前記ヒアルロナン関連および／またはプロテオグリカン関連の疾患または障害が、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（黄色腫症）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症および糖尿病性足病変からなる群から選択される、請求項１４に記載の治療方法。