CN115702242A

CN115702242A - 一种改性的细菌透明质酸酶多肽、生产方法、药物组合物及其用途

Info

Publication number: CN115702242A
Application number: CN202080102261.8A
Authority: CN
Inventors: 巩特尔·伯加德; 赖纳·伯恩克; 斯文·班森; 伦茨·洛伦兹; 菲利普·舍伦贝格尔
Original assignee: Pharmaceutical Holding Co
Current assignee: Pharmaceutical Holding Co
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2023-02-14
Also published as: WO2021213623A1; EP4139448A1; JP2023522966A; US20230167428A1

Abstract

本发明涉及一种改性的细菌透明质酸酶多肽、其生产方法、包含本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽的药物组合物及其用途。

Description

一种改性的细菌透明质酸酶多肽、生产方法、药物组合物及其用途

技术领域

背景技术

透明质酸是细胞外基质的重要组分，也是间质屏障的数量上显著的成分。透明质酸酶是一种水解酶，可将透明质酸裂解为D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺，从而增加间质基质的通透性。透明质酸酶在自然界中广泛分布。在人体内，已经确定了六种不同的透明质酸酶，HYAL1-4、HYAL-P1和PH-20，其中PH-20被认为发挥了最强的生物活性。

目前，动物来源的牛或羊睾丸透明质酸酶以及合成的透明质酸酶在临床上被用作辅助用药以增加药物的生物利用度、用于治疗外渗或管理与基于透明质酸的填充剂的美容注射相关的并发症。

动物来源的透明质酸酶会带来传播动物疾病(如海绵状脑病)的风险，而人类和细菌的重组透明质酸酶具有更高的纯度，从而降低了药物风险。

为了满足临床需要，本发明的目的是提供一种透明质酸酶多肽，其适用于药物应用，特别是具有适宜的高纯度，和/或适宜的比活性、适宜的稳定性和溶解性，并且同时具有有时间和成本效益的生产方法。

发明内容

上述目的至少部分地通过要求保护的发明主题得以解决。优点(优选实施方案)在下文的详细说明和/或附图以及从属权利要求中进行阐述。

因此，本发明的第一方面涉及一种改性的细菌透明质酸酶多肽，其包括与SEQ IDNo.1至少90％的序列同一性或由其组成，其特征在于，该透明质酸酶多肽包括SEQ ID No.7的C端HIS标签和SEQ ID No.5的N端Strep标签。

本发明的第二方面涉及一种编码本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽的核酸，优选其中该核酸包括SEQ ID No.2或由其组成。

本发明的第三方面涉及一种重组表达载体，其包括载体和本发明的核酸。

本发明的第四方面涉及一种用本发明的重组表达载体转化的宿主细胞，优选其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

本发明的第五方面涉及一种纯化的细菌透明质酸酶多肽的生产方法，其包括以下步骤或由以下步骤组成：

a.在合适的生长条件下，在合适的生长培养基中培养本发明的转化的宿主细胞，以表达本发明的细菌透明质酸酶多肽，

b.收获步骤a)中培养的转化的宿主细胞，

c.裂解步骤b)中收获的宿主细胞，并将所得的宿主细胞碎片与所得的包含本发明的细菌透明质酸酶多肽的宿主细胞内容物分离，以及

d.用HIS亲和层析和STREP亲和层析纯化步骤c)所得的宿主细胞内容物，从而得到本发明的纯化的细菌透明质酸酶多肽。

本发明的第六方面涉及一种改性的细菌透明质酸酶多肽，其包括与可根据本发明的生产方法获得的SEQ ID No.1至少90％的序列同一性或由其组成。

本发明的第七方面涉及一种药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本发明的第八方面涉及一种治疗透明质酸相关和/或蛋白多糖相关的疾病或病症的方法，所述疾病或病症优选地选自由纯合子型家族性高胆固醇血症(黄瘤病)、杂合子型家族性高胆固醇血症或糖尿病足综合征组成的组，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽或本发明的药物组合物。

在上文中公开的本发明的创造性方面可以包括从属权利要求中所阐述的或在以下详细描述中和/或在附图中公开的其优选的创造性实施方案的任何可能的(子)组合，只要所产生的特征组合对本领域技术人员来说是合理的。

附图说明

本发明进一步的特征和优点将从附图中得出，其中

图1表示本发明的重组表达载体的质粒载体图谱。

图2表示SDS-Page分析后的染色凝胶扫描图，包括不同浓度的参考蛋白(牛血清白蛋白，同义词：BSA)条带、ladder蛋白条带和不同浓度的本发明的改性的细菌透明质酸酶条带。

图3表示包含大肠杆菌阳性对照(图3a))、LB-平板阴性对照(图3b))和本发明的d016样品(图3c))的LB-琼脂平板在4天时间内的图像。

具体实施方式

正如下文更详细地阐述的那样，本发明不同方面的发明人发现，本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽包括与SEQ ID No.1至少90％的序列同一性或由其组成，其特征在于所述透明质酸酶多肽包括SEQ ID No.7的C端HIS标签和SEQ ID No.5的N端Strep标签，表现出>98.8％的高纯度(见实施例部分1.4.1)和1,500,000U/mg的高比活性(见实施例部分1.4.2)。

与此相反，相比较的透明质酸酶，如牛透明质酸酶表现出宽范围的较低的比活性，即在300至15,000U/mg的范围内(见实施例部分2.3)。被认为是人类透明质酸酶中最活跃的PH20也表现出较低的比活性，即在40,000至50,000U/mg的范围内。来自链霉菌考干尼西斯(Streptomyces koganeiensis)的细菌透明质酸酶的比活性与PH20的比活性相当，因此，也低于本发明的改性的细菌透明质酸酶的比活性。

此外，本发明的改性的细菌透明质酸酶表现出适宜的稳定性和溶解性，这在下面的实施例部分1.4.5中显示。增加的稳定性，包括对(外)肽酶的稳定性(半衰期)可能是由于使用了相应的SEQ ID No.7的C端HIS标签和相应的SEQ ID No.5的N端Strep标签。与野生型透明质酸酶(见SEQ ID No.3，编码野生型透明质酸酶的DNA见SEQ ID No.4)相比，各标签还可以增加本发明的改性的细菌透明质酸酶的溶解性。由于稳定性和溶解性的提高，本发明的改性的细菌透明质酸酶优选用于配制药物组合物，特别是肠外注射组合物。

因此，本发明的用于提供纯化的改性的细菌透明质酸酶的生产方法提供了相对高的产率，同时提供了已是实验室规模的高纯度和高比活性，并且考虑到了生产步骤的时间和成本效益。

在本发明的背景下，“本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽包括与SEQ ID No.1至少90％的序列同一性或由其组成，其特征在于，所述透明质酸酶多肽包括SEQ ID No.7的C端HIS标签和SEQ ID No.5的N端Strep标签”的表述与“本发明的细菌透明质酸酶多肽”、“本发明的细菌透明质酸酶”或“本发明的透明质酸酶”同义，其中这些表述是指本发明的透明质酸酶包括SEQ ID No.1的序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％，或者它由100％的SEQ ID No.1组成，并且本发明的透明质酸酶同时具有SEQ ID No.7的C端HIS标签和SEQ ID No.5的N端Strep标签。如果本发明的透明质酸酶的序列由100％的SEQ ID No.1组成，本发明的透明质酸酶也被同义地称为“d016”。

因此，本发明的改性的细菌透明质酸酶，优选d016，适合用于药物组合物中。

鉴于所提出的相对高的比活性、纯度、稳定性、溶解性和安全性，本发明的改性的细菌透明质酸酶，优选d016，适合用于治疗或预防透明质酸相关和/或蛋白多糖相关的疾病或病症。本发明人发现，本发明的改性的细菌透明质酸酶，优选d016，特别适合用于治疗或预防纯合子型家族性高胆固醇血症(黄瘤病)、杂合子型家族性高胆固醇血症或糖尿病足综合征。

纯合子型家族性高胆固醇血症(HoFH)是一种罕见的遗传性疾病，发病率为1/1,000,000。作为家族性高胆固醇血症的一种形式，它是一种脂质代谢病症。HoFH患者因低密度脂蛋白(LDL，血液中的胆固醇部分)大量增加并在皮肤和肌腱中沉积(所谓的黄瘤(淡黄色、结节状的脂质沉积))而突出。脂质也沉积在血管壁上，并导致严重动脉粥样硬化的早期发病，显著降低预期寿命。患者在幼年时就遭受第一次心脏病发作，从5岁左右就已经开始，每周都要进行脂质单采术(apheresis)，同时接受最高剂量的药物治疗，然而不幸的是，他们的预期寿命平均只有30年左右。

HoFH应与更常见的杂合子型家族性高胆固醇血症(HeFH)区分开来，后者也与早期心血管事件的风险显著增加有关，但没有那么引人注目。这种遗传性疾病的发病率估计为1:200至1:500。在这里，动脉硬化的迹象，即由血管疾病如外周动脉闭塞性疾病引起的病症和症状，使冠状动脉狭窄直至心脏病发作、中风，也可以在年轻时发生，但与该疾病的纯合子型变体相比发生较晚且程度较轻。

鉴于本发明的细菌透明质酸酶对动脉粥样硬化斑块和动脉硬化血管壁中的组织细胞外基质(ECM)和软骨素-6-硫酸盐及其他蛋白多糖水平的降低作用，本发明的细菌透明质酸酶对HoFH和HeFH的治疗和/或预防是有效的。因此，施用治疗有效量的本发明的改性的细菌透明质酸酶，优选d016，会导致狭窄斑块的尺寸缩小和血管壁的弹性增加。

糖尿病足综合征(DFS)是糖尿病中一种基于无痛性感觉神经病变和/或外周动脉闭塞性疾病(PAVK)的病理变化综合征。它在2型糖尿病患者中最常见，并与足部伤口愈合不良的高风险有关。大约15％的糖尿病患者在其一生中会出现无痛(由于感觉神经病变)、愈合不良的足部伤口。每年约有4％的糖尿病患者出现新的伤口，0.1％的糖尿病患者由于足弓的塌陷而出现所谓的夏科足。

鉴于糖尿病足综合征的PAVK方面，本发明的细菌透明质酸酶通过对动脉粥样硬化斑块和动脉硬化血管壁中的组织细胞外基质(ECM)和软骨素-6-硫酸盐及其他蛋白多糖水平表现出降低作用，对糖尿病足综合征的治疗和/或预防是有效的。因此，它导致了狭窄斑块的尺寸缩小和血管壁的弹性增加。此外，本发明的细菌透明质酸酶对糖尿病足综合征的神经病变方面也有作用。在这方面，它减少了由慢性多发性神经炎引起的神经鞘区域中存在的透明质酸浓度的增加。基于髓鞘隔离功能紊乱的相关神经传输病症得到减少，神经传输能力再次得到提高。

此外，作为第二方面，本发明提供了编码本发明的第一方面的改性的细菌透明质酸酶多肽的核酸。与本发明第一方面相关的所公开的所有特征和实施方案可单独组合或与本发明第二方面(包括其每个优选实施方案)进行(子)组合，只要所产生的特征组合对本领域技术人员来说是合理的。

根据第二发明方面的优选实施方案，所述核酸包括SEQ ID No.2或由其组成。编码本发明透明质酸酶的C端HIS标签的核酸序列优选为SEQ ID No.8，编码本发明透明质酸酶的N端Strep标签的核酸序列优选为SEQ ID No.6。本发明的核酸可以按照任何合适的方法来制备。下面的实施例部分1.1.1描述了一种示例方法。

在本发明的背景下，“本发明的核酸”的表述是指编码本发明的改性的细菌透明质酸酶、优选d016的核酸。本发明的核酸优选包括与SEQ ID.2至少90％的序列同一性或由其组成，优选地，本发明的核酸由100％的SEQ ID No.2组成。

根据本发明的第三方面，提供了包含本发明的第二方面的核酸的重组表达载体。与本发明第一方面或第二方面相关的所公开的所有特征和实施方案可单独组合或与本发明第三方面(包括其每个优选实施方案)进行(子)组合，只要所产生的特征组合对本领域技术人员来说是合理的。

本发明的第三方面的重组表达载体可以按照任何合适的方法制备。下面的实施例部分1.1.1描述了一种示例方法。本发明的重组表达载体包括本发明的包含SEQ ID No.2或由其组成的核酸，任何合适的载体，如pET-28a DNA载体，特别是使用NcoI/BlpI限制性位点的pET28a。本发明的重组表达载体可以是任何适宜的形式，如质粒的形式。

根据本发明的第四方面，提供了用本发明的第三方面的重组表达载体转化的宿主细胞。与本发明第一方面至第三方面有关的所公开的所有特征和实施方案都可单独组合或与本发明第四方面(包括其每个优选实施方案)进行(子)组合，只要所产生的特征组合对本领域技术人员来说是合理的。

本发明的第四方面的宿主细胞可以按照任何合适的方法制备。下面的实施例部分1.1.2中描述了一种示例方法。本发明的宿主细胞可以选自任何合适的宿主细胞。优选地，宿主细胞选自大肠杆菌细胞，更优选大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，其提供了较高产率的本发明的改性的细菌透明质酸酶，优选d016。

本发明的第五方面提供了根据第一发明方面的纯化的细菌透明质酸酶多肽的生产方法。与本发明第一方面至第四方面有关的所公开的所有特征和实施方案都可单独组合或与本发明第五方面(包括其每个优选实施方案)进行(子)组合，只要所产生的特征组合对本领域技术人员来说是合理的。

本发明的生产方法可以使用传统的摇瓶以实验室规模进行，或可以放大用于发酵罐。考虑到放大至发酵罐生产，可以基于高密度生长、表达的开始/停止(offset)、混合的速度和时间以及适用温度来优化工艺步骤。本发明人发现，鉴于本发明的改性的细菌透明质酸酶(优选d016)的高比活性，使用摇瓶的实验室规模已经足以生产有意义的量(每年的量)的本发明的改性的细菌透明质酸酶，优选d016，用于治疗和/或预防纯合子型家族性高胆固醇血症(黄瘤病)、杂合子型家族性高胆固醇血症或糖尿病足综合征。

本发明的第五方面的生产方法包括以下步骤或由以下步骤组成：

步骤a)在合适的生长条件下，在合适的生长培养基中培养根据第四发明方面的转化的宿主细胞以表达根据第一发明方面的本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽。例如，可以使用极好肉汤(terrific broth,TB)培养基。相应的肉汤培养基可以补充适宜的抗生素如卡那霉素，和/或缓冲成分如磷酸钾缓冲液。所述生长培养基还包含适宜的表达诱导剂，例如异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)。根据实验室规模，细胞生长和蛋白表达可以在合适的温度下，优选在28-30℃之间在摇瓶中进行，震荡(优选180rpm)18-20小时。

步骤b)收获步骤a)中培养的转化的宿主细胞。在合适的生长条件下培养所述转化的宿主细胞后，用合适的方法收获宿主细胞。根据实验室规模，优选使用无热原的无菌管来收集收获的含有宿主细胞的生长培养基。优选地将该收获的生长培养基在低温下(优选4℃)离心(优选4000rcf)至少30分钟，以将培养基与宿主细胞分离，所述宿主细胞在离心后聚集成所谓的沉淀物(pellet)。上清液将被丢弃，将收获的管优选地密封并在低温下储存，优选在0℃以下，更优选在-80℃。

步骤c)裂解步骤b)中收获的宿主细胞，并将所得的宿主细胞碎片与所得的包含本发明的细菌透明质酸酶多肽的宿主细胞内容物分离。根据实验室规模，通常将离心后形成聚集沉淀物的宿主细胞在合适的介质，优选合适的缓冲介质，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS；含有280mM NaCl、6mM KCl、15.1mM Na₂HPO₄、4.9mM NaH₂PO₄，pH＝7.4，在室温下)中重新悬浮并混合，优选通过涡旋。宿主细胞通过任何合适的方法，如超声处理，进行裂解。为了在介质内保持合适的温度，超声处理优选在低温下进行，更优选地，在对介质进行超声处理时，使管被冰块包围。用合适的方法将所得的宿主细胞碎片与本发明的细菌透明质酸酶多肽分离，优选通过离心，更优选在例如4℃的低温下，在例如4000rcf下离心至少30分钟。优选地，将包含本发明的细菌透明质酸酶的上清液转移至新管中，并任选地进一步进行一个或多个离心步骤。然后将所得的包含本发明的细菌透明质酸酶的上清液用于纯化步骤d)。

步骤d)用HIS亲和层析和STREP亲和层析纯化步骤c)所得的宿主细胞内容物，以得到第一方面的纯化的本发明的细菌透明质酸酶多肽。优选地，HIS和STREP亲和层析随后进行，其中顺序可以互换，即其中先进行HIS亲和层析纯化，然后进行STREP亲和层析，反之亦然。在下文中，先进行HIS亲和层析，再进行STREP亲和层析的后续纯化被描述为一个示例性实施方案。鉴于HIS亲和层析柱通常比STREP亲和层析柱便宜，在先进行HIS亲和层析的情况下，可以以更具有成本效益的方式实现高纯度的产率。

根据本发明，可以使用任何合适的HIS亲和层析，以便与本发明的改性的细菌透明质酸酶的C端HIS标签(SEQ ID NO.1的氨基酸735至740，还参见SEQ ID NO.7)结合。根据实验室规模，例如，将一个或多个适宜的重力式HIS纯化柱与通用PBS下游缓冲液平衡。步骤c)后产生的每个管的内容物被分配到一个或多个HIS柱。任选地将HIS纯化程序重复一次、两次或多次，优选两次。然后，将加样的一个或多个HIS柱优选地用合适的清洗介质清洗，例如用10mM咪唑PBS溶液，然后用适宜的洗脱介质洗脱，例如用150mM咪唑PBS溶液。一般来说，来自同一生产烧瓶(管)的一个或多个HIS柱的洗脱液被合并，并且优选地用通用下游缓冲液PBS稀释至35ml。优选地，然后将包含本发明的改性的细菌透明质酸酶的纯化的洗脱液样品在低温下(优选在冰上)储存，直至接下来的STREP纯化。

根据本发明，可以使用任何合适的STREP亲和层析，以便与本发明的改性的细菌透明质酸酶的N端STREP标签(SEQ ID NO.1的氨基酸3至10，还参见SEQ ID NO.5)结合。根据实验室规模，优选可以使用一个或多个合适的基于注射器的STREP亲和层析柱。例如，进行一个或多个基于注射器的STREP纯化步骤，更优选流速<5ml/min。STREP柱(5ml柱床体积)一般用2x25 ml的通用下游缓冲液PBS进行清洗和平衡。使用适量的从HIS纯化产生的洗脱液样品并使其流过STREP柱。然后优选用适量的通用下游PBS缓冲液清洗加样的STREP柱，以去除任何剩余的污染物蛋白。通过使用适宜的洗脱介质，例如含有2.5mM d-脱硫生物素的PBS缓冲液，将目的蛋白质，即本发明的改性的细菌透明质酸酶洗脱，优选地洗脱到新鲜的、无菌的、无热原的管中。这支管可以在低温下(例如在冰上)储存，或者冻干，以获得纯化的本发明的改性的细菌透明质酸酶的干燥的可储存产品。根据现有技术，STREP柱在适当的再生后可以重新使用。

任选地，可以通过适当的方法更换洗脱液的缓冲液，包括离心洗脱液以聚集本发明的细菌透明质酸酶、丢弃上清液并将聚集的本发明的细菌透明质酸酶重新悬浮在不同的缓冲介质如Tris-HCl NaCl中。根据一个优选的实施方案，重新悬浮的本发明的细菌透明质酸酶被储存在低温下，例如在冰上，用于进一步的后处理，例如精制。

根据一个优选的实施方案，本发明的纯化步骤额外包括一个或多个适宜的精制步骤，以去除步骤d)中本发明的细菌透明质酸酶多肽的最后杂质，从而提高其纯度。根据实验室规模，可以进行一个或多个内毒素去除步骤，如基于多粘菌素B的内毒素去除步骤；一个或多个无菌过滤步骤，和一个或多个颗粒去除步骤。

根据本发明，实验室规模的蛋白质产率在HIS纯化后为0.09至0.13mg/ml，在双HIS/STREP纯化和随后的精制纯化步骤后为0.04至0.06mg/ml(见下文实施例部分项目1.3.4)。预计这一产率在发酵规模生产后会明显增加。

根据本发明的第六方面，提供了可根据本发明的根据第五方面所述的生产方法获得的改性的细菌透明质酸酶多肽，优选地其中本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽由SEQID No.1组成。与本发明第一方面至第五方面有关的所公开的所有特征和实施方案可单独组合或与本发明第六方面(包括其每个优选实施方案)进行(子)组合，只要所产生的特征组合对本领域技术人员来说是合理的。

根据本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的根据本发明第一或第六方面的本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂。与本发明第一方面至第六方面有关的所公开的所有特征和实施方案可单独组合或与本发明第七方面(包括其每个优选实施方案)进行(子)组合，只要所产生的特征组合对本领域技术人员来说是合理的。

一般来说，本发明的细菌透明质酸酶的治疗有效量取决于药物组合物的治疗应用。根据本发明，术语“治疗活性量”是指在所述药物组合物或其药物单位剂量中的本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽的量，优选由SEQ ID No.1组成的本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽的量，是适合用于治疗或预防透明质酸相关和/或蛋白多糖相关的疾病或病症的，所述疾病或病症优选地选自由纯合子型家族性高胆固醇血症(黄瘤病)、杂合子型家族性高胆固醇血症或糖尿病足综合征组成的组。

例如，在药物组合物是用于静脉内应用的肠外液体组合物的情况下，本发明的细菌透明质酸酶可以作为小瓶中的1至10，优选2或5mL的浓缩物提供，治疗有效量在15,000至1,500,000U/mL之间。根据一个优选的实施方案，本发明的药物组合物的单位剂量包括浓度范围为200U/kg/天至30,000U/kg/天的本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽。为了增加本发明的细菌透明质酸酶的半衰期，给药方案可以优选包括适当的单次剂量(bolus)的本发明的透明质酸酶，以使外切蛋白酶和/或内切蛋白酶饱和，然后再施用治疗有效的单位剂量。优选地，在静脉施用的情况下，在本发明的细菌透明质酸酶的单次剂量施用(bolusadministration)后至多1小时，或者至多30分钟、至多15分钟或至多5分钟施用随后的单位剂量。

尽管如此，本发明的药物组合物可以以任何适宜的应用形式存在，如固体、半固体或液体应用形式。相应地计算治疗有效量。例如，本发明的药物组合物的固体形式可以以干燥或冻干的形式存在。除了本发明的细菌透明质酸酶多肽外，还可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，如选自膨松剂、缓冲剂、张力调节剂、塌陷温度调节剂、溶剂和/或助溶剂、增溶剂、防腐剂、抗氧化剂、抗微生物剂和螯合剂、润湿剂、絮凝剂/悬浮剂的组的一种或多种成分；以及任选的一种或多种蛋白酶抑制剂，如选自金属蛋白酶抑制剂、二肽基-4外肽酶抑制剂(同义：DPP-4抑制剂或列汀类药物(gliptins))或透明质酸结合蛋白2蛋白酶抑制剂。

根据本发明，适宜的膨松剂可包括蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、棉子糖、甘氨酸、组氨酸或聚乙烯吡咯烷酮(K40)。适宜的缓冲剂可包括柠檬酸钠、磷酸钠、氢氧化钠、Tris碱65、Tris乙酸盐或Tris HCl 65。适宜的张力调节剂可包括右旋糖。适宜的塌陷温度调节剂可以是葡聚糖、聚蔗糖、明胶、羟乙基淀粉。适宜的溶剂优选地选自注射用水，而非水性的可与水混溶的试剂可作为助溶剂，如乙醇、甘油、丙二醇和正乳酰胺(n-lactamide)。适宜的增溶剂可以选自适宜的表面活性剂和助溶剂。适宜的表面活性剂的几个例子是聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80)、山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween 20)、卵磷脂、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物(Pluronics)。作为增溶剂的适宜的助溶剂的例子是丙二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇(300和400)、山梨醇、二甲基乙酰胺和聚氧乙烯蓖麻油EL(Cremophor EL)。适宜的防腐剂可选自对羟基苯甲酸酯类，如苯甲醇(0.9％至1.5％)、对羟基苯甲酸甲酯(0.18％至0.2％)、对羟基苯甲酸丙酯(0.02％)、苯扎氯铵(0.01％至0.02％)以及硫柳汞(0.001％至0.01％)。适宜的抗氧化剂优选地选自抗坏血酸、亚硫酸盐(如亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠)、甲醛次硫酸氢钠、硫脲、乙酰半胱氨酸、抗坏血酸酯、丁基羟基甲苯、生育酚。适宜的抗微生物剂选自苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯类(甲基、丙基、丁基)、苯扎氯铵、氯丁醇、硫柳汞、苯汞盐类(乙酸盐、硼酸盐、硝酸盐)。适宜的螯合剂选自乙二胺四乙酸盐。适宜的润湿剂优选地选自甘油、乙醇和丙二醇。适宜的絮凝剂/悬浮剂选自电解质类(如氯化钾/钠、柠檬酸钾/钠或乙酸钾/钠)或表面活性剂和亲水胶体(如羧甲基纤维素钠、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)。蛋白酶抑制剂可增加本发明的细菌透明质酸酶的半衰期，因此可减少透明质酸酶的使用总量或提高疗效。依地酸钙二钠可广泛用于抑制金属蛋白酶。维格列汀(Vildagliptin)或利格列汀(Linagliptin)可用于特异性抑制DPP-4外肽酶，能够切割具有脯氨酸的序列。抑肽酶(Aproptinin)可能适于抑制透明质酸结合蛋白2(HABP2)，并可能适于抑制广泛的丝氨酸蛋白酶。

在冻干的药物组合物的情况下，一种或多种赋形剂可选自适宜的膨松剂、缓冲剂、张力调节剂、塌陷温度调节剂和蛋白酶抑制剂。如果本发明的药物组合物作为肠外注射剂使用，所述一种或多种药物赋形剂可选自溶剂、增溶剂、助溶剂、防腐剂、润湿剂/表面活性剂、絮凝剂/悬浮剂和蛋白酶抑制剂。

所述相应的一种或多种蛋白酶抑制剂可以替代地单独施用至包含本发明的细菌透明质酸酶的本发明的药物组合物。在单独施用的情况下，所述一种或多种适宜的蛋白酶抑制剂通常以适宜的量在本发明的细菌透明质酸酶之前施用或与其同时施用以有效抑制外肽酶和/或内肽酶。

如果包括本发明的透明质酸酶的本发明的药物组合物以单次剂量施用和随后的单位剂量施用的形式施用，所述蛋白酶抑制剂可包含在本发明的药物组合物的单次剂量和任选的后续单位剂量中。为了减轻蛋白酶抑制剂的身体负担，优选地仅单次剂量施用包含所述适宜的一种或多种蛋白酶抑制剂，或者所述一种或多种蛋白酶抑制剂的单独施用在包括本发明的透明质酸酶的本发明的药物组合物的单次剂量施用之前施用或与其同时施用。

作为另一个例子，本发明的药物组合物的液体形式可以呈现为本发明的细菌透明质酸酶多肽在适宜的悬浮介质中的悬浮液，优选在用于肠外应用，更优选用于静脉内应用的适宜的悬浮介质中。所述药物组合物可以是在肠外应用前进行稀释的浓缩物的形式。用于肠外注射的所述药物组合物可以包括选自增溶剂、助溶剂、防腐剂、润湿剂/表面活性剂、絮凝剂/悬浮剂和蛋白酶抑制剂的组的一种或多种赋形剂。

例如，本发明的用于肠外注射的药物组合物的液体形式(稀释后)包括0.9％NaCl溶液、林格溶液(Ringer solution)或乳酸钠-氯化钠溶液。

一般来说，本发明的药物组合物可适于口服、鼻、透皮、直肠、静脉内或肌肉内应用。在口服应用的情况下，本发明的细菌透明质酸酶多肽优选与适宜的肠溶包衣配制以避免/减少本发明的细菌透明质酸酶在肠道液体中的降解。因为本发明的细菌透明质酸酶多肽直接存在于血管空间中，没有首过效应，所以特别优选的是静脉内应用本发明的药物组合物，这优选地尤其适用于治疗或预防透明质酸相关和/或蛋白多糖相关的疾病或病症，所述疾病或病症优选地选自由纯合子型家族性高胆固醇血症(黄瘤病)、杂合子型家族性高胆固醇血症或糖尿病足综合征组成的组。在这种情况下，可以通过使用本发明的细菌透明质酸酶的单次剂量应用和/或在同一药物组合物或单独的药物组合物中额外施用蛋白酶抑制剂来抑制外肽酶和内肽酶。

一种治疗透明质酸相关和/或蛋白多糖相关的疾病或病症的方法，所述疾病或病症优选地选自由纯合子型家族性高胆固醇血症(黄瘤病)、杂合子型家族性高胆固醇血症或糖尿病足综合征组成的组，所述方法包括以下，或由以下组成：向有需要的受试者施用根据第一方面或第六方面的本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽或者本发明第七方面的药物组合物。

下文基于示例性实施方案对本发明进行说明，这些示例性实施方案仅作为示例，并不限制本发明的保护范围。

实施例

本发明进一步的特征和优点将参考附图从以下对本发明方面的示例性实施方案的描述中得出。

下面与所述示例性实施方案和/或附图有关的所公开的所有特征可以单独组合或以任何子组合的方式与本发明各方面的特征(包括其优选实施方案的特征)相结合，只要所产生的特征组合对本领域技术人员来说是合理的。

设备(通用)

1.Thermo Scientific Multifuge X3R(SN:42343259)

2.Eppendorf离心机5920R(SN:5948HR902433)

3.New Brunswick Scientific Innova 4300(SN:590544115)

4.New Brunswick Scientific Innova 4300(SN:791060864)

5.Jenway 6305分光光度计(SN:68993)

6.ARCTIKO ULTF 420 -80℃冰箱(SN:20180262153)

7.Liebherr GX 823-20M冰箱(SN:50.636.690.7)

8.Sartorius Arium迷你UV超纯水机(SN:36802288)

9.VWR蒸汽Line 135-B高压釜(MN:12175020)

10.Peqlab TS-100恒温摇床(SN:430805037)含24x2ml模块(SN:191165)

11.IKA涡旋振荡器2S000(SN:100451198)

12.Fisher Scientific Mini300V Plus电源(SN:190118120)

13.IKA Rocker 2D basic摇床(SN:100574254)

14.Kern精密天平ABJ320-4NM(SN:WB18AM0063)

15.Kern PBS4200-2M天平(SN:WB17M0023)

16.AQUALYTIC pH计SD AL 10PH(SN:AJ.12842)

17.Eppendorf 500-5000μl移液器(SN:G44139I)

18.Eppendorf 100-1000μl移液器(SN:J37828B)

19.Eppendorf 100-1000μl移液器(SN:H41815D)

20.Eppendorf 10-100μl移液器(SN:H39057D)

21.Eppendorf 10-100μl移液器(SN:H39145D)

22.Eppendorf 0.1-10μl移液器(SN:400555A)

23.Bandelin Sonoplus GM 2200.2发电机(SN:3714.00125432.005)含转换器UW2200(SN:599.00125433.006)及KE76 horn

24.Epson Workforce Pro WF-4720(型号C582A)(SN:*X2TU046376*)

25.Thermo Scientific NanoDrop Lite(SN:5149)

材料/化学品(通用)

1.甘油(CAS:56-81-5)

2.琼脂-琼脂(CAS:9002-18-0)

3.酵母提取物(CAS:8013-01-2)

4.异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷IPTG(CAS:367-93-1)

5.植物蛋白胨(CAS:91079-46-8)

6.氯化钠NaCl(CAS:7647-14-5)

7.氯化钾KCl(CAS:7447-40-7)

8.卡那霉素溶液(CAS:25389-94-0)

9.磷酸二氢钠NaH₂PO₄(CAS:13472-35-0)

10.磷酸氢二钠Na₂HPO₄(CAS:7558-79-4)

11.磷酸二氢钾KH₂PO₄(CAS:7778-77-0)

12.磷酸氢二钾K₂HPO₄(CAS:7758-11-4)

13.咪唑(CAS:288-32-4)

14.d-脱硫生物素(CAS:533-48-2)

15.盐酸HCl(CAS:7647-01-0)

16.氢氧化钠NaOH(CAS:1310-73-2)

17.Tris碱(CAS:77-86-1)

18.His GraviTrap TALON(Sigma-Aldrich GE29-0005-94)

19.StrepTrap^TM High Performance(Sigma-Aldrich GE28-9075-47)

20.牛血清蛋白BSA(CAS:9048-46-8)

21.透明质酸(CAS:9067-32-7)

22.乙酸钠NaOAc(CAS:6131-90-4)

23.2x LAEMMLI缓冲液(β-巯基乙醇CAS:60-24-2，十二烷基硫酸钠CAS:151-21-3)

24.Tris-MOPS SDS运行缓冲液(十二烷基硫酸钠CAS:151-21-3,Tris CAS:77-86-1,EDTA CAS:60-00-4,MOPS CAS:1132-61-2)

25.甲醇MeOH(CAS:67-56-1)

26.考马斯亮蓝R-250(CAS:6104-59-2)

27.牛透明质酸酶Typ I-S(CAS:37326-33-3)

1：SEQ ID 1的本发明的改性的细菌透明质酸酶多肽的生产

1.1制备

1.1.1基因合成和亚克隆-pET28a(+)

编码SEQ ID No.1的本发明的改性的细菌透明质酸酶的SEQ ID No.2的d016基因序列是通过截断SEQ ID No.4的肺炎链球菌野生型序列，并加入SEQ ID No.8的C端HIS标签基因序列和SEQ ID No.6的N端Strep标签基因序列而设计的以用于两步亲和层析纯化。通过设计，这两个标签被指定保留在最终的酶产品上，以增加溶解性和保护血管空间(指定的药物隔室)中的(外)肽酶。合成基因构建体，使用NcoI/BlpI限制性位点克隆到pET28a中，产生重组表达载体(同义：包括d016插入片段的pET28a(+)载体的质粒)。pET28a(+)和插入片段d016的质粒载体图谱显示在图1中。

1.1.2质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中

根据供应商的方案(New England Biolabs)，在42℃通过热休克将质粒转化到宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。根据pET28a编码的抗性，在含有50μg/ml卡那霉素抗生素的溶菌肉汤(LB)琼脂平板上对本发明的宿主细胞的阳性转化体进行选择。所述平板在室温下生长48小时。

1.1.3本发明的宿主细胞在溶菌肉汤(LB培养基)中的转化体培养和甘油储备制备(-80℃储存)

从平板上挑出本发明的宿主细胞的单个克隆，并在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中于37℃培养过夜。准备装有灭菌的50％甘油溶液的无菌、无热原的管。在无菌层流条件下，将过夜生长的液体培养物(12-14h)在含有50％液体培养物体积和50％制备的甘油溶液的主克隆储存管中稀释。主克隆在-80℃下储存。所有批次的d016本发明宿主细胞的培养都源于这个主克隆。

1.2生产

1.2.1在LB培养基中进行预培养接种并过夜生长(37℃)

准备两个装有(植物)LB培养基(高压灭菌)的250ml的培养瓶(高压灭菌)。加入50μg/ml卡那霉素以防止可能的细菌污染物的生长。预培养物的制备/处理始终在无菌层流条件下进行。一个装有65ml含卡那霉素的(植物)LB培养基的烧瓶通过一个移液器吸头(高压灭菌)从主克隆储存管中接种样品。第二个烧瓶用作阴性对照，其中移液器吸头不含主克隆细胞。预培养管在层流下用透气膜密封，并递送至培养摇床。细胞在37℃下以180rpm生长过夜(12-14h)。主克隆储存管在整个过程中被严密密封，只在层流条件下打开。接种后，主克隆管被密封并在-80℃下储存。

1.2.2在极好肉汤(TB)培养基中进行主培养接种，异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达过夜(28-30℃)

14个带透气螺旋盖的500ml带挡板烧瓶经过高压灭菌，每个烧瓶装入200ml(植物)TB培养基(高压灭菌，植物蛋白胨12g/l，酵母提取物24g/l，甘油8ml/l)，其含有磷酸钾缓冲液(分别高压灭菌，最终浓度为9.4g/l K₂HPO₄和2.2g/l KH₂PO₄)。加入50μg/ml卡那霉素以防止可能的细菌污染物的生长。12个烧瓶分别用5ml的移液器吸头(高压灭菌)接种4ml的预培养物。剩下的两个装有4ml对照预培养物的烧瓶作为对照。主培养物的制备始终在无菌层流条件下进行。在将烧瓶转移到培养摇床之前，将所有烧瓶的盖子拧紧，生长条件被设定为37℃，180rpm。3-4h后，生长OD600为0.7-1.1，将所有烧瓶平衡到室温。用200μl的100mMIPTG储备溶液诱导蛋白质的产生。最后，将所有烧瓶(包括污染物对照)置于28-30℃(180rpm)的第二个培养箱摇床内18-20h。

1.2.3培养物的收获和细胞沉淀物的储存(-80℃)

在规定的18-20h的生长时间后，将培养瓶从培养摇床中取出。检查对照烧瓶以确保该批次中没有出现污染物的生长。对照不做进一步处理。使用无热原、无菌的50ml管采收所有12个培养烧瓶。每个烧瓶收获3x50 ml，剩余的体积被丢弃。所有管在4000rcf，4℃下离心30-45min。丢弃上清液，所有含有包含本发明的改性的细菌透明质酸酶的沉淀物的管被严密密封并在-80℃下储存以用于下游处理。

1.3下游处理

1.3.1收获/预处理：通过超声处理进行细胞裂解，通过离心去除碎片

通过彻底涡旋将沉淀物重新悬浮于10ml的通用下游缓冲液PBS中(磷酸盐缓冲盐水，含280mM NaCl、6mM KCl、15.1mM Na₂HPO₄、4.9mM NaH₂PO₄，室温下pH＝7.4)。将源自同一烧瓶的三支管合并进行超声处理(36支管合并为12支管)，并储存在冰上直至处理。超声机被设置为60％的振幅，以2秒开4秒关为一循环。将每支管单独进行超声处理，并在100ml玻璃瓶中用冰水包围以确保所有样品处在恒定的低温状态。所有样品超声处理后，将所述管在4000rcf和4℃下离心45min。将上清液转移到新的无菌、无热原的50ml管中，同时确保没有大量的细胞碎片物质被转移。在4000rcf和4℃下再进行一轮45min的离心以去除残留的细胞碎片。将包括本发明的改性的细菌透明质酸酶的所得的上清液直接用于HIS纯化。

1.3.2纯化I：HIS亲和层析，随后短期储存洗脱液(在冰上)

将18根重力式HIS纯化柱与通用PBS下游缓冲液平衡。每个被离心的管的内容物被分配至3个HIS柱。对于单个批次，将纯化程序重复两次(每个批次2x18柱＝36柱纯化)。未处理的管一直保存在冰上。在每个管中，通过移液器将3x9 ml上清液样品小心地转移到3个独立的HIS柱中，以便不扰乱管中剩余的任何残留细胞沉淀物。然后用10ml的10mM咪唑PBS溶液清洗加样的柱子，然后在新的无菌、无热原的管中制备的6ml的150mM咪唑PBS溶液中洗脱。来自同一生产烧瓶的3个柱子的洗脱液被合并(36个总的纯化洗脱液被合并到12个管中)并用通用下游缓冲液PBS稀释到35ml。将本发明的改性的细菌透明质酸酶的纯化样品保存在冰上直至后续的STREP纯化。用12ml 300mM咪唑PBS溶液清洗HIS纯化柱，用12ml超纯水和随后的12ml通用下游缓冲液PBS准备第二次运行。

1.3.3纯化II：STREP亲和层析，缓冲液更换(Tris-HCl NaCl)，短期储存洗脱液(在冰上)

所有含有本发明的改性的细菌透明质酸酶的HIS纯化蛋白样品的管都在冰上储存直至完成整个STREP纯化过程。对于每个合并的来自HIS纯化的洗脱液样品，在每个过程中重复进行两次流速<5ml/min的基于注射器的STREP纯化步骤(12个来自HIS纯化的合并管被24个STREP柱处理)。STREP柱(5ml柱床体积)用2x25ml通用下游缓冲液PBS进行清洗和平衡。使用17.5ml洗脱液样品并流过柱子。然后用50ml的通用下游PBS缓冲液清洗加样的柱子以去除任何剩余的污染蛋白质。通过使用20ml含有2.5mM d-脱硫生物素的PBS缓冲液，将目的蛋白质洗脱至新鲜的、无菌的、无热原的管中，所述管始终保存在冰上。用15ml超纯水，然后用15ml 0.5M NaOH，接着用15ml超纯水，最后用25ml通用下游PBS缓冲液使柱再生。在这个阶段，下一个样品被装载并以同样的方式纯化。单根STREP柱用于12次纯化运行，即所述批次的一半。整个批次的纯化后，通过Sartorius VivaSpin20 50kDa离心浓缩器进行缓冲液更换。每个VivaSpin装载20ml STREP洗脱液。通过在4℃下以4000rcf离心45min，样品被浓缩至1ml以下。在VivaSpins中收集本发明的改性的细菌透明质酸酶的纯化蛋白，并通过加入Tris-HCl NaCl(50mM Tris，154mM NaCl，室温下pH＝7.4)至20ml进行缓冲液更换。从那时起这种离心浓缩和用Tris-HCl NaCl重新稀释至20ml的程序进行了3次，以满足CoA的规范。在最后一次离心后，VivaSpins没有被填充至20ml，而是填充至5ml。然后小心地将每个VivaSpin重悬，并取出所述5ml放入无菌、无热原的管中。再用5ml Tris-HCl NaCl进行两次重悬以确保从VivaSpins中很好地回收所需的蛋白质。所有12个管各自含有15ml缓冲液更换的本发明的改性的细菌透明质酸酶的蛋白质，都被保持在冰上用于精制步骤。

1.3.4任选的精制：内毒素去除(LPS去除)，颗粒去除(过滤)，无菌过滤，长期储存(-15℃)

对于精制，进行了2次基于多粘菌素B的内毒素去除步骤、2次无菌过滤步骤和1次颗粒去除步骤。在制备过程中，将所有缓冲液更换的蛋白质都通过无菌、无热原的0.22μmPES过滤器。在冰上将滤液储存在新鲜、无菌和无热原的管中。以下步骤是在无菌层流条件下进行的。每个样品在(两个独立的)固定化多粘菌素B柱(供应商GenScript)上进行两次连续的内毒素去除。每根柱子用总共15ml提供的再生缓冲液清洗以去除任何残留的内毒素，然后用总共18ml提供的平衡缓冲液(基于磷酸盐)来去除所有的再生缓冲液。此外，总共应用15ml的Tris-HCl NaCl来进一步去除磷酸盐缓冲液。将15ml无菌过滤的样品装载在第一根柱子上，并收集在新的无菌、无热原的管中。为了收集剩余的本发明的改性的细菌透明质酸酶的蛋白质并提高产率，将5ml Tris-HCl/NaCl施加至柱子，并将流过的液体也收集在同一管中。使用新的第二根柱子重复这一过程。用总共10ml再生缓冲液，然后用总共10ml的平衡缓冲液，最后用总共15ml的Tris-HCl NaCl将两根内毒素去除柱在批次运行过程中短期多次再生。总共使用了一组两根内毒素去除柱(用于整个批次)。内毒素去除柱在3次样品运行后进行再生。对所有的样品执行这些内毒素去除程序，并将所得的样品储存在冰上。然后将样品收集在新鲜的、无菌的、无热原的管中，在层流下转移到新鲜的SartoriusVivaSpin20 100kDa离心浓缩器中用于在10℃下以3000rcf离心20min。在层流条件下，VivaSpin的流过物被重新悬浮并收集在新鲜的、无菌的和无热原的管中。在收集了所有的流过物(每个样品单独收集)后，在层流内通过无菌、无热原的0.22μm的PES过滤器进行另一轮无菌过滤。使用无热原的移液器吸头，对样品进行等分，通过280nm处吸光度测量最终样品中的蛋白质浓度。根据该浓度数据，将合并的产品用Tris-HCl NaCl稀释至最终浓度约为0.1mg/ml。从一个批次的最终产品中制备多个小的等分试样用于在无菌、无热原的管中的批次分析。将包含本发明的改性的细菌透明质酸酶d016的最终产品和所有等分的批次分析样品拧紧并用石蜡膜密封，然后于-15℃下储存。

大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)摇瓶表达的蛋白质产率[mg/ml]是通过借助在280nm处的吸光度(计算的吸收系数为132590mol^-1cm^-1，计算的质量为84516Da)测量HIS纯化和STREP纯化后的蛋白质量[mg]并参考蛋白质表达时的培养体积[ml]来确定的。

因此，达到的产率约为0.09-0.13mg/ml(HIS纯化后)。经过HIS纯化、STREP纯化和精制后，最终产率约为0.04-0.06mg/ml。

1.4批次分析

1.4.1蛋白质的纯度：通过考马斯R-250染色对最终批次的纯度进行SDS-PAGE分析

为了分析蛋白质的纯度，解冻单批次分析等分试样，并通过280nm吸光度检查浓度。基于该数据，创建了浓度为0.1μg/25μl至16μg/25μl的样品以在SDS-PAGE上分析纯度。在每个稀释液中加入25μl 2x LAMMELI缓冲液，并通过移液器吹吸轻轻地混合。然后，为了改善通过凝胶基质的均匀传输，将样品在加样前通过在60℃下孵育20min变性。随后在20℃和6000rcf下离心1分钟，将浓缩物恢复至样品体积中。在GenScript GelBox中注入一半的GenScript Tris-MOPS SDS运行缓冲液，并在移除安全条后安装即用型SurePage凝胶。然后用Tris-MOPS SDS运行缓冲液将内部空间完全填满，并将梳子轻轻取出。将每个单独的加样腔室(每个凝胶12个)通过多次移液器移取100μl Tris-MOPS SDS进行清洗以去除甘油。将所有变性的和制备的样品(50μl)加样(每个凝胶加样11个样品)，另外一个腔室被用来施加5μl NEB预染蛋白ladder。将GelBox密封并接通电源(120V)直到ladder的最小条带接近于从凝胶中跑出来(60-90min)。关掉电源，将凝胶从室中取出。打开凝胶盒后，将凝胶置于用染色液(50％MeOH，40％超纯水，10％乙酸，1.0g/l考马斯R-250)填充至1cm水平的染色盒中。凝胶在rocker摇床上染色过夜。第二天早上去除染色液。

用去离子水清洗凝胶，并在微波炉中加热至大约70-90℃。然后将凝胶转移到摇床中20min。重复进行这个过程，直到条带清晰可见并且背景信号明显减少。作为最后一步，进行脱色扫描(1200dpi)(见图2)，通过监测0.1μg/泳道至16μg/泳道样品中的样品污染条带的可见度，根据检测限来评估纯度。检测限由已知数量(0.2μg和0.1μg)的参考蛋白(BSA)验证。

图2表示对一个测试批次的扫描图，该批次包括浓度为0.2μg和0.1μg的BSA蛋白、ladder参考条带和浓度为16μg、8μg、4μg、2μg的本发明的改性的细菌透明质酸酶。本发明的改性的细菌透明质酸酶的蛋白质在80kDa和100kDa ladder参考条带之间迁移，这证实了本发明蛋白质的大小是正确的。

在本发明的改性的细菌透明质酸酶的任何加样浓度(0.1-16μg)中都检测不到污染条带，这表明单一污染蛋白的理论纯度大于98.8％。这一发现是基于每条泳道0.2μg的检测限，尽管在每条泳道0.1μg时也已经可以检测到分析的蛋白质和BSA。

材料：

GenScript GenBox迷你电泳槽(L00780)

NEB预染蛋白Ladder(P7712)

GenScript SurePage凝胶10x8 12％(M00668)

Peqlab TS-100恒温摇床(见设备)

FisherScientific Mini300V Plus电源(见设备)

Thermo Fisher Scientific NanoDrop Lite(见设备)

GenScript Tris-MOPS SDS运行缓冲液(M00138)

Sigma-Aldrich(GE)BSA(05470)

Sigma-Aldrich LAEMMLI 2x缓冲液(S3401)

Eppendorf移液器(见设备)

Sigma-Aldrich(Nalgene)染色盒(Z358290)

Carl-Roth甲醇(KK39.2)

Sigma-Aldrich考马斯亮蓝R-250(27816-25G)

Epson Workforce Pro WF-4720(见设备)

Sartorius Arium Mini Plus(见设备)

IKA Rocker 2Dbasic摇床

1.4.2蛋白质活性：比活性的测量

根据美国药典(USP)，透明质酸酶的单位活性是通过与USP国家处方集参考标准的校准来确定的。单位活性被定义为：“一个单位是基于USP参考标准透明质酸酶在600nm处的吸光度的变化(浊度的变化)，所述USP参考标准透明质酸酶与该产品的每一批次同时进行检测。”

由于这个标准品不再能买到，供应商Sigma-Aldrich使用以前校准过的参考酶衍生出了一种方法。新的单位定义是：“在37℃、pH5.7的条件下，一个单位将导致A600 nm的变化为0.330/min(45-min的测定)。”

此外：“新的单位定义中选择吸光度值的变化为0.330是为了与使用USP透明质酸酶标准定义活性所发现的结果最接近地匹配。因此，基于USP的已停用的单位定义和新单位Sigma-Aldrich单位定义的转换系数约为1:1(一个旧单位约等于一个新单位)。”关于活性单位定义的来源也可以在以下网站上找到：https://www.sigmaaldrich.com/life-science/biochemicals/biochemical-products.html？TablePage＝111679355。

测量本发明的改性的细菌透明质酸酶活性单位的浊度测定是按照Sigma Aldrich公司的方案进行的(其中包括相同的所有测定缓冲液的制备、反应参数和测定程序)。任何改变的程序将在下面描述：

这样描述的基于USP的比活性分析进一步针对来自Sigma-Aldrich的“参考”透明质酸酶进行校准，以消除个别测量产生的偏差。在不同浓度下使用该参考酶(Sigma-Aldrich牛透明质酸酶Typ I-S[H3506])，以生成标准曲线(线性拟合)，从而将测量的透射率(空白A600-样品A600)转换为U/mg。根据上述方案确定了Sigma-Aldrich的比活性。

标准品(3.16U/1.5ml反应-6.55U/1.5ml反应)是通过稀释程序制备的。为了测量比活性，将本发明的改性的细菌透明质酸酶(同义词：d016)的每个样品稀释(如果需要)到Tris-HCl NaCl中至浓度为0.1mg/ml。通过A280测量检查浓度，并使用任何确定的偏差来校正相应的比活性测量。

随后，将样品在Sigma-Aldrich测定法的酶稀释缓冲液中稀释400倍—每1.5ml反应使用11.7μl稀释的样品，因而每1.5ml反应使用2.93ng d016(见下表1)。2.93ng酶的稀释程序是根据经验确定的，其结果在上述标准范围的吸光度之内。

表1：

样品(d016)	mg/ml	μg/μl	ng/μl
				Tris-HCl NaCl中的浓度	0.1	0.1
“酶稀释缓冲液”中400倍稀释的浓度		0.00025	0.25

因此，最终反应中的本发明的改性的细菌透明质酸酶d016的量(每个反应使用11.7μl)相当于2.93ng/反应。

对于吸光度的测量，250μl的45分钟的反应与1.25ml沉淀缓冲液(pH＝3.75)结合，在分光光度计中测量A600。该值被用来计算透射率，并根据上述方案将该值转换为比活性。

有关浊度法的细节在Sigma Aldrich公司的以下网站上有描述：https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/2/hyaluronidase.pdf。

参照根据USP单位定义确定的Sigma-Aldrich公司的牛透明质酸酶，本发明的改性的细菌透明质酸酶d016S产生的各自的比活性如下表2所示：

表2：

检测批次的样品	比活性(USP)	标准偏差
			1	1.564.111U/mg	7％
2	1.580.274U/mg	7％

因此，本发明的改性的细菌透明质酸酶的一般比活性的范围在1.5Mio.USP U/mg+/-150k USP U/mg之间。这相当于25.000katal/kg+/-2.500katal/kg。

材料：

Jenway 6305分光光度计(见设备)

Sigma-Aldrich(BRAND)半微型紫外光比色皿(Z628026)

Eppendorf移液器(见设备)

Peqlab TS-100恒温摇床(见设备)

Thermo Fisher Scientific NanoDrop Lite(见设备)

Sigma-Aldrich(Eppendorf)3810X微管(Z606340)

Sigma-Aldrich(GE)BSA(05470)

Sigma-Aldrich透明质酸(53747)

Sigma-Aldrich牛透明质酸酶类型I-S(H3506)

Carl-Roth乙酸(3738.2)

Carl-Roth HCl(P074.4)

Carl-Roth NaOH(9356.1)

Carl-Roth乙酸钠(3856.1)

Carl Roth磷酸二氢钠(2370.3)

Sartorius Arium Mini Plus(见设备)

1.4.3内毒素定量

对于内毒素定量，按照制造商的方案，使用了供应商GenScript的测试试剂盒ToxinSensorTM Chromogenic LAL内毒素检测试剂盒(L00350)。该试剂盒包括内毒素标准品、无内毒素水、鲎变形细胞溶解物、显色底物、颜色稳定剂、无内毒素移液器吸头和管，以及管架。所有包装都用超纯水清洗，组件在层流下灭菌。粉末/冻干的成分按照制造商的方案进行重构和储存。通过稀释提供的试剂盒中的内毒素标准品，制备了四种用于内毒素测量的标准品(0.1EU/ml、0.25EU/ml、0.5EU/ml、1.0EU/ml)。这些标准品被用来生成参考曲线，通过该曲线可以将每个样品的吸光度转换为以EU/ml为单位的浓度。在所有批次的样品测量中，各标准品被平行分析。对于批量分析，在冰上解冻单个批量分析的等分试样，用超纯水对管进行消毒和清洗，然后转移到层流中。100μl未稀释的批次样品、作为空白的100μl无内毒素的水以及内毒素浓度在0.1EU/ml和1.0EU/ml之间的四个标准品被用于单次分析运行。所有的样品处理都在无菌层流条件下进行。进行以下步骤：

1.将充分混合的标准品、空白和样品与LAL在37℃下孵育12分钟

2.加入底物溶液进行显色反应，在37℃下孵育6分钟

3.在每个测量瓶中逐步加入三种颜色稳定剂溶液并轻轻混合

4.将最终的反应的溶液转移至比色皿以在分光光度计上进行545nm的吸收测量。从所有批次的样品测量中减去空白的背景，并绘制标准曲线。从标准曲线外推得出样品的内毒素浓度，单位为EU/ml。考虑到最终批次产品/等分试样浓度为0.1mg/ml，内毒素水平被进一步描述为EU/mg产品。

1.4.4无菌性测试

用超纯水制备植物LB-琼脂(10g/l大豆蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l酵母提取物，15g/l琼脂-琼脂)，并进行高压灭菌。将高温的瓶子与无菌培养皿一起放在经乙醇灭菌的层流中。在生长培养基中不添加抗生素的情况下，浇注平板。对于无菌性测试，取单个批次分析等分试样，并在冰上解冻。在平板固化并冷却后，用无菌、无热原的移液器吸头将单个批次分析的等分试样移液到单个平板上，并用无菌的Lazy-L-Spreaders涂布。含有无菌过滤的Tris-HCl NaCl的平板被用作对照以测试环境污染。含有未经转化的大肠杆菌BL21(DE3)的平板被用作阳性对照。将平板封闭但不密封以允许空气交换。为了确保环境的无菌性，将用于产品无菌性测试的平板在层流内放置4天以检查是否有任何生长(时间范围可根据在层流中的处理的过程中的环境污染速度调整)。无可见的生长是对产品无菌性的确认。

图3显示了包含大肠杆菌阳性对照(图3a))、LB-平板阴性对照(图3b))和本发明的d016样品(图3c))的LB-琼脂平板在4天的时间段内的图像。本发明的改性的细菌透明质酸酶d016在不含抗生素的植物LB-琼脂平板中在4天的时间段内没有显示任何生长，因此，被认为为无菌。

因此，本发明的改性的细菌透明质酸酶d016可用于药物组合物，特别是用于需要无菌质量的药物组合物，如静脉内应用。

材料：

Carl-Roth植物蛋白胨(2832.2)

Carl-Roth氯化钠(3957.3)

Carl-Roth酵母提取物(2363.3)

Carl-Roth琼脂-琼脂(6494.1)

Sigma Aldrich(无菌)培养皿(P5981)

Sigma-Aldrich(无菌)Lazy-L-Spreaders(Z376779)

Carl Roth(Sorenson Bioscience)无热原1000μl过滤器吸头(9773.1)

Eppendorf移液器(见设备)

1.4.5稳定性和溶解性，冻融测试

为了测试本发明样品的稳定性和可溶性，在一段时间内对多种浓度的纯化蛋白进行比活性测量。在无菌过滤的Tris-HCl NaCl中制备多种样品稀释液，其浓度为0.2mg/ml(产品的200％最终储备溶液)、0.1mg/ml(产品的目标最终储备溶液)和0.01mg/ml(用于目标应用的低浓度剂量)。采用280nm吸收测量本发明蛋白的浓度。各稀释液储存在-15℃、2-8℃和25℃，这代表相关的储存和处理条件。在稳定性测试开始时、1天、2天、3天、1周、2周和4周后，取等分试样用于比活性测量。所有的等分样品都储存在浓度为154mM的Tris-HClNaCl中，该浓度相当于0.9％的药用盐水溶液的离子强度。将等分试样储存在冰上直至测量。根据活性测量方案进行测量。

此外，还进行了冻融测试，以评估产品溶液在冻融过程中如何抵抗冰晶的形成。样品在-80℃下冷冻5次，然后再次解冻，同时在每个循环后取等分样品来测量活性。一般稳定性和溶解性结果表明，如果样品浓度在在-15℃、2-8℃和25℃高于0.1mg/ml，总体上比活性在7天内不会下降。如果样品冷冻少于2次，-80℃冻融循环的冻融稳定性不会降低比活性。样品储存浓度显示，在单个冻融循环内和储存在-15℃和2-8℃的单日内，蛋白质的损失为5-15％，这很可能是由于吸附作用。在25℃，浓度高于0.2mg/ml的样品在7天内似乎没有显示出浓度损失。

结果表明，最终产品应优选地储存在蛋白低结合管中，浓度在0.2mg/ml以上，并且冷冻不超过一次以确保绝对稳定。测量在在具有150-1500μl低填充体积的小微管(1.5ml)中进行。与在50ml管中的产品存储相比，这导致体积比表面积的商小得多。因此，上述结果很可能比商业化的产品更依赖于吸附效果。

材料：

Sigma-Aldrich Tris(TRIS-RO)

Carl-RothHCl(P074.4)

Carl-RothNaCl(3957.3)

Thermo Fisher Scientific NanoDrop Lite(见设备)

Sigma-Aldrich(Eppendorf)3810X微管(Z606340)

Eppendorf移液器(见设备)

2:现有技术中的透明质酸酶肽与本发明的改性的细菌透明质酸酶(同义词：d016) 之间的比活性比较

2.1来自链霉菌考干尼西斯(Streptomyces koganeiensis)的细菌透明质酸酶(同义词：Messina透明质酸酶)与本发明的改性的细菌透明质酸酶之间的比活性比较

“因此，周质可溶部分的rHyal_Sk以约2g/L培养基的最终浓度产生，具有非常高的功能活性(超过40000单位/mg)，比发酵产生的自体Hyal高670-750倍。”(见Messina etal.,“Identification and characterization of a bacterial hyaluronidase and itsproduction in recombinant form”,Federation of European Biochemical Societies(FEBS)Letters,Volume 590,Issue 14,July 2016,pp.2180-2189)。

因此，源自链霉菌考干尼西斯的细菌Messina透明质酸酶的每毫克比活性是：>40,000U/mg，即40,000U/mg至50,000U/mg之间。

如实施例1.4.2中所示的本发明的改性的细菌透明质酸酶d016的比活性为：1,500,000U/mg。

因此，本发明的改性的细菌透明质酸酶d016每毫克蛋白质的比活性是相比较的Messina透明质酸酶比活性的约30倍至37.5倍。

2.2人类PH20透明质酸酶和本发明的改性的细菌透明质酸酶d016的比较

“人类PH20，His标签(目录号PH0-H5225)的活性是通过其在浊度测定(45分钟测定)中水解HA的能力来衡量的。比活性>40,000U/mg。(单位定义：在2.0mL反应混合物中，在pH 5.35和37℃下，一个单位的透明质酸酶活性将导致A600的变化为0.330/分钟)”-ACRObiosystems，https://www.acrobiosystems.com/P563-Human-PH20--SPAM1-Protein-His-Tag.html。

因此，人类PH20透明质酸酶的每毫克比活性是：>40,000U/mg，即在40,000U/mg至50,000U/mg之间。

因此，本发明的改性的细菌透明质酸酶d016每毫克蛋白质的比活性是相比较的人类PH20透明质酸酶比活性的约30倍至37.5倍。

2.3牛透明质酸酶与本发明的改性的细菌透明质酸酶d016的比较

“透明质酸酶降解透明质酸，并被发现在癌症进展过程中受到不适当的调节。这些酶随机裂解透明质酸、软骨素和硫酸软骨素中的β-N-乙酰己糖胺-[1→4]糖苷键。单位定义：在2.0ml的反应混合物中，在pH 5.35和37℃下，一个单位会使600nm处的透射率百分比的变化为0.330/分钟(45分钟测定)。”-Sigma-Aldrich，牛睾丸透明质酸酶的供应商。

牛睾丸透明质酸酶，I-S型，冻干粉400-1,000U/mg固体，

牛睾丸透明质酸酶，IV-S型，粉末，适用于小鼠胚胎细胞培养750-3,000U/mg固体，

牛睾丸透明质酸酶，IV-S型，冻干粉(基本无盐)，750-3,000U/mg，

牛睾丸透明质酸酶，VIII型，冻干粉，300-1,000U mg，

牛睾丸透明质酸酶，VI-S型，冻干粉，3,000-15,000U/mg。

因此，牛透明质酸酶的比活性范围广泛，在300至15,000U/mg之间。

因此，本发明的改性的细菌透明质酸酶d016每毫克蛋白质的比活性是相比较的牛透明质酸酶比活性的约100倍至5,000倍。

序列表

<110> 医药控股公司

<120> 一种改性的细菌透明质酸酶多肽、生产方法、药物组合物及其用途

<130> P1035/WO

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 740

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<220>

<223> 改性的细菌透明质酸酶 D016

<400> 1

Met Gly Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ala Ser Val Lys Asp Thr

1 5 10 15

Tyr Thr Asp Arg Leu Asp Asp Trp Asn Gly Ile Ile Ala Gly Asn Gln

20 25 30

Tyr Tyr Asp Ser Lys Asn Asp Gln Met Ala Lys Leu Asn Gln Glu Leu

35 40 45

Glu Gly Lys Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser Ile Ser Ser Gln Ala Asp

50 55 60

Arg Ile Tyr Leu Trp Glu Lys Phe Ser Asn Tyr Lys Thr Ser Ala Asn

65 70 75 80

Leu Thr Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Glu Glu Met Ala Lys Gln Val Thr

85 90 95

Asn Pro Ser Ser Arg Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Val Val Arg Thr Val

100 105 110

Arg Asp Ser Met Glu Trp Met His Lys His Val Tyr Asn Ser Glu Lys

115 120 125

Ser Ile Val Gly Asn Trp Trp Asp Tyr Glu Ile Gly Thr Pro Arg Ala

130 135 140

Ile Asn Asn Thr Leu Ser Leu Met Lys Glu Tyr Phe Ser Asp Glu Glu

145 150 155 160

Ile Lys Lys Tyr Thr Asp Val Ile Glu Lys Phe Val Pro Asp Pro Glu

165 170 175

His Phe Arg Lys Thr Thr Asp Asn Pro Phe Lys Ala Leu Gly Gly Asn

180 185 190

Leu Val Asp Met Gly Arg Val Lys Val Ile Ala Gly Leu Leu Arg Lys

195 200 205

Asp Asp Gln Glu Ile Ser Ser Thr Ile Arg Ser Ile Glu Gln Val Phe

210 215 220

Lys Leu Val Asp Gln Gly Glu Gly Phe Tyr Gln Asp Gly Ser Tyr Ile

225 230 235 240

Asp His Thr Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val Leu Ile

245 250 255

Asp Gly Leu Ser Gln Leu Leu Pro Val Ile Gln Lys Thr Lys Asn Pro

260 265 270

Ile Asp Lys Asp Lys Met Gln Thr Met Tyr His Trp Ile Asp Lys Ser

275 280 285

Phe Ala Pro Leu Leu Val Asn Gly Glu Leu Met Asp Met Ser Arg Gly

290 295 300

Arg Ser Ile Ser Arg Ala Asn Ser Glu Gly His Val Ala Ala Val Glu

305 310 315 320

Val Leu Arg Gly Ile His Arg Ile Ala Asp Met Ser Glu Gly Glu Thr

325 330 335

Lys Gln Arg Leu Gln Ser Leu Val Lys Thr Ile Val Gln Ser Asp Ser

340 345 350

Tyr Tyr Asp Val Phe Lys Asn Leu Lys Thr Tyr Lys Asp Ile Ser Leu

355 360 365

Met Gln Ser Leu Leu Ser Asp Ala Gly Val Ala Ser Val Pro Arg Thr

370 375 380

Ser Tyr Leu Ser Ala Phe Asn Lys Met Asp Lys Thr Ala Met Tyr Asn

385 390 395 400

Ala Glu Lys Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Leu Phe Ser Ser Arg Thr

405 410 415

Leu Asn Tyr Glu His Met Asn Lys Glu Asn Lys Arg Gly Trp Tyr Thr

420 425 430

Ser Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Gly Asp Leu Ser His Tyr Ser

435 440 445

Asp Gly Tyr Trp Pro Thr Val Asn Pro Tyr Lys Met Pro Gly Thr Thr

450 455 460

Glu Thr Asp Ala Lys Arg Ala Asp Ser Asp Thr Gly Lys Val Leu Pro

465 470 475 480

Ser Ala Phe Val Gly Thr Ser Lys Leu Asp Asp Ala Asn Ala Thr Ala

485 490 495

Thr Met Asp Phe Thr Asn Trp Asn Gln Thr Leu Thr Ala His Lys Ser

500 505 510

Trp Phe Met Leu Lys Asp Lys Ile Ala Phe Leu Gly Ser Asn Ile Gln

515 520 525

Asn Thr Ser Thr Asp Thr Ala Ala Thr Thr Ile Asp Gln Arg Lys Leu

530 535 540

Glu Ser Ser Asn Pro Tyr Lys Val Tyr Val Asn Asp Lys Glu Ala Ser

545 550 555 560

Leu Thr Glu Gln Glu Lys Asp Tyr Pro Glu Thr Gln Ser Gly Phe Leu

565 570 575

Glu Ser Ser Asp Ser Lys Lys Asn Ile Gly Tyr Phe Phe Phe Lys Lys

580 585 590

Ser Ser Ile Ser Met Ser Lys Ala Leu Gln Lys Gly Ala Trp Lys Asp

595 600 605

Ile Asn Glu Gly Gln Ser Asp Lys Glu Val Glu Asn Glu Phe Leu Thr

610 615 620

Ile Ser Gln Ala His Lys Gln Asn Gly Asp Ser Tyr Gly Tyr Met Leu

625 630 635 640

Ile Pro Asn Val Asp Arg Ala Thr Phe Asn Gln Met Ile Lys Glu Leu

645 650 655

Glu Ser Ser Leu Ile Glu Asn Asn Glu Thr Leu Gln Ser Val Tyr Asp

660 665 670

Ala Lys Gln Gly Val Trp Gly Ile Val Lys Tyr Asp Asp Ser Val Ser

675 680 685

Thr Ile Ser Asn Gln Phe Gln Val Leu Lys Arg Gly Val Tyr Thr Ile

690 695 700

Arg Lys Glu Gly Asp Glu Tyr Lys Ile Ala Tyr Tyr Asn Pro Glu Thr

705 710 715 720

Gln Glu Ser Ala Pro Asp Gln Glu Val Phe Lys Lys Leu Glu His His

725 730 735

His His His His

740

<210> 2

<211> 2251

<212> DNA

<213> 肺炎链球菌

<220>

<223> 编码改性的细菌透明质酸酶D016的DNA序列

<400> 2

ccatgggctg gagccatccg cagtttgaaa aagcaagcgt gaaggatacg tacacggacc 60

gcttagatga ctggaacggg atcatcgcgg ggaaccagta ctatgatagc aaaaacgacc 120

aaatggcaaa attaaatcaa gaattagaag gtaaggtcgc ggattcactc tcaagcatta 180

gcagccaagc tgaccggatc tatttatggg aaaaatttag caactataaa acaagcgcca 240

accttacggc aacgtatcga aaattagagg agatggcaaa gcaggtaacg aacccgagca 300

gccgctatta tcaggatgaa acggtcgtgc ggacggtccg agattcaatg gaatggatgc 360

ataaacatgt ctacaacagc gaaaagtcaa ttgtggggaa ttggtgggat tatgaaatcg 420

gcacgccgcg cgcaatcaat aacacgttaa gccttatgaa agaatacttc agcgatgagg 480

aaattaaaaa atatacggat gtaattgaaa aatttgtccc agatccagaa catttccgga 540

agacaacgga taatccgttc aaggcgctcg gcggtaattt agtggatatg ggtcgagtca 600

aagtcatagc gggcttactt cgcaaggatg atcaggaaat tagcagcacg attcggtcaa 660

ttgagcaggt attcaagtta gtcgaccagg gcgaaggctt ttatcaggat ggttcatata 720

tcgaccacac gaacgtggca tatacaggcg cgtatgggaa cgtgttaatt gatgggttga 780

gccagctttt accggtcatt cagaagacga agaacccgat cgataaagat aaaatgcaga 840

cgatgtacca ctggattgat aaatcatttg cgccgttact tgtaaacggt gagcttatgg 900

atatgagccg cggtcggtca atcagccgcg ccaactcaga ggggcacgta gcagccgtcg 960

aagtcctccg ggggattcac cggatagctg atatgagcga aggtgaaacg aaacagcgct 1020

tacaaagctt agtaaagacg attgtgcagt cagatagcta ttatgatgtc tttaagaact 1080

taaagacgta taaggatatc agcttaatgc agtcattatt aagcgatgcc ggtgtcgcca 1140

gcgtgccgcg gacgagctac ctcagcgcat ttaataagat ggataaaacg gcaatgtaca 1200

acgccgagaa agggtttggt tttgggttaa gcttgttttc aagccgcacg ttaaactacg 1260

aacacatgaa taaggaaaac aaacgcggct ggtatacaag cgatgggatg ttctatttat 1320

acaacgggga tttaagccac tattcagatg ggtactggcc gacggtgaac ccgtataaga 1380

tgccgggcac gacggagaca gatgcgaagc gggctgattc agatacgggc aaagtgttac 1440

ccagcgcgtt cgtgggtaca tcaaaactcg atgatgcaaa cgctacggcc acgatggatt 1500

tcacgaattg gaaccagacg ttaacggcgc ataagtcatg gtttatgctc aaggataaga 1560

ttgcattttt aggttcaaac atccagaata cgagcacgga tacggcggcc acgacgattg 1620

accaacggaa acttgaaagc agcaacccgt ataaagtcta tgtcaacgat aaagaagcat 1680

cattaacgga acaggaaaag gattatccgg aaacgcagag cgggttttta gaatcatcag 1740

attcaaaaaa gaacattggc tactttttct ttaagaagag cagcatcagc atgagcaagg 1800

cgttacagaa gggtgcatgg aaggatatca acgaaggtca aagcgacaag gaagtggaaa 1860

acgaattttt aacaattagc caagcgcata agcagaacgg tgatagctat gggtatatgt 1920

tgattccgaa tgtagatcgc gcaacgttca accagatgat aaaagagtta gaatcatcat 1980

tgatcgaaaa caatgaaacg ttacaaagcg tgtatgatgc aaaacagggt gtgtggggga 2040

ttgtaaaata tgatgatagc gtcagcacga tttcaaatca gttccaggtg ttaaaacgcg 2100

gtgtctatac gattcggaaa gaaggggatg aatataagat tgcatactat aacccggaaa 2160

cgcaagaaag cgcgccggat caagaagtct ttaaaaagct cgagcatcat catcatcatc 2220

actaaccact cgacttcttt tggagctgag c 2251

<210> 3

<211> 949

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<220>

<223> 野生型细菌透明质酸酶序列

<400> 3

Met Val Pro Ile Glu Ala Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Arg Phe Lys Ile

1 5 10 15

Lys Thr Asp Asn Lys Val Gly Ile Ala Lys Val Arg Ile Ile Glu Glu

20 25 30

Ser Gly Lys Asp Lys Arg Leu Trp Asn Ser Ala Thr Thr Ser Gly Thr

35 40 45

Lys Asp Trp Gln Thr Ile Glu Ala Asp Tyr Ser Pro Thr Leu Asp Val

50 55 60

Asp Lys Ile Lys Leu Glu Leu Phe Tyr Glu Thr Gly Thr Gly Thr Val

65 70 75 80

Ser Phe Lys Asp Ile Glu Leu Val Glu Val Ala Asp Gln Pro Ser Glu

85 90 95

Asp Ser Gln Thr Asp Lys Gln Leu Glu Glu Lys Ile Asp Leu Pro Ile

100 105 110

Gly Lys Lys His Val Phe Pro Leu Ala Asp Tyr Thr Tyr Lys Val Glu

115 120 125

Asn Pro Asp Val Ala Ser Val Lys Asn Gly Ile Leu Glu Pro Leu Lys

130 135 140

Glu Gly Thr Thr Asn Val Ile Val Ser Lys Asp Gly Lys Glu Val Lys

145 150 155 160

Lys Ile Pro Leu Lys Ile Leu Ala Ser Val Lys Asp Thr Tyr Thr Asp

165 170 175

Arg Leu Asp Asp Trp Asn Gly Ile Ile Ala Gly Asn Gln Tyr Tyr Asp

180 185 190

Ser Lys Asn Asp Gln Met Ala Lys Leu Asn Gln Glu Leu Glu Gly Lys

195 200 205

Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser Ile Ser Ser Gln Ala Asp Arg Ile Tyr

210 215 220

Leu Trp Glu Lys Phe Ser Asn Tyr Lys Thr Ser Ala Asn Leu Thr Ala

225 230 235 240

Thr Tyr Arg Lys Leu Glu Glu Met Ala Lys Gln Val Thr Asn Pro Ser

245 250 255

Ser Arg Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Val Val Arg Thr Val Arg Asp Ser

260 265 270

Met Glu Trp Met His Lys His Val Tyr Asn Ser Glu Lys Ser Ile Val

275 280 285

Gly Asn Trp Trp Asp Tyr Glu Ile Gly Thr Pro Arg Ala Ile Asn Asn

290 295 300

Thr Leu Ser Leu Met Lys Glu Tyr Phe Ser Asp Glu Glu Ile Lys Lys

305 310 315 320

Tyr Thr Asp Val Ile Glu Lys Phe Val Pro Asp Pro Glu His Phe Arg

325 330 335

Lys Thr Thr Asp Asn Pro Phe Lys Ala Leu Gly Gly Asn Leu Val Asp

340 345 350

Met Gly Arg Val Lys Val Ile Ala Gly Leu Leu Arg Lys Asp Asp Gln

355 360 365

Glu Ile Ser Ser Thr Ile Arg Ser Ile Glu Gln Val Phe Lys Leu Val

370 375 380

Asp Gln Gly Glu Gly Phe Tyr Gln Asp Gly Ser Tyr Ile Asp His Thr

385 390 395 400

Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val Leu Ile Asp Gly Leu

405 410 415

Ser Gln Leu Leu Pro Val Ile Gln Lys Thr Lys Asn Pro Ile Asp Lys

420 425 430

Asp Lys Met Gln Thr Met Tyr His Trp Ile Asp Lys Ser Phe Ala Pro

435 440 445

Leu Leu Val Asn Gly Glu Leu Met Asp Met Ser Arg Gly Arg Ser Ile

450 455 460

Ser Arg Ala Asn Ser Glu Gly His Val Ala Ala Val Glu Val Leu Arg

465 470 475 480

Gly Ile His Arg Ile Ala Asp Met Ser Glu Gly Glu Thr Lys Gln Arg

485 490 495

Leu Gln Ser Leu Val Lys Thr Ile Val Gln Ser Asp Ser Tyr Tyr Asp

500 505 510

Val Phe Lys Asn Leu Lys Thr Tyr Lys Asp Ile Ser Leu Met Gln Ser

515 520 525

Leu Leu Ser Asp Ala Gly Val Ala Ser Val Pro Arg Thr Ser Tyr Leu

530 535 540

Ser Ala Phe Asn Lys Met Asp Lys Thr Ala Met Tyr Asn Ala Glu Lys

545 550 555 560

Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Leu Phe Ser Ser Arg Thr Leu Asn Tyr

565 570 575

Glu His Met Asn Lys Glu Asn Lys Arg Gly Trp Tyr Thr Ser Asp Gly

580 585 590

Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Gly Asp Leu Ser His Tyr Ser Asp Gly Tyr

595 600 605

Trp Pro Thr Val Asn Pro Tyr Lys Met Pro Gly Thr Thr Glu Thr Asp

610 615 620

Ala Lys Arg Ala Asp Ser Asp Thr Gly Lys Val Leu Pro Ser Ala Phe

625 630 635 640

Val Gly Thr Ser Lys Leu Asp Asp Ala Asn Ala Thr Ala Thr Met Asp

645 650 655

Phe Thr Asn Trp Asn Gln Thr Leu Thr Ala His Lys Ser Trp Phe Met

660 665 670

Leu Lys Asp Lys Ile Ala Phe Leu Gly Ser Asn Ile Gln Asn Thr Ser

675 680 685

Thr Asp Thr Ala Ala Thr Thr Ile Asp Gln Arg Lys Leu Glu Ser Ser

690 695 700

Asn Pro Tyr Lys Val Tyr Val Asn Asp Lys Glu Ala Ser Leu Thr Glu

705 710 715 720

Gln Glu Lys Asp Tyr Pro Glu Thr Gln Ser Gly Phe Leu Glu Ser Ser

725 730 735

Asp Ser Lys Lys Asn Ile Gly Tyr Phe Phe Phe Lys Lys Ser Ser Ile

740 745 750

Ser Met Ser Lys Ala Leu Gln Lys Gly Ala Trp Lys Asp Ile Asn Glu

755 760 765

Gly Gln Ser Asp Lys Glu Val Glu Asn Glu Phe Leu Thr Ile Ser Gln

770 775 780

Ala His Lys Gln Asn Gly Asp Ser Tyr Gly Tyr Met Leu Ile Pro Asn

785 790 795 800

Val Asp Arg Ala Thr Phe Asn Gln Met Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ser

805 810 815

Leu Ile Glu Asn Asn Glu Thr Leu Gln Ser Val Tyr Asp Ala Lys Gln

820 825 830

Gly Val Trp Gly Ile Val Lys Tyr Asp Asp Ser Val Ser Thr Ile Ser

835 840 845

Asn Gln Phe Gln Val Leu Lys Arg Gly Val Tyr Thr Ile Arg Lys Glu

850 855 860

Gly Asp Glu Tyr Lys Ile Ala Tyr Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Glu Ser

865 870 875 880

Ala Pro Asp Gln Glu Val Phe Lys Lys Leu Glu Gln Ala Ala Gln Pro

885 890 895

Gln Val Gln Asn Ser Lys Glu Lys Glu Lys Ser Glu Glu Glu Lys Asn

900 905 910

His Ser Asp Gln Lys Asn Leu Pro Gln Thr Gly Glu Gly Gln Ser Ile

915 920 925

Leu Ala Ser Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Phe Arg

930 935 940

Arg Gly Lys Asn Asn

945

<210> 4

<211> 2850

<212> DNA

<213> 肺炎链球菌

<220>

<223> 编码野生型细菌透明质酸酶序列的DNA序列

<400> 4

atggttccta ttgaagctaa gaaaaagtat aaactgcgtt tcaagattaa aacagataat 60

aaagtcggga ttgccaaagt tcgtatcatt gaggaaagtg gtaaggacaa gcgattgtgg 120

aattctgcaa cgacgtcagg aacaaaggac tggcagacca ttgaagcaga ctatagcccg 180

actttagatg ttgataaaat caagctggag ttattctatg aaacaggaac tgggactgtt 240

tcctttaagg atattgagct ggtagaggta gcagaccagc cttctgagga ttctcaaaca 300

gataaacaac ttgaggaaaa gattgattta ccaattggaa aaaaacatgt ttttcctctt 360

gcggactata cttataaggt agaaaatcct gacgttgctt cagtcaaaaa tggaatttta 420

gaacctctta aggaagggac aaccaatgtc attgtcagta aagatggcaa ggaagtgaaa 480

aagattcctt tgaagattct agcctctgtt aaggatacat acacagaccg tttggatgac 540

tggaatggca tcatcgctgg gaatcaatac tatgattcta aaaatgacca gatggccaaa 600

ttaaaccagg aattggaagg aaaggtagct gatagcctat ccagtatttc aagtcaggcg 660

gaccgcatct atttgtggga aaaattttca aattataaaa cgtctgcaaa tctgactgcc 720

acttatcgga aattggagga gatggccaag caagtgacca atccttcttc tcgttattat 780

caagatgaaa ctgtcgttcg aacagtcagg gattccatgg aatggatgca taaacatgtc 840

tacaatagtg aaaagagcat tgttgggaac tggtgggatt atgaaatcgg tacacctcgt 900

gccatcaaca ataccttgtc tctgatgaaa gaatacttct ctgatgagga aattaaaaaa 960

tatacagatg tgattgaaaa atttgtacca gatcccgaac atttccgaaa gacgactgat 1020

aacccattca aggctctagg tggaaactta gttgatatgg gaagggtaaa agtaatagct 1080

ggtttactgc gtaaggatga tcaagaaatt tcttctacca ttcgctcgat tgagcaagtg 1140

ttcaagttgg tagaccaagg tgaaggtttt tatcaagatg gatcctatat cgaccacacc 1200

aatgttgcct atacgggtgc ttatgggaat gttttgattg atggcctgtc tcaactgttg 1260

ccagtcattc aaaagaccaa gaatccaatc gataaagata aaatgcaaac catgtaccac 1320

tggattgata aatcgtttgc tcctttgctg gtgaatggag agctgatgga tatgagtcgt 1380

ggacgctcga tcagtcgtgc aaatagcgag gggcacgtgg ccgcagtaga agtactaaga 1440

gggattcacc gaatagcgga tatgtctgaa ggagaaacca aacaacgttt gcagagtctt 1500

gtgaagacca ttgttcaatc ggatagttat tatgatgtct ttaagaattt gaagacttat 1560

aaggatatca gtttgatgca atccttgtta agtgatgcag gagtcgcaag tgttccaaga 1620

acaagttacc tatctgcctt taacaagatg gataaaacag ccatgtacaa tgcagagaaa 1680

gggtttggat ttggcttgtc actcttttcc agtcgtacct tgaattacga acacatgaac 1740

aaggaaaata aacgtggttg gtatacgagt gatgggatgt tctatcttta caatggcgat 1800

ttgagtcact atagcgatgg ctactggcca acagttaatc catataagat gcctggtaca 1860

acagagacgg atgctaagag agcggatagc gatacaggta aagttttacc gtctgctttc 1920

gttggaacga gcaaactaga tgatgccaat gcgacagcaa ccatggattt caccaactgg 1980

aatcaaacat tgactgctca taagagctgg tttatgctaa aggataagat tgccttttta 2040

ggaagcaata tccaaaacac ttcaacagat actgctgcaa ctacaattga ccagagaaaa 2100

ctggaatcaa gtaatccata taaagtctat gtcaatgata aagaagcctc ccttacagaa 2160

caagaaaagg attatcctga aacccaaagt gggtttttag aatcgtccga ttcgaaaaag 2220

aatattggtt actttttctt taagaagagt tcaatcagta tgagtaaggc tttgcaaaag 2280

ggagcctgga aggatatcaa tgaaggacag tcagacaagg aagttgaaaa tgaatttctt 2340

acgattagtc aggctcataa gcaaaatgga gattcttatg gctatatgct cattcctaac 2400

gtggatcgtg ccaccttcaa tcaaatgata aaagagttag aaagcagcct catcgaaaat 2460

aacgaaaccc ttcagtctgt ttatgatgcc aaacaaggag tttggggcat tgtgaaatat 2520

gatgattctg tctctactat ttccaaccaa ttccaagttt tgaaacgtgg agtctatact 2580

attcgaaaag aaggggatga atataagatt gcctactata atcctgaaac ccaggaatca 2640

gctccagatc aggaagtctt taaaaagcta gagcaagcag ctcagccaca agtacagaat 2700

tcaaaagaaa aggaaaaatc tgaagaggaa aagaaccatt cggatcaaaa gaatctccct 2760

cagacaggag aaggtcagtc aatcttggca agtctagggt tcttgctact tggggcgttt 2820

tatttattcc gtagaggaaa gaacaactaa 2850

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Strep标签氨基酸序列

<400> 5

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码Strep标签氨基酸序列的DNA序列

<400> 6

tggagccatc cgcagtttga aaaa 24

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> His标签氨基酸序列

<400> 7

His His His His His His

1 5

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码His标签氨基酸序列的DNA序列

<400> 8

catcatcatc atcatcac 18

Claims

1.一种改性的细菌透明质酸酶多肽，其包括与SEQ ID No.1至少90％的序列同一性或由与SEQ ID No.1至少90％的序列同一性组成，其特征在于，所述透明质酸酶多肽包括SEQID No.7的C端HIS标签和SEQ ID No.5的N端Strep标签。

2.根据权利要求1所述的改性的细菌透明质酸酶多肽，其用于治疗或预防透明质酸相关和/或蛋白多糖相关的疾病或病症，所述疾病或病症优选地选自由纯合子型家族性高胆固醇血症即黄瘤病、杂合子型家族性高胆固醇血症或糖尿病足综合征组成的组。

3.一种核酸，其编码根据权利要求1所述的改性的细菌透明质酸酶多肽，优选地其中所述核酸包括SEQ ID No.2或由SEQ ID No.2组成。

4.一种重组表达载体，其包括表达载体和根据权利要求3所述的核酸。

5.一种宿主细胞，其被根据权利要求4所述的重组表达载体转化，优选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

6.纯化的根据权利要求1或2所述的细菌透明质酸酶多肽的生产方法，其包括以下步骤或由以下步骤组成：

a.在合适的生长条件下，在合适的生长培养基中培养根据权利要求5所述的转化的宿主细胞以表达根据权利要求1或2所述的细菌透明质酸酶多肽，

b.收获步骤a)中培养的转化的宿主细胞，

c.裂解步骤b)中收获的宿主细胞，并将所得的宿主细胞碎片与所得的包含所述细菌透明质酸酶多肽的宿主细胞内容物分离，和

d.用HIS亲和层析和STREP亲和层析纯化步骤c)所得的宿主细胞内容物，以产生根据权利要求1或2所述的细菌透明质酸酶多肽的纯化形式。

7.根据权利要求6所述的纯化的细菌透明质酸酶多肽的生产方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

8.一种包含SEQ ID No.1或由SEQ ID No.1组成的改性的细菌透明质酸酶多肽，其可根据根据权利要求6或7所述的生产方法获得。

9.一种药物组合物，其包括治疗有效量的根据权利要求1、2或8中任一项所述的改性的细菌透明质酸酶多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述组合物的单位剂量包括的所述改性的细菌透明质酸酶多肽的量为200U/公斤/天至30,000U/公斤/天。

11.根据权利要求9或10所述的药物组合物，其中所述组合物选自固体、半固体或液体应用形式。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物适于口服、鼻、透皮、直肠、静脉内或肌肉内应用。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的药物组合物，其用于治疗或预防透明质酸相关和/或蛋白多糖相关的疾病或病症，所述疾病或病症优选地选自由纯合子型家族性高胆固醇血症即黄瘤病、杂合子型家族性高胆固醇血症或糖尿病足综合征组成的组。

14.一种治疗透明质酸相关和/或蛋白多糖相关的疾病或病症的方法，其包括以下或由以下组成：向有需要的受试者施用根据权利要求1、2或8中任一项所述的改性的细菌透明质酸酶多肽，或根据权利要求9至13所述的药物组合物。

15.根据权利要求14所述的治疗方法，其中所述透明质酸相关和/或蛋白多糖相关的疾病或病症选自由纯合子型家族性高胆固醇血症即黄瘤病、杂合子型家族性高胆固醇血症或糖尿病足综合征组成的组。