SK17612001A3 - Hyaluronidáza z Hirudinaria manillensis, jej izolácia, čistenie a rekombinantné spôsoby jej výroby - Google Patents

Hyaluronidáza z Hirudinaria manillensis, jej izolácia, čistenie a rekombinantné spôsoby jej výroby Download PDF

Info

Publication number
SK17612001A3
SK17612001A3 SK1761-2001A SK17612001A SK17612001A3 SK 17612001 A3 SK17612001 A3 SK 17612001A3 SK 17612001 A SK17612001 A SK 17612001A SK 17612001 A3 SK17612001 A3 SK 17612001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
lys
leu
protein
ser
gly
Prior art date
Application number
SK1761-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Maria Kordowicz
Detlef G�Ssow
Uwe Hofmann
Tadeusz Pacuszka
Andrzej Gardas
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of SK17612001A3 publication Critical patent/SK17612001A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Vynález sa týka izolácie, čistenia a charakterizácie novej hyaluronidázy pochádzajúcej z tropickej pijavice Hirudinaria manillensis. Preto sa podlá tohto vynálezu nový enzým nazýva manilláza. Vynález sa týka dalej rekombinantného spôsobu produkcie manillázy, ktorý zahŕňa rozkrytie DNA a sekvencií aminokyselín rovnako ako expresných vektorov a hostiteíských systémov. Vynález sa tiež týka použitia manillázy na terapeutické účely, napríklad na liečenie chorôb myokardu, trombotických príhod a nádorov.
Doterajší stav techniky
Hyalurónová kyselina alebo hialuronan (HA) je lineárny nerozvetvený glykózaminoglykán s vysokou molekulovou hmotnosťou (2-6xl06), skladajúci sa z opakujúcej sa disacharidovej štruktúry GlcNAc(β1-4)GlcUA. Jej karboxylové skupiny sú úplne ionizované v prevažujúcej hodnote pH extracelulárnych kvapalín ako normálnych tak patologických. HA patrí spolu so síranmi chondroitínu keraténu a heparínu do skupiny glykózaminoglykánov (Jeanloz R. W., Arthr. Rheum. 3, str. 233 až 237, 1960). Na rozdiel od ostatných nemodifikovaných glykózaminoglykánov (GAG) nemá žiadne sulfátové substituenty alebo kovalentne viazaný peptid a dĺžka jeho reťazca a molekulová hmotnosť sú zvyčajne veími značne väčšie. HA je všadeprítomné rozdelený v spojivových tkanivách a bol nájdený snád vo všetkých častiach tela po zavedení zlepšených spôsobov fixácie (Hellstrôm S. a kol., Histochem. J. 22, str. 677 až 682, 1990) a špecifických histochemických spôsobov pri použití hialuronan viažucich peptidov (HABP). Je rovnako prítomný počas vývoja a zrenia v tkanivách neuroektodermáIného pôvodu.
Výrazom hyaluronidáza sa rozumie všeobecne a podía vynálezu enzým, ktorý pôsobí na hyalurónovú kyselinu, nezávisle od aktivity voči iným substrátom.
Hyaluronidáza bola poprvýkrát izolovaná z mikroorganizmov a neskoršie z cicavčích vajec, čo je dnes jej hlavný zdroj (Meyer K., The Enzýme 307, 1971). Podía reakčného mechanizmu boli hyaluronidázy rozdelené do troch hlavných skupín:
V prvej skupine sú mikrobiálne enzýmy kombinované tak, že pôsobia na svoje substráty β-elimináciou produkujúcou delta-4,5-nenasýtené disacharidy. Enzým sa preto musí menovat hyaluronátové lyázy, EC 4.2.99.1.
Druhá skupina, hyaluronoglukózamidáza alebo hyaluronidáza testikulárneho typu (EC 3.2.1.35), pôsobí ako endo-N-acetyl-β-D-hexózaminidáza degradujúca HA na menšie fragmenty, predne tetrasacharid s hexózamínovým podielom na voínom redukujúcom konci. Enzýmy s podobnými vlastnosťami ako hyaluronidáza z vajec, boli získané z pulcov, z hadieho jedu, z včelieho jedu, z početných zvieracích tkanív, z íudského séra a z iných zdrojov. Je dobre známe, že hyaluronidáza z vajec má tiež transglykozylátové účinky (Weissman B. a kol., J. Biol. Chem. 208, str. 417 až 429, 1954). Enzýmy, patriace do tejto skupiny hyaluronidáz, vykazujú enzymatické pôsobenie nie len na hyaluronát, ale tiež na chondroitin-4-sulfát, chondroitin-6-sulfát, a dermatansulfát.
Tretiu skupinu tvorí hyaluronoglukuronidáza (EC 3.2.1.36), ktorá pôsobí ako endo-p-glukuronidáza. Tento enzým bol izolovaný z pijavíc Hirudo medicinalis (Yuki H., Fushman W.H., J. Biol. Chem. 238, str. 1877 až 1879, 1963) a je absolútne špecifický pre HA. Chondroitínsulfát, dermatan a heparín nie sú substráty pre túto hyaluronidázu. Odbúrava iba hyalurónovú kyselinu na tetrasacharid s glukurónovou kyselinou na voínom redukujúcom konci (Linker A. a kol., J. Biol. Chem. 235, str. 924 až 927, 1960). Na rozdiel od cicavčích endo-p-glukózaminidáz, nemá heparín vplyv na pôsobenie tejto pijavicovej hyaluronidázy. Môže sa teda podávač pacientom spoločne s heparínom a jeho derivátmi extenzívne používanými ako antikoagulanty. Kyselina hialurónová, špecificky endo-p-glukuronidáza (nazývaná Orgeláza) z druhov {Poecilobdella granulosa) podskupiny Hirudinariinae (vrátane Hirudinaria illebdella, poecilobdella, sanguisoga) byvolích pijavíc je opísaná v európskom patentovom spise číslo EP 0193 330 a má molekulovú hmotnosť približne 28,5
Hialuronidázy majú vela praktických aplikácií in vitro a in vivo. Intravenózne podávanie hyaluronidázy je navrhované na liečenie myokardiálnej infrakcie (Kloner R.A. a kol., Circulation 58, str. 220 až 226, 1978; Wolf R.A. a kol., Am. J. Cardiol. 53, str. 841 až 944, 1984; Taira A. a kol., Angiology 41, str. 1029 až 1036, 1990). Myokardiálna infrakcia predstavuje spoločnú formu nemechanických poranení; menovite hrubé porušenie a uhynutie buniek, spôsobené v tomto prípade náhlou bunkovou hypoxiou. Pri umele vyvolanej myokardiálnej infrakcie potkanov (Waldenstrôm A. a kol.,J. Clin. Invest. 88, str. 1622 až 1628, 1991) je zvýšený obsah HA v poranenom srdcovom svale (infraktové oblasti) počas 24 hodín približne trikrát, normálne po troch dňoch a je sprevádzaný intersticiálnym opuchom. Pomerný obsah vody v infraktovanej oblasti tiež progresívne vzrastá a dosahuje maximálne hodnoty tretí deň a je v silnej korelácii s hromadením HA. Rovnaká súvislosť so zvýšeným obsahom HA s opuchom bola pozorovaná v experimentálnom odmietnutí implantátu srdca a obličiek (Hällgren R. a kol., J. Clin. Invest 85, str. 668 až 673, 1990; Hällgren R. a kol., J. Exp.
Med. 171, str. 2063 až 2076, 1990), v odmietnutí ludskej implantovanej obličky (Wells A. a kol., Transplantation 50, str. 240 až 243, 1990), pri plúcnych ochoreniach (Bjermer A. a kol., Brit. Med. J. 295, str. 801 až 806 1987) a pri idiopatickej intersticiálnej fibróze (Bjermer A. a kol., Thorax 44, str.
126 až 131 1989). Všetky tieto štúdie poskytujú nie len poznatok o zvýšení HA v akútnom zápale, ale dokladajú tiež jeho účast v lokálnej retencii kvapaliny hlavne zodpovednej za zdurenie tkaniva a ovplyvnení mechanických a elektrofyziologických funkcií srdca.
Tieto výsledky môžu vysvetíovat mechanizmus pôsobenia hyaluronidáz použitých v klinických pokusoch. Uvádza sa, že ošetrenie hyaluronidázou obmedzuje poškodenie buniek počas myokardiálnej ischémie pri potkanoch, psoch a íudí (Maclean D. a kol., Science 194, str. 199, 1976). Degradácia HA môže byt nasledovaná znížením hromadenia vody, znížením tkanivového tlaku a nakoniec lepšou perfúziou.
Bolo doložené, že hyaluronidázy aj extrakty obsahujúce hyaluronidázu z pijavíc je možné použit na rôzne liečebné účely. Tak hyázová terapia kombinovaná s cyklosporínom, viedla k predĺženiu prežitia štepu (Johnson C. a kol., Transplant Inter. v tlači). Hyáza (rozptyíujúci faktor) v najširšom zmysle sa používa na zvýšenie priepustnosti tkanív na zlepšenie difúzie iných farmakologických činidiel (napríklad kombinácie s cytostatikami pri liečení rakovinových nádorov). Okrem toho bolo možné predviesť, že hyaluronidázy sú užitočné pri liečení nádorov, kde pôsobí ako inhibítory angiogenéza a ako pomoc pri lokálnom dodávaní drogy pri liečení nádorov, na liečenie zeleného zákalu a iných očných chorôb a ako prídavok k ostatným terapeutickým činidlom, ako sú lokálne anestetiká a antibiotiká. Celkový prehíad terapeutického použitia a relevancii podal v prehíadnom článku Farr a kol. (Wiener Medizinische Wochenschrift 15, str. 347, 1997 a pripojený zoznam literatúry). Existuje teda potreba aktívnej zlúčeniny, ako je hyaluronidáza. Avšak známe a dostupné hyaluronidázy sú jednak nestabilné (hyaluronidázy z Hirudo medicinalis, Linker a kol., J. Biol. Chem. 235, str. 924, 1960; Yuki a Fishman, J. Biol. Chem. 238, str. 1877, 1963), alebo vykazujú skôr nízku špecifickú aktivitu (EP 0193 330, Budds a kol., Comp. Biochem. Physiol 87B 3, str. 497, 1987). Okrem toho nie je žiadna zo známych hyaluronidáz dostupná v rekombinantnej forme, čo je nutný predpoklad k intenzívnemu komerčnému použitiu.
Vynález teraz predkladá poprvýkrát novú hyaluronidázu, ktorá bola izolovaná a vyčistená z Hirudonaria manillensis rovnako ako rekombinantnú verziu uvedeného enzýmu získaného technikou biologického inžinierstva.
Podstata vynálezu
Vyčistený proteín izolovaný z pijavíc druhu Hirudonaria manillensis majúci biologickú aktivitu hyaluronidázy, ktorá nie je ovplyvnená v svojom pôsobení heparínom má podlá vynálezu molekulovú hmotnosť 53 až 60 v závislosti od glykozylácie
Nový proteín, ktorý sa nazýva manilláza je glykozylovaný v svojej natívnej forme majúcej molekulovú hmotnosť približne 58 kD (± 2 kD) a štyri glykoformy. Vynález sa rovnako týka neglykozylovaného proteínu, získatelného enzymatickým alebo chemickým štiepením cukrových zvyškov štandardnými spôsobmi. Neglykozylovaný enzým podlá vynálezu má molekulovú hmotnosť približne 54 (±2) merané SDS-PAGE.
Z priameho porovnania vyplýva, že hyaluronidáza, opísaná v európskom patentovom spise číslo EP 0 193330 (orgeláza) má za rovnakých podmienok molekulovú hmotnosť približne 28 a obsa huje vela nečistôt, ako je hemoglobín. Natívna manilláza podlá vynálezu má optimálnu hodnotu pH 6,0 až 7,0, izoelektrický bod
7,2 až 8,0 a má sekvenciu aminokyselín vyznačenú na obr. 7.
S prekvapením sa zistilo, že manilláza získaná spôsobom preparátívneho čistenia (pozri dalej) má extrémne vysokú špecifickú aktivitu 100 až 150, s výhodou 110 až 140 (WHO) kU/mg proteínu, zatial čo špecifická aktivita orgelázy je iba približne 1,2 kU/mg. Okrem toho má orgeláza v porovnaní s manillázou nižšiu optimálnu hodnotu pH (5,2 až 6,0). Manilláza nie je ako orgeláza ovplyvňovaná heparínom.
Vynález sa dalej týka spôsobu izolovania a čistenia manillázy, skladajúceho sa z nasledujúcich stupňov:
(i) homogenizácia hláv pijavíc druhu Hirudinaria manillensis kyslým tlmivým roztokom a odstredenie, (ii) vyzrážanie supernatantu zo stupňa (i) síranom amónnym, (iii) katexová chromatografia, (iv) afinitná chromatografia konkanavalínu A, (v) hydrofóbna interakčná chromatografia, (vi) afinitná chromatografia matríc potiahnutých fragmentmi hialurónovej kyseliny, (vii) gólová permeačná chromatografia a prípadne (viii) enzymatická alebo chemická deglykozylácia vyčisteného proteínu.
Uvedené stupne spôsobu podlá vynálezu zaručujú, že je proteín podlá vynálezu možné získať s takou vysokou biologickou enzymatickou aktivitou. Vynález sa preto týka proteínu majúceho biologickú aktivitu hyaluronidázy, ktorá nie je ovplyvnená v svojej účinnosti heparínom a má molekulovú hmotnosť 53 až 60 závislú na glykozylácii, ktorá je získatelná spôsobom podlá vynálezu a ktorá má špecifickú enzymatickú aktivitu vyššiu ako 100 U/mg proteínu. Pojmom jednotka sa rozumie medzinárodná jednotka (U).
Vynález sa týka spôsobu prípravy rekombinantnej manillázy, ktorý obsahuje príslušné molekuly DNA, vektory a transformované hostitelské bunky. Vynález sa teda týka sekvencie DNA kódujúcej proteín majúci vlastnosti natívnej manillázy. Doložilo sa, že by mohli byt vybrané aspoň tri dalšie klony s mierne odlišnými sekvenciami DNA, ktoré kódujú proteíny s vlastnosťami manillázy (hyaluronidázy) majúce mierne odlišnú sekvenciu aminokyselín.
Špecifické klony majú sekvencie DNA vyznačené na obr. 8, a 10 (horné sekvencie), ktoré sú tiež predmetom vynálezu rovnako ako expresné vektory obsahujúce uvedené sekvencie a hostiteľské bunky transformované týmito vektormi.
Vynález sa okrem toho týka rekombinantného proteínu s biologickou aktivitou hyaluronidázy a s molekulovou hmotnosťou 55 až 59 kD, v závislosti od glykozylácie, majúcej sekvencie aminokyselín vyznačené na obr. 8, 9 a 10 (dolné sekvencie) alebo sekvenciu, ktorá je homologická s týmito sekvenciami najmenej z 80 %. Pojem manilláza zahŕňa všetky tieto proteíny majúce hore uvedené vlastnosti.
Natívne alebo rekombinantné proteíny sa môžu používať ako liečivá, ktoré je možné pacientom podávať priamo alebo vo forme farmaceutických prostriedkov. Vynález sa teda týka tiež hore definovaných rekombinantných alebo natívnych proteínov obsahujúcich uvedený proteín, aplikovateľných ako liečivo, a príslušných farmaceutických prostriedkov obsahujúcich uvedený proteín a k tomu farmaceutický prijateľné riedidlo, nosič alebo excipient.
Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu môžu obsahovať prídavné veľmi rozmanité farmaceutické látky. Výhodné sú antikoagulačné činidlá, ktoré nebránia alebo neovplyvňujú biologickú a farmakologickú aktivitu proteínu podľa vynálezu. Takými antikoagulačnými činidlami môžu byt napríklad heparín, hirudín alebo dikumarín, s výhodou heparín. Vynález teda poskytuje farmaceutický prostriedok obsahujúci prídavné farmakologicky účinnú zlúčeninu, s výhodou heparín.
V rámci humánnej a veterinárnej terapie pôsobí proteín podľa vynálezu s výhodou ako dispergačné činidlo (rozptylový faktor) alebo podporuje prenikanie tkanivom a pokožkou. Manillázu je teda možné používať ako adjunkt ostatných látok (ako sú lokálne anestetiká), napríklad v chemoterapii nádorov, na liečenie porúch a chorôb s ohľadom na akútnu myokardiálnu ischémiu alebo infrakciu, na liečenie zeleného zákalu a ostatných očných porúch, napríklad na zlepšenie obehu fyziológie8 kých tekutín v oku, na liečenie pokožkových a tkanivových štepov na odstránenie zrážavosti a zlepšenie obehu, ako systému na dodávanie drogy pokožkou, membránami, iným tkanivom a ako činiteía na odstraňovanie vreciek hialurónovej kyseliny obklopujúcej určité patogénne mikroorganizmy alebo niektoré nádory a rakovinové tkanivá a ako inhibítoru angiogenézy, ktorý je možné použiť ako protitrombotické a protinádorové činidlo.
Vynález sa preto týka použitia manillázy definovanej podía vynálezu na výrobu liečiv na liečenie predovšetkým myokardiálnych, kardiovaskulárnych a trombotických porúch a nádorov.
Výrazom farmaceutický prijateíný nosič sa vždy rozumie nosič, inertné netoxické pevné alebo tekuté plnidlo, riedidlo alebo zapuzdrujúci materiál nereagujúci nepriaznivo s účinnou látkou alebo s pacientom. Vhodné, s výhodou tekuté nosiče sú v odbore známe: príkladne sa uvádzajú sterilná voda, solanka, vodná dextróza, cukrové roztoky, etanol, glykoly a oleje, vrátane olejov minerálneho, živočíšneho alebo rastlinného pôvodu napríklad podzemnicového, sójového a minerálneho oleja.
Prostriedky podía vynálezu sa môžu podávať v jednotkových dávkach obsahujúcich obvyklé netoxické, farmaceutický prijateľné nosiče, riedidlá, adjuvansy a nosiče, ktoré sú typické na parenterálne podávanie.
Výrazom parenterálne sa vždy rozumie subkutánne, intravenózne, intraartikulárne a intratracheálne injekčné a infúzne techniky. Vhodné sú tiež iné podania, ako orálne a topické. Parenterálne prostriedky a kombinácie sa najvýhodnejšie podávajú intravenózne bud’ vo forme bolusu alebo ako konštantná infúzia známymi spôsobmi. Tablety a kapsuly na orálne podanie obsahujú konvenčné excipienty ako sú spojivá, plnidlá, riedidlá, tabletačné činidlá, mazadlá, rozpadavé činidlá a namáčadlá. Tablety môžu byť potiahnuté spôsobmi známymi v odbore.
Tekuté prostriedky na orálne podanie môžu byt vo forme vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, sirupov alebo elixírov alebo sa môžu podávač ako suchý produkt na zmiešanie s vodou alebo iným vhodným nosičom pred použitím. Také tekuté prostriedky môžu obsahovať bežné prísady, ako sú suspenzačné, emulgačné činidlá, nevodné nosiče a konzervačné prísady. Topické aplikácie môžu byt vo forme vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, želé alebo s výhodou emulzných mastí.
Jednotkové dávky podlá vynálezu môžu obsahovať denné potrebné množstvá proteínu podlá vynálezu, alebo ich podiely na vytvorenie potrebnej dávky. Optimálna terapeuticky prijatelná dávka alebo dávkovacia miera pre jednotlivých pacientov (cicavce vrátane ludí) závisí od mnohých činitelov, ako je účinnosť určitej použitej účinnej látky, vek, telesná hmotnosť, celkový zdravotný stav, pohlavie, diéta, čas a cesta podania, rýchlosť vymiznutia, aktivita enzýmu (jednotiek/mg proteínu), liečená choroba, napríklad terapia alebo profylaxia a povaha liečenej choroby.
Preto v prostriedkoch a kombináciách napríklad s antikoagulantmi, ako je heparín na liečenie pacienta (in vivo), je farmaceutický prijatelná dávka proteínu podlá vynálezu (manillázy) približne 0,01 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti (v závislosti od špecifickej aktivity 100 kU/mg), s výhodou 0,1 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti. Jednotková dávka podlá vynálezu môže obsahovať 0,5 až 10 mg manillázy.
Množstvo napríklad prípadne podávaného heparínu spolu s manillázou je na deň 500 až 4000 U (IU), môže však byť prípadne zvýšené alebo znížené.
Čistenie manillázy podlá vynálezu je podrobne opísané v príkladoch. Tabulka I obsahuje schému preparátívneho čisté10 nia manillázy. V tabuíke II je zachytený spôsob obohacovania proteínu podlá vynálezu a tabuíka III obsahuje porovnanie manillázy so známymi hyaluronidázami z pijavíc.
Enzým zvaný manilláza, štiepiaci hyalurónovú kyselinu, bol izolovaný z hláv pijavíc Hirudinaria manillensis a vyčistený do homogenity. Táto hyaluronidáza sa čistí použitím kyselinovej extrakcie, vyzrážaním síranom amónnym, nasledovaným postupnou chromatografiou na stĺpcoch katexu Concanavalin A-Sepharosa, Propyl-Fractogel, Hyaluronanové fragmenty-Sepharosa a DiolLi-Chrospher. Hialurónové fragmenty sa pripravia rozštiepením natívneho hyaluronanu pomocou hyaluronidázy hoväadzích vajec. Po vyčistení a charakteristike fragmentov sa pripraví afinitná matrica, ako je uvedené ďalej. Taká afinitná matrica sa poprvýkrát použila na čistenie hyaluronidázy. Táto vysoko výkonná chromatografia je technikou na rýchle a účinné vyčistenie proteinov viažucich hyaluronan. Výťažok enzýmovej aktivity je po každom stupni čistenia dostatočne vysoký. Výsledky troch nezávislých preparatívnych čistení sú porovnateľné. Ich výsledkom sú vysoko aktívne vzorky obsahujúce 20 až 160 kU/mg v závislosti od stupňa vyčistenia. V porovnávacích pokusoch sa izolujú známe hyaluronidázy podía doterajšieho stavu techniky a ich vlastnosti sa porovnávajú s proteínom podía vynálezu (tabuíka III).
Hialuronidázy vyčistené spôsobom podía schémy uvedenej v tabuíke I sa líšia od iných pijavicových hyaluronidáz opísaných inými autormi. Podobné molekulové hmotnosti boli dosiahnuté za nedisociačných podmienok (každý β-merkaptoetanol), čo naznačuje, že manilláza je jediný podjednotkový enzým v porovnaní sa širokým odborom hyaluronidázových prostriedkov z cicavčích zdrojov. Tento konečný prostriedok je samostatný podjednotkový enzým (obr. 1) so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 58 ± 2 stanovenou pomocou MALDI, s izoelektrickým bodom
7,2 až 8,0.
Tabulka I
Preparatívne čistenie manillázy
Príprava východiskového materiálu pijavice z Bangladéše, približne 15 kg
I
Separácia živých živočíchov zmrazenie týchto živočíchov príprava hlavičiek
Tabulka II
Čistenie manillázy (obohacovanie) z 1 kg hlavičiek pijavíc
Stupeň čistenia Proteín celkom mg Aktivita celková ku Výťažok % Špecifická aktivita U/mg Vyčistenie násobok
Stupeň I supernatant po extrakcii a vyzrážaní kyselinou 31 700 633,3 100 20 1
Stupeň II supernatant po vyzrážaní síranom amónnym 9 530 443,3 70 45 2,25
Katexová chromatografia 426,7 332,5 52,5 770 38,5
Con Ä afinitná chromatografia 41,0 166,2 26,2 4 000 200
Chromatografia Propy1-Fraktoge1 11,9 133,0 21,0 11 000 550
Afinitná chromá- 1,9 tografia fragmentmi hyalurónovej kyseliny-Sepharosa 66,4 10,5 35 000 1 750
Diol-LiChrospher 0,307 33,2 5,2 108 000 5 400
Tabulka III
Porovnanie manillázy so známymi pijavicovými hyaluronidázami
.Manilláza“ Hirudinaria manillensis podľa vynálezu Hvaluronidáza Hvaluronidáza ..Oreeláza“ P.granulosa EP 0 193 330 Budds et al.
H. medicinalis porovnávací príklad H. medicinalis Linker et al, (J-Biol.Chem.,1960)
špecifická aktivita WHO(IU) U/mg 140 000 -20 000 semi-čístené £100 £100
homogenita SDS-PAGE MALDI 1 proteín homogénne 4 glykoformy zmes proteinov nie sú dostupné žiadne výsledky zmes početných proteinov, hlavná nečistota hemoglobín
molekulová hmotnosť 58,3kD±2kD nestanovené nezdelené 28,5±3 kD
aminokyselinová sekvencia určená nestanovené nezdelené nezdelené
pH optimum 6,0-7,0 6,0-7,0 nezdelené 5,2-6,0
pi 7,5-8,0 nestanovené nestanovené nestanovené
hydrofobicita väzba na propyl-HIC pri2M amóniumsulfátu žiadna väzba na propyl-HIC pri2M amóniumsulfátu
aktivita zníženia heparíuom bez vplyvu nestanovené bez vplyvu bez vplyvu
Stabilita
pri + 4°C stála po 7 dňoch *-75% zachovanej aktivity nestála 100% strata aktivity po 7 dňoch inkubácie
pri + 37°C stála po 7 dňoch **60% zachovanej aktivity nestála 100% strata aktivity po 7 dňoch inkubácie pomerne stála
stabilita pri +37°C v prítomnosti psieho séra stála po 7 dňoch M00% zachovanej aktivity nestála 100% strata aktivity po 7 dňoch inkubácie nezdelené netestované
Hviezdičky v tabulkách znamenajú informácie o stanovení aktivity a biochemické charakterizácie (*-*****).
Použité spôsoby stanovenia aktivity a biochemickej charakterizácie závisia od koncentrácie manillázy v analyzovaných vzorkách. Preto boli postupne rozširované vhodnými technikami v nasledujúcich stupňoch čistenia:
* - stanovenie aktivity - test zníženia zákalu ** - stanovenie aktivity - test zníženia zákalu
- stanovenie obsahu proteínu (E280, spôsob Pierce BCA)
- SDS-PAGE (SDS-Polyakrylamide Gel Electrophoresis)
- stanovenie hemoglobínu *** - stanovenie aktivity - test zníženia zákalu
- stanovenie obsahu proteínu (E280' sP°s°b Pierce BCA)
- SDS-PAGE-Western Blot (antiíudská hemoglobínová protilátka ) **** - stanovenie aktivity - test zníženia zákalu
- stanovenie obsahu proteínu (E288, spôsob Pierce BCA)
- SDS-PAGE-Western Blot (antiíudská hemoglobínová protilátka )
- SDS-PAGE-Western Blot protilátky anti Con A
- SDS-PAGE-Western Blot antipeptidových protilátok ***** - MALDI
- stanovenie obsahu proteínu (spôsob Pierce BCA)
- SDS-PAGE-Western Blot - antipeptidovej protilátky
Väzba manillázy na Concanavalin A ukazuje, že táto hyaluronidáza je glykoproteínom, ktorého cukrové zložky sú zakončené α-D-manopyranozylom alebo α-D-glukopyranozylom a stéricky odvodenými zvyškami. Mániilázou-aktivované vzorky vykazujú dva pruhy s takmer rovnakými hodnotami RF v SDS-PAGE. Na lepšie oddelenie pásov sa použije dlhšia SDS-PAGE a rôzne prevádzkové podmienky. Pri týchto pokusoch bolo možné zistit dva ďalšie slabšie pruhy (obr.2). Ich N-koncová čast všetkých (30 aminokyselín) bola individuálne sekvenovaná a opát neukázala žiadny rozdiel v N-konci. Po deglykozylácii endo F-glykozidázou (NPGáza) sa zistilo, že všetky štyri pruhy vytvorili jediný pruh so znížením MW o približne 3. Preto je dosť pravdepodobné, že pozorované rozdiely elektroforetickej mobility sú spôsobené rozdielmi v glykozylačnom obrazci molekúl manillázy. Neuroaminidáza, O-endoglykozidáza a neuraminidáza plus O-glykozidázové spracovanie nemajú vplyv na molekulovú hmotnosť vyčisteného enzýmu (obr. 3). Tieto výsledky ukázali, že manilláza obsahuje aspoň jeden N-riadený oligosacharidový reťazec. Ο-Riadené karbohydrátové reťazce nebolo možné použitým spôsobom zistiť.
Ako záverečná čistiaca operácia bola vykonaná RP-chromatografia. Hoci enzymatická aktivita už nemohla byť preukázaná, mohli byť soli a inhibítory peptidovej proteázy odstránené (obr. 4). Frakcie, obsahujúce proteín, boli charakterizované dalej pomocou MALDI. Molekulová hmotnosť manillázy, stanovená pomocou MALDI, je 58,3.
Heparín nemá vplyv na aktivitu hyaluronidázy (obr. 5). Manilláza je mnohonásobne stabilnejšia ako Hirudo medicinalis hyaluronidáza (obr.6). Okrem toho vykazujú vzorky čiastočne vyčistenej manillázy veimi vysokú stabilitu v plazme psov a potkanov v rozmedzí -20 až + 37.
Príprava Ha-afinitných matríc bola opísaná v literatúre (Tengblad A., B i och im. Biophys. Acts 578, str. 281 až 289, 1979). HA-matrica sa použila na čistenie proteínov viažucich kartiláž-hyaluronáty alebo proteglykanproteín-keratansulfátového jadra (Christner J.E., Anál. Biochem. 90, str. 22 až 32, 1978) z rovnakého zdroja. HA-viazaný proteín (HABP), vyčistený pomocou tejto afinitnej matrice, sa použil dalej v histochemických štúdiách týkajúcich sa rozdelenia hyaluronátových receptorov (Green S-J. a kol., J. Celí Science 89, str. 145 až 156, 1988; Chán F.L. a kol., J. Celí. Biol. 107, str. 289 až 301, 1997) alebo hyaluronanu (Waldenstrôm A. a kol.,J. Clin.
Invest. 88, str. 1622 až 1628, 1991; Waldenstrôm A. a kol., Eur. J. Clin. Invest. 23, str. 277 až 282, 1993) v tkanivách.
Avšak spôsob prípravy tohto gélu, vyvinutý v autorovom laboratóriu, umožňuje vyrábať gély s presne definovanou koncentráciou Ha-fragmentov (1 až 15 mg/ml). To umožňuje používať tieto gély nie len na čistenie proteínov viažucich hyaluronan, ale tiež na ich separáciu pri využití ich rôznej afinity k hyaluronanu. Táto selektívna separácia môže byť riadená pomocou HA-fragmentov rôznej dĺžky. Taká separácia umožňuje lepšiu charakterizáciu mnohých receptorov biologicky závažných (napríklad v onkológii).
HA-matrice pripravené spôsobom podía vynálezu je možné použiť
1) na čistenie známych HA-viažucich proteínov
2) na čistenie neznámych HA-viažucich proteínov
3) na identifikáciu nových HA-viažucich proteínov
4) na čistenie hyaluronidáz.
HA-Fragmenty, získané spôsobom podía vynálezu, môžu byť charakterizované pomocou moderných analytických metód (NMR, MALDI-MS) a je možné ich použiť na výskum vzájomných interakcií proteínov. Okrem toho je možné tieto fragmenty použiť vo výskumoch týkajúcich sa angiogenézy a neovaskularizačných procesov.
Zoznam obrázkov na výkresoch
Na obr.l je gélová elektroforéza SDS-polyakrylamidu (SDS PAGE - vyfarbenie CBB) proteínového štandardu, manillázovej vzorky (po chromatografii Diol-LiChrospher)
1- proteínový štandard veíkého rozsahu
2- manilláza 4 ug
3- orgeláza 6 μg
4- hemoglobín 40 μg.
Na obr. 2 je a) SDS-PAGE (vyfarbenie CBB) b) SDS-PAGE -Western blot štyroch manillázou aktivovaných vzoriek (riadok 3 až 6) po HA-afinitnej chromatografii. V tomto pokuse je použitá králičia P3-2A polyklonálna antipeptidová protilátka.
Na obr. 3 je SDS-PAGE (vyfarbenie CBB) týchto vzoriek:
1- LW-MM- markér s nízkou molekulovou hmotnosťou (BioRad)
2- manilláza
3- N-glykozidáza F (PNGáza F)
4- manilláza po spracovaní PNGázou F
5- manilláza po spracovaní O-glykozidázou
6- manilláza po spracovaní O-glykozidázou a neuraminidázou
7- O-glykozidáza a neuraminidáza
8- markér molekulovej hmotnosti (MWM prestained BioRad).
Na obr. 4 je chromatografia reverznej fázy
a) ribonukleázového štandardu
b) vzorky manillázy (špecifická aktivita 140 kU/mg)
Na osa x je vždy retenčný čas v minútach.
Na obr. 5 je vplyv heparínu na hyaluronidázovú aktivitu manillázy (čara s prázdnym kolieskom) a hyaluronidázy z býčích vajec (čara s plným kolieskom).
Na osa x je IU heparín, na osa y je % zvyšnej aktivity.
Na obr. 6 je meranie stability hyaluronidáz v tlmivom roztoku a v plazme:
a) manilláza (4’C) (čara s plným kolieskom v tlmivom roztoku, čara s plným trojuholníčkom v plazme)
b) manilláza (-20’C) (čara s plným kolieskom v tlmivom roztoku, čara s plným trojuholníčkom v plazme)
c) manilláza (37’C) (čara s plným kolieskom v tlmivom roztoku, čara s plným trojuholníčkom v plazme)
d) hyaluronidáza z býčích vajec (Y) a hyaluronidáza Hirudo medicinalis (A) (čara pre A s plným kolieskom v tlmivom roztoku, čara pre A s plným trojuholníčkom v plazme, čara pre Y s plným štvorčekom v tlmivom roztoku, čara pre Y s plným kosoštvorčekom v plazme,
Na ose x sú vždy dni inkubácie, na osa y jednotky WHO (IU).
Na obr. 7 je sekvencia aminokyselín natívnej manillázy získaná sekvenovaním izolovaného a vyčisteného proteínu z Hirudinaria manillensis podľa vynálezu (zodpovedá SEQ ID No. 1).
Na obr. 8 sú sekvencie nukleotidu (horné čary) a aminokyselín rekombinantného klonu manillázy (kloň 21); (zodpovedá SEQ ID No. 2, 3).
Na obr. 9 sú sekvencie nukleotidu (horné čary) a aminokyselín rekombinantného klonu manillázy (kloň 31); (zodpovedá SEQ ID No. 4, 5).
Na obr. 10 sú sekvencie nukleotidu (horné čary) a aminokyselín rekombinantného klonu manillázy (kloň 31); (zodpovedá SEQ ID No. 6, 7).
Na obr. 11 je expresný vektor E. coli pre manillázu.
Na obr. 12 je plazmid baculo donor pre manillázu.
Na obr. 13 je kvasinkový expresný vektor pre manillázu.
Vynález objasňujú, žiadnym spôsobom však neobmedzujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia. Kecľ to nie je uvedené inak, používajú sa štandardné spôsoby známe zo stavu techniky a všeobecne dostupný materiál.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1 (Všeobecné poznámky)
Početné predbežné pokusy sa uskutočnili pri pomoci surových extraktov Hirudinaria manillensis na zavedenie spôsobu čistenia. Boli zvolené a overené nasledujúce spôsoby: spôsob vyzrážania síranom amónnym, katexová a anexová chromatografia, afinitná chromatografia pomocou látok Heparin-Fractogel, Con-A sefaróza, hydrofóbna interakčná chromatografia (HIC) na oktylsefaróze, propylfraktogéli, fenylfraktogéli, butylfraktogéli, preparatívne izoelektrické zameranie a preparatívna elektroforéza. Výsledky potvrdzujú, že kyselinové a amóniové vyzrážanie, katex, Con-A sefaróza, propylfrakrogél (HIC), Diol-LiChrospher a chromatografia fragmentmi kyseliny hyaluróvej-Sefarózy (HA-Sepharosa) sú vhodné na čistenie manillázy. Matrica HA-sefarózy, pripravená v autorovom laboratóriu, bola s úspechom použitá na čistenie tejto glykozidázy. Všetky prípravy sa vykonávajú za studená, pokial to nie je uvedené inak. Čistenie sa vykonáva podlá schémy uvedenej hore (Tabulka I).
Príklad 2
Extrakcia manillázy z hláv pijavíc
Príprava východiskového materiálu na čistenie; príprava hláv pijavíc
Z Bangladéše privezené pijavice Hirudinaria manillensis sa okamžite zmrazia a uložia pri teplotách -40 až -80°C. V zmrazenom stave sa zbavia hláv, pričom hmotnosť hlavy je približne 5 % hmotnosti tela.
Príklad 3
Pri reprezentatívnom čistení sa 1 kg mrazených hláv pijavíc homogenizuje v miešači Waring Blender s 2500 ml studenej O,1M kyseliny octovej ako tlmivého roztoku s hodnotou pH 4,0, obsahujúcej
0,025 % timerosalu a 16 mg/ml trehalózy (Merck KGaA, Art.No. 1.08216). Homogénna zmes sa mierne mieša a bezprostredne sa pridajú nasledujúce inhibítory proteázy:
1. PMSF 1,7 mg/ml 10,0 mM
2. Leupeptín 10,0 μg/ml 20,0 μΜ
3. Pepstatín A 0,7 μg/ml 1 μΜ
4. EGTA 380,35 μg/ml 1,0 mM
5. p-APMSF 40,00 μg/ml 20,0 μΜ
V miešaní sa pokračuje 4 hodiny za studená a odstredenie pri 4900 otáčkach za minútu trvá 20 minút. Supernatantný roztok (supernatant I) sa zhromaždí a zmieša so supernatantom II, následne získaným extrakciou tkanivových peliet. Spojené supernatanty predstavujú materiál stupňa I.
Súhrnne proces znázorňuje nasledujúca schéma:
Východiskový materiál - hlavy yijavíc homogenizácia
I extrakcia I* vyzrážanie kyselinou odstredenie / \
I* peleta extrakcia II* vyzrážanie kyselinou i
odstredenie supernatant dialýza * (odsolenie) supernatant II* peleta (odložené) * Stanovenie aktivity a biochemická charakterizácia vzoriek sa vykonajú pomocou testu zníženia zákalu a stanovenia obsahu proteínu (E28q met°dou Pierce BCA, SDS-PAGE). V homogenizáte pijavíc nie je možné zraeriť aktivitu enzýmu vzhíadom na veími vysoký obsahu hemoglobínu (merané súpravou Merck KGaA 13851 na stanovenie hemoglobínu) a iných proteínov. Okrem toho nie je možné merať aktivitu hyaluronidázy v stave pred vyzrážaním kyselinou. Konečné špecifické aktivity (aktivita na gram proteínu) týchto extraktov je približne 10 až 30 jednotiek WHO. Podía SDS-PAGE obsahujú surové extrakty veíké množstvá rôznych proteínov, z ktorých hlavné majú molekulové hmotnosti približne 120, 55 až 60, 45, 31, 28, 22, 15 a 14 až 10.
Príklad 4
Spôsob vyzrážania materiálu stupňa I síranom amónnym
Skúma sa spôsob vyzrážania síranom amónnym ako prvý krok čistenia manillázy, pri ktorom dochádza k približne 5-násobnému obohateniu tohto enzýmu.
Enzymaticky inertný materiál sa vyzráža zo surových extraktov stupňa I pomalým pridávaním síranu amónneho (Merck kGaA) do 36% hmotnosť/objem pri teplote + 4’C. Táto zmes sa mieša jednu hodinu a odstriedi sa. Zrazenina sa odloží. Supernatant sa dialýzuje oproti tekúcej vode cez noc a 24 hodín proti 20 mM fosfátovému tlmivému roztoku s hodnotou pH 6,0. Konečné špecifické aktivity týchto extraktov sú približne 40 až 150 jednotiek WHO. Podía SDS-PAGE obsahujú extrakty stupňa II veíké množstvá rôznych proteínov.
Príklad 5
Katexová chromatografia
Katex sa použije spôsobom absorpcie po dávkach. Cez noc sa inkubuje enzýmom bohatá dialyzovaná vzorka (stupeň II) spolu s 1 litrom katexu EMD S03” 650 (S), Merck KGaA, druh č. 16882. Po ukončení inkubácie odstredením sa katex premyje tlmivým roztokom, odstredí sa opát a stĺpec vysoko výkonnej HPLC sa naplní gélom. Po premytí stĺpca použitím 20 mM fosfátového tlmivého roztoku pH 4,9 sa viazané proteíny zo stĺpca eluujú rovnakým tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pH 6,0, obsahujúcim lineárny gradient 0 až IM chloridu sodného. Frakcie sa odoberajú každé 3 minúty (9 ml) a absorbancia sa sleduje pri 280 nm. Manilláza sa eluuje pri koncentráciách chloridu sodného 0,15 až 0,18 M. Meria sa aktivity a obsah proteínu všetkých frakcií a frakcie sa zhromaždia a dialýzujú sa cez noc proti 20 mM fosfátovému tlmivému roztoku pH 6,0 obsahujúcemu azid sodný a 17 mg/ml trehalózy.
Stanovia sa koncentrácie proteínov, špecifické aktivity zhromaždených frakcií a vykonajú sa analýzy SDS-PAGE. Cez veími dobré výťažky (aktivity) a vysokú špecifickú aktivitu (jednotky aktivity WHO na mg proteínu zodpovedajú IU) výsledky analýz SDS-PAGE vzoriek ukazujú stále zmes veía proteínov. Katexovou chromatografiou pri použití Fractogelu EMD S03“650 (S)R (Merck KGaA, Nemecko) sa dosahuje veími vysoký stupeň čistoty približne 10 až 50. Tento stupeň veími účinne znižuje hemoglobínové nečistoty. Okrem toho sa zistilo, že postup po dávkach je veími užitočným východiskovým krokom na zvládnutie veíkých množstiev supernatantu stupňa II (5 až 16).
Príklad 6
Afinitná chromatografia Concanavalin A-Sefarózy
Enzýmom bohaté zhromaždené frakcie po spracovaní katexom sa čfalej čistia afinitnou chromatografiou pri použití Con A lektínu. Obchodne dostupná Con-A-SefarózaR (Pharmacia Biotech, Art 17-0440-01) sa premyje octovým tlmivým roztokom 0,1 M + 0,5M NaCl pH 8,0, 0,lM kyseliny boritej + 0,1 % Tritonu xlOO pH 6,0 a nakoniec 0,1 M octovým tlmivým roztokom + 0,5M NaCl, pH 6,0. Vzorka sa dialyzuje cez noc proti 20 mM acetátového tlmivého roztoku + 0,5 mM NaCl + lmM CaCl2+ lmM MgCl2 pH 6,0 + 1 mM MnCl2 pri teplote miestnosti za nanesenia na stĺpec 1000 ml Con A a eluuje sa dve hodiny 510 ml 100 mM kyseliny octovej ako tlmivého roztoku + 0,5 M NaCl + l mM CaCl2 + lmM MgCl2, pH 6,0 + lmM MnCl2· Nasleduje desorpcia pri použití rovnakého tlmivého roztoku obsahujúceho 0,5 M metyl-a-D-manopyranozidu. Elúcia sa priebežne sleduje pri 280 nm. Zhromaždené 3 ml frakcie sa skúmajú z híadiska aktivity hialuronidázy. Aktívne frakcie sa zhromaždia a dialýzujú sa cez noc proti 20 mM fosfátovému tlmivému roztoku pH 6,0 obsahujúcemu azid sodný a 17 mg/ml trehalózy. Vykoná sa stanovenie koncentrácie proteínov, špecifických zhromaždených aktivít a analýza SDS-PAGE. Tento stupeň je veími účinný z híadiska odstránenia zvyškov hemoglobínu. Chromatografiou Con A sa dosiahne 4 až 10 čistiaceho faktoru. Tento faktor sa mení podía kvality východiskového materiálu.
Príklad 7
Propylfraktogél hydrofóbnej interakčnej chromatografie
Do hialuronidázou aktívnych zobraných Con A sa pridá síran amónny na konečnú koncentráciu 2M. Vzorky sa inkubujú jednu hodinu pri teplote miestnosti so 150 ml Propyl-Fractogelu EMD Propyl 650 (S)R, Merck KgaA, Nemecko, druhové číslo 1.10085, vyváženým 0,lM fosfátovým tlmivým roztokom pH 7,0, obsahujúcim
2M síranu amónneho. Po ukončenej inkubácii sa gél premyje dvakrát rovnakým tlmivým roztokom a pripraví sa stĺpec (2,6 x 60 cm) vysoko výkonnej HPLC. Viazané proteíny sa eluujú 0,1
M fosfátovým tlmivým roztokom, pH 7,0. Každé 3 minúty sa odoberajú 6ml frakcie, priamo sa dialyzujú proti deionizovanej vode (2 až 3 hodiny) a potom proti 20mM fosfátovému tlmivému roztoku, pH 6,0. Frakcia sa skúmajú z híadiska aktivity hialuronidázy. Aktívne frakcie sa zhromaždia a dialyzujú sa cez noc proti 20mM fosfátovému tlmivému roztoku, pH 6,0, obsahujúcemu azid sodný a 17 mg/ml trehalózy. Stanoví sa proteín a aktivita zhromaždených frakcií.
Čistiaci faktor tohto chromatografického stupňa je približne 3 až 5. Malé množstvo Con A, uvoínené z nosičového gélu v predchádzajúcom stupni, sa odstráni spolu s ostatnými proteínovými nečistotami.
Príklad 8
Príprava afinitného stĺpca oligosacharidu hialuronovej kyseliny
a) Hydrolýza hialuronanu (HA) hialuronidázou z býčích vajec
Rozpustí sa hialurónová kyselina, 7 gv 1,25 1 0,1 M tlmivého roztoku octanu sodného obsahujúceho 0,15 chloridu sodného a 0,5 mM EDTA, pH 5,2 miešaním cez noc pri teplote 4’C v prítomnosti toluénu. Nastaví sa hodnota pH roztoku obsahujúceho HA na 5,2 a po ohreve na teplotu 37’C sa pridá hialuronidáza z býčích vajec (Merck KGaA, 700 WHO jednotiek/mg). Na 7 g HA sa použije 210 mg enzýmu rozpusteného bezprostredne pred použitím v 50 ml uvedeného tlmivého roztoku. Hydrolýza sa nechá prebiehať 30 minút pri teplote 37’C za stáleho miešania a ukončí sa päťminútovým ohrevom na teplotu 100’C v kúpeli vriacej vody. Reakčná zmes sa vyčíri 30-minútovým odstredením pri 10 000 g, denaturovaný proteín obsahujúci zrazeninu sa odstráni a supernatant sa sfiltruje cez 0,2 μπι filter s predradeným filtrom zo sklenených vláken. Vyčírený roztok obsahujúci, HA oligosacharidy (HAOS), sa frakcionuje filtráciou cez tri ultrafiltračné membrány Diaflo (Amicon) s dalej uvedenými hodnotami rôznych molekulárnych rezov.
b) Frakcionácia HAOS ultrafiltráciou
Roztok obsahujúci HAOS z predchádzajúceho stupňa sa filtruje cez ultrafiltračnú membránu 30 YM Diaflo. Zvyšok na filtri sa zachová na ďalšie štúdie, zatial čo filtrát sa podrobí druhej ultrafiltrácii cez ultrafiltračnú membránu 10 YM Diaflo. Zvyšok na filtri sa opäť zachová na ďalšie štúdie, zatial čo roztok, prešlý membránou 10 YM, sa podrobí poslednej ultrafiltrácii cez ultrafiltračnú membránu 3 YM Diaflo. Potom sa zvyšok na filtri obsahujúci HAOS, približne 10 ml roztoku, použije na ďalšie čistenie. Táto frakcia: HAOS 3-10 sa dalej čistí a použije sa na kopuláciu na Sefarózu.
c) čistenie HAOS 3-10
HAOS 3-10 sa čistí (odsoluje) na stĺpci Biogel P2R. Tento stĺpec (4x100 cm) sa naplní médiom Biogel 2R 200-400 mesh (BioRad) a premyje sa 5 objemami stĺpca vodou (Milli Q, Millipore). Frakcia 3-10 HAOS, získaná v predchádzajúcom stupni (15 ml, 1,5 g oligosacharidov), sa nanesie na tento stĺpec. Stĺpec sa eluuje vodou, zhromaždí sa 15 ml frakcie a analyzujú sa na obsah oligosacharidov HA. Oligosacharidy obsahujúce frakcie, eluované pred soíami (soli sa zisťujú dusičnanom strieborným) sa spoja a opäť sa skoncentrujú na membráne 3 YM Diaflo.
d) Analýza HAOS 3-10
Na zistenie kopulačnej účinnosti Sefarózy sa premyje gél (rovnaké dávky) a suspenduje sa vo vode na prípravu 50% suspenzie. Zo suspenzie sefarózového konjugátu HAOS 3-10 a zo Sefarózy použitej ako kontrola, sa trikrát odoberú 100 μΐ podiely a pridajú sa do 2,5 ml 2,2 N trifluóroctovej kyseliny (TFA, Merck KgaA) v teflónovej skúmavke so skrutkovým uzáverom. Na hydrolýzu sa zmes prepláchne argónom a inkubuje sa 16 hodín pri teplote 100’C. Na konci hydrolýzy sa vzorky vysušia v prostredí dusíka, resuspendujú sa vo vode a použijú sa na stanovenie glukózamidu a urónovej kyseliny. Na stanovenie rozsahu rozkladu urónovej kyseliny a glukózamínu pre každú hydrolýzu, sa zaradia kontrolné vzorky obsahujúce známe množstvá UA a GlcNAc a inkubujú sa za rovnakých podmienok.
Za hore opísaných podmienok sa kopuluje 5, 8, 9, 11 a 15 mg HAOS 3-10 na 1 ml vysušenom sefarózovom géli v dvoch nezávislých testoch. Tieto výsledky sú založené na UA a glukózamínových testoch.
e) Použité testy
Obsah urónovej kyseliny v analyzovaných vzorkách sa stanoví spôsobom známym z literatúry (Bitter T. a Muir H.M., Anál. Biochem. 4, str. 330 až 334, 1962). Množstvo hexózamínu sa zisťuje spôsobom, ktorý opísali Rondle C.J.M. a Morgan W. T.J. (Biochem. J. 61, str. 586 až 593, 1955).
Príklad 9
Chromatografia sefarózových fragmentov hialurónovej kyseliny (HA-Sefarózová chromatograf ia)
Pripravia sa chromatografické matrice obsahujúce 8 až 10 mg/ml. Vzorka, obsahujúca enzým, sa dialyzuje proti 20 mM octovému tlmivému roztoku + 0,15 M NaCl, pH 4,0 a nanesie sa na stĺpec 25 ml HA-Sefarózy. Po premytí rovnakým tlmivým roztokom sa eluuje 20 mM octovým tlmivým roztokom s 0,15 až IM gradientom NaCl. Na stanovenie aktivity hialuronidázy sa testujú lml frakcie, zhromaždia sa, dialyzujú sa cez noc proti 20mM fosfátovému tlmivému roztoku, pH 6,0, obsahujúcemu azid sodný a 17 mg/ml trehalózy. Stanoví sa proteín a aktivita zobraných frakcií. Čistiaci faktor chromatografického stupňa je približne 3.
Príklad 10
Diol-LiChrosferová chromatograf ia
Na Diol-LiChrosferový stĺpec sa nanesie 20 ml aktívnej vzorky dialyzovanej proti Milli-Q-H20. Stĺpec sa potom vyváži 15 ml Milli-Q-H2O a premýva sa 5 minút 2 ml vody. Vykoná sa 15-minútová elúcia aktívnej vzorky 20 mM acetátovým tlmivým roztokom pH 5,9 (gradient 0 až 5 mM NaCl) a 35 minút gradientom 20 mM až 100 mM kyseliny octovej ako tlmivého roztoku, pH
5,5, obsahujúcej 5 mM NaCl. Frakcie sa skúmajú z hľadiska aktivity hialuronidázy. Aktívne frakcie sa spoja a dialyzujú sa cez noc proti 20 mM fosfátovému tlmivého roztoku, pH 6,0, obsahujúcemu azid sodný a 17 mg/ml ťrehalózy. Stanoví sa proteín a aktivita zobraných frakcií. Čistiaci faktor chromatograf ického stupňa je približne 3.
Príklad 11
Chromatografia RP18e
Tento čistiaci stupeň sa môže použiť iba ako posledný a zámerom je získať vzorku oprostenú od solí a iných proteínových nečistôt (napríklad inhibítorov peptidovej proteázy). Aktivita hialuronidázy je úplne stratená, pretože manilláza nie je odolná voči organickým rozpúšťadlám používaným v tomto stupni. Manillázová vzorka sa nenesie na stĺpec RP 18e. Zhromaždia sa frakcie 0,25 ml/min. Elúcia prebieha v prítomnosti 0,1% TFA a použije sa gradient vody až 99% acetonitril. Vzorka, vyčistená RP, sa môže použiť priamo na sekvenovanie aminokyselín, na meranie MALDI, na analýzy karbohydrátovej štruktúry a ako štandard na čistenie iných dávok manillázy.
Príklad 12
Stanovenie aktivity - test zníženia zákalu
Aktivita hialuronidázy sa stanoví meraním zníženia zákalu. Obchodne dostupné prípravky hyaluronanu (izolovaných z rôznych živočíšnych tkanív a tekutín, napríklad z ľudskej miechy, z kohútieho hrebienku) a hialuronidáz (endo-p-glukózaminidáz z býčích vajec, z diviačích vajec, z včelieho jedu; lyáz zo Streptomyces hialurolyticus) sa použijú na stanovenie vhodných podmienok na skúšku aktivity. V autorovom laboratóriu sa čiastočne vyčistila endo-p-glukuronidáza z Hirudo medicinallis.
Rezervný roztok hyaluronanu (koncentrácia 2 mg/ml) sa pripraví rozpustením HA v 0,3M fosfátovom tlmivom roztoku, pH 5,3. Roztok sa zriedi rovnakým tlmivým roztokom na koncentráciu 0,2 mg/ml tesne pred testom. Vzorky, obsahujúce enzým, sa zriedia na vhodné množstvo enzýmu (0,5 až 5 jednotiek WHO) 20mM fosfátovým tlmivým roztokom obsahujúcim 0,01 % hovädzieho albumínu a 77 mM chloridu sodného (enzým riediaci tlmivý roztok). Do 0,1 ml týchto vzoriek sa pridá roztok 0,1 ml hyaluronanu (0,2 mg/ml), zmieša sa a inkubuje 45 minút pri teplote 37’C. Test sa vykoná dvojmo. Reakcia sa ukončí zriedením 1,0 ml albumínového reakčného činidla (0,1 % albumínu rozpusteného v 80mM octovej kyseline/40mM tlmivom roztoku octanu sodného, pH 3,75). Po 10-minútovej inkubácii pri teplote miestnosti alebo 37’C sa odčíta optická hustota pri 600 nm a aktivita sa vyjadrí v jednotkách WHO(IU) porovnaním so štandardom (program SLT). Prípravok WHO z býčej vajcovej hialuronidázy (Humphrey J.H., Bull.-World Health Org. 16, str. 291 až 294, 1957) slúži ako štandard.
Príklad 13
Stanovenie proteínu
Obsah proteínu stĺpcových eluentov sa stanoví meraním ultrafialovej absorbancie roztokov pri 280 nm. Koncentrácia proteínov spojených frakcií sa stanoví Piercovou mikrometódou. Ako referenčný proteín sa použije roztok BSA.
Príklad 14
Elektroforéza SDS-PAGE
Elektroforéza sa uskutočňuje Laemmliho spôsobom (Náture 227, str. 680 až 685, 1970). Použijú sa nasledujúce gély: 4 až 20% gradient alebo alebo 12,5% separačné gély s 4% rezervným gélom. Vzorky sa podrobia elektroforéze v prítomnosti dodecylsulfátu sodného a β-sulfanyletanolu. Proteíny sa zviditeínia vyfarbením Comassiovou brilantnou modrosťou alebo vyfarbením striebrom (podía inštrukcií Pharmacia).
Príklad 15
Izoelektrické zaostrenie
Na sledovanie štúdií izoelektrického zaostrenia pri príprave manilláz sa volí protokol poskytnutý dodávateíom (Pharmacia). Po zaostrení sa gél fixuje a vyfarbí striebrom (podía protokolu Pharmacia).
Príklad 16
Príprava imunoglobínu z imunitného králičieho séra (anti-ConA, antihemoglobínové a antipeptidové králičie protilátky)
Opatria sa králičie séra pri použití nasledujúcich imunogénov: konkanavalín A lektín, zmes hemoglobínov a konjugátov peptid-KLH. Peptidová sekvencia je totožná s 14 aminokyselinovou N-koncovou časťou manillázy (KEIAVTIDDKNVIA).
Séra sa vyčistia na stĺpci Protein A Sefarózy (Pharmacia, 17-0780-01) podía štandardných inštrukcií Pharmacia. Čistota vzoriek lgG sa kontroluje pomocou testu SDSPAGE a ELISA.
Príklad 17
Test Western-Immunoblot
Vhodné podiely vzoriek a vopred ofarbený markér proteínu so známou molekulovou hmotnosťou sa podrobí SDS-PAGE, ako je hore uvedené. Použije sa markér molekulovej hmotnosti vopred ofarbený BioRad. Proteín sa premiestni elektroforeticky z polyakrylamidových gélov (0,8 mA/cm2) na imobilné polyvinyldifluoridové membrány (PVDF) v prítomnosti transferového tlmivého roztoku pre 100 minút. Membrána PVDF sa inkubuje blokovacím roztokom (PBS pH 7,5 + 2 % odtučneného mlieka) jednu hodinu pri teplote miestnosti. Membrána sa inkubuje dve hodiny pri teplote miestnosti s protilátkou, príslušne zriedenou blokovácím roztokom. Membrána sa premyje TBS + 0,05% Tween 20, pH 7,5 a inkubuje sa dve hodiny pri teplote miestnosti (druhá protilátka) s kozím protikráličím alkalínfosfátovým konjugátom, BioRad. Membrána sa premyje dvakrát TBS + Tween 20 a inkubuje sa 10 minút s BCIP alkalickým roztokom fosfatázového substrátu. Reakcia sa ukončí prísadou ukončovacieho tlmivého roztoku.
Príklad 18
Sekvenovanie aminokyselín
Sekvencia N-koncových 33 zvyškov aminokyselín manillázy sa získa Edmanovým odbúraním. Po SDS-PAGE mániilázo-aktívnych vzoriek sa pruhy prevedú na PDVF membránu, vyfarbia sa Coomassiovou modrosťou, vyrežú a sekvenujú. Rovnaká aminosekvencia sa nájde pre vzorky získané pomocou RP stĺpcovej chromátograf ie.
Príklad 19
Závislosť enzýmovej aktivity od pH (Pre hialuronidázu izolovanú z Hirudinaria manillensis a z hláv pijavíc Hirudo medicinalis)
Vzorky hialuronidázy, použité v tomto pokuse, sa extrahujú jednak z Hirudinaria manillensis, jednak z hláv pijavíc Hirudo medicinalis a čiastočne sa vyčistia vyzrážaním síranom amónnym a katexovou chromatografiou. Každá vzorka, obsahujúca 500 WHO jednotiek/ml, sa inkubuje pri teplote 20eC,+4C a 37’C v rozmedzí hodnôt pH 2,6 až 9,0 (20 mM acetátového tlmivého roztoku pre pH 2,6 až 5, 20 mM fosfátového tlmivého roztoku pre pH 5 až 9). Aktivita enzýmu sa merí počas 1, 2 a 7 dní dlhej inkubačnej periódy. Ako pri kyselinových tak pri zásaditých krajných hodnotách pH sa pozoruje rovnaký rozsah aktivity pri obidvoch hialuronidázach. Avšak v priebehu dlhších inkubačných periód je manilláza stabilnejšia ako hialuronidáza Hirudo medicinalisz napríklad po 7 dňoch inkubácie pri pH 7,0 pri teplotách +4 ’C a 37‘C si manilláza zachovala 75 % a 60 % východiskovej aktivity. Hialuronidáza Hirudo medicinalis, inkubovaná za rovnakých podmienok, bola už neaktívna po 1 dni.
Príklad 20
Meranie stability hialuronidáz v prítomnosti psieho séra (pre hialuronidázu izolovanú z Hirudinaria manillensis a z hláv pijavíc Hirudo medicinalis)
Vzorky 5 kU/ml manillázy, Hirudo medicinalis a hialuronidázy z býčích vajec sa zriedi v citrátovanej psej alebo potka32 nej plazme na koncovú koncentráciu 250 U/ml. Potom sa tieto roztoky inkubujú pri teplotách -20C, + 4°C a + 37’C počas 0 až 7 dní. Do tohto pokusu sa zaradia kontrolné vzorky obsahujúce rovnaké hialuronidázy zriedené v tlmivom roztoku. Nakoniec sa zmerí aktivita hialuronidáz.
Príklad 21
Aktivity kontaminovaných enzýmov
V každom stupni čistenia pijavicovej hialuronidázy sa prostriedok kontroluje z hladiska iných enzýmov schopných odbúravať proteín pomocou univerzálneho proteínového substrátu (Boehringer Mannheim katalógové číslo 1080 733) podlá Twininga S. S. (Anál. Biochem. 143, str. 30 až 34 1984).
Príklad 22
Pôsobenie heparínu na aktivitu hialuronidázy
Rozštiepenie hyaluronanu hialuronidázou vedie k uvolneniu redukčných cukrov. Množstvo uvolnených cukrov sa merí kolorimetricky upravenou Parkovou metódou (Park J. & Johnson M. J., Biol. chem. 181, atr. 149, 1949). Na meranie vplyvu heparínu na aktivitu manillázy a hialuronidázy z býčích vajec sa vykonajú dve stanovenia aktivity; jedno v prítomnosti heparínu a druhé bez heparínu. Hialuronidázové vzorky, 25 μΐ (3,2 jednotiek WHO) sa inkubujú 30 minút pri teplote 37°C s 25 μΐ roztoku heparínu (Liquemin, Fa Hoffmann La Roche) obsahujúcim 0 až 24 jednotiek heparínu. Potom sa pridá 50 μΐ hyaluronanu (2,5 mg/ml) a v inkubácii sa pokračuje 30 minút pri teplote 37’C. Reakcia sa ukončí dvojminútovým ohrevom na teplotu 100°C Potom sa pridá 100 μΐ karbonát-kyanidového roztoku a 100 μΐ roztoku ferokyanidu draselného do inaktivovaného digestu. Vzorky sa zahrievajú 15 minút v kúpeli vriacej vody a potom sa ochladia v ladovom kúpeli. Potom sa do reakčných zmesí pridá 0,75 μΐ amóniumsulfátu železitého. Po 15-minútovej inkubácii pri teplote miestnosti sa vytvorené zafarbenie zmerí pri 690 nm spektrofotometrom Shimadzu. Do každej skúšky sa vloží vhodné nulové a neenzýmové kontroly, očakávané zníženie cukru (glukurónovej kyseliny alebo N-acetylglukózamínu, 1 až 15 μg) pre typ analyzovanej vzorky sa použije ako štandard.
Príklad 23
Deglykozylácia manillázy
Vzorky manillázy sa deglykozylujú pomocou enzýmu PNGáza F (BioLabs Art. č. 701 L) podlá dodávatelových inštrukcií. Deglykozylácia sa vykonáva za denaturačných a natívnych podmienok. O-Glykanázové, neuraminidázové a neuraminidázové + O-glykanázové spracovanie sa uskutoční podlá štandardných predpisov spoločnosti Boehringer Mannheim. Všetky vzorky sa charakterizujú SDS-PAGE a aktivitným determinačným testom.
Príklad 24
Konštrukcia expresného vektoru E. coli (obr. 11)
Na expresiu v E. coli sa použije modifikovaná verzia plazmidu pASK75, ktorý nesie tet promotérovú oblasť (Skera, Gene 151, str. 131 až 135, 1994). Modifikácia sa vykoná klono vaním nového spojovníka medzi miestami Xbal a Hind III. Nový spojovník obsahuje vodcovskú sekvenciu ompA, iné multiplitné klonovacie miesto a 6xHis-tag miesto strep-tagu.
Xbal
119 CTAGATAACS AGGGCMAAA ATGAAAAAGA CAGCTATC3C GATTGCAGTG GCACTGGCTG TATTGC TUAJb»IIII TACJ'I ITfCr GTCGATAQCG CTAACSľCAC CCTGACCGAC
I^MatLysLysT hrAlalIcAl allaAlaVal AlaĽeuAlaG Osí EooB! Sal Kpnl Sna BanHI
179 bi iTCSCTAC CGTAGC3CAG ffi AT CGA TGA ATT CGA GCT CGG TAC CCS 033 CAAAGCGATG GCATCGCGTC 03 TA GCT ACT TAA GCT CGA G3C ATG ΟΧ αχ laMyPheAlaTh rValAlaQn Al a xhoi sai m eomtiii
230 ATC CCT CGA GCT CGA CCT GCA GGC AGC GCTATGWGSATCQCATCACCATCACCA TAG GGA GCT CCA GCT OCA CGT CCG TC3 CGATACTCTCCTAGCCTAGTGCTAGrGCT
Hind III 1*ΆΙ aMelAr gGi ySer Hi sHllHi aHi í Hl
2B6 TCACTAATAGA
AGTGATTATCTTCG*
10*JHH......
Na konštrukciu expresného vektoru pre manillázu je nutné zaviesť reštrikčné miesta 5'Clal a 3'Eco471Il spôsobom PCR. Preto sa použijú dva prajmery 5' ATC GAT AAA GAG ATT GCC GTG AC a 3' GTT GTT TCC GAT GCT AAA GCG CT. Produkt PCR sa klonuje najskôr do vektorového systému PCR II (Invitrogen) a sekvenuje sa. V druhom stupni sa manillázový gén klonuje do modifikovaného vektoru pASK75 pri použití reštrikčných miest 5'Clal a 3' Eco47111. Po expresii a overení aktivity tejto rekombinovanej manillázy v druhej reakcii PCR sa His-tag odstráni a štartovací kodón manillázového génu sa priamo fúzuje do vodcovskej sekvencie omp A. Prajmery pre túto reakciu PCR sú:
5' ACC GTA GCG CAG GCC AAA GAG ATT GCC GTG a
3' CAC GGC AAT CTC TTT GGC CTG CGC TAC GGT.
Príklad 25
Konštrukcia Baculo donorového plazmidu (obr. 12)
Na expresiu manillázy v expresnom systéme Baculo vírusu sa použije expresný systém Bac-To-Bac™ Baculovirus Expression System (spoločnosti Gibco Life Technologies). Na získanie sekčného systému vodcovskej sekvencie melitínu z včelieho medu sa fúzuje na manillázový gén a na zavedenie reštrikčných miest 5'BamHI a 3' Kpnl sa uskutoční jediná reakcia pCR.
5' prajmer:
CGG ATC CAT GAA ATT CTT AGT CAA CGT TGC CCT TGT TTT TAT GGT CGT ATA CAT TTC TTA CAT CTA TGC GAA AGA GAT TGC CGT GAC 3'prajmer:
AAT GTT GAA GCA TAA GGT ACC
Produkt PCR sa klonuje do vektoru PCR II (Invitrogen) a sekvenuje sa. Potom sa mellitin-manillázová fúzia klonuje do vektoru pFastBac pomocou reštrikčných miest 5'BamHI a 3'Kpnl (obr. 12).
Príklad 26
Konštrukcia kvasinkového expresného vektoru (obr.13)
Na expresiu v kvasinkách sa použije expresný systém pichia multi copy (Invitrogen). Na konštrukciu expresného vektoru pre manillázu sa použije spôsob zosilnenia PCR manillázového génu tak, že kompatibilné reštrikčné konce (5'EcoRI, 3'Not I) sa generujú na väzbu do príslušného vektoru (pPIC9K).
Použijú sa nasledujúce prajmery:
5' GTA GAA TTC AAA GAG ATT GCC GTG ACA
3' GAT GCT AAT GTT GAA GCA TAA TGA GCG GCC GC
Pred transformáciou Pichia Speroplastov je potrebné expresný vektor linearizovat pomocou Sal I.
Príklad 26
Expresia E. coli
Na expresiu sa transformuje vektor pRG72, ktorý obsahuje štruktúrny gén Sarastatinu fúzovaného na vodcovskú sekvenciu ompA do príslušných buniek W3110. Bunky sa nechajú rásť v mid-log fáze a potom sa zavedie promotér pridaním 200 p.g TC/1. Po jednej hodine je možná zretelná detekcia rekombinantnej manillázy.
Príklad 27
Generácia rekombinantných baculovírusov a expresia manillázy expresným systémom Bac-To-Bac
Donorový plazmid pTD13 sa transformuje do príslušných buniek DHlOBac, ktoré obsahujú bacmid s cielovým miestom mini-attTn7 a pomocný plazmid. Mini-Tn7 element na donorovom plazmide sa transponuje do delového miesta mini-attTn7 na bacmide v prítomnosti transpozičných proteínov opatrených pomocným plaz midom. Kolónie, obsahujúce rekombinantné plazmidy, sa identifikujú pretrhnutím génu lacZ. Vysokomolekulárna mini-prep DNA pripravená zo selektovaných klonov E. coli obsahujúca rekombinanantný bacmid sa potom použije na transfekt hmyzích buniek.
Podrobný opis je v inštrukčnej príručke expresného kitu.
Príklad 28
Expresia v kvasinkách
Na uistenie existencie integrovaného manillázového génu je potrebné kolónie testovať na mutanty His* a Mut*.
Pri použití jednej kolóny sa naočkuje 100 ml média do banky s obsahom 1 liter. Rastové podmienky sú 28 až 30C, 250 otáčok za minútu, do OD 2-6. Na vyvolanie expresie sa kultúra napred odstredí, supernatant sa dekantuje a resuspenduje sa bunková peleta do nového média pri použití 1/5 objemu pôvodnej kultúry. Pridá sa 100% metanol do konečnej koncentrácie 0,5 % každých 24 hodín na udržanie indukcie. Po maximálne 6 dňoch sa supernatant analyzuje SDS-PAGE a skúškou aktivity.
Priemyselná vvužiteínosť
Rekombinantný spôsob produkcie manillázy, ktorý zahŕňa rozkrytie DNA a sekvencií aminokyselín rovnako ako vektorov a hostujúcich systémov. Manillázu je možné použiť na výrobu farmaceutických prostriedkov napríklad na liečenie chorôb myokardu, trombotických príhod a nádorov.
Zoznam sekvencií <iio> Merck Patent GmbH <120? Hyaluronidáza z Hirudinaria manillensis, jej izolácia, čistenie a rekombinantné spôsoby jej výroby <130? manilláza <140?
<141?
<160? 15 <170? Patentln Ver. 2.1 <210? 1 <211? 488 <212? PRT <213? pijavica <400? 1
Lys Glu 1 Zlé Ala Val Thr 5 íle Asp Asp Lys Asn Val Xle Ala Ser Val
10 15
Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro
20 25 30
Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp íle Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys
35 40 45
Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe
50 55 60
Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp
65 70 75 80
Tyr Trp Ala. Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr íle Thr Arg
85 90 95
Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gin Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Glu Asp
100 105 110
Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Het Arg Leu Leu Phe Asp
115 120 125
Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu íle Gly Lys Lys Met Thr
130 135 140
Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val
145 150 155 160
Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn íle Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro
165 170 175
Asp His Thr Ser Ala His Ásn Leu Thr Glu Lys Gin Val Gly Glu Asp
180 185 190
Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys
195 200 205
Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val
210 215 220
Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Leu Val Thr Ala Phe Thr Leu
225 230 235 240
His Gin. Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr Leu
245 250 255
Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gin Gin Leu Phe Asp Lys Val Lys
260 265 270
Asp Val Leu Lys Asn Ser Gin His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly
275 280 285
Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp Arg
290 295 300
Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala
305 310 315 320
Asn Asn Val Lys Val Val íle Arg Gin Thr íle Tyr Asn Gly Tyr Tyr
325 330 335
Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu
340 345 350
Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp
355 360 · 365
Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gin Cys Thr Lys
370 375 380
Thr Asn Ser Lys His Thr Gin Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr
385 390 395 400
íle Phe Ala Leu Asn Val l Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys íle Asp
405 410 415
Gin Tyr Gly Gly Lys Lys íle Tyr Ser Tyr íle Leu Thr Pro Glu Gly
420 425 430
Gly Gin Leu Thr Ser Gin Lys Val Leu Leu Asn.Gly Lys Glu Leu Lys
435 440 445
Leu Val Sér Asp Gin Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asn Glu Ser Lys Thr
450 455 4 60
Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp
465 470 475 480
Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys 485 <210> 2 <211> 1464 <212> DNA <213> pijavica <220>
<221> CDS <222> (1)..(1464) <220>
<22ΐ> variácia <222> (667)..(669) <223> Xaa = Tyr alebo Asn <400> 2
aaa gag att gcc gtg aca att gac gat aag aat gtg att gca tet gcc 48
Lys 1 Glu íle Ala Val 5 Thr íle Asp Asp Lys Asn Val íle Ala Ser Ala
10 15
agt ggg tet ttc ctt gga gtt gcc ttt gat gcg tet cta ttt tcg CCC 96
Ser Gly Ser Phe Leu Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro
20 25 30
aag ggt ctt tgg age ttt gtt gat att acc tet cca aaa ttg ttc aaa 144
Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp íle Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys
35 40 45
ttg ctg gaa gga ctt tet cct gga tac ttc agg gtt ggc gga acg ttt 192
Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe
50 55 60 1
gcc aat tgg ctg ttt ttc gac ttg gac gaa aat aat aag tgg aag gat 240
Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp
65 70 75 80
tat tgg get ttt aaa gac aaa acc CCC gaa act gcg aca ata aca agg 288
Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr íle Thr Arg
85 90 95
aga tgg ctg ttc aga aaa caa aat aat ctg aaa aag gag act ttt gac 336
Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gin Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp
100 105 110
aat t-a gtg aaa cta aca aag gga age aag atg aga ttg tta ttc gat 384
Asn Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp
115 120 125
ttg aat gcc gaa gtg agg act ggt tat gaa att gga aag aag atg aca 432
Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu íle Gly Lys Lys Met Thr
130 135 140
tcc act tgg gat tca tcg gag get gaa aag tta ttt aaa tat tgt gtg 480
Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val
145 150 155 160
tca aaa ggt tac gga gac aat atc gat tgg gaa ctt gga aat gaa ccg . 528
Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn íle Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro
165 17*0 175
gac cac acc tca get cac aat tta act gaa aag cag gtt gga gaa gat 576
Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gin Val Gly Glu Asp
180 185 190
/
ttt aaa gca ctg cat aaa gtt cta gag aaa tat cca act ctt aac aaq 624
Phe Lys Ala Leu His 195 Lys Val Leu 200 Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys 205
gga tcg ctc gtt ggt cca gat gta ggg tgg atg ggc gtc agt wac gtc 672
Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Xaa Val
210 215 220
aag gga ttg gca gac gag gcr ggt gac cat gta ack get ttt aca ctc 720
Lys Gly Leu Ala Asp Glu Xaa Gly Asp His Val Xaa Ala Phe Thr Leu
225 230 235 240
cac caa tat tat ttc gat gga aac acy tct gat gta tca ata tat ctt 768
His Gin Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Xaa Ser Asp Val Ser íle Tyr Leu
245 250 255
gat gcc aca tac ttt aag aag ctg caa caa cta ttt gat aaa gtg aaa 816
Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gin Gin Leu Phe Asp Lys Val Lys
260 265 270
gat gtt ttg aaa gat tct cca cat aaa gac gaa cca tta tgg ctt gga 864
Asp Val Leu Lys Asp Ser Pro His Lys Asp Glu Pro Leu Trp Leu Gly
275 280 285
gaa aca agt tct gga tac aac agc ggc aca gaa gat gta tcc gat ega 912
Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Glu Asp Val Ser Asp Arg
290 295 300
tat gtt tca gga ttt cta aca tta gac aag ttg ggt ctc agt gca gcc 960
Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala
305 310 315 320
aac aat gta aag gtt gtt ata aga cag aca ata tac aat gga tat tat 1008
Asn Asn Val Lys Val Val íle Arg Gin Thr íle Tyr Asn Gly Tyr Tyr
325 330 335
ggt ctc ctt gac aaa aac act tta gag ccg aat-ccg gat tac tgg tta 1056
Gly Leu Leu Asp Lys. Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu
. 340 345 350
atg cat gtt cat aat tct ttg gtc gga aat aca gtt ttt aaa gtt gac 1104
Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp
355 360 365
gtt agt gat cca act aat aaa gca aga gtt tac gcg caa tgt acc aaa 1152
Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gin Cys Thr Lys
370 375 380
aca aat agc aaa cat act caa agc aga tat tac aag ggc tct ttg aca 1200
Thr Asn Ser Lys His Thr Gin Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr
385 ’ 390 395 400
atc ttt gca ctt aat gtt gga gat gga gat gta acg tta aag atc ggt 1248
íle Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Gly Asp Val Thr Leu Lys íle Gly
405 410 415
caa tac agc ggt aaa aaa att tat tca tac att ctg aca cct gaa gga 1296
Gin Tyr Ser Gly Lys Lys íle Tyr Ser Tyr íle Leu Thr Pro Glu Gly
420 425 430
gga caa ctt aca tca cag aaa gtt ctc ttg aat gga aag gaa ttg aac 1344
Gly Gin Leu Thr Ser Gin Lys Val Leu Leu Asn Gly ’ Lys Glu Leu Asn
435 440 445
1392
tta gtg tct Ser gat Asp cag Gin tta Leu cca Pro 455 gaa cta aat Asn gca gat Ala Asp 4 60 gaa Glu tcc Ser aaa Lys aca Thr
Leu Val 450 Glu Leu
tct ttc acc tta tcc cca aag aca ttt ggt ttt ttt gtt gtt tcc gat
Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp
465 470 475 480
get aat gtt gaa gca tgy aar aar
Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys
485
1440 '1464 <210> 3 <211> 488 <212> PRT <213> pijavica <400> 3
Lys Glu Zle Ala Val Thr íle Asp Asp Lys Asn Val íle Ala Ser Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ser Phe Leu Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro
20 25 30
Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp íle Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys
35 40 45
Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe
50 55 60
Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp
65 70 75 80
Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr íle Thr Arg
85 90 95
Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gin Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe' Asp
100 105 110
Asn Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp
115 120 125
Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu íle Gly Lys Lys Met Thr
130 135 140
Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val
145 150 155 160
Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn íle Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro
165 170 175
Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gin Val Gly Glu Asp
180 185 190
Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys
195 200 205
Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Xaa Val
210 215 220
Lys Gly Leu Ala Asp Glu Xaa Gly Asp His Val Xaa Ala Phe Thr Leu
225 230 235 240
r: /
Γ'·'
His Gin Tyr Tyr Phe 245 Asp Gly Asn Xaa Ser Asp Val Ser íle Tyr Leu
250 255
Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gin Gin Leu Phe Asp Lys Val Lys
260 265 270
Asp Val Leu Lys Asp Ser Pro His Lys Asp Glu Pro Leu Trp Leu Gly
275 280 285
Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Glu. Asp Val Ser Asp Arg
290 295 300
Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala
305 310 315 320
Asn Asn Val Lys Val Val íle Arg Gin Thr íle Tyr Asn Gly Tyr Tyr
325 330 335
Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu
340 345 350
Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp
355 360 365 ***
Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gin Cys Thr Lys
370 375 380
Thr Asn Ser Lys His Thr Gin Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr
385 390 395 400
íle Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Gly Asp Val Thr Leu Lys íle Gly
405 410 415
Gin Tyr Ser Gly Lys Lys íle Tyr Ser Tyr íle Leu Thr Pro Glu Gly
420 425 430
Gly Gin Leu Thr Ser Gin Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Asn
435 440 445
Leu Val Ser Asp Gin Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys Thr
450 455 4 60
Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp
4 65 — 470 475 480
Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys
485 <210> 4 <211> 1464 <212> DNA <213> pijavica <220>
<221> CDS <222> (1)..(1464) <220>
<22l> variácia <222> (1348)..(1350) <223> Xaa Val alebo Met <400> 4
aaa gag att gcc gtg aca att gac gat aag aat gtg att gca tct gcc 48
Lys 1 Glu íle Ala Val 5 Thr íle Asp Asp Lys 10 Asn Val íle Ala Ser Ala 15
agt gag tct ttc cat gga gtt gcc ttt gat gcg tct cta ttt tcg ccc 96
Sex Glu Ser Phe 20 His Gly Val Ala Phe 25 Asp Ala Ser Leu Phe 30 Ser Pro
aag ggt ctt tgg age ttt gtt gat att acc tct cca aaa ttg ttc aaa 144
Lys Gly Leu 35 Trp Ser Phe Val Asp 40 íle Thr Seŕ Pro Lys 45 Leu Phe Lys
ttg ctg gaa gga ctt tct cct gga tac ttc agg gtt ggc gga acg ttt 192
Leu Leu SO Glu Gly Leu Ser Pro 55 Gly Tyr Phe Arg Val 60 Gly Gly Thr Phe
gčc aat cgg ctg ttt ttt gac ttg gac gaa aat aat aag tgg aar gat 240
Ala 65 Asn Arg Leu Phe Phe 70 Asp Leu Asp Glu Asn 75 Asn Lys Trp Lys Asp 80
tat tgg get ttt aaa gac aaa acc ccc gaa act gcg aca ata aca agg 288
Tyr Trp Ala Phe Lys 85 Asp Lys Thr Pro Glu 90 Thr Ala Thr íle Thr Arg 95
aga tgg ctg ttc aga aaa caa aat aat ctg aaa aag gag act ttt gac 336
Arg Trp Leu Phe 100 Arg Lys Gin Asn Asn 105 Leu Lys Lys Glu Thr 110 Phe Asp
aat tta gtg aaa cta aca aag gga age aag atg aga ttg tta ttc gat 384
Asn Leu Val 115 Lys Leu Thr Lys Gly 120 Ser Lys Met Arg Leu 125 Leu Phe Asp
ttg aat gcc gaa gtg agg act ggt tat gaa att gga aag aag atg aca 432
Leu Asn 130 Ala Glu Val Arg Thr 135 Gly Tyr Glu íle Gly 140 Lys Lys Met Thr
tcc act tgg gat tca tcg gag get gaa äag tta ttt aaa tat tgt gtg 480
Ser 145 Thr Trp Asp Ser Ser 150 Glu Ala Glu Lys Leu 155 Phe Lys Tyr Cys Val 160
tca aaa ggt tac gga gac aat atc gat tgg gaa ctt ggg aat gga ccg 528
Ser Lys Gly Tyr Gly Asp 165 Asn íle Asp Trp 170 Glu Leu Gly Asn Gly Pro 175
gac cac acc tca get cac aat tta act gaa aag cag gtt gga gaa gat 576
Asp His Thr Ser 180 Ala His Asn Leu Thr 185 Glu Lys Gin Val Gly 190 Glu Asp
ttt aaa gca ctg cat aaa gtt cta gag aaa tat cca act ctt aac aag 624
Phe Lys Ala 195 Leu His Lys Val Leu 200 Glu Lys Tyr Pro Thr 205 Leu Asn Lys
gga tcg ctc gtt ggt cca gat gta ggg tgg atg ggc gtc agt tac .gtc 672
Gly Ser 210 Leu Val Gly Pro Asp 215 Val Gly Trp Met Gly 220 Val Seŕ Tyr Val
aag gga ttg gca gac gag gca ggt gac cat gta act get ttt aca ctc- 720
Lys 225 Gly Leu Ala Asp Glu 230 Ala Gly Asp His Val 235 Thr Ala Phe Thr Leu 240
cac caa tat tat ttc gat gga aac acc
His Gin Tyr Tyr Phe 245 Asp Gly Asn Thr
gat gcc aca tac ttt aag aag ctg caa
Asp Ala Thr Tyr 260 Phe Lys Lys Leu Gin 265
gat gtt ttg aaa gat tct cca cat aaa
Asp Val Leu 275 Lys Asp Ser Pro His 280 Lys
gaa aca agt tct gga tac aac age ggc
Glu Thr 290 Ser Ser Gly Tyr Asn 295 Ser Gly
tat gtt tca gga ttt cta aca tta gac
Tyr 305 Val Ser Gly Phe Leu 310 Thr Leu Asp
aac aat gta aag gtt gtt ata aga cag
Asn Asn Val Lys Val 325 Val íle Arg Gin
ggt CCC ctt gac aaa aac act tta gag
Gly Pro Leu Asp 340 Lys Asn Thr Leu Glu 345
atg cat gtt cat aat tct ttg gtc gga
Met His Val 355 His Asn Ser Leu Val 360 Gly
gtt agt gat cca act aat aaa gca aga
Val Ser 370 Asp Pro Thr Asn Lys 375 Ala Arg
aca aat age aaa cat act caa age aga
Thr 385 Asn Ser Lys His Thr 390 Gin Ser Arg
atc ttt gca ctt aat gtt gga gat gaa
íle Phe Ala Leu Asn 405 Val Gly Asp Glu
caa tac age ggt aaa aaa att tat tca
Gin Tyr Ser Gly Lys 420 Lys Íle Tyr Ser 425
gga caa ctt aca tca cag aaa gtt ctc
Gly Gin Leu 435 Thr Ser Gin Lys Val 440 Leu
tta rtg tct gat cag tta cca caa cta
Leu Xaa 450 Ser Asp Gin Leu Pro 455 Gin Leu
tct ttc acc tta tcc cca aag aca ttt
Ser 465 Phe Thr Leu Ser Pro 470 Lys Thr Phe
get aat gtt gaa gca tgy aar aar
Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys
tct gat gta tca ata tat ctt 768
Ser 250 Asp Val Ser íle Tyr 255 Leu
caa cta ttt gat aaa gtg aaa 816
Gin Leu Phe Asp Lys 270 Val Lys
gac aaa cca tta tgg ctt gga 864
Asp Lys Pro Leu 285 Trp Leu Gly
aca gaa gat gta tcc gat ega 912
Thr Glu Asp 300 Val Ser Asp Arg
aag ttg ggt ctc agt gca gcc 960
Lys Leu 315 Gly Leu Ser Ala Ala 320
aca ata tac agt gga tat tat 1008
Thr 330 íle Tyr Ser. Gly Tyr 335 Tyr
cca aat ccg gat tac tgg tta 1056
Pro Asn Pro Asp Tyr 350 Trp Leu
aat aca gtt ttt aaa gtt gac 1104
Asn Thr Val Phe 365 Lys Val Asp
gtt tac gcg caa tgt acc aaa 1152
Val Tyr Ala 380 Gin Cys Thr Lys
tat tac aag ggc tct ttg aca 1200
Tyr Tyr 395 Lys Gly Ser Leu Thr 400
gat gta acg tta aag atc ggt 1248
Asp 410 Val Thr Leu Lys íle 415 Gly
tac att ctg aca cct gaa gga 1296
Tyr íle Leu Thr Pro 430 Glu Gly
ttg aat gga aag gaa ttg aac 1344
Leu Asn Gly Lys 445 Glu Leu Asn
aat gca gat gaa tcc aaa aca 1392
Asn Ala Asp 460 Glu Ser Lys Thr
ggt ttt ttt gtt gtt tcc gat 14 4 0
Gly Phe 475 Phe Val Val Ser Asp 480
1464 • 485
K
<210> 5 <211> 488 <212> PRT <213> pijavica
<400> 5
Lys Glu Zle Ala 1 Val Thr íle Asp Asp Lys Asn Val íle Ala Ser Ala 5 10 15
Ser Glu Ser Phe 20 His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro 25 30
Lys Gly Leu Trp 35 Ser Phe Val Asp íle Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys 40 45
Leu Leu Glu Gly 50 Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe 55 60
Ala Asn Arg Leu €5 Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp 70 75 80
Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr £ro Glu Thr Ala Thr íle Thr Arg 85 90 95
Arg Trp Leu Phe 100 Arg Lys Gin Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp 105 110
Asn Leu Val Lys 115 Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp 120 125
Leu Asn Ala Glu 130 Val Arg Thr Gly Tyr Glu íle Gly Lys Lys Met Thr 135 140
Ser Thr Trp Asp 145 Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val 150 155 160
Ser Lys Gly Tyr Gly Asd Asn íle Asp Trp Glu Leu Gly Asn Gly Pro .165 ‘ 170 175
Asd His Thr Ser 180 Ala Kis Asn Leu Thr Glu Lys Gin Val Gly Glu Aso 185 190
Phe Lys Ala Leu ' 195 His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys 200 205
Gly Ser Leu Val 210 Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val 215 220
Lys Gly Leu Ala 225 Asp Glu Ala Gly Asp His Val Thr Ala Phe Thr Leu 230 235 „ 240
His Gin Tyr Tyr Phe Aso Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser íle Tyr Leu 245 250 255
Asp Ala Thr Tyr 260 Phe Lys Lys Leu Gin Gin Leu Phe Asp Lys Val Lys 265 270
Asp Val Leu Lys 275 Asp Ser Pro His Lys- Asp Lys Pro Leu Trp' Leu Gly 280 285
Glu Thr Ser Ser 290 Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Glu Asp Val Ser Ásp Arg 295 300
Tyr Val 305 Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser 1 Ala Ala 320
310 315
Asn Asn Val Lys Val Val íle Arg Gin Thr íle Tyr Ser Gly Tyr Tyr
325 330 335
Gly Pro Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu
340 345 350
Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp
355 360 365
Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gin Cys Thr Lys
370 375 380
Thr Asn Ser Lys His Thr- Gin Ser Arg Ťyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr
385 390 395 400
íle Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys íle Gly
405 410 415
Gin Tyr Ser Gly Lys Lys íle Tyr Ser Tyr íle Leu Thr Pro Glu Gly
420 425 430
Gly Gin Leu Thr Ser Gin Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Asn
435 440 445
Leu Xaa Ser Asp Gin Leu Pro Gin Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys Thr
450 455 460
Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe.Gly Phe Phe Val Val Ser Asp
4 65 470 475 480
Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys
485 <210> 6 <211> 1464 <212> DNA <213> pijavica <220>
<221> CDS <222> (1)..(1464) <400> 6
aaa gag att gcc gtg Lys Glu íle Ala Val aca att gac gat aag aat gtg att gca tet gtc Lys Asn Val íle Ala Ser Val 43
Thr íle Asp Asp
1 5 10 15
agt gag tet ttc cat gga gtt gcc ttt gat gcg tet cta ttc tcg ccc 96
Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro
20 25 30
aag ggt cct tgg age ttt gtt aat att acc tet cca aaa ttg ttc aaa 144
Lys Gly Pro Trp Ser Phe Val Asn íle Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys •
35 - 40 45
ttg ctg gaa gga ctt tet cct gga tac ttc agg . gtt ggc gga acg ttt 192
Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe
50 55 60
gcc aat Ala Asn 65 tgg Trp ctg ttt ttt gac ttg gac gaa aat aat aag tgg aag gat 240
Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp 80
70 75
tat tgg get ttt aaa gac aaa acc CCC gaa act gcg aca ata aca agg 288
Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr íle Thr Arg
85 90 95
aga tgg ctg ttc aga aaa caa aat aat ctg aaa aag gag act ttt gac 336
Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gin Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp
100 105 110
gat tta gtg aaa cta aca aag gga age aag atg aga ttg tta ttc gat 384
Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp
115 120 125
ttg aat gcc gaa gtg agg act ggt tat gaa att gga aag aag acg aca 432
Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu íle Gly Lys Lys Thr Thr
130 135 140
tcc act tgg gat tca tcg gag get gaa aag tta ttt aaa tat tgt gtg 480
Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val
145 150 155 160
tca aaa ggt tac gga gac aat atc gat tgg gaa ctt gga aat gaa ccg 528
Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn íle Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro
165 170 175
gac cac acc tca get cac aat tta act gaa aag cag gtt gga gaa gat 576
Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gin Val Gly Glu Asp
180 185 190
ttc aaa gca ctg cat aaa gtt tta gag aaa tat cca act ctt aac aag 624
Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys
195 200 205
gga tcg CCC gtt ggt cca gat gta ggg tgg atg ggc gtc age tac gtc 672
Gly Ser Pro Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val
210 215 220
aag gga ttg gca gac ggg gca ggt gac ctt gta act get ttt aca cta 720
Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Leu Val Thr Ala Phe Thr Leu
225 230 235 240
cac caa tat tat ttc gat gga aac acc tet gat gta tca aca tat ctt 768
His Gin Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr Leu
245 250 255
gat gcc tca tac ttt aaa aag ctg caa cag ctg ttt gat aaa gtg aaa 816
Asp Ala Ser Tyr Phe Lys . Lys Leu Gin Gin Leu Phe Asp Lys Val Lys
260 265 270
gat gtt ttg aaa aat tet cca cat aaa gac aaa cca tta tgg ctt gga 864
Asp Val Leu Lys Asn Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly
275 280 285
gag aca agt tet gga tgc aac age ggc aca aaa gat gta tcc gat ega 912
Glu Thr Ser Ser Gly Cys Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp Arg
.290 295 300
tat gtt tca gga ttt cta aca tta gac aag ttg ggt ctc agt gca gcc 960
Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala
305 310 315 320
aac Asn aat gta aag gtt gtt ata aga cag aca ata tac aat gga tat tat 1008
Asn Val Lys Val Val íle 325 Arg Gin Thr 330 íle Tyr Asn Gly Tyr 335 Tyr
ggt ctc ctt gat aaa aac act tta gag cca aat cct gat tac tgg tta 1056
Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu
340 345 350
atg eat gtt cac aat tct ttg gtc gga aat aca gtt ttt aaa gtt gac 1104
Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp
355 360 365
gtt ggt gat cca act aat aaa acg aga gtc tat gca caa tgt acc aag 1152
Val Gly Asp Pro Thr Asn Lys Thr Arg Val Tyr Ala Gin Cys Thr Lys
370 375 380
aca aat age aaa cac act caa gg= aag tat tac aag ggc tct ttg aca 1200
Thr Asn Ser Lys His Thr Gin Gly Lys Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr
385 390 395 400
atc ttt gca ctt aat gtt gga gat gaa gaa gta acg tta aag atc gat 124 8
íle Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Glu Val Thr Leu Lys íle Asp
405 410 415
caa tac ggc ggt aaa aaa att tat tca tac att ctg aca cct gaa gga 1296
Gin Tyr Gly Gly Lys Lys íle Tyr Ser Tyr íle Leu Thr Pro Glu Gly
420 425 430
gga caa ctt aca tca cag aaa gtt ctc ttg aat gga aag gaa ttg aac 1344
Gly Gin Leu Thr Ser Gin Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Asn
435 440 445
tta gtg tct gat cag tta cca gaa cta aat gca gat gaa tcc aaa aca 1392
Leu Val Ser Asp Gin Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys Thr
450 455 460
tct ttc acc tta tcc cca aag aca ttt ggt ttt ttt gtt gtt tcc gat 1440
Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser ' Asp
465 470 475 480
get aat gtt gaa gca tgy aar aar 1464
Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys
-- 485 •
<210> 7 <211> 488 <212> PRT . <213> pijavica <400> 7
Lys 1 -Glu íle Ala Val 5 Thr íle Asp Asp Lys 10 Asn Val íle Ala Ser 15 Val
Ser Glu Ser Phe 20 His Gly Val Ala Phe 25 Asp Ala Ser Leu Phe 30 Ser Pro
Lys Gly Pro 35 Trp Ser Phe Val Asn 40 íle Thr Sér Pro Lys 45 Leu Phe Lys
Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe
55 60
Ala Asn 65 Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp
70 75 80
Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr íle Thr Arg
85 90 95
Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gin Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp
100 105 110
Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp
115 120 125
Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu íle Gly Lys Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val
145 150 155 160
Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn íle Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro
165 170 175
Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gin Val Gly Glu Asp
180 185 190
Phe· Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys
195 200 205
Gly Ser Pro Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val
210 215 220
Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Leu Val Thr Ala Phe Thr Leu
225 230 235 240
His Gin Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr Leu
245 250 255
Asp Ala Ser Tyr Phe Lys Lys Leu Gin Gin Leu Phe Asp Lys Val Lys
260 265 270
Asp Val Leu Lys Asn Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly
275 280 285
Glu Thr Ser Ser Gly Cys Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp Arg
290 295 300
Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala
305 310 315 320
Asn Asn Val Lys Val Val íle Arg Gin Thr íle Tyr Asn Gly Tyr Tyr
325 330 335
Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu
340 345 350
Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp
355 360 365
Val Gly Asp Pro Thr Asn Lys Thr Arg Val Tyr Ala Gin Cys Thr Lys
370 375 380
Thr Asn Ser Lys His Thr Gin Gly Lys Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr
385 390 395 400
SP
íle Phe Ala Leu Asn 405 Val Gly Asp Glu Glu 410 Val Thr Leu Lys íle 415 Asp
Gin Tyr Gly Gly 420 Lys Lys íle Tyr Ser 425 Tyr íle Leu Thr Pro 430 Glu Gly
Gly Gin Leu 435 Thr Ser Gin Lys Val 440 Leu Leu Asn Gly Lys 445 Glu Leu Asn
Leu Val 450 Ser Asp Gin Leu Pro 455 Glu Leu Asn Ala Asp 460 Glu Ser Lys Thr
Ser 465 Phe Thr Leu Ser Pro 470 Lys Thr Phe Gly Phe 475 Phe Val Val Ser Asp 480
Ala Asn Val Glu Ala 485 Cys Lys Lys
<210> 8 <2115· 23 <212> DNA' <2135 umelá sekvencia <2205· <223> Opis znelej sekvencie: 5'-prajmer I <4005 8 atcgataaag agattgccgt gac 23 <2105 9 <211> 23 <212> DNA <2135 umelá sekvencia <2205 <223> opis umelej sekvencie: 3'-prajmer <400> 9 gttgtttccg atgctaaagc get 23 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> umelá sekvencia <2205 · <223> opis umelej sekvencie: 5'-prajmer <4005 10 accgtagcgc aggccaaaga gattgccgtg <210> 11 <211> 30 <2125 DNA <2H> umelá sekvencia <2-20>
<223> opis umelej sekvencie: 3'-prajmer <400> 11 cacggcaatc tctttggcct gcgctacggt
J <210> 12 <211> 87 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> opis umelej sekvencie: 5'-prajmer <400> 12 cggatccatg aaattcttag tcaacgttgc ccttgttttt atggtcgtat acatttctta 60 catctatgcg aaagagattg ccgtgac 37 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> opis umelej sekvencie: 3'-prajmer <400> 13 aatgttgaag cataaggtac c 21 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223>opis umelej sekvencie: 5'-prajmer <400> 14 gtagaattca aagagattgc cgtgaca 27 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> opis umelej sekvencie: 3'-prajmer <400> 15 gatgctaatg ttgaagcata atgagcggcc gc

Claims (20)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Vyčistený proteín izolovaný z pijavíc druhu Hirudonaria manillensis majúci biologickú aktivitu hyaluronidázy, ktorá nie je ovplyvnená v svojom pôsobení heparínom a má molekulovú hmotnosť 53 až 60 v závislosti od glykozylácie.
  2. 2. Glykolyzovaný proteín podía nároku 1 majúci molekulovú hmotnosť 58 (±2).
  3. 3. Glykolyzovaný proteín podía nároku l majúci molekulovú hmotnosť 54 (±2).
  4. 4. Proteín podía nároku 1 až 3 majúci izoelektrický bod
    7,2 až 8,0.
  5. 5. Proteín podía nároku 1 až 4 majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 7 a SEQ ID No.l.
  6. 6. Proteín podía nároku 1 až 5 majúci špecifickú enzymatickú aktivitu väčšiu ako 100 kU/mg proteínu.
  7. 7. Spôsob izolovania a čistenia proteínu podía nároku 1 až 6,vyznačujúci sa tým, že sa skladá z nasledujúcich stupňov:
    (i) homogenizácia hláv pijavíc druhu Hirudinaria manillensis kyslým tlmivým roztokom a odstredenie, (ii) vyzrážanie supernatantu zo stupňa (i) síranom amónnym, (iii) katexová chromatografia, (iv) afinitná chromatografia konkanavalínu A, (v) hydrofóbna interakčná chromatografia, (vi) afinitná chromatografia matríc potiahnutých fragmentmi hialurónovej kyseliny, (vii) gélová permeačná chromatografia a prípadne (viii) enzymatická alebo chemická deglykozylácia vyčisteného proteínu.
    - Λ?
  8. 8. Proteín majúci biologickú aktivitu hialuronidázy, ktorá nie je ovplyvnená pôsobením heparínu s molekulovou hmotnosťou 53 až 60 v závislosti od glykozylácie, získatelný výrobnými stupňami podlá nároku 7.
  9. 9. Proteín podlá nároku 8 majúci špecifickú enzymatickú aktivitu väčšiu ako 10 kU/mg proteínu.
  10. 10. Sekvencia DNA kódujúca proteín podlá nároku 1 a 9.
  11. 11. Sekvencia DNA kódujúca proteín podlá nároku 8, zahŕňajúca všetky nukleotidové sekvencie vyznačené na obr. 8 (SEQ.ID No.2), obr. 9 (SEQ.ID No.4) a obr. 10 (SEQ.ID No.6).
  12. 12. Rekombinantný proteín s biologickou aktivitou hialuronidázy kódovanou ktoroukolvek sekvencií DNA podlá nároku 11
  13. 13. Rekombinantný proteín s biologickou aktivitou hialuronidázy a molekulovou hmotnosťou 55 až 59 závislou od glykozylácie, majúci ktorúkolvek sekvenciu aminokyselín vyznačenú na obr. 8, 9 a 10 (SEQ.ID No. 3, 5, 7) alebo sekvenciu, ktorá má najmenej 80% homológiu k uvedeným sekvenciám.
  14. 14. Expresný vektor majúci sekvenciu DNA podlá nároku 10 alebo 11.
  15. 15. Hostitelská bunka vhodná na expresiu proteínu podlá nároku 12 alebo 13, transformovaná vektorom podlá nároku 14.
  16. 16. Proteín podlá nároku 1 až 6, 8, 9, 12 a 13, ktorý je liečivom.
  17. 17. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje proteín podlá nároku 16 a farmaceutický vhodné riedidlo, nosič alebo excipient.
  18. 18. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje prídavné farmakologicky aktívnu látku.
  19. 19. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 18, vy z n a čujúci sa tým, že obsahuje ako prídavnú farmakologicky aktívnu látku heparin.
  20. 20. Použitie proteínu podlá nárokov 1 až 6, 8, 9, 12 a 13 na výrobu liečiv na liečenie myokardiáIných, kardiovaskulárnych a trombotických ochorení a nádorov.
SK1761-2001A 1999-06-12 2000-06-06 Hyaluronidáza z Hirudinaria manillensis, jej izolácia, čistenie a rekombinantné spôsoby jej výroby SK17612001A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99111468 1999-06-12
PCT/EP2000/005181 WO2000077221A1 (en) 1999-06-12 2000-06-06 Hyaluronidase from the hirudinaria manillensis, isolation, purification and recombinant method of production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK17612001A3 true SK17612001A3 (sk) 2002-04-04

Family

ID=8238352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1761-2001A SK17612001A3 (sk) 1999-06-12 2000-06-06 Hyaluronidáza z Hirudinaria manillensis, jej izolácia, čistenie a rekombinantné spôsoby jej výroby

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7049124B1 (sk)
EP (1) EP1185666B1 (sk)
JP (1) JP2003502045A (sk)
KR (1) KR20020011138A (sk)
CN (1) CN1355850A (sk)
AR (1) AR024335A1 (sk)
AT (1) ATE324452T1 (sk)
AU (1) AU6149300A (sk)
BR (1) BR0011500A (sk)
CA (1) CA2376467A1 (sk)
CZ (1) CZ20014383A3 (sk)
DE (1) DE60027562T2 (sk)
DK (1) DK1185666T3 (sk)
ES (1) ES2258976T3 (sk)
HK (1) HK1046297A1 (sk)
HU (1) HUP0201452A2 (sk)
MX (1) MXPA01012806A (sk)
NO (1) NO20016047L (sk)
PL (1) PL352060A1 (sk)
PT (1) PT1185666E (sk)
SK (1) SK17612001A3 (sk)
WO (1) WO2000077221A1 (sk)
ZA (1) ZA200200233B (sk)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060291A (zh) * 2012-12-28 2013-04-24 青岛九龙生物医药有限公司 一种玻璃酸酶的提取方法

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610292B2 (en) 1995-11-22 2003-08-26 Ista Pharmaceuticals, Inc. Use of hyaluronidase in the manufacture of an ophthalmic preparation for liquefying vitreous humor in the treatment of eye disorders
US5866120A (en) 1995-11-22 1999-02-02 Advanced Corneal Systems, Inc. Method for accelerating clearance of hemorrhagic blood from the vitreous humor with hyaluronidase
BR9908692A (pt) 1998-03-09 2001-12-04 Ista Pharmaceuticals Inc Uso de agentes de enrijecimento corneal emortocerotologia enzimática
CA2522544A1 (en) * 2003-04-15 2004-10-28 Ista Pharmaceuticals, Inc. Process for isolating and purifing ovine hyaluronidase
WO2004110479A1 (de) * 2003-05-27 2004-12-23 Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V. Hyaluronatlyase enthaltendes mittel zur behandlung des akuten myokardinfarktes bzw. symptomen darauf sowie zur behandlung von postinfarktioneller myokarditis und myokardischämie
WO2005030962A1 (en) * 2003-09-26 2005-04-07 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Synthetic heparanase molecules and uses thereof
US8288142B2 (en) * 2007-06-19 2012-10-16 Uvarkina Tamara P Hyaluronidase and method of use thereof
GB0717166D0 (en) * 2007-09-04 2007-10-17 Univ Brighton Method for stabilisation of purified P-Glycoprotein
EP3760715B1 (en) * 2008-03-06 2021-08-04 Halozyme, Inc. Large-scale production of soluble hyaluronidase
EP2177227B1 (en) * 2008-10-14 2013-03-20 Burgard, Gunter, Dr. med. Use of hyaluronidase for the prevention or treatment of arterial hypertension.
AU2012318303B2 (en) 2011-10-18 2015-09-03 Csl Behring Gmbh Combined use of a sulfated glycosaminoglycan and a hyaluronidase for improving the bioavailability of Factor VIII
EP2698636A1 (en) * 2012-08-13 2014-02-19 Fundació Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge Methods and reagents for prevention and/or treatment of transplant rejection
US8790711B2 (en) 2012-09-17 2014-07-29 Biopep Solutions, Inc. Treating diabetes with a whole, leech saliva extract
KR101454646B1 (ko) 2012-11-05 2014-10-27 (주)한국비엠아이 히알루로니다아제의 안정화 제제 및 이를 포함하는 액상제제
CN103695448B (zh) * 2013-07-29 2016-08-17 江南大学 一种透明质酸酶编码基因及其发酵生产和纯化方法
US9279111B2 (en) * 2013-07-29 2016-03-08 Jiangnan University Leech hyaluronidase and its application
CN104263666B (zh) * 2014-09-12 2017-07-14 江南大学 一种产小分子透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法
CN106148302A (zh) * 2016-07-08 2016-11-23 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种重组蛋白质的纯化方法
CN106520728B (zh) * 2016-11-08 2019-06-21 江南大学 一种提高水蛭透明质酸酶酶活的方法
CN109298113B (zh) * 2018-12-11 2021-06-18 华熙生物科技股份有限公司 一种测定包含有柠檬酸的溶液中的透明质酸含量的方法
JP2023522966A (ja) * 2020-04-20 2023-06-01 ファーマクト ホールディング アーゲー 修飾細菌性ヒアルロニダーゼポリペプチド、製造方法、医薬組成物およびそれらの使用
CN112915106A (zh) * 2021-02-05 2021-06-08 张虎山 一种肿瘤免疫微环境调控剂的制备及其应用
WO2023067008A1 (en) * 2021-10-19 2023-04-27 Pharmact Holding Ag A production of a purified modified bacterial hyaluronidase polypeptide, pharmaceutical compositions and their uses
CN116640745B (zh) * 2023-06-29 2023-12-08 江南大学 透明质酸酶突变体及其在水解硫酸软骨素中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8504025D0 (en) 1985-02-16 1985-03-20 Biopharm Ltd Hyaluronidase
DE4440892A1 (de) * 1994-11-17 1996-05-23 Gruenenthal Gmbh Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften
US5747027A (en) 1995-04-07 1998-05-05 The Regents Of The University Of California BH55 hyaluronidase

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060291A (zh) * 2012-12-28 2013-04-24 青岛九龙生物医药有限公司 一种玻璃酸酶的提取方法
CN103060291B (zh) * 2012-12-28 2014-10-08 青岛九龙生物医药有限公司 一种玻璃酸酶的提取方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20020011138A (ko) 2002-02-07
EP1185666A1 (en) 2002-03-13
ES2258976T3 (es) 2006-09-16
JP2003502045A (ja) 2003-01-21
NO20016047D0 (no) 2001-12-11
DE60027562T2 (de) 2006-11-02
WO2000077221A1 (en) 2000-12-21
PL352060A1 (en) 2003-07-28
CZ20014383A3 (cs) 2002-03-13
NO20016047L (no) 2001-12-11
HUP0201452A2 (en) 2002-08-28
DE60027562D1 (de) 2006-06-01
CN1355850A (zh) 2002-06-26
BR0011500A (pt) 2002-03-12
ATE324452T1 (de) 2006-05-15
PT1185666E (pt) 2006-09-29
US7049124B1 (en) 2006-05-23
AR024335A1 (es) 2002-10-02
MXPA01012806A (es) 2002-09-02
DK1185666T3 (da) 2006-07-03
CA2376467A1 (en) 2000-12-21
AU6149300A (en) 2001-01-02
HK1046297A1 (zh) 2003-01-03
ZA200200233B (en) 2003-06-25
EP1185666B1 (en) 2006-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK17612001A3 (sk) Hyaluronidáza z Hirudinaria manillensis, jej izolácia, čistenie a rekombinantné spôsoby jej výroby
JP7204729B2 (ja) 新規なヒアルロン酸加水分解酵素変異体およびそれを含む薬学組成物
JP5856261B2 (ja) 可溶性ヒアルロニダーゼの大規模生産
JP4464395B2 (ja) 可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、その調製プロセス、使用およびそれを含む薬学的組成物
US5547931A (en) Methods of stimulatory thrombocytopoiesis using modified C-reactive protein
US10400229B2 (en) Bacterial hyaluronidase and process for its production
JP2022552756A (ja) 安定性が向上した新規ヒアルロン酸加水分解酵素変異体及びこれを含む薬剤学的組成物
CN104711243B (zh) 重组的弹性蛋白酶蛋白质及其制备方法和用途
RU2426745C2 (ru) Рекомбинантный химерный белок фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена и содержащая его фармацевтическая композиция
CA2188159A1 (en) Chondroitinases i and ii, methods of preparation, and use thereof
KR101067525B1 (ko) 헤파린 결합 단백질의 재조합 생산
WO2018175403A1 (en) Il-37 fusion protein and methods of making and using same
PT866130E (pt) Sialidase de células cho por tecnologia de adn recombinante
Wolff et al. Expression of C1 esterase inhibitor by the baculovirus expression vector system: preparation, purification, and characterization
JPH04503960A (ja) 高発現宿主細胞系からの生物活性血小板由来成長因子の産生
JP4155779B2 (ja) 糖鎖硫酸化剤
WO2023198171A1 (zh) 一种凝血因子x激活酶及其应用
WO2012136768A1 (en) Use of mutants of human hyaluronidase ph-20 with increased chondroitinase activity for axonal regrowth
RU2811464C2 (ru) Новые варианты гиалуронидазы с улучшенной стабильностью и содержащая их фармацевтическая композиция
CA2398539C (en) Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
US6743617B1 (en) Human lysozyme gene, its encoded polypeptide and the method for preparing them
US6461851B1 (en) High expression modules containing two or more tandem copies of a methioninase encoding sequence