DE60027562T2

DE60027562T2 - Hyaluronidase aus hirudinaria manillensis, isolierung, reinigung, und rekombinante herstellung

Info

Publication number: DE60027562T2
Application number: DE60027562T
Authority: DE
Inventors: Maria Kordowicz; Detlef Güssow; Uwe Hofmann; Tadeusz Pacuszka; Andrzej Gardas
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1999-06-12
Filing date: 2000-06-06
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2020-06-07
Also published as: EP1185666B1; HUP0201452A2; PL352060A1; EP1185666A1; CZ20014383A3; WO2000077221A1; MXPA01012806A; SK17612001A3; US7049124B1; DE60027562D1; ATE324452T1; NO20016047D0; ZA200200233B; NO20016047L; AR024335A1; CA2376467A1; DK1185666T3; AU6149300A; JP2003502045A; CN1355850A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolation, Reinigung und Charakterisierung einer neuen Hyaluronidase, die aus dem tropischen Egel Hirudinaria manillensis stammt. Daher wird das neue Enzym erfindungsgemäß als "Manillase" bezeichnet. Die Erfindung betrifft ferner das Rekombinationsverfahren zur Herstellung von Manillase, das die Offenbarung von DNA- und Aminosäuresequenzen sowie von Expressionsvektoren und Wirtssystemen beinhaltet. Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung von Manillase zu therapeutischen Zwecken, zum Beispiel zur Behandlung von myokardialen Erkrankungen, thrombotischen Ereignisse und Tumoren.
Hyaluronsäure oder Hyaluronan (HA) ist ein lineares, unverzweigtes, hochmolekulares (2–6 × 10⁶) Glykosaminoglykan, das aus einer wiederholten Disaccharidstruktur GlcNAc(β1-4)GlcUA besteht. Seine Carboxylgruppen sind bei dem vorherrschenden pH der extrazellulären Flüssigkeiten, ob normal oder pathologisch, vollständig ionisiert. HA gehört zusammen mit den Chondroitinsulfaten, Keratansulfaten und Heparinen zur Gruppe der Glykosaminoglykane (Jeanloz R. W., Arthr Rheum., 1960, 3, 233–237). Im Gegensatz zu anderen unmodifizierten Glykosaminoglykanen (GAG) weist es keine Sulfatsubstitution oder ein kovalent verknüpftes Peptid auf, und seine Kettenlänge und sein Molekulargewicht sind gewöhnlich sehr viel höher. HA ist in Bindegeweben ubiquitär verbreitet und wurde nach Einführung eines verbesserten Fixierungsverfahrens (Hellström S. et al., 1990, Histochem. J., 22, 677–682) und des spezifischen histochemischen Verfahren unter Verwendung hyaluronanbindender Peptide (HABP) praktisch in allen Teilen des Körpers gefunden. Es ist während der Entwicklung und Reifung auch in Geweben neuroektodermalen Ursprungs vorhanden.
Der Begriff Hyaluronidase betrifft allgemein und erfindungsgemäß ein Enzym, das ungeachtet seiner Aktivität gegenüber anderen Substraten auf Hyaluronsäure einwirkt.
Hyaluronidase wurde zuerst aus Mikroorganismen und später aus Säugerhoden isoliert, die inzwischen die Hauptquelle darstellen (Meyer K. in The Enzyme, 1971, 307).
Anhand ihres Reaktionsmechanismus unterteilt man Hyaluronidasen in drei Hauptgruppen.
In der ersten Gruppe sind mikrobielle Enzyme zusammengefasst, die auf ihre Substrate durch β-Elimination unter Bildung Δ-4,5-ungesättigter Disaccharide einwirken. Das Enzym muss daher als Hyaluronatlyasen, EC 4.2.99.1, bezeichnet werden.
Die zweite Gruppe, Hyaluronoglucosaminidase oder Hodentyp-Hyaluronidase (EC 3.2.1.35) wirkt als endo-N-Acetyl-β-D-Hexosaminidase und baut HA in kleinere Fragmente ab, in erster Linie Tetrasaccharide mit der Hexosamin-Einheit am freien reduzierenden Ende. Enzyme mit ähnlichen Eigenschaften wie die Hoden-Hyaluronidase wurden aus Kröten, Schlangengift, Bienengift, zahlreichen tierischen Geweben, humanem Serum und anderen Quellen isoliert. Es ist bekannt, dass Hyaluronidase aus Hoden auch eine Transglykosylase-Aktivität besitzt (Weissman B. et al., J. Biol. Chem., 1954, 208, 417–429). Die zu dieser Gruppe von Hyaluronidasen gehörenden Enzyme zeigen enzymatische Aktivität nicht nur gegenüber Hyaluronat, sondern auch gegenüber Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin und Dermatansulfat.
Die dritte Gruppe besteht aus Hyaluronoglucuronidase (EC 3.2.1.36), die als endo-β-Glucuronidase wirkt. Dieses Enzym wurde aus Hirudo medicinalis-Egeln isoliert (Yuki H. & Fishman W. H.; J. Biol. Chem. 1963, 238, 1877–79) und ist absolut spezifisch für HA. Chondroitinsulfat, Dermatan und Heparin sind keine Substrate für diese Hyaluronidase. Sie baut nur Hyaluronsäure in Tetrasaccharide mit der Glucuronsäure am freien reduzierenden Ende ab (Linker A. et al., J. Biol. Chem., 1960, 235, 924–27). Im Gegensatz zu endo-β-Glucosaminidasen aus Säugern hat Heparin keinen Einfluss auf die Aktivität dieser Egel-Hyaluronidase. Daher kann sie einem Patienten gemeinsam mit einem Heparin und dessen Derivaten, die ausgiebig als Antikoagulantien verwendet werden, verabreicht werden. Eine für Hyaluronsäure spezifische endo-beta-Glucuronidase (als "Orgelase" bezeichnet) aus Spezies (Poecilobdella granulosa) der Unterfamilie Hirudinariinae (einschließlich der Gattungen Hirudinaria, Illebdella, Poecilodbella, Sanguisoga) der Büffelegel wurde in EP 0193 330 offenbart, die ein Molekulargewicht von etwa 28,5 besitzt.
Hyaluronidasen besitzen viele praktische In-vivo- und In-vitro-Anwendungen. Die intravenöse Verabreichung von Hyaluronidase wurde zur Behandlung von Myokardinfarkt vorgeschlagen (Kloner R. A et al., Circulation, 1978, 58, 220–226; Wolf R. A. et al., Am. J. Cardiol., 1984, 53, 941–944; Taira A. et al., Angiology, 1990, 41, 1029–1036). Myokardinfarkt stellt eine übliche Form einer nicht-mechanischen Verletzung dar, nämlich schwerwiegende Zellschädigung und -tod, die in diesem Fall durch plötzliche Zellhypoxie hervorgerufen werden. Bei einem in Ratten induzierten experimentellen Myokardinfarkt (Waldenström A. et al., 1991, J. Clin. Invest., 88, 1622–1628) stieg der HA-Gehalt des verletzten Herzmuskels (Infarktbereich) innerhalb von 24 Std., erreichte nach 3 Tagen fast das Dreifache des Normalen und war von interstitiellen Ödemen begleitet. Der relative Wassergehalt der Infarktbereiche erhöhte sich ebenfalls zunehmend, erreichte einen Maximalwert am Tag 3 und war stark mit der HA-Akkumulation korreliert. Der gleiche Zusammenhang eines erhöhten HA-Gehalts mit Ödemen wurde bei experimenteller Herz- und Nierentransplantatabstoßung (Hällgren R. et al., J. Clin. Invest., 1990, 85, 668–673; Hällgren R. et al., J. Exp. Med., 1990, 171, 2063–2076), bei der Abstoßung menschlicher Nierentransplantate (Wells A. et al. Transplantation, 1990, 50, 240–243), Lungenerkrankungen (Bjermer A. et al., Brit. Med. J., 1987, 295, 801–806) und bei idiopathischer interstitieller Fibrose beobachtet (Bjermer A. et al., Thorax, 1989, 44, 126–131). Diese sämtlichen Studien liefern nicht nur einen Hinweis auf erhöhtes HA bei akuter Entzündung, sondern zeigen auch seinen Anteil an der lokalen Flüssigkeitszurückhaltung, die hauptsächlich für die Gewebeschwellung verantwortlich ist und sowohl die mechanischen als auch elektrophysiologischen Funktionen des Herzens beeinflusst.
Diese Ergebnisse können den Wirkmechanismus von Hyaluronidasen erklären, die in klinischen Versuchen eingesetzt wurden. Es wurde berichtet, dass eine Hyaluronidase-Behandlung die Zellschädigung während Myokardischämie bei Ratten, Hunden und Mensch beschränkte (Maclean D. et al. Science, 1976, 194, 199). Auf den Abbau von HA kann eine Verringerung der Gewebewasserakkumulation, eine Verringerung des Gewebedrucks und schließlich eine bessere Perfusion folgen.
Es wurde gezeigt, dass Hyaluronidasen sowie Hyaluronidase enthaltende Extrakte aus Egeln für andere therapeutische Zwecke eingesetzt werden können. So führte eine Hyase-Therapie, allein oder in Kombination mit Cyclosporin, zu einem verlängerten Transplantatüberleben (Johnsson C. et al. Transplant Inter. im Druck). Hyasen ("spreading factor") im weitesten Sinne werden zur Erhöhung der Permeabilität von Geweben zur Verstärkung der Diffusion anderer pharmakologischer Substanzen (z.B. in Kombination mit Zytostatika bei der Behandlung von Krebstumoren) verwendet. Ferner konnte gezeigt werden, dass Hyaluronidasen, die als Angiogeneseinhibitor wirken, für die Tumortherapie und als Hilfe zur lokalen Arzneimittelzuführung bei der Behandlung von Tumoren, zur Behandlung von Glaukom und anderen Augenleiden und als Adjunkt zu anderen Therapeutika, wie Lokalanästhetika und Antibiotika, geeignet sind. Ein allgemeiner Überblick über die therapeutische Verwendung und die Relevanz wird in dem Übersichtsartikel von Farr et al. (1997, Wiener Medizinische Wochenschrift, 15, S. 347) und der darin zitierten Literatur gegeben. Daher besteht ein Bedarf an einem Wirkstoff, wie Hyaluronidase. Die bekannten und verfügbaren Hyaluronidasen sind jedoch entweder nicht stabil (Hyaluronidase aus Hirudo medicinalis, Linker et al., 1960, J. Biol. Chem. 235, S. 924; Yuki und Fishman, 1963,1. Biol. Chem. 238, S. 1877) oder sie zeigen eine recht niedrige spezifische Aktivität ( EP 0193 330 , Budds et al., 1987, Comp. Biochem. Physiol., 87B, 3, S. 497). Außerdem ist keine der bekannten Hyaluronidasen in rekombinanter Form erhältlich, was eine wesentliche Voraussetzung für eine intensive kommerzielle Verwendung ist.
Diese Erfindung offenbart jetzt zum ersten Mal eine neue Hyaluronidase, die aus Hirudonaria manillensis isoliert und gereinigt wurde, sowie eine rekombinante Version dieses Enzyms, die durch biotechnologische Techniken gewonnen wurde.
Somit ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, ein aus der Egelspezies Hirudinaria manillensis isoliertes gereinigtes Protein mit der biologischen Aktivität einer Hyaluronidase bereitzustellen, das in seiner Aktivität nicht durch Heparin beeinflusst wird und dadurch gekennzeichnet ist. dass es je nach der Glykosylierung ein Molekulargewicht von 53–60 kD aufweist. Das neue Protein, das als "Manillase" bezeichnet wird, ist in seiner nativen Form glykosyliert und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 58 kD (±2 kD) und vier Glykoformen. Das unglykosylierte Protein, das durch enzymatische oder chemische Abspaltung der Zuckerreste gemäß Standardtechniken erhältlich ist, ist jedoch ebenfalls Aufgabe der Erfindung. Das erfindungsgemäße unglykosylierte Enzym hat ein Molekulargewicht von etwa 54 (±2), wie mittels SDS-PAGE gemessen wurde.
Ein direkter Vergleich zeigt, dass die in EP 0 193 330 offenbarte Hyaluronidase ("Orgelase") unter den gleichen Bedingungen ein Molekulargewicht von etwa 28 hat und eine Menge an Verunreinigungen, wie Hämoglobin, enthält.
Native erfindungsgemäße Manillase hat ein pH-Optimum von 6,0–7,0, einen isoelektrischen Punkt von 7,2–8,0 und die in 7 dargestellte Aminosäuresequenz.
Überraschenderweise hat die durch ein präparatives Reinigungsverfahren (siehe unten) erhalten Manillase eine extrem hohe spezifische Aktivität von 100–150, vorzugsweise 110–140 (WHO) kU/mg Protein, wohingegen die spezifische Aktivität von Orgelase nur etwa 1,2 kU/mg beträgt. Außerdem hat Orgelase ein niedrigeres pH-Optimum (5,2–6,0) verglichen mit Manillase. Manillase wird nicht wie Orgelase durch Heparin beeinflusst.
Ferner ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Isolation und Reinigung von Manillase bereitzustellen, das die Schritte enthält:

(i) Homogenisieren von Köpfen von Egeln der Spezies Hirudinaria manillensis mit einem Säurepuffer und Zentrifugation,
(ii) Ammoniumsulfat-Fällung des Überstands von Schritt (i),
(iii) Kationenaustauschchromatographie,
(iv) Concanavalin-A-Affinitätschromatographie,
(v) hydrophobe Wechselwirkungschromatographie,
(vi) Affinitätschromatographie an Matrices, die mit Hyaluronsäurefragmenten beschichtet sind,
(vii) Gelpermeationschromatographie und gegebenenfalls
(viii) enzymatische oder chemische Deglykosylierung des gereinigten Proteins.

Die vorstehend offenbarten Verfahrensschritte gewährleisten, dass das erfindungsgemäße Protein mit einer derartig hohen biologischen Enzymaktivität erhalten werden kann. Daher ist es eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Hyaluronidase bereitzustellen, das in seiner Aktivität nicht durch Heparin beeinflusst wird, je nach der Glykosylierung ein Molekulargewicht von 53–60 hat, durch die vorstehend und in den Patentansprüchen angegebenen Verfahrensschritte erhältlich ist und vorzugsweise eine spezifische Enzymaktivität von > 100 kU/mg Protein besitzt. Der Begriff "Unit" betrifft vorstehend und nachstehend "International Units" (IU).
Die Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Manillase, das entsprechende DNA-Moleküle, Vektoren und transformierte Wirtszellen beinhaltet. Daher ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, eine DNA-Sequenz bereitzustellen, die für ein Protein mit den Eigenschaften von nativer Manillase kodiert.
Es konnte gezeigt werden, dass mindestens drei weitere Klone mit leicht unterschiedlichen DNA-Sequenzen selektiert werden konnten, die für Proteine mit Manillase-(Hyaluronidase-)Eigenschaften und leicht unterschiedlichen Aminosäuresequenzen kodieren.
Die genannten Klone haben die in 8, 9 und 10 (obere Sequenz) dargestellten DNA-Sequenzen, die ebenfalls eine Aufgabe dieser Erfindung sind sowie Expressionsvektoren, die diese Sequenzen enthalten, und Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert sind.
Außerdem ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, ein rekombinantes Protein mit der biologischen Aktivität einer Hyaluronidase und einem Molekulargewicht von 55–59 kD je nach der Glykosylierung und mit einer der in 8, 9 und 10 (untere Sequenz) dargestellten Aminosäuresequenzen oder einer Sequenz, die eine Homologie zu diesen Sequenzen von mindestens 80% aufweist, bereitzustellen. Der Begriff "Manillase" enthält all diese Proteine mit den obengenannten Eigenschaften.
Das native sowie das/die rekombinante(n) Protein(e) kann/können als Medikament verwendet werden, das direkt oder innerhalb pharmazeutischer Zusammensetzungen auf Patienten angewendet werden kann. Somit ist ein weiterer Aspekt dieser Erfindung die Bereitstellung eines rekombinanten oder nativen Proteins, wie oben und unten definiert, das als Medikament anwendbar ist, und einer entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzung. die das Protein und ein pharmazeutisch unbedenkliches Verdünnungsmittel, einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Excipienten dafür enthält.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusätzlich eine breite Vielfalt an weiteren pharmazeutischen Wirkstoffen enthalten. Bevorzugte Mittel sind Antikoagulantien, die die biologische und pharmakologische Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins nicht hemmen oder beeinflussen. Solche Antikoagulantien können zum Beispiel Heparin, Hirudin oder Dicumarin, vorzugsweise Heparin, sein. Somit ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die zusätzlich einen pharmakologischen Wirkstoff, vorzugsweise Heparin, enthält.
In Zusammenhang mit der Verwendung in der Human- oder Veterinärtherapie wirkt das erfindungsgemäße Protein vorzugsweise als Dispersionsmittel ("spreading factor") oder unterstützt die Durchdringung von Gewebe und Haut. Somit kann Manillase als Adjunkt für andere Substanzen (wie ein Lokalanästhetikum) z.B. auf dem Gebiet der Chemotherapie von Tumoren, zur Behandlung von Störungen und Erkrankungen in Bezug auf akute Myokardischämie oder Infarkt, zur Behandlung von Glaukom und anderen Augenkrankheiten, z.B. zur Verbesserung der Zirkulation physiologischer Flüssigkeiten im Auge, zur Behandlung von Haut- und Gewebetransplantaten zur Entfernung von Verstopfung und zur Ver besserung des Kreislaufs, als Arzneimittelzuführungssystem durch die Haut, Membranen, andere Gewebe, als Mittel zum Entfernen der Hyaluronsäure-Kapsel, die bestimmte pathogene Mikroorganismen oder bestimmte Tumoren und kanzeröse Gewebe umgibt, und als Inhibitor der Angiogenese, der als antithrombotisches und Anti-Tumor-Mittel eingesetzt werden kann, verwendet werden.
Daher ist die Verwendung von Manillase, wie vorstehend und nachstehend definiert, zur Herstellung eines Medikaments insbesondere zur Behandlung von myokardialen, kardiovaskulären und thrombotischen Störungen und Tumoren eine Aufgabe dieser Erfindung.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "pharmazeutisch unbedenklicher Träger" ein(en) inerte(n/s), nichttoxische(n/s) feste(n/s) oder flüssige(n/s) Füllstoff, Verdünnungsmittel oder Einkapselungsmaterial, der/das nicht nachteilig mit dem Wirkstoff oder mit dem Patienten reagiert. Geeignete, vorzugsweise flüssige, Träger sind im Stand der Technik bekannt, wie steriles Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose, Zuckerlösungen, Ethanol, Glykole und Öle, einschließlich derjenigen mit Erdöl-, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, zum Beispiel Erdnussöl, Sojaöl und Mineralöl.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können als Enheitensdosen verabreicht werden, die herkömmliche nichttoxische pharmazeutisch unbedenkliche Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und Vehikel enthalten, die zur parenteralen Verabreichung üblich sind.
Der Begriff "parenteral" beinhaltet hier subkutane, intravenöse, intraartikuläre und intratracheale Injektions- und Infusionstechniken. Auch andere Verabreichungen, wie orale Verabreichung und topische Applizierung, sind geeignet. Parenterale Zusammensetzungen und Kombinationen werden am stärksten bevorzugt intravenös verabreicht, entweder in Bolusform oder als konstante Fusion gemäß bekannter Verfahren. Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung enthalten herkömmliche Excipienten, wie Bindemittel, Füllstoffe, Verdünnungsmittel, Tablettierhilfsmittel, Gleitmittel, Auflösemittel und Benetzungsmittel. Die Tabletten können gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren überzogen werden.
Orale flüssige Zubereitungen können die Form wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupe oder Elixiere haben oder können als trockenes Produkt zum Wiederauflösen mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor Gebrauch dargereicht werden. Solche flüssigen Zubereitungen können herkömmliche Additive enthalten, wie Suspendierungsmittel, Emulgatoren, nicht-wässrige Vehikel und Konservierungsstoffe. Topische Applikationen können in Form wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Gelees oder vorzugsweise Emulsionssalben erfolgen.
Erfindungsgemäße Einheitsdosen können täglich erforderliche Mengen des erfindungsgemäßen Proteins oder mehrfache Unterteilungen davon, die die gewünschte Dosis ausmachen, enthalten. Die optimale therapeutisch unbedenkliche Dosierung und Dosisrate für einen gegebenen Patienten (Säuger, einschließlich Menschen) hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, wie der Aktivität des spezifischen eingesetzten Wirkstoffs, dem Alter, Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht, der Ernährung, der Zeit und dem Weg der Verabreichung, der Clearance-Rate, der Enzymaktivität (Units/mg Protein), dem Gegenstand der Behandlung, d.h. Therapie oder Prophylaxe, und der Art der zu behandelnden Erkrankung.
Daher beträgt in Zusammensetzungen und Kombinationen, wie mit Antikoagulantien, wie Heparin, in einem behandelten Patienten (in vivo) eine pharmazeutisch wirksame tägliche Dosis des erfindungsgemäßen Proteins (Manillase) zwischen etwa 0,01 und 100 mg/kg Körpergewicht (bezogen auf eine spezifische Aktivität von 100 kU/mg), vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 mg/kg Körpergewicht. In Abhängigkeit von der Applikationsform kann eine Einzeldosis zwischen 0,5 und 10 mg Manillase enthalten.
Die Konzentration von z.B. Heparin, wenn es zusammen mit Manillase verabreicht wird, beträgt üblicherweise 500–4000 U (IU) über einen Tag, kann jedoch, wenn nötig, erhöht oder verringert werden.
Die Reinigung von erfindungsgemäßer Manillase wurde erzielt, wie in den Beispielen detailliert beschrieben. Tabelle 1 zeigt ein präparatives Reinigungsschema für Manillase. Tabelle 2 zeigt das Verfahren zur Anreicherung des erfindungsgemäßen Proteins, und Tabelle 3 zeigt den Vergleich von Manillase mit bekannten Egel-Hyaluronidasen.
Ein als Manillase bezeichnetes Enzym, das Hyaluronsäure spaltet, wurde aus den Köpfen von Hirudinaria-manillensis-Egeln isoliert und bis zur Homogenität ge reinigt. Diese Hyaluronidase wurde unter Verwendung von Säureextraktion, Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt von aufeinanderfolgender Chromatographie an Kationenaustauscher-, Concanavalin-A-Sepharose-, Propyl-Fractogel-, Hyaluronanfragmente-Sepharose- und Diol-LiChrospher-Säulen gereinigt. Die Hyaluronanfragmente wurden durch Spaltung des nativen Hyaluronans mithilfe von Hyaluronidase aus Rinderhoden hergestellt. Nach Reinigung und Charakterisierung der Fragmente wurden die Affinitätsmatrices hergestellt, wie nachstehend erläutert. Solche Affinitätsmatrices wurden zum ersten Mal zur Reinigung der Hyaluronidase eingesetzt. Diese Hochleistungschromatographie ist eine Technik zur schnellen und effizienten Reinigung von Hyaluronan-Bindungsproteinen. Die Rückgewinnung der Enzymaktivität nach jedem Reinigungsschritt war recht hoch. Die Ergebnisse der drei unabhängigen präparativen Reinigungen waren vergleichbar. Sie führten zu hochaktiven Proben, die je nach dem Grad der Reinigung zwischen 20 bis 160 kU/mg besaßen. In Vergleichsexperimenten wurden bekannte Hyaluronidasen isoliert, wie im Stand der Technik angegeben, und ihre Eigenschaften wurden mit dem erfindungsgemäßen Protein verglichen (Tab. 3).
Die gemäß dem Schema der Tab. 1 gereinigte Hyaluronidase unterscheidet sich von anderen Egel-Hyaluronidasen, die von anderen Autoren beschrieben wurden. Ein ähnliches Molekulargewicht wurden unter nicht-dissoziierenden Bedingungen (kein β-Mercaptoethanol) erhalten, was zeigt, dass Manillase ebenso wie ein breites Spektrum an Hyaluronidase-Zubereitungen aus Säugerquellen ein Ein-Untereinheiten-Enzym ist. Die endgültige Zubereitung ist ein Ein-Untereinheiten-Enzym (1) mit einem apparenten Molekulargewicht von 58 ± 2, wie mithilfe von MALDI bestimmt, und einem isoelektrischen Punkt von 7,2 to 8,0.
Tab. 1: Präparative Reinigung von Manillase
Tab. 2: Reinigung von Manillase (Anreicherung) aus 1 kg Egelköpfen
Tab. 3: Vergleich von Manillase mit bekannten Egel-Hyaluronidasen
Die Sternchen in den Tabellen bedeuten Information zur Aktivitätsbestimmung und biochemischen Charakterisierung (*–*****).
Die verwendeten Verfahren zur Aktivitätsbestimmung und biochemischen Charakterisierung hängen von der Konzentration an Manillase in den analysierten Proben ab. Daher wurden sie bei den aufeinanderfolgenden Schritten der Reinigung nach und nach durch die geeigneten Techniken ausgeweitet.

* – Aktivitätsbestimmung – Trübungsverringerungstest
** – Aktivitätsbestimmung – Trübungsverringerungstest – Proteingehaltsbestimmung (E₂₈₀, Pierce-BCA-Verfahren) – SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) – Hämoglobin-Bestimmung
*** – Aktivitätsbestimmung – Trübungsverringerungstest – Proteingehaltsbestimmung (E₂₈₀, Pierce-BCA-Verfahren) – SDS-PAGE – Westernblot (Anti-human-Hämoglobin-Antikörper)
**** – Aktivitätsbestimmung – Trübungsverringerungstest – Proteingehaltsbestimmung (E₂₈₀, Pierce-BCA-Verfahren) – SDS-PAGE – Westernblot Anti-human-Hämoglobin-Antikörper, – SDS-PAGE – Westernblot – Anti-Con-A-Antikörper – SDS-PAGE – Westernblot – Anti-Peptid-Antikörper
***** – MALDI – Proteingehaltsbestimmung (E₂₈₀, Pierce-BCA-Verfahren) – SDS-PAGE – Westernblot – Anti-Peptid-Antikörper

Die Bindung von Manillase an Concanavalin A zeigt, dass diese Hyaluronidase ein Glykoprotein ist, dessen Zuckerkomponenten mit α-D-Mannopyranosyl oder α-D-Glucopyranosyl und sterisch verwandten Resten enden. Manillase-aktive Proben zeigten zwei Banden mit fast identischen RF-Werten in der SDS-PAGE. Längere SDS-PAGE und unterschiedliche Laufbedingungen wurden zur besseren Auftrennung der Banden verwendet. Bei diesen Experimenten konnten zwei zusätzliche schwächere Banden nachgewiesen werden (2). Der N-terminale Abschnitt von allen (30 Aminosäuren) wurde einzeln sequenziert und zeigte wiederum keinen Unterschied im N-Terminus. Nach Deglykosylierung mit endo-F-Glykosidase (PNGase) wurde beobachtet, dass alle vier Banden zu einer einzigen Bande führten, wobei sich das MG um etwa 3 verringerte.
Daher ist es recht wahrscheinlich, dass die beobachteten Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit auf Unterschiede im Glykosylierungsmuster von Manillase-Molekülen zurückzuführen sind. Die Neuraminidase-, O-endo-Glykosidase- und Neuraminidase- plus O-Glykosidase-Behandlungen haben keinen Einfluss auf das Molekulargewicht des gereinigten Enzyms (3). Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass Manillase mindestens eine N-verknüpfte Oligosaccharidkette besitzt. Die O-verknüpften Kohlenhydratketten konnten mit dem verwendeten Verfahren nicht nachgewiesen werden.
Als abschließender Reinigungsschritt wurde die RP-Chromatographie durchgeführt. Obwohl die Enzymaktivität nicht mehr nachgewiesen werden konnte, konnten die Salze und Peptidprotease-Inhibitoren entfernt werden (4). Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden mithilfe von MALDI weiter charakterisiert. Das mithilfe von MALDI bestimmte Molekulargewicht von Manillase betrug 58,3.
Heparin hat keinen Einfluss auf die Aktivität dieser Hyaluronidase (5). Manillase ist vielfach stabiler als Hirudo-medicinalis-Hyaluronidase (6). Außerdem zeigten die Proben der teilweise gereinigten Manillase eine sehr hohe Stabilität im Hunde- und Rattenplasma im Bereich von –20 bis +37.
Die Herstellung von HA-Affinitätsmatrices ist in der Literatur beschrieben (Tengblad A., Biochim. Biophys. Acta, 1979, 578, 281–289). Diese HA-Matrix wurde zur Reinigung der Knorpel-Hyaluronat-Bindungsproteine oder des Proteoglykanprotein-Keratansulfat-Kerns (Christner J. E., Anal. Biochem., 1978, 90, 22–32) aus der gleichen Quelle verwendet. Das HA-Bindungsprotein (HABP), das mithilfe dieser Affinitätsmatrix gereinigt wurde, wurde bei histochemischen Studien in Bezug auf die Verbreitung der Hyaluronat-Rezeptoren (Green S. J. et al., J. Cell Science, 1988, 89, 145–156; Chan F. L. et al., J. Cell. Biol., 1997, 107, 289–301) oder von Hyaluronan (Waldenström A. et al., 1991, J. Clin. Invest., 88, 1622–1628; Waldenström A. et al., Eur. J. Clin. Invest., 1993, 23, 277–282) in den Geweben weiter verwendet.
Das in unserem Labor entwickelte Verfahren zur Präparation dieses Gels gestattet jedoch die Herstellung von Gelen mit einer exakt definierten Konzentration an HA-Fragmenten (1 bis 15 mg/ml). Dies gestattet wiederum die Verwendung solcher Gele nicht nur zur Reinigung von Hyaluronan-Bindungsproteinen, sondern auch zu ihrer Auftrennung, indem ihre unterschiedliche Affinität zu Hyaluronan genutzt wird. Diese selektive Auftrennung kann unter Verwendung von HA-Fragmenten unterschiedlicher Länge gesteuert werden. Diese Auftrennung gestattet es, viele Rezeptoren von biologischer Relevanz (z.B. in der Onkologie) besser zu charakterisieren.
Gemäß dem beschriebenen Verfahren erhaltene HA-Matrices können eingesetzt werden zur:

1) Reinigung bekannter HA-Bindungsproteine
2) Reinigung unbekannter HA-Bindungsproteine
3) Identifikation der neuen HA-Bindungsproteine
4) Reinigung von Hyaluronidasen

HA-Fragmente, die gemäß dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren erhalten werden, können unter Verwendung moderner Analyseverfahren (NMR, MALDI-MS) charakterisiert und zur Forschung nach Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt werden. Ferner können diese Fragmente bei der Forschung in Bezug auf Angiogenese- und Neuvaskularisationsvorgänge verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE – CBB-Färbung) von Proteinstandard, Manillase-Probe (nach Diol-LiChrospher-Chromatographie).

1 – Proteinstandard über breiten Bereich
2 – Manillase, 4 μg
3 – Orgelase, 6 μg
4 – Hämoglobin, 40 μg

2:

a) SDS-PAGE (CBB-Färbung) und
b) SDS-PAGE – Westernblot von vier Manillase-aktiven Proben (Spuren 3–6) nach HA-Affinitätschromatographie. Bei diesem Experiment wurde polyklonaler Kaninchen-P3-2A-Anti-Peptid-Antikörper verwendet.

3: SDS-PAGE (CBB) der folgenden Proben:

1 – LW-MM – niedermolekularer Marker (BioRad)
2 – Manillase
3 – N-Glykosidase F (PNGase F)
4 – Manillase nach Behandlung mit PNGase F
5 – Manillase nach Behandlung mit O-Glykosidase
6 – Manillase nach Behandlung mit O-Glykosidase und Neuraminidase
7 – O-Glykosidase und Neuraminidase
8 – Molekulargewichtsmarker (MWM – vorgefärbt, BioRad)

4: Umkehrphasenchromatographie von

a) Ribonuclease-Standard
b) Manillase-Probe (spezifische Aktivität 140 kU/mg)

5: Einfluss von Heparin auf die Hyaluronidase-Aktivität von Manillase (-O-) und Rinderhoden-Hyaluronidase(-
-) X-Achse: IU Heparin; Y-Achse: % verbliebene Aktivität
6: Stabilitätsmessung von Hyaluronidasen in Puffer und Plasma:

(a) Manillase (4°C),
(b) Manillase (–20°C)
(c) Manillase (37°C),
(d) Rinderhoden-Hyaluronidase (Y) und Hirudo medicinalis-Hyaluronidase (A) X-Achse: Tage Inkubation; Y-Achse: WHO (IU) Units

7: Aminosäuresequenz von nativer Manillase, die durch Sequenzieren des isolierten und gereinigten erfindungsgemäßen Proteins aus Hirudinaria manillensis (entsprechend SEQ ID Nr. 1) erhalten wurde.
8: Nukleotid-(obere Zeilen) und Aminosäuresequenz eines rekombinanten Manillase-Klons (entspricht SEQ ID. Nr. 2, 3);
9: Nukleotid-(obere Zeilen) und Aminosäuresequenz eines rekombinanten Manillase-Klons (entspricht SEQ ID. Nr. 4, 5);
10: Nukleotid-(obere Zeilen) und Aminosäuresequenz eines rekombinanten Manillase-Klons (entspricht SEQ ID. Nr. 6, 7);
11: E.-coli-Expressionsvektor für Manillase
12: Baculo-Donorplasmid für Manillase
13: Hefe-Expressionsvektor für Manillase
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele detailliert beschrieben. Diese Beispiele beschränken jedoch die Erfindung nicht auf die allgemeinen Materialien, Verfahren, physikalischen Parameter, Verbindungen, biologischen Materialien, Expressionsvektoren und Wirte usw., die in den Experimenten verwendet wurden und in dem Beispielen genannt sind. Wenn nicht anderweitig angegeben, wurden im Stand der Technik bekannte Standardtechniken und allgemein verfügbares Material verwendet.
Beispiel 1 (allgemeine Bemerkungen):
Eine Reihe vorläufiger Experimente wurde unter Verwendung von Rohextrakten von Hirudinaria manillensis durchgeführt, um das Reinigungsverfahren zu etab lieren. Die folgenden Verfahren wurden gewählt und bestätigt: Ammo-niumsulfat-Fällungsverfahren, Kationen- und Anionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie mithilfe von Heparin-Fractogel, Con-A-Sepharose, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) an Octyl-Sepharose, Propyl-Phenyl-, Butyl-Fractogel, präparative isoelektrische Fokussierung und präparative Elektrophorese. Die Ergebnisse zeigen, dass Ammonium-Fällung, Kationenaus-tausch-, Con-A-Sepharose-, Propyl-Fractogel-HIC- und Diol-LiChrospher- sowie Hyaluronsäurefragmente-Sepharose-(HA-Sepharose-)Chromatographie zur Reinigung von Manillase geeignet sind. Die in unserem Labor hergestellte HA-Sepharose-Matrix wurde zur Reinigung dieser Glykosidase erfolgreich eingesetzt. Alle Präparationen wurden im Kalten durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. Die Reinigung erfolgte nach dem vorstehend gezeigten Schema (Tab. 1).
Beispiel 2: – Herstellung des Ausgangsmaterials für die Reinigung; Präparation von Egelköpfen.
In Bangladesch gesammelte Hirudinaria-manillensis-Egel wurden sofort schockgefroren und dann bei –40° bis –80° aufbewahrt. Sie wurden im gefrorenen Zustand dekapitiert, wobei das Gewicht der Köpfe etwa 5% des Körpers ausmachte.
Beispiel 3: – Extraktionsverfahren für Manillase aus Egelköpfen
Bei einer beispielhaften Reinigung wurde 1 kg gefrorener Egelköpfe in einem Waring-Mischer mit 2500 ml kaltem 0,1 M Essigsäurepuffer pH 4,0, der 0,025% Thimerosal und 17 mg/ml Trehalose (Merck KGaA, Art.-Nr. 1.08216) enthielt, homogenisiert. Das Homogenisat wurde vorsichtig gerührt, und die folgenden Proteaseinhibitoren wurden sofort zugegeben:
Das Rühren wurde für 4 Stunden im Kalten fortgesetzt, und es wurde bei 4900 U/min für 20 Minuten zentrifugiert. Die Überstandslösung (Überstand 1) wurde gesammelt und mit Überstand II, der anschließend durch Extraktion des Gewebesediments erhalten wurde, vereinigt. Die vereinigten Überstände stellen Stufe-I-Material dar.
Das Verfahren ist im folgenden Schema zusammengefasst:

* Aktivitätsbestimmung und biochemische Charakterisierung der Proben erfolgte mithilfe des Aktivitätsbestimmungs-Trübungsverringerungstests und der Bestimmung des Proteingehalt (E₂₈₀, Pierce BCA-Verfahren, SDS-PAGE).

Aufgrund eines sehr hohen Gehalts an Hämoglobinen (mit dem Hämoglobinbestimmungskit, Merck KGaA, 13851, gemessen) und anderen Proteinen war es unmöglich, die Enzymaktivität in Egelhomogenat zu messen. Außerdem konnte die Hyaluronidase-Aktivität auf der Stufe vor der Säurefällung nicht gemessen werden. Die endgültigen spezifischen Aktivitäten (Aktivität pro mg Protein) dieser Extrakte betrugen etwa 10–30 WHO-Units. SDS-PAGE zufolge enthielten die Rohextrakte große Mengen verschiedener Proteine, von denen die hauptsächlichen ein Molekulargewicht von ~120, 55–60, 45, 31, 28, 22, 15 und 14–10 hatten.
Beispiel 4: – Ammoniumsulfat-Fällungsverfahren des Stufe-I-Materials
Als nächstes wurde ein Ammoniumsulfat-Fällungsverfahren als erster Schritt der Reinigung von Manillase gewählt und führte zu einer ~5-fachen Anreicherung dieses Enzyms.
Enzymatisch inertes Material wurde aus Stufe-I-Rohextrakt durch langsame Zugabe von festem Ammoniumsulfat (Merck KGaA) bis auf 36% (Gew./Vol.) bei +4°C gefällt. Dieses Gemisch wurde für 1 Stunde gerührt und zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen. Der Überstand wurde über Nacht gegen laufendes entmineralisiertes Wasser und 24 Stunden gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 6,0 dialysiert. Die endgültigen spezifischen Aktivitäten dieser Extrakte betrugen etwa 40–150 WHO-Units. SDS-PAGE zufolge enthalten die Stufe-II-Extrakte große Mengen verschiedener Proteine.
Beispiel 5: – Kationenaustauschchromatographie
Der Kationenaustauscher wurde im Chargenadsorptionsverfahren verwendet. Eine enzymreiche dialysierte Probe (Stufe II) wurde über Nacht mit 1 l Fractogel EMD SO₃ ^– 650 (S)-Kationenaustauscher, Merck KGaA, Art.-Nr. 16882, inkubiert. Nachdem die Inkubation durch Zentrifugation beendet worden war, wurde der Kationenaustauscher mit dem Puffer gewaschen, erneut zentrifugiert, und eine HPLC-Superformace-Säule wurde mit dem Gel gefüllt. Nach Waschen der Säule mit 20 mM Phosphatpuffer pH 4,9 wurden die gebundenen Proteine mit dem gleichen Natriumphosphatpuffer pH 6,0, der einen linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl enthielt, von der Säule eluiert. Fraktionen wurden alle 3 min gesammelt (9 ml), und die Absorption bei 280 nm wurde überwacht. Manillase wurde bei NaCl-Konzentrationen von 0,15 bis 0,18 M eluiert. Die Aktivitäten und Proteingehalte aller Fraktionen wurden gemessen, und die Fraktionen wurden vereinigt und über Nacht gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 6,0, der Natriumazid und 17 mg/ml Trehalose enthielt, dialysiert.
Es wurden eine Bestimmung der Konzentrationen von Proteinen, der spezifischen Aktivitäten der "Pools" und SDS-PAGE-Analyse durchgeführt. Trotz sehr guter Ausbeuten (Aktivität) und hoher spezifischer Aktivität (WHO-Aktivitätseinheiten pro mg Protein, entspricht IU) zeigten die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse der Proben immer noch ein Gemisch vieler Proteine. Die Kationenaustauschchromatographie mithilfe von Fractogel EMD SO₃ ^– 650 (S)^® (Merck KGaA, Deutschland) führte zu einem sehr hohen Reinigungsfaktor von 10 bis 50. Dieser Schritt ist sehr wirksam zur Verringerung von Hämoglobin-Verunreinigungen. Außerdem haben wir gefunden, dass das Chargenverfahren ein sehr nützlicher Anfangsschritt zur Handhabung großer Volumina von Stufe-II-Überstand (5–16 l) war.
Beispiel 6: – Concanavalin-A-Sepharose-Affinitätschromatographie
Die weitere Reinigung der enzmyreichen Pools nach dem Kationenaustauscher erfolgte mithilfe von Con-A-Lektin-Affinitätschromatographie. Kommerziell erhältliche Con-A-Sepharose" von Pharmacia Biotech, Art. 17-0440-01, wurde mit einem Essigsäurepuffer 0,1 M + 0,5 M NaCl pH 8,0; 0,1 M Borsäure + 0,1% Triton X 100 pH 6,0 und schließlich mit 0,1 M Essigsäurepuffer + 0,5 M NaCl pH 6,0 gewaschen. Die Probe wurde über Nacht gegen 20 mM Essigsäurepuffer + 0,5 mM NaCl + 1 mM CaCl₂ + 1 mM MgCl, pH 6,0 + 1 mM MnCl₂ dialysiert, bei Raumtemperatur auf eine 1000-ml-Con-A-Säule aufgebracht und 2 Std. mit 510 ml 100 mM Essigsäurepuffer + 0,5 M NaCl + 1 mM CaCl₂ + 1 mM MgCl₂ pH 6,0 + 1 mM MnCl₂ eluiert. Darauf folgte Desorption mithilfe des gleichen Puffers, der 0,5 M Methyl-α-D-mannopyranosid enthielt. Die Elution wurde stetig bei 280 nm überwacht. Die 3-ml-Fraktionen, die gesammelt wurden, wurden hinsichtlich Hyaluronidase-Aktivität getestet. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und über Nacht gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 6,0, der Natriumazid und 17 mg/ml Trehalose enthielt, dialysiert. Die Bestimmung der Konzentration von Proteinen, der spezifischen Aktivitäten der "Pools" und SDS-PAGE-Analyse wurden durchgeführt. Dieser Schritt war sehr wirksam zur Entfernung des restlichen Hämoglobins. Die Con-A-Chromatographie führte zu einem Reinigungsfaktor von 4–10. Dieser Faktor unterschied sich je nach der Qualität des Ausgangsmaterials.
Beispiel 7: – hydrophobe Wechselwirkungschromatographie an Propyl-Fractogel
Zu Hyaluronidase-aktiven Con-A-Pools wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 2 M hinzugefügt. Die Proben wurden für 1 Std. bei Raumtemperatur mit 150 ml Propyl-Fractogel EMD Propyl 650 (S)^®, Merck KgaA, Deutschland, Art.-Nr. 1.10085, das mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 äquilibriert worden war und 2 M Ammoniumsulfat enthielt, inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurde das Gel zweimal mit dem gleichen Puffer gewaschen, und die HPLC-Superformance-(2,6 cm × 60 cm)Säule wurde vorbereitet. Die gebundenen Proteine wurden mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 eluiert. Die 6-ml-Fraktionen wurden alle 3 min gesammelt, direkt gegen entmineralisiertes Wasser (2–3 Std.) und dann gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 6,0 dialysiert. Die Fraktionen wurden hinsichtlich Hyaluronidase-Aktivität getestet. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und über Nacht gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 6,0, der Natriumazid und 17 mg/ml Trehalose enthielt, dialysiert. Die Protein- und Aktivitätsbestimmung der Pools wurde durchgeführt.
Der Reinigungsfaktor bei diesem Chromatographieschritt betrug etwa 3 bis 5. Eine kleine Menge Con A, die im vorherigen Schritt vom Trägergel freigesetzt wurde, wurde zusammen mit anderen Proteinverunreinigungen entfernt.
Beispiel 8: – Herstellung einer Hyaluronsäure-Oligosaccharid-Affinitätssäule
(a) Hydrolyse von Hyaluronan (HA) mit Rinderhoden-Hyaluronidase
Hyaluronsäure, 7 g, wurde in 1,25 l 0,1 M Natriumacetatpuffer, der 0,15 NaCl und 0,5 mM EDTA enthielt, pH 5,2 gelöst, indem über Nacht bei 4°C in Gegenwart von Toluol gemischt wurde. Danach wurde der pH der HA enthaltenden Lösung auf 5,2 eingestellt, und nach Erwärmen auf 37°C wurde Rinderhoden-Hyaluronidase (Merck KGaA; 700 WHO-Units/mg) hinzugefügt. Für 7 g HA wurden 210 mg Enzym, die unmittelbar vor Gebrauch in 50 ml des obigen Puffers gelöst wurden, verwendet. Man ließ die Hydrolyse für 30 min bei 37°C unter stetigem Rühren ablaufen und beendete sie durch Erhitzen für 5 min bei 100°C in einem kochenden Wasserbad. Das Reaktionsgemisch wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 10000 g geklärt, Sediment, das denaturiertes Protein enthielt, wurde verworfen und der Überstand durch ein 0,2-μm-Filter, auf das ein Glasfaser-Vorfilter aufgebracht wurde, filtriert. Die geklärte Lösung, die HA-Oligosaccharide (HAOS) enthielt, wurde mittels Filtration durch drei Diaflo-Ultrafiltrationsmembranen (Amicon) mit unterschiedlichen molekularen Ausschlusswerten wie folgt fraktioniert.
(b) Fraktionierung von HAOS durch Ultrafiltration
HAOS-haltige Lösung aus dem vorhergehenden Schritt wurde durch 30-YM-Diaflo-Ultrafiltrationsmembran filtriert. Das Retenat wurde für andere Studien aufgefangen, während das Filtrat der zweiten Ultrafiltration durch 10-YM-Diaflo-Ultrafiltrationsmembran unterzogen wurde. Wiederum wurde das Retenat für andere Studien aufbewahrt, während die durch 10 YM hindurchgehende Lösung der letzten Ultrafiltration durch 3-YM-Diaflo-Membran unterzogen wurde. Danach wurde das Retenat, das HA-OS enthielt, etwa 10 ml der Lösung, zur weiteren Reinigung eingesetzt. Diese Fraktion: HAOS 3–10 wurde wie folgt gereinigt und weiter für die Kupplung an Sepharose verwendet.
(c) Reinigung von HAOS 3–10
HA-OS 3–10 wurde an einer Biogel-P2^®-Säule gereinigt (entsalzt). Diese Säule (4 cm × 100 cm) war mit Biogel 2 medium^®, 200–400 Mesh, (BioRad) gefüllt und wurde mit 5 Säulenvolumina Wasser (Milli Q, Millipore) gewaschen. Die aus dem vorhergehenden Schritt erhaltene HAOS-3-10-Fraktion (15 ml; 1,5 g Oligosaccharide) wurde auf diese Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit Wasser eluiert; eine 15-ml-Fraktion wurde gesammelt und auf das Vorliegen von HA-Oligosacchariden analysiert. Oligosaccharidhaltige Fraktionen eluierten vor den Salzen (die Letzteren wurden mit AgNO₃ nachgewiesen), wurden vereinigt und erneut auf 3-YM-Diaflo-Membran eingeengt.
(d) Analyse von HAOS 3–10
Um die Kupplungseffizienz der Sepharose zu bestimmen, wurde das Gel (die gleiche Charge) gewaschen und in Wasser suspendiert, um eine 50%ige Aufschlämmung herzustellen. Aus der Suspension von Sepharose-HAOS-3-10-Konjugat und Sepharose, die als Kontrolle verwendet wurde, wurden 100-μl-Aliquote in Dreifachansätzen entnommen und zu 2,5 ml 2,2 N Trifluoressigsäure (TFA, Merck KgaA) in einem Teflon-Schraubdeckelgefäß gegeben. Für die Hydrolyse wurde das Gemisch mit Argon gespült und für 16 Std. bei 100°C inkubiert. Am Ende der Hydrolyse wurden die Proben unter Stickstoff getrocknet, in Wasser resuspendiert und zur Bestimmung von Glucosamin und Uronsäure verwendet. Zur Bestimmung des Ausmaßes an Uronsäure- und Glucosamin-Zersetzung bei jeder der Hydrolysen wurden Kontrollproben, die bekannte Mengen an UA oder GlcNAc enthielten, eingeschlossen und unter den gleichen Bedingungen inkubiert.
Unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen wurden 5, 8, 9, 11 und 15 mg HAOS 3–10 pro 1 ml abgetropftem Sepharose-Gel in zwei unabhängigen Experimenten gekuppelt. Diese Ergebnisse basieren auf den UA- und Glucosamin-Assays.
(e) Verwendeter Assay
Der Gehalt an Uronsäure in den analysierten Proben wurde gemäß Bitter T. und Muir H. M., Anal. Biochem., 1962, 4, 330–334 bestimmt.
Die Hexosamin-Mengen wurden mit dem Verfahren von Rondle C. J. M. und Morgan W. T. J., Biochem. J., 1955, 61, 586–593 analysiert.
Beispiel 9: – Hyaluronsäurefragmente-Sepharose-Chromatographie (HA-Sepharose-Chromatographie)
Die Chromatographiematrices, die 8 bis 10 mg/ml enthielten, wurden wie angegeben hergestellt. Die enzymhaltige Probe wurde gegen 20 mM Essigsäurepuffer + 0,15 M NaCl pH 4,0 dialysiert und auf die 25-ml-HA-Sepharose-Säule aufgetragen. Nach Waschen mit dem gleichen Puffer erfolgte die Elution mit dem 20 mM Essigsäurepuffer einem Gradienten von NaCl von 0,15 bis 1 M.
Die 1-ml-Fraktionen wurden im Hyaluronidase-Aktivitätsbestimmungstest getestet, vereinigt, über Nacht gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 6,0, der Natriumazid und 17 mg/ml Trehalose enthielt, dialysiert. Die Protein- und Aktivitätsbestim mung der Pools wurde durchgeführt. Der Reinigungsfaktor dieses Chromatographieschritts betrug etwa 3.
Beispiel 10: – Diol-LiChrospher-Chromatographie
Eine gegen Milli-Q-H₂O dialysierte aktive 20-ml-Probe wurde auf die Diol-LiChrospher-Säule aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 15 ml Milli-Q-H₂O äquilibriert und 5 min mit 2 ml Wasser gewaschen. Die Elution der aktiven Probe erfolgte 15 min mit 20 mM Essigsäurepuffer pH 5,9 (Gradient, 0 bis 5 mM NaCl) und 35 min mit einem Gradienten von 20 mM bis 100 mM Essigsäurepuffer pH 5,5, der 5 mM NaCl enthielt. Die Fraktionen wurden hinsichtlich Hyaluronidase-Aktivität untersucht. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und über Nacht gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 6,0, der Natriumazid und 17 mg/ml Trehalose enthielt, dialysiert. Die Protein- und Aktivitätsbestimmung der Pools wurde durchgeführt. Reinigungsfaktor: 3.
Beispiel 11: – RP-18e-Chromatographie
Dieser Reinigungsschritt kann nur als letzter verwendet werden und zielt darauf ab, die Probe ohne Salze und andere Proteinverunreinigungen (z.B. Peptidprotease-Inhibitoren) zu erhalten. Die Hyaluronidase-Aktivität ging vollständig verloren, weil Manillase nicht gegenüber in diesem Schritt verwendeten organischen Lösungsmitteln resistent ist. Die Manillase-Probe wurde auf die RP-18e-Säule aufgetragen. Die 0,25-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Elution erfolgte in Gegenwart von 0,1% TFA, und ein Gradient von Wasser bis 99% Acetonitril wurde verwendet. Die RP-gereinigten Proben können direkt zur Aminosäuresequenzierung, MALDI-Messung, Kohlenhydratstrukturanalyse und als Standard zur Reinigung anderer Chargen von Manillase verwendet werden.
Beispiel 12: – Aktivitätsbestimmug – Trübungsverringerungstest
Die Hyaluronidase-Aktivitätsbestimmung erfolgte mit Trübungsverringerungsmessungen. Kommerziell erhältliche Zubereitungen von Hyaluronan (isoliert aus verschiedenen tierischen Geweben und Flüssigkeiten, z.B. menschlichem Rückenmark, Hahnenkamm) und Hyaluronidasen (endo-β-Glucosaminidasen aus Rinderhoden, Schweinehoden, Bienengift; Lyasen aus Streptomyces hyalurolyticus) wurden zur Etablierung geeigneter Aktivitätsassaybedingungen verwendet. Die endo-β-Glucuronidase aus Hirudo medicinalis wurde in unserem Labor teilweise gereinigt.
Eine Hyaluronan-Stammlösung (Konz. 2 mg/ml) wurde durch Lösen von HA in 0,3 M Phosphatpuffer pH 5,3 hergestellt. Diese Lösung wurde direkt vor dem Test mit dem gleichen Puffer auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml verdünnt. Die enzymhaltigen Proben wurden mit 20 mM Phosphatpuffer, der 0,01% Rinderalbumin und 77 mM NaCl enthielt, (Enzymverdünnungspuffer) auf eine geeignete Menge Enzym (0,5–5 WHO-Units) verdünnt. Zu 0,1 ml dieser Proben wurden 0,1 ml Hyaluronan-(0,2 mg/ml)Lösung gegeben, gemischt und 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Der Test erfolgte in Doppelansätzen. Die Reaktion wurde durch Verdünnen mit 1,0 ml Albumin-Reagenz (0,1% Albumin, in 80 mM Essigsäure/40 mM Natriumacetat-Puffer, pH 3,75 verdünnt) abgestoppt. Nach 10-minütiger Inkubation bei RT oder 37°C wurde die optische Dichte bei 600 nm abgelesen, und die Aktivität wurde in WHO-(IU)Units durch Vergleich (SLT-Programm) mit einem Standard ausgedrückt. Die WHO-Zubereitung von Rinderhoden-Hyaluronidase (Humphrey J. H., Bull. World Health Org. 1957, 16, 291–294) wurde als Standard verwendet.
Beispiel 13: – Proteinbestimmug
Der Proteingehalt von Säuleneluaten wurde durch Messen der Ultraviolettabsorption von Lösungen bei 280 nm bestimmt. Die Proteinkonzentration der vereinigten Fraktionen wurde mithilfe des Pierce-Mikroverfahrens bestimmt. Die BSA-Lösung wurde als Referenzprotein verwendet.
Beispiel 14: – SDS-PAGE-Elektrophorese
Die Elektrophorese erfolgte gemäß dem Laemmli-Verfahren (Nature, 1970, 227, 680–685). Die folgenden Gele wurden verwendet: 4- bis 20%iger Gradient oder 12,5%ige Trenngele mit 4%igem Sammelgel. Die Proben wurden der Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat und β-Mercaptoethanol unterzogen. Die Proteine wurden nach dem Färben mit Coomassie Brilliant Blue und/oder Silberfärbung (nach Pharmacia-Anleitung) sichtbar gemacht.
Beispiel 15: – Isoelektrische Fokussierung
Zur Durchführung von Studien zur isoelektrischen Fokussierung an der Manillase-Zubereitung wurde das vom Zulieferer (Pharmacia) bereitgestellte Protokoll verwendet. Nach der Fokussierung wurde das Gel fixiert und silbergefärbt (nach Pharmacia-Protokoll).
Beispiel 16: – Präparation von Immunglobin aus Immunseren von Kaninchen (Anti-Con-A-, Anti-Hämoglobin- und Anti-Peptid-Kaninchen-Antikörper)
Die Kaninchenseren wurden mithilfe der folgenden Immunogene erzeugt: Concanavalin-A-Lektin, Gemisch von Hämoglobinen und Peptid-KLH- Konjugaten. Die Peptidsequenz war identisch mit derjenigen des 14 Aminosäuren langen N-terminalen Abschnitts von Manillase (KEIAVTIDDKNVIA).
Die Seren wurden an der Protein-A-Sepharose-(Pharmacia, 17-0780-01)Säule gemäß der Standard-Pharmacia-Anleitung gereinigt. Die Reinheit der IgG-Proben wurden mithilfe von SDS-PAGE und ELISA-Test überprüft.
Beispiel 17: Western-Immunblot-Assay
Geeignete Aliquote der Proben und ein vorgefärbter Proteinmarker bekannten Molekulargewichts wurden einer SDS-PAGE, wie vorstehend beschrieben, unterzogen. Es wurde ein vorgefärbter BioRad-Molekulargewichtsmarker verwendet. Das Protein wurde für 100 min in Gegenwart von Transferpuffer elektrophoretisch aus Polyacrylamidgelen (0,8 mA/cm²) auf immobile Polyvinylfluorid-(PVDF-)Membranen übertragen. Die PVDF-Membran wurde für 1 Std. bei Raumtemperatur mit Blockierungslösung (PBS, pH 7,5 + 2% fettfreie Milch) inkubiert. Als nächstes wurde die Membran für 2 Std. bei Raumtemperatur mit dem Antikörper inkubiert, der mit der Blockierungslösung angemessen verdünnt wurde. Die Membran wurde mit TBS + 0,05% Tween 20, pH 7,5 gewaschen und für 2 Std. bei Raumtemperatur mit einem (Zweitantikörper)-Ziege-Anti-Kaninchen-alkalische-Phosphatase-Konjugat, BioRad inkubiert. Die Membran wurde zweimal mit TBS + Tween 20 gewaschen und 10 min mit einer Lösung des alkalische-Phosphatase-Substrats BCIP inkubiert. Zugabe von Stopppuffer beendet die Umsetzung.
Beispiel 18: – Aminosäuresequenzierung
Die Sequenz der N-terminalen 33 Aminosäurereste der Manillase wurde mittels Edman-Abbau erhalten. Nach SDS-PAGE Manillase-aktiver Proben wurden die Banden auf PDVF-Membran übertragen, mit Coomassie Blue gefärbt, ausgeschnitten und sequenziert. Die gleiche Aminosäuresequenz wurde für die Probe gefunden, die nach dem letzten Reinigungsschritt mithilfe der RP-Säulenchromatographie erhalten wurde.
Beispiel 19: – pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität (für aus Hirudinaria manillensis- und Hirudo medicinalis-Egelköpfen isolierte Hyaluronidase)
Die in diesem Experiment verwendeten Hyaluronidase-Proben wurden entweder aus Hirudinaria manillensis- oder Hirudo medicinalis-Egelköpfen extrahiert und mithilfe von Ammoniumsulfat-Fällung und Kationenaustauschchromatographie teilweise gereinigt. Jede Probe, die 500 WHO-Units/ml enthielt, wurde bei –20°C, +4°C und 37°C bei einem pH-Bereich von 2,6 bis 9,0 (20 mM Essigsäure für pH 2,6 bis 5; 20 mM Phosphatpuffer für pH 5 bis 9) inkubiert. Die Enzymaktivität wurde nach 1-, 2- und 7-tägigen Inkubationszeiträumen gemessen. Sowohl bei dem sauren als auch dem alkalischen Extrem des pH wurde für beide Hyaluronidasen eine Hemmung der Aktivität in demselben Ausmaß beobachtet. Während längerer Inkubationszeiträume war jedoch Manillase stabiler als Hirudo-medicinalis-Hyaluronidase: z.B. behielt Manillase nach 7 Tagen Inkubation bei pH 7,0 und +4°C und 37°C 75% bzw. 60% der Ausgangsaktivität. Die unter den gleichen Bedingungen inkubierte Hirudo-medicinalis-Hyaluronidase war bereits nach 1 Tag inaktiv.
Beispiel 20: – Stabilitätsmessung von Hyaluronidasen in Gegenwart von Hundeserum (für aus Hirudinaria manillensis- und Hirudo medicinalis-Egelköpfen isolierte Hyaluronidase)
Die 5-kU/ml-Proben von Manillase, Hirudo-medicinalis- und Rinderhoden-Hyaluronidase wurden mit Hunde- oder Ratten-Citratplasma auf eine Endkonzentration von 250 U/ml verdünnt. Als nächstes wurden diese Lösungen bei –20°C, +4°C und +37°C für 0 bis 7 Tage inkubiert. Die in Puffer verdünnten Kontrollen, die die gleichen Hyaluronidasen enthielten, wurden in dieses Experiment eingeschlossen. Schließlich wurde die Hyaluronidase-Aktivität gemessen.
Beispiel 21: – Kontaminierende Enzymaktivitäten
Auf jeder Stufe des Reinigungsverfähren für Egel-Hyaluronidase wurde die Zubereitung hinsichtlich anderer Enzyme, die zum Abbau von Protein in der Lage sind, mithilfe des universellen Proteasesubstrats (Boehringer Mannheim, Kat.-Nr. 1080 733) gemäß Twining S. S. (Anal. Biochem., 1984, 143, 30–34) überprüft.
Beispiel 22: – Einfluss von Heparin auf die Hyaluronidase-Aktivität
Die Spaltung von Hyaluronan durch Hyaluronidasen führt zur Freisetzung reduzierender Zucker. Die Menge an freigesetzten Zuckern wurden kolorimetrisch durch das modifizierte Verfahren von Park (Park J. & Johnson M.; J. Biol. Chem. 1949, 181, 149) gemessen. Zur Messung des Einflusses von Heparin auf die Aktivität von Manillase und Rinderhoden-Hyaluronidase wurden zwei Aktivitätsbestimmungen durchgeführt: eine in Gegenwart von Heparin und eine zweite ohne Heparin. Hyaluronidase-Proben, 25 μl (3,2 WHO-Units), wurden 30 min bei 37°C mit 25 μl der Heparin-(Liquemin, Fa. Hoffmann LaRoche)Lösung, die 0 bis 24 Units Heparin enthielt, inkubiert. Dann wurden 50 μl Hyaluronan (2,5 mg/ml) hinzugefügt, und die Inkubation wurde für 30 min bei 37°C fortgesetzt. Die Umsetzung wurde durch Erhitzen für 2 min bei 100°C beendet. Als nächstes wurden 100 μl Carbonat-Cyanid-Lösung und 100 μl Kaliumferricyanid-Lösung zu dem inaktivierten Verdau gegeben. Die Proben wurden in einem kochenden Wasserbad für 15 min erhitzt und dann in einem Eisbad abgekühlt. Danach wurden 0,75 μl Eisen(III)ammoniumsulfat-Lösung zu den Reaktionsgemischen gegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei RT wurde die entwickelte Färbung bei 690 nm in einem Shimadzu-Spektralphotometer gemessen. Geeignete Leerwerte und Kontrollen ohne Enzym wurden in jeden Assay eingeschlossen. Der für den Typ der analysierten Probe erwartete reduzierende Zucker (Glucuronsäure oder N-Acetylglucosamin, 1 bis 15 μg) wurde als Standard verwendet.
Beispiel 23: – Deglykosylierung der Manillase
Die Manillase-Proben wurden mithilfe des PNGase-F-Enzyms (BioLabs Art.-Nr. 701 L) gemäß den Anweisungen des Zulieferers deglykosyliert. Die Deglykosylierung erfolgte unter denaturierenden und nativen Bedingungen. Die O-Glykanase-, Neuraminidase- und Neuraminidase- + O-Glykanase-Behandlungen erfolgten gemäß Boehringer Mannheim-Standardvorschriften. Alle Proben wurden mittels SDS-PAGE und Aktivitätsbestimmungstest charakterisiert.
Beispiel 24: – Konstruktion des E. coli-Expressionsvektors (11)
Für die Expression in E. coli verwendeten wir eine modifizierte Version des Plasmids pASK75, das die tet-Promotorregion trägt. {Skerra, Gene 151, (1994), S. 131–135}. Die Modifikation erfolgte durch Klonieren eines neuen Linkers zwischen die XbaI- und die Hind-III-Stelle. Der neue Linker enthält die ompA-Leadersequenz, eine weitere multiple Klonierungsstelle und eine 6 × His-Markierung an Stelle der Strep-Markierung.
Die in pASK75 klonierte Linkersequenz:
Zur Konstruktion des Expressionsvektors für Manillase war es notwendig, 5'-Cla-I- und 3'-Eco47III-Restriktionsstellen mithilfe des PCR-Verfahrens einzuführen. Daher wurden die beiden Primer
verwendet. Das PCR-Produkt wurde zuerst in das PCR-II-Vektorsystem (Invitrogen) kloniert und sequenziert.
In einem zweiten Schritt wurde das Manillase-Gen unter Verwendung der Restriktionsstellen 5' ClaI und 3' Eco47III in den modifizierten pASK75-Vektor kloniert. Nach Expression und Nachweis der Aktivität dieser rekombinanten Manillase wurde in einer zweiten PCR-Reaktion die His-Markierung entfernt, und das Startcodon des Manillase-Gens wurde direkt an die omp-A-Leadersequenz fusioniert. Die Primer für diese PCR-Reaktion waren:
Beispiel 25: – Konstruktion des Baculo-Donorplasmids (12)
Für die Expression von Manillase im Baculovirus-Expressionssystem wurde das Bac-To-Bac^TM-Baculovirus-Expressionssystem von Gibco Life Technologies verwendet. Um ein Schnittsystem zu erhalten, wurde die Honigbienen-Mellitin-Leadersequenz an das Manillase-Gen fusioniert, und um die Restriktionsstellen 5' BamHI und 3' KpnI einzuführen, wurde eine einzige PCR-Reaktion durchgeführt.
Das PCR-Produkt wurde in den PCR-II-Vektor (Invitrogen) kloniert und sequenziert. Dann wurde die Mellitin-Manillase-Fusion unter Verwendung der Restriktionsstellen 5' BamHI und 3' KpnI in den pFastBac-Vektor kloniert (12).
Beispiel 26: – Konstruktion des Hefe-Expressionsvektors (13)
Zur Expression in Hefe verwendeten wir das Pichia-Multikopie-Expressionssystem (Invitrogen). Zur Konstruktion des Expressionsvektors für Manillase verwendeten wir das PCR-Amplifikationsverfahren des Manillase-Gens auf eine Weise, dass kompatible Restriktionsenden (5' EcoRI, 3' NotI) für die Ligation in den ent sprechenden Vektor (pPIC9K) erzeugt wurden. Daher wurden die folgenden Primer verwendet:
Vor der Transformation der Pichia-Sphäroplasten muss der Expressionsvektor mit SalI linearisiert werden
Beispiel 26: – Expression in E. coli
Im Expressionsvektor pRG72, der das Strukturgen von Sarastatin, fusioniert an die mpA-Leadersequenz, enthält, wurde in kompetente W3110-Zellen transformiert. Die Zellen wurden bis zur Mitte der log-Phase gezüchtet, und der Promotor wurde dann durch Zugabe von 200 μg aTC/l induziert. 1 Std. danach konnte die rekombinante Manillase deutlich nachgewiesen werden.
Beispiel 27: – Erzeugung von rekombinanten Baculoviren und Manillase Expression mit dem Bac-To-Bac-Expressionssystem
Das Donorplasmid pTD13 wurde in kompetente DH10Bac-Zellen transformiert, die das Bacmid mit einer mini-attTn7-Zielstelle und das Helferplasmid enthalten. Das mini-Tn7-Element auf dem Donorplasmid kann zu in Gegenwart von Transpositionsproteinen, die vom Helferplasmid bereitgestellt werden, zu der mini-attTn7-Zielstelle auf dem Bacmid transponieren. Kolonien, die rekombinante Bacmide enthielten, wurden durch Zerstörung des lacZ-Gens identifiziert. Hochmolekulare Minipräp-DNA wurde aus ausgewählten E.-coli-Klonen, die das rekombinante Bacmid enthielten, präpariert, und diese DNA wurde dann zur Transfektion von Insektenzellen verwendet.
Eine detaillierte Beschreibung findet sich in der Anleitungsbeilage des Expressionskits.
Beispiel 28: – Expression in Hefe
Um sicherzustellen, dass das Manillase-Gen integriert wurde, müssen die Kolonien nach His⁺Mut⁺-Mutanten durchmustert werden.
Beimpfe unter Verwendung einer Einzelkolonie 100 ml Medium in einen 1-l-Kolben. Die Wachstumsbedingungen sind: 28–30°C, 250 U/min, bis zu OD 2–6. Um die Expression zu induzieren, zentrifugiere zunächst die Kultur, dekantiere den Überstand und resuspendiere das Zellsediment in neuem Medium unter Verwendung von 1/5 des ursprüunglichen Kulturvolumens. Gib 100% Methanol bis auf eine Endkonzentration von 0,5% alle 24 Stunden zu, um die Induktion aufrechtzu erhalten. Nach max. 6 Tagen wird der Überstand mit SDS-Page und dem Aktivitätstest analysiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes, aus der Egel der Art Hirudinaria manillensis isoliertes Protein mit der biologischen Aktivität einer Hyaluronidase, die nicht durch Heparin gehemmt wird, wobei das Protein die folgenden Eigenschaften besitzt: (a) ein Molekulargewicht von 53–60 kDa, je nach der Glykosylierung, (b) ein Optimum der enzymatischen Aktivität bei pH 6,0–7,0, (c) einen isoelektrischen Punkt von 7,2–8,0, (d) eine Restaktivität von 60% bei 37°C nach 7 Tagen und von 100% bei 37°C nach 7 Tagen in Gegenwart von Hundeserum und (e) eine spezifische Enzymaktivität von mehr als 100 kU/mg Protein.
Gereinigtes Protein nach Anspruch 1, das durch die folgenden Schritte erhalten werden kann: (i) Homogenisieren von Köpfen von Egeln der genannten Art mit saurem Puffer, gefolgt von Zentrifugation, (ii) Fällen des Überstands von Schritt (i) mit 36% Ammoniumsulfat, (iii) Verwendung von Kationenaustauschchromatographie zur Reinigung des Überstands von Schritt (ii), (vi) Verwendung von Concanavalin-A-Affinitätschromatographie zur Reinigung vereinigter Fraktionen von Schritt (iii), (v) Verwendung von hydrophober Wechselwirkungschromatographie zur Reinigung vereinigter Fraktionen von Schritt (iv), (vi) Verwendung von Affinitätschromatographie an Matrices, die mit Hyaluronsäurefragmenten beschichtet sind, zur Reinigung vereinigter Fraktionen von Schritt (v) und (vii) Verwendung von Gelpermeationschromatographie zur Reinigung vereinigter Fraktionen von Schritt (vi).
Gereinigtes Protein nach Anspruch 1 oder 2 mit der Aminosäuresequenz, wie in 7 und SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
Glykosyliertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einem Molekulargewicht von 58 kDa (±2).
DNA-Molekül, das für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert und eine der Nukleotidsequenzen, wie in 8 (SEQ ID Nr. 2), 9 (SEQ ID Nr. 4) und 10 (SEQ ID Nr. 6) dargestellt, aufweist.
Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 5 enthält.
Wirtszelle, die sich zur Expression des Proteins, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beschrieben, eignet und den Vektor nach Anspruch 6 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und ein pharmazeutisch unbedenkliches Verdünnungsmittel, einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Excipienten enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die zusätzlich einen pharmakologischen Wirkstoff enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der pharmakologische Wirkstoff Heparin ist.
Verwendung eines Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Myokard-, kardiovaskulären und thrombotischen Störungen und Tumoren.
Verfahren zum Isolieren und Reinigen des Proteins nach Anspruch 1, das die Schritte enthält: (i) Homogenisieren von Köpfen von Egeln der genannten Art mit saurem Puffer, gefolgt von Zentrifugation, (ii) Fällen des Überstands von Schritt (i) mit Ammoniumsulfat, (iii) Verwendung von Kationenaustauschchromatographie zur Reinigung des Überstands von Schritt (ii), (vi) Verwendung von Concanavalin-A-Affinitätschromatographie zur Reinigung vereinigter Fraktionen von Schritt (iii), (v) Verwendung von hydrophober Wechselwirkungschromatographie zur Reinigung vereinigter Fraktionen von Schritt (iv), (vi) Verwendung von Affinitätschromatographie an Matrices, die mit Hyaluronsäurefragmenten beschichtet sind, zur Reinigung vereinigter Fraktionen von Schritt (v) und (vii) Verwendung von Gelpermeationschromatographie zur Reinigung vereinigter Fraktionen von Schritt (vi).