KR20020011138A - 히루디나리아 마닐렌시스 유래의 히알루로니다아제, 분리,정제 및 재조합적 제조 방법 - Google Patents
히루디나리아 마닐렌시스 유래의 히알루로니다아제, 분리,정제 및 재조합적 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 열대성 거머리 히루디나리아 마닐렌시스 유래의 히알루로니다아제의 분리, 정제 및 특징화에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 그 효소는 "마닐라아제"로 명명되었다. 더욱이 본 발명은 DNA 및 아미노산 서열 뿐만 아니라 의 발현 벡터 및 숙주 시스템의 개시를 포함하는, 마닐라아제의 제조를 위한 재조합적 방법에 관한 것이다. 최종적으로, 본 발명은 치료 목적, 예를 들어 심근계 질병, 혈전성 사상(事象) 및 종양의 치료를 위한 마닐라아제의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 열대성 거머리인 히루디나리아 마닐렌시스(Hirudinaria manillensis)로부터 유래한 신규한 히알루로니다아제의 분리, 정제 및 특징화에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명에 따라 신규한 효소는 "마닐라아제"로 명명된다. 더욱이 본 발명은 DNA 및 아미노산 서열 뿐 아니라, 발현 벡터 및 숙주 시스템의 개시를 포함하는 마닐라아제의 재조합적 제조 방법에 관한 것이다. 최종적으로, 본 발명은 치료 목적, 예를 들어 심근 질환, 혈전성 사상(事象) 및 종양의 치료를 위한 마닐라아제의 용도에 관한 것이다.
히알루론산 또는 히알루로난(HA)은, 반복적인 이당류 구조 GlcNAc(β1-4)GlcUA로 구성된 선형 비분지 고분자량(2 - 6 ×106) 글리코사미노글리칸이다. 그의 카르복실기는 정상이든 병적이든, 세포외액의 우세한 pH 에서 완전히 이온화된다. HA 는 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트 및 헤파린과 함께 글리코사미노글리칸의 군에 속한다(Jeanloz R.W., Arthr Rheum., 1960, 3, 233 - 237). 다른 비변형 글리코사미노글리칸(GAG)과는 달리, HA 는 설페이트 치환체 또는 공유결합된 펩티드가 없으며, 그의 사슬 길이 및 분자량은 일반적으로 매우 크다. HA는 결합 조직에 편재되어 분포되어 있으며, 개선된 고정 방법(Hellstroem S. et al., 1990, Histochem. J., 22, 677 - 682) 및 히알루로난-결합 펩티드(HABP)를 이용하는 특별한 조직화학법의 도입 후에는 실제적으로 신체의 모든 부분에서 발견되었다. 또한 HA 는 발생 및 성숙기 동안 신경 외배엽 기원 조직에서도 존재한다.
용어 히알루로니다아제는 일반적으로 및 본 발명에 따라, 다른 기질에 대한 활성과 무관하게 히알루론산 상에 작용하는 효소를 의미한다.
히알루로니다아제는 초창기에는 미생물로부터, 이후에는 현재 그의 주 원천인 포유류의 고환으로부터 분리되었다(Meyer K. The Enzyme, 1971, 307).
반응 메카니즘에 따라, 히알루로니다아제는 3 개의 주요 군으로 분류되었다.
제 1 군에서는, Δ-4,5-불포화 이당류를 생성시키는 β-제거반응에 의해서 그들의 기질에 작용하는 미생물의 효소가 합해져 있다. 그러므로, 효소는 히알루로네이트 절단효소, EC 4.2.99.1 로 명명되어야 한다.
제 2 군인, 히알루로노글루코사미니다아제 또는 고환성-유형 히알루로니다아제(EC 3.2.1.35)는, HA를 작은 단편들, 첫째로 자유 환원 말단을 가진 헥소오스 아민 부분을 가진 4당류로 분해하는 엔도-N-아세틸-β-D-헥사미니다아제로서 작용한다. 고환 히알루로니다아제와 유사한 성질을 가진 효소는 올챙이, 뱀독, 벌독, 각종 동물 조직, 인간 혈청 및 다른 원으로부터 수득된다. 고환 유래의 히알루로니다아제는 또한 트랜스글리코실라아제 활성을 갖고 있음이 공지되었다(Weissman B. et al., J. Biol. Chem., 1954, 208, 417 - 429). 히알루로니다아제의 상기 군에 속하는 효소는 히알루로네이트 뿐 아니라 콘드로이틴-4-설페이트,콘드로이틴-6-설페이트, 콘드로이틴 및 데르마탄 설페이트에 대해서 효소 활성을 나타낸다.
제 3 군은 히알루로노글루쿠로니다아제(EC 3.2.1.36)로 구성되고, 이는 엔도-β-글루쿠로니다아제로서 작용한다. 이 효소는 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis) 거머리로부터 분리되며(Yuki H. & Fishman W.H.; J. Biol. Chem. 1963, 238, 1877 - 79), HA 에 대해서만 특이적이다. 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 및 헤파린은 이러한 히알루로니다아제의 기질이 아니다. 이는 히알루론산만을 자유 환원 말단에 글루쿠론산을 가진 4당류로 분해한다(Linker A. et al., J. Biol. Chem., 1960, 235, 924 - 27). 포유류의 엔도-β-글루코사미니다아제와는 달리, 헤파린은 이러한 거머리 히알루로니다아제의 활성에 영향을 주지 않는다. 그러므로, 환자에게 항응고제로서 널리 사용되는 헤파린 및 그의 유도체와 동시투여될 수 있다. 버팔로 거머리의 하위계층인 히루디나리이나에(Hirudinariinae){일반적인 히루디나리아 (Hirudinaria)속, 일레브델라(Illebdella)속, 포에실로드벨라(Poecilodbella)속, 상구이소가(Sanguisoga)속을 포함}의 종{포에실로브델라 그래뉼로사(Poecilobdella granulosa)}으로부터의 히알루론산 특이적 엔도-베타-글루쿠로니다아제("오르겔라아제" 로 명명)는 약 28.5의 분자량을 가진 것으로 EP 0 193 330 에 개시되었다.
히알루로니다아제는 다수의 유용한 생체내 및 생체외 용도를 가진다. 히알루로니다아제의 정맥내 투여는 심근 경색증의 치료를 위해 제안되었다(Kloner R.A. et al., Circulation, 1978, 58, 220 - 226; Wolf R.A. et al., Am.J.Cardiol.,1984, 53, 941 - 944; Taira A. et al., Angiology, 1990, 41, 1029 - 1036). 심근 경색증은 일반적인 형태의 비-기계적 상해, 즉 갑작스런 세포 저산소증에 의해 상기의 경우에서 유발되는 심각한 세포 손상 및 사멸을 나타낸다. 래트에서 유도된 실험에서의 심근 경색(Waldenstroem A., et al., 1991, J. Clin. Invest., 88, 1622 - 1628)에서, 손상된(경색 부분) 심근의 HA 함량은 24 시간 내에 증가하여, 3 일 후에는 정상치의 약 3 배에 이르며, 간질성 부종을 동반했다. 경색 영역의 상대적인 함수량이 또한 점차 증가하여 3 일 째에 최대값이 되었으며, HA 축적과 강한 상관관계가 있었다. 증가된 HA 함량과 부종의 동일한 관계가 실험에서의 심장 및 신장 이식 거부 반응(Haellgren R. et al., J. Clin. Invest., 1990, 85, 668 - 673; Haellgren R. et al., J. Exp. Med., 1990, 171, 2063 - 2067), 인간 신장 이식 거부 반응(Wells A. et al., Transplantation, 1990, 50, 240 - 243), 폐 질환(Bjermer A. et al., Brit. Med. J., 1987, 295, 801 - 806) 및 특발성 간질 섬유화(Bjermer A. et al., Thorax, 1989, 44, 126 - 131)에서 관찰된다. 상기의 모든 연구는, 급성 염증 중 증가되는 HA 의 증거를 제공할 뿐 아니라, 주로 조직 팽윤의 원인이 되며 심장의 기계적 및 전기생리학적 작용에 영향을 미치는, 체액의 국부 정류에서의 이의 역할을 증명한다.
상기 결과들은 임상적 시도에서 사용되는 히알루로니다아제의 작용 메카니즘을 설명할 수 있다. 히알루로니다아제 처리는 래트, 개 및 인간에서의 심근허혈 동안의 세포 손상을 제한하는 것으로 보고되었다(Maclean D. et al., Science, 1976, 194, 199). HA 의 분해는 조직 수분 축적의 감소, 조직압력의 감소 및 최종적으로는 더 나은 관류로 이어질 수 있다.
거머리로부터의 추출물을 함유하는 히알루로니다아제 뿐 아니라 히알루로니다아제들이 다른 치료 목적을 위해 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 단독 또는 시클로스포린과 조합된 하이아제 치료법으로 이식편의 생존이 연장된다(Johnsson C. et al., Transplant Inter. in press). 가장 광범위한 의미의 하이아제("확산 인자")는 다른 약리학적 제제의 확산을 강화시키기 위해 조직의 투과성을 증가시키기 위해 사용된다(예를 들어, 암 종양의 치료에서 세포성장억제제와의 조합). 더욱이, 히알루로니다아제는 혈관형성 저해제로서, 및 녹내장 및 다른 눈 장애의 치료를 위한, 종양 치료에서의 국부적 약물 전달에서의 보조제로서, 및 국부 마취제 및 항생제와 같은 다른 치료제의 보강제로서 작용하며, 종양 치료에서 유용함이 입증되었다. 치료 용도의 일반적인 개요 및 관련 문헌은 Farr et al. 의 개요 논문(1997, Wiener Medizinische Wochenschrift, 15, p. 347) 및 그에 인용된 문헌에 있다. 그러므로, 히알루로니다아제와 같은 활성 화합물이 필요하다. 그러나, 공지되어 사용가능한 히알루로니다아제는 안정하지 않거나(히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis) 유래의 히알루로니다아제, Linker et al., 1960, J. Biol. Chem., 235, p.924; Yuki and Fishman, 1963, J. Biol. Chem., 238, p.1877) 또는 다소 낮은 특이적 활성을 나타낸다(EP 0 193 330, Budds et al., 1987, Comp. Biochem. Physiol., 87B, 3, p.497). 더욱이, 공지된 히알루로니다아제 중 어느것도 본격적인 상용의 중요한 필요조건인 재조합 형태로 이용될 수 없다.
본 발명은 최초로 히루디나리아 마닐렌시스로부터 분리 및 정제한 신규한 히알루로니다아제 뿐 아니라 생물공학적 기술로 수득되는 상기 효소의 재조합 버전을 개시한다.
따라서, 본 발명의 목적은, 헤파린에 의해 그의 활성이 영향을 받지 않으며, 글리코실화에 따라 53 - 60 kD의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는, 히알루로니다아제의 생물학적 활성을 가진, 거머리종 히루디나리아 마닐렌시스로부터 분리된 정제 단백질을 제공하는 것이다. "마닐라아제"로 명명되는 신규한 단백질은, 약 58 kD(±2 kD) 의 분자량 및 4 개의 글리코 형태를 가진 천연 형태로 글리코실화된다. 그러나, 표준 기술에 따른 당 잔기의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 수득될 수 있는 비-글리코실화 단백질도 본 발명의 목적이다. 본 발명의 비-글리코실화 효소는 SDS-PAGE로 측정시 약 54(±2) 의 분자량을 가진다.
직접적인 비교는, EP 0 193 330 에 기재된 히알루로니다아제 ("오르겔라아제")가 같은 조건 하에서 약 28 의 분자량을 가지며 헤모글로빈과 같은 다수의 불순물을 함유하는 것을 보여준다. 본 발명에 따른 천연 마닐라아제는, 6.0 - 7.0 의 최적 pH , 등전점 7.2 - 8.0 을 가지며, 도 7 에 도시한 아미노산 서열을 가진다.
놀랍게도, 준비 정제 과정(하기 참조)에 의해 수득되는 마닐라아제는 100 - 150, 바람직하게는 110 - 140 (WHO) kU/mg 단백질의 매우 높은 특이적 활성을 가지는 반면, 오르겔라아제의 특이적 활성은 약 1.2 kU/mg 일 뿐이다. 더욱이, 오르겔라아제는 마닐라아제와 비교시 더 낮은 최적 pH(5.2 - 6.0)를 가졌다. 마닐라아제는, 오르겔라아제처럼 헤파린에 영향을 받지 않는다.
더욱이, 본 발명의 목적은, 하기 단계를 포함하는 마닐라아제 분리 및 정제 방법을 제공하는 것이다:
(i) 히루디나리아 마닐렌시스 종의 거머리 머리를 산 완충액과 함께 균질화 및 원심분리하는 단계,
(ii) 단계 (i) 의 상층액의 암모늄 설페이트 침전 단계,
(iii) 양이온 교환 크로마토그래피 단계,
(iv) Con A (콘카나발린 A)친화 크로마토그래피 단계,
(v) 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계,
(vi) 히알루론산 단편으로 코팅된 매트릭스 상에서의 친화 크로마토그래피 단계,
(vii) 겔 투과 크로마토그래피 단계,
및 선택적으로는
(viii) 정제된 단백질의 효소성 또는 화학적 탈글리코실화 단계.
상기 개시된 공정 단계는 상기와 같은 높은 생물학적 효소 활성을 갖는 본 발명에 따른 단백질이 수득될 수 있도록 보장한다. 따라서, 본 발명의 또다른 목적은, 헤파린에 의해 그의 활성이 영향받지 않는 히알루로니다아제의 생물학적 활성을 가지며, 글리코실화에 의존하여 53 - 60 의 분자량을 가진, 상기 및 청구 범위에 기재된 공정 단계로 수득가능하고, 바람직하게는 >100 kU/mg 단백질의 특이적 효소 활성을 가진 단백질을 제공하는 것이다. 용어 "단위" 는, 상기 및 하기에서"국제 단위" (IU) 에 관한 것이다.
본 발명은 각각 DNA 분자, 벡터 및 형질전환 숙주 세포를 포함하는 재조합 마닐라아제의 제조 방법을 개시한다. 따라서, 본 발명의 목적은 천연 마닐라아제의 특성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제공하는 것이다. 또한, 약간 상이한 아미노산 서열을 가진 마닐라아제(히알루로니다아제) 특성을 가진 단백질을 코딩하는 약간 상이한 DNA 서열을 가진 3 개 이상의 클론이 선택될 수 있음을 볼 수 있을 것이다.
구체적인 클론은 역시 본 발명의 목적인 도 8, 9 및 10 에 도시된 DNA 서열 뿐 아니라, 상기 서열을 가진 발현 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포도 가진다.
또한, 본 발명의 목적은 히알루로니다아제의 생물학적 활성 및 글리코실화에 따라 55 - 59 kD 의 분자량을 가진, 도 8, 9 및 10(아래쪽 서열)에 도시된 임의의 아미노산 서열 또는 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 서열을 갖는 재조합 단백질을 제공하는 것이다. 용어 "마닐라아제" 는 상기-상술된 성질을 가진 모든 단백질을 포함한다.
재조합 뿐 아니라 천연 단백질(들)은, 환자에게 직접 적용할 수 있는 의약품으로서 또는 약학적 조성물 중에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 국면은 의약품으로서 적용가능한 상기 및 하기에 정의된 바와 같은 재조합성 또는 천연 단백질, 및 상기 단백질 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 함유하는 각각의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 매우 다양한 추가적 약학적 활성 화합물을 추가적으로 함유할 수 있다. 바람직한 약제는 본 발명에 따른 단백질의 생물학적 및 약리학적 활성에 영향을 미치거나 이를 저해하지 않는 항응고제이다. 그러한 항응고제는, 예를 들어 헤파린, 히루딘 또는 디코우마린, 바람직하게는 헤파린일 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 약리학적으로 활성인 화합물, 바람직하게는 헤파린을 추가적으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
인간 또는 수의학적 치료에서의 용도에 관련하여, 본 발명에 따른 단백질은 바람직하게는 분산제("확산" 인자)로 작용하거나 또는 조직 또는 피부를 통한 통과를 지지한다. 따라서, 예를 들어 종양의 화학 치료 분야에서, 급성 심근 경색 및 허혈과 관련된 장애 및 질병의 치료를 위한, 예를 들어 눈에서의 생리학적 유체액의 순환을 개선하기 위한, 녹내장 및 다른 눈 장애의 치료를 위한, 혈전을 제거하고 순환을 개선시키기 위한 피부 및 조직 이식편의 치료를 위한, 다른 물질(예컨대 국부 마취제)의 보강제로서, 피부, 막, 기타 조직을 통한 약물 전달계로서, 특정한 병원성 미생물 또는 특정 종양 및 암 조직을 둘러싼 히알루론산 캡슐을 제거하기 위한 약제로서, 및 항-혈전 및 항-종양 약제로서 사용될 수 있는 혈관형성 억제제로서 마닐라아제가 사용될 수 있다.
따라서, 특히 심근, 심혈관 및 혈전성 장애 및 종양의 치료를 위한 의약품의 제조에서의 상기 및 하기에 정의된 마닐라아제의 용도가 본 발명의 목적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는, 불활성의 무독성 고체 또는 액제 충전제, 희석제 또는 캡슐화된 물질로, 활성 화합물 또는환자에 역효과적으로 반응하지 않는 것을 의미한다. 적합한, 바람직하게는 액체인 담체는, 예컨대 멸균수, 식염수, 수성 덱스트로오스, 당 용액, 에탄올, 글리콜, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의, 예를 들어 땅콩유, 대두유 및 광유를 포함하는 오일이 당분야에 공지되었다.
본 발명의 따른 제형물은 비경구 투여에 전형적인, 통상적인 무독성의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보강제 및 비히클을 함유하는 단위 복용량으로서 투여될 수 있다.
용어 "비경구" 는 본원에서 피하, 정맥내, 관절내 및 기관내 주사 및 주입 기술을 포함한다. 또한 다른 투여법, 예컨대 경구 투여 및 국소 적용도 적합하다. 비경구 조성물 및 조합물은 가장 바람직하게는 공지된 과정에 따라 볼루스 형태나 일정 주입 융해물로서 정맥내 투여된다. 경구 투여용 정제 및 캡슐은 통상적인 부형제, 예컨대 결합제, 충전제, 희석제, 타정제, 윤활제, 붕해제 및 습윤제를 함유한다. 정제는 당 분야에 공지된 방법에 따라 코팅될 수 있다.
경구용 액체 제제는 수성 또는 오일성 현탁제, 용액, 에멀션, 시럽 또는 엘릭서 형태일 수 있으며, 또는 사용 전 물 또는 또다른 적합한 비히클과의 재구성을 위한 건조 제조품으로서 제공될 수 있다. 그러한 액체 제제는 상용적인 첨가제- 예컨대 현탁화제, 에멀션화제, 비수성 비히클 및 방부제를 함유할 수 있다. 국부 적용물은 수성 또는 오일성 현탁제, 용액, 에멀션, 젤리 또는 바람직하게는 에멀션 연고의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 단위 복용량은 본 발명에 따른 단백질의 1 일 필요량, 또는원하는 투여량을 맞추기 위한 그의 서브-멀티플(sub-multiple)을 함유할 수 있다. 주어진 환자(인간을 포함한 포유 동물)를 위한 최적의 치료에서 허용되는 투여량 및 투여 속도는 각종 인자, 예컨대 사용된 특별한 활성 물질의 활성, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간 및 경로, 청소율, 효소 활성(단위/단백질mg), 처리 목적, 즉 치료 또는 예방, 및 치료될 질병의 성질에 좌우된다.
따라서, 치료된 환자(생체 내)에서, 예컨대 헤파린과 같은 항응고제와의 조성물 및 조합물 중, 본 발명의 단백질(마닐라아제)의 약학적으로 유효한 1 일 복용량은 약 0.01 내지 100 mg/체중 kg, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/체중 kg이다(100 kU/mg 의 특이적 활성에 근거함). 적용 형태에 따라서 단일 복용량은 0.5 내지 10 mg의 마닐라아제를 함유할 수 있다.
마닐라아제와 함께 투여시, 예를 들어 헤파린의 농도는 전형적으로는 1 일에 500 - 4,000 U(IU) 이지만, 필요하다면 증가되거나 또는 감소될 수 있다.
본 발명의 마닐라아제의 정제는 실시예에 상술된 바와 같이 달성되었다. 표 1 은 마닐라아제의 준비 정제 과정을 도시한다. 표 2 는 본 발명에 따른 단백질의 농축 방법을 나타내며, 표 3 은 마닐라아제와 공지된 거머리 히알루로니다아제와의 비교를 나타낸다.
마닐라아제로 명명된, 히알루론산을 절단하는 효소는 거머리 히루디나리아 마닐렌시스의 머리로부터 분리되며, 정제하여 균질화시킨다. 상기의 히알루로니다아제는 산-추출법, 암모늄설페이트 침전법, 및 이어서 연속적으로 양이온 교환,Con A-세파로스, 프로필-프락토겔, 히알루로난 단편-세파로스 및 디올-리크로스퍼 (Diol-LiChrospher)칼럼 상에서의 크로마토그래피를 이용하여 정제되었다. 히알루로난 단편은, 천연 히알루로난을 소 고환 히알루로니다아제로 절단함으로써 제조되었다. 단편의 정제 및 특징화 후, 친화 매트리스를 하기에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 그러한 친화 매트리스는 히알루로니다아제의 정제를 위해 최초로 적용되었다. 이러한 고성능 크로마토그래피는 히알루로난 결합 단백질의 신속하며 효과적인 정제를 위한 기술이다. 정제의 각 단계 후의 효소 활성의 회수율은 상당히 높았다. 3 개의 독립적인 준비 정제의 결과를 비교했다. 그들은 정제 정도에 따라 20 내지 160 kU/mg을 가진 높은 활성의 샘플로 나타났다. 비교 실험에서 공지된 히알루로니다아제는 선행 기술에서 지시하는 바와 같이 분리되었으며, 그들의 특성을 본 발명에 따른 단백질과 비교했다(표 3).
표 1 의 과정에 따라 정제된 히알루로니다아제는 다른 저자들에 의해 기술된 거머리 히알루로니다아제와 다르다. 비분리 조건 (임의의 β-메르캅토에탄올) 하에서 유사한 분자량이 수득되며, 이는 마닐라아제가 통상적으로 포유류 원 유래의 광범위한 히알루로니다아제 제제와 공통으로 단일 서브유닛 효소임을 나타낸다. 상기 최종 제제는 7.2 내지 8.0 의 등전점을 가진, MALDI 로 측정한 겉보기 분자량 58 ±2 의 단일 서브유닛 효소이다(도 1).
표 중 별표는 활성 측정 및 생화학적 특징화에 대한 정보를 의미한다(*-*****).
사용된 활성 측정 방법 및 생화학적 특징화의 방법은 분석된 샘플 중의 마닐라아제의 농도에 의존적이다. 따라서, 이것들도 정제의 연속적인 단계 중 적절한 기술에 의해 연속적으로 확장되었다.
* - 활성 측정-탁도 감소 테스트
** - 활성 측정-탁도 감소 테스트
- 단백질 함량 측정(E280, Pierce BCA 방법)
- SDS-PAGE(SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)
- 헤모글로빈 측정
*** - 활성 측정-탁도 감소 테스트
- 단백질 함량 측정(E280, Pierce BCA 방법)
- SDS-PAGE-웨스턴 블럿(항 인간 헤모글로빈 항체)
**** - 활성 측정-탁도 감소 테스트
- 단백질 함량 측정(E280, Pierce BCA 방법)
- SDS-PAGE-웨스턴 블럿(항 인간 헤모글로빈 항체),
- SDS-PAGE-웨스턴 블럿(항 Con A 항체)
- SDS-PAGE-웨스턴 블럿-항 펩티드 항체
***** - MALDI
- 단백질 함량 측정(Pierce BCA 방법)
- SDS-PAGE-웨스턴 블럿(항 펩티드 항체)
Con A 에 대한 마닐라아제의 결합은 상기 히알루로니다아제가, 그의 당 성분이 α-D-만노피라노실 또는 α-D-글루코피라노실 및 입체적으로 연관된 잔기로 종결된 당단백질이라는 것을 나타낸다. 마닐라아제-활성 샘플은 SDS-PAGE 에서 거의 동일한 RF 값을 가지는 2 개의 밴드를 나타냈다. 밴드의 더 나은 분리를 위해 더 긴 SDS-PAGE 및 다른 실시 조건이 사용되었다. 상기 실험에서, 두 개의 추가적인 더 약한 밴드도 검출될 수 있었다(도 2). 이것들 모두(30 아미노산)의 N-말단 부분은 각각 서열분석되었으며, N-말단에서는 다른 점이 없음을 다시 한 번 보여주었다. 엔도-F-글리코시다아제(PNGase)로 탈글리코실화한 후에는, 약 3의 MW 가 감소되어 모든 4 밴드가 단일 밴드를 형성하는 것이 관찰되었다. 따라서, 전기영동에서의 움직임 중 관찰된 차이는 마닐라아제 분자의 글리코실화 패턴에서의 차이 때문인 것으로 추정된다. 뉴라미니다아제, O-엔도-글리코시다아제, 및 뉴라미니다아제와 O-글리코실다아제 처리는 정제된 효소의 분자량에 영향을 주지 않는다(도 3). 상기 결과는 마닐라아제가 하나 이상의 N-결합 올리고당 사슬을 함유하는 것을 나타낸다. O-결합 탄수화물 사슬은 사용된 방법으로는 검출할 수 없었다.
최종의 정제 단계로 RP-크로마토그래피가 수행되었다. 효소 활성은 더 이상 검출될 수 없지만, 염 및 펩티드 프로테아제 저해제는 제거될 수 있다(도 4). 단백질을 함유하는 분획은 MALDI 로 더 특징화되었다. MALDI 로 측정된 마닐라아제의 분자량은 58.3 이다.
헤파린은 상기 히알루로니다아제의 활성에 아무 영향을 주지 않는다(도 5). 마닐라아제는 히루도 메디시날리스 히알루로니다아제보다 수 배 더 안정하다. 더욱이, 부분적으로 정제된 마닐라아제의 샘플은 개 및 래트 혈청 중 -20 내지 +37 의 범위 내에서 매우 높은 안정성을 나타낸다.
HA-친화성 매트리스의 제조법은 문헌에 기재되어 있다(Tengblad A., Biochim. Biophys. Acta, 1979, 578, 281 - 289). 상기 HA-매트릭스는 동일한 원으로부터의 연골 히알루로네이트 결합 단백질 또는 프로테오글리칸 단백질-케라틴 설페이트 코어(Christner J.E., Anal. Biochem., 1978, 90, 22 - 32)의 정제에 사용되었다. 이러한 친화성 매트릭스로 정제된 HA-결합 단백질(HABP)은 조직 중 히알루로네이트 수용체(Green S. J. et al., J. Cell Science, 1988, 89, 145 - 156; Chan F. L. et al., J. Cell.Biol., 1997, 107, 289 - 301) 또는 히알루로난(Waldenstroem A. et al., 1991, J. Clin. Invest., 88, 1622 - 1628; Waldenstroem A. et al., Eur. J. Clin. Invest., 1993, 23, 277 - 282)의 분포에 관한 조직화학적 연구에도 사용되었다.
그러나, 본 실험실에서 개발된 상기 겔의 제조 방법은, 정확히 한정된 HA-단편(1 내지 15 mg/ml) 농도의 겔을 제조할 수 있게 한다. 차례로, 이는 상기 겔을 히알루로난-결합 단백질의 정제 뿐 아니라 그들의 히알루로난에 대한 다른 친화성을 이용함으로써 그들의 분리용으로도 사용할 수 있도록 한다. 이러한 선택적인 분리는 상이한 길이의 HA-단편을 사용함으로써 제어될 수 있다. 상기 분리는 생물학적 연관성(예를 들어 종양학적인)의 다수의 수용체의 더 나은 특징화를 가능하게 할 것이다.
기재된 방법에 따라 제조된 HA- 매트리스는 하기에 적용될 수 있다:
1) 공지된 HA-결합 단백질의 정제
2) 비공지된 HA-결합 단백질의 정제
3) 신규한 HA-결합 단백질의 규명
4) 히알루로니다아제의 정제
본 발명에서 기재된 방법에 의해 수득되는 HA-단편은 현대적인 분석 방법(NMR, MALDI-MS)을 사용하여 특징화될 수 있으며, 단백질-단백질 상호작용에 관한 연구에 적용될 수 있다. 더욱이, 상기 단편은 혈관형성 및 혈관신생 과정에 관한 연구에 사용될 수 있다.
도 1: 단백질 표준 물질, 마닐라아제 샘플(디올-리크로스퍼 크로마토그래피 후)의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE-CBB 염색)
1-광범위한 단백질 표준 물질
2-마닐라아제, 4㎍
3-오르겔라아제, 6㎍
4-헤모글로빈, 40㎍
도 2: HA 친화 크로마토그래피 후의 4 개의 마닐라아제-활성 샘플(라인 3 - 6)의 a) SDS-PAGE(CBB 염색) 및
b) SDS-PAGE-웨스턴 블럿. 토끼 P3-2A 폴리클로날 항-펩티드 항체가 이 실험에서 사용되었다.
도 3: 하기 샘플의 SDS-PAGE(CBB):
1- LW-MM-저분자량 마커(BioRad)
2- 마닐라아제
3- N-글리코시다아제 F(PNGase F)
4- PNGase F 처리 후의 마닐라아제
5- O-글리코시다아제 처리 후의 마닐라아제
6- O-글리코시다아제 및 뉴라미니다아제 처리 후의 마닐라아제
7- O-글리코시다아제 및 뉴라미니다아제
8- 분자량 마커(MWM-예비 염색된 BioRad)
도 4: 하기의 역상 크로마토그래피:
a) 리보뉴클리아제 표준 물질
b) 마닐라아제 샘플(특이적 활성 140 kU/mg)
도 5: 마닐라아제(--) 및 소 고환 히알루로니다아제(--)의 히알루로니다아제 활성에 대한 헤파린의 영향
X-축: IU 헤파린; Y-축: 잔류하는 %활성
도 6: 완충액 및 혈청 중 히알루로니다아제의 안정성 측정
(a) 마닐라아제(4℃), (b) 마닐라아제(-20℃)
(c) 마닐라아제(37℃),
(d) 소 고환 히알루로니다아제(Y) 및 히루도 메디시날리스히알루로니다아제(A)
X-축: 인큐베이션 일 수; Y-축: WHO(IU) 단위
도 7: 본 발명에 따라 히루디나리아 마닐렌시스로부터 분리 및 정제된 단백질의 서열 분석으로 수득된 천연 마닐라아제의 아미노산 서열(서열 번호 1 에 상응)
도 8: 재조합 마닐라아제 클론(클론 21)의 뉴클레오티드(윗선) 및 아미노산 서열;(서열 번호 2, 3 에 상응)
도 9: 재조합 마닐라아제 클론(클론 31)의 뉴클레오티드(윗선) 및 아미노산 서열;(서열 번호 4, 5 에 상응)
도 10: 재조합 마닐라아제 클론(클론 31)의 뉴클레오티드(윗선) 및 아미노산 서열;(서열 번호 6, 7 에 상응)
도 11: 마닐라아제용 E. coli 발현 벡터
도 12: 마닐라아제용 바큘로(Baculo) 공여 플라스미드
도 13: 마닐라아제용 효모 발현 벡터
본 발명은 하기 실시예에 의해 상세히 설명된다. 그러나 하기 실시예는, 실험에 사용되고 실시예에서 나타낸 일반적인 재료, 방법, 물리적 파라미터, 화합물, 생물학적 재료, 발현 벡터 및 숙주 등으로 본 발명을 제한하지 않는다. 언급하지 않은 경우에도, 당 분야에 공지된 표준 기술 및 일반적으로 사용가능한 재료가 사용되었다.
실시예 1(일반적인 설명):
정제 과정을 설정하기 위해 히루디나리아 마닐렌시스의 조추출물을 사용해 다수의 준비 실험을 수행했다. 하기 방법이 선택 및 검증되었다: 암모늄 설페이트 침전 과정, 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피, 헤파린-프락토겔 및 Con A-세파로스를 이용한 친화 크로마토그래피, 옥틸-세파로스, 프로필-페닐-, 부틸-프락토겔 상의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 준비 등전압 포커싱 및 준비 전기영동. 결과는 산 및 암모늄 침전, 양이온 교환, Con A-세파로스, 프로필-프락토겔 HIC 및 디올-리크로스퍼 및 히알루론산 단편-세파로스(HA-세파로스) 크로마토그래피가 마닐라아제의 정제에 적합함을 보여준다. 본 연구실에서 제조된 HA-세파로스 매트릭스는 상기 글리코시다아제의 정제에 성공적으로 사용되었다. 다른 언급이 없을 경우 모든 제조는 저온 조건에서 수행되었다. 정제는 상기(표 1)에 나타낸 과정에 따라 수행되었다.
실시예 2: 정제를 위한 개시 물질의 제조; 거머리 머리의 준비
방글라데시에서 수집한 히루디나리아 마닐렌시스 거머리를 즉시 급냉시켜 -40 내지 -80℃에서 보관했다. 거머리의 머리를 냉동 상태에서 잘랐으며, 머리의 무게는 체중의 약 5 % 였다.
실시예 3: 거머리 머리로부터의 마닐라아제의 추출 과정
대표적인 정제에서, 1 kg의 냉동 거머리 머리를, 0.025% 티메로잘 및 17 mg/ml의 트레할로스(Merck KGaA, 상품 번호 1.08216)를 함유하는 0.1 M 의 냉 아세트산 완충액 pH 4.0 2500 ml과 함께 Waring Blender 에서 균질화했다. 균질화물을 살며시 교반하여 하기 프로테아제 저해제를 곧바로 첨가했다:
1. PMSF 1.7 mg/ml 10.0 mM
2. 류펩틴 (Leupeptin) 10.0 ㎍/㎖ 20.0 μM
3. 펩스타틴 A (Pepstatin A) 0.7 ㎍/㎖ 1 μM
4. EGTA 380.35 ㎍/㎖ 1.0 mM
5. p-APMSF 40.0 ㎍/㎖ 20.0 μM
교반을 냉 조건에서 4 시간 동안 지속하고, 4900 rpm 에서 20 분 동안 원심분리했다. 상층 용액(상층액 I) 을 수집하고, 이어서 조직 펠렛을 추출함으로써 수득되는 상층액 II 와 합했다. 합한 상층액을 단계 I 물질로 나타낸다.
과정을 하기 과정에 요약했다:
* 샘플의 활성 측정 및 생화학적 특징화는 활성 측정-탁도 감소 테스트 및 단백질 함량 측정(E280, Pierce BCA 방법, SDS-PAGE)로 수행되었다. 거머리 균질화물에서의 효소 활성 측정은, 헤모글로빈(헤모글로빈 측정 키트로 측정, Merck KGaA, 13851) 및 다른 단백질의 매우 높은 함량 때문에 불가능했다. 더욱이, 히알루로니다아제 활성은 산 침전 전 단계에서는 측정될 수 없다. 상기 추출물의 최종 특이적 활성(단백질의 mg 당 활성)은 약 10-30 WHO 단위였다. SDS-PAGE 에 따르면, 조 추출물은 다량의 다른 단백질을 함유했으며, 주요한 것은 분자량이 ∼120, 55 - 60, 45, 31, 28, 22, 15 및 14 - 10 이었다.
실시예 4:- 단계 I 물질의 암모늄 설페이트 침전 과정
이어서, 암모늄 설페이트 침전 과정이 마닐라아제 정제의 첫 번째 단계로서 선택되었으며, 상기 효소의 ∼5 배 농축물이 생성되었다.
효소적으로 불활성인 물질을 고체 암모늄 설페이트(Merck KGaA)를 +4℃에서 36%(w/v)로 천천히 첨가함으로써 단계 I 조 추출물로부터 침전시켰다. 혼합물을 1 시간 동안 교반하고 원심분리했다. 침전물을 제거했다. 상층액을 흐르는 탈이온수로 밤새 투석한 후, 24 시간 동안 pH 6.0의 20 mM 포스페이트 완충액에 대해 투석했다. 상기 추출물의 최종 특이적 활성은 약 40 - 150 WHO 단위였다. SDS-PAGE 에 따르면, 단계 II 추출물은 다량의 다른 단백질을 함유한다.
실시예 5: - 양이온 교환 크로마토그래피
양이온 교환기는 뱃치 흡착 모드에서 사용되었다. 효소-풍부 투석 샘플(단계 II) 을 밤새 1 ℓ 프락토겔 EMD SO3 -650(S) 양이온 교환기, Merck KGaA, 상품 번호 16882 와 인큐베이션했다. 원심분리로 인큐베이션을 종결한 후, 양이온 교환기를 완충액으로 세척하고, 다시 원심분리하여 HPLC-Superformance 칼럼에 겔을 채웠다. 칼럼을 20 mM 포스페이트 완충액 pH 4.9 으로 세척한 후, 0 내지 1 M 의 선형 농도구배의 NaCl을 함유하는 동일한 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.0)을 사용하여 결합된 단백질을 칼럼으로부터 용출했다. 분획을 매 3 분마다 수집하여(9 ml) 280 nm 에서의 흡광도를 모니터했다. 마닐라아제는 0.15 내지 0.18 M 의 NaCl 농도에서 용출되었다. 모든 분획의 활성 및 단백질 함량을 측정하여, 분획을 합하고(pool), 나트륨 아지드 및 17 mg/ml 의 트레할로오스를 함유하는 pH 6.0 의 20 mM 포스페이트 완충액에 대해 밤새 투석했다.
단백질의 농도, "풀(pool)" 의 특이적 활성 측정 및 SDS-PAGE 분석을 수행했다. 매우 우수한 수율(활성) 및 높은 특이적 활성(단백질 mg 당 WHO 활성, IU 에 상응)에도 불구하고, 다수의 단백질의 혼합물이 샘플의 SDS-PAGE 분석의 결과에 의해 여전히 나타났다. 프락토겔 EMD SO3-650(S)(Merck KGaA, Germany)를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피로 ∼10 내지 50 의 매우 높은 정제 계수를 수득했다. 상기 단계는 헤모글로빈 불순물을 제거하는데 매우 효과적이다. 더욱이, 뱃치 과정은 다량의 단계 II 상층액(5 - 16 ℓ)을 다루기 위한 매우 유용한 초기 단계임을 발견했다.
실시예 6:-Con A-세파로스 친화 크로마토그래피
양이온 교환기 이후, 효소-풍부 풀(pool)의 추가 정제는 Con A 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 수행되었다. Pharmacia Biotech사제의 상품 번호 17-0440-01 의 시판용 Con A-Sepharose를 아세트산 완충액 0.1 M + 0.5 M NaCl pH 8.0; 0.1 M 붕산 + 0.1% Triton ×100 pH 6.0 및 최종적으로는 0.1 M 아세트산 완충액 + 0.5 M NaCl pH 6.0 으로 세척했다. 샘플을 20 mM 아세트 완충액 + 0.5 mM NaCl + 1 mM CaCl2+ 1 mM MgCl2pH 6.0 + 1 mM MnCl2에 대해 밤새 투석하고, 실온에서 100.0 ml Con A 칼럼에 적용하여 2 시간 동안 510 ml 의 100 mM 아세트산 완충액 + 0.5 M NaCl + 1 mM CaCl2+ 1 mM MgCl2pH 6.0 + 1 mM MnCl2로 용출했다.
이어서, 상기를 0.5 M 메틸-α-D-만노피라노시드를 함유하는 동일한 완충액을 이용해 탈착했다. 용출을 280 nm 에서 지속적으로 모니터했다. 수집된 3 ml 분획을 히알루로니다아제 활성에 대해 검정했다. 활성 분획을 모아서, 나트륨 아지드 및 17 mg/ml 트레할로오스를 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액 pH 6.0 에 대해 밤새 투석했다. 단백질의 농도의 측정, "풀(pool)"의 특이적 활성 및 SDS-PAGE 분석을 수행했다. 이 단계는 나머지 헤모글로빈의 제거에 매우 효과적이었다. Con A 크로마토그래피로 4 - 10 정제 계수를 수득했다. 이 계수는 개시 물질의 품질에 따라 달랐다.
실시예 7: -프로필 프락토겔 소수성 상호작용 크로마토그래피
히알루로니다아제 활성 Con A-풀에 최종 농도 2 M 으로 암모늄 설페이트를 첨가했다. 이어서, 샘플을 150 ml의 프로필-프락토겔 EMD 프로필 650 (S), Merck KGaA, 독일, 상품 번호 1.10085 와 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 2 M 암모늄 설페이트를 함유하는 0.1 M 포스페이트 완충액 pH 7.0 으로 평형화하였다. 인큐베이션을 종결한 후, 겔을 동일한 완충액으로 2 번 세척하고, HPLC-Superformance(2.6㎝ ×60㎝) 칼럼을 제조했다. 결합된 단백질을 0.1 M 포스페이트 완충액 pH 7.0 으로 용출했다. 6 ml 분획을 3 분 마다 수집하여 곧바로 탈이온수에 대해 투석(2 - 3 시간)한 후, 20 mM 포스페이트 완충액 pH 6.0 에 대해 투석했다. 분획을 히알루로니다아제 활성에 대해 분석했다. 활성 분획을 합하고, 나트륨 아지드 및 17 mh/ml 트레할로오스를 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액 pH 6.0 에 대해 밤새 투석했다. 풀의 단백질 및 활성 측정을 수행했다.
이 크로마토그래피 단계에서의 정제 계수는 약 3 - 5 이다. 선행 단계 중의 담체 겔로부터 방출된 소량의 Con A는 다른 단백질 불순물과 함께 제거되었다.
실시예 8:-히알루론산 올리고당 친화 칼럼의 제조
(a) 소 고환 히알루로니다아제를 사용한 히알루로난(HA)의 가수분해
히알루론산 7 g 을 0.15 NaCl 및 0.5 mM EDTA, 를 함유하는 1.25 ℓ의 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액 pH 5.2 에 톨루엔의 존재 하에 4℃에서 밤새 혼합하여 용해시킨다. 이후 HA를 함유하는 용액의 pH를 5.2 로 맞추고, 37℃까지 승온한 뒤 소 고환 히알루로니다아제(Merck KGaA; 700 WHO 단위/mg)를 첨가했다. 7 g의 HA 에 대해, 사용 직전에 50 ml 의 상기 완충액에 용해된 210 mg 의 효소를 사용했다. 가수분해를 일정한 교반과 함께 37℃에서 30 분 동안 진행시켰으며, 비등 수조에서 100℃로 5 분 동안 가열함으로써 종결했다. 반응 혼합물을 30 분 동안 10,000 g의 원심분리를 통해 정화시켰으며, 변형된 단백질을 함유하는 침전물을 제거하고, 상층액을 유리 섬유 예비 필터가 있는 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다. HA 올리고당(HAOS) 을 함유하는 정화된 용액을, 서로 다른 분자량 차단 값의 tree Diaflo 한외여과 막 (Amicon)을 통한 여과로써 분획화했다.
(b) 한외여과에 의한 HAOS 의 분획화
선행 단계로부터의 HAOS-함유 용액을 30 YM Diaflo 한외여과 막을 통해 여과시켰다. 잔류물은 다른 연구를 위해서 보유하고, 여과물은 10 YM Diaflo 한외여과 막을 통한 두 번째 여과에 적용시켰다. 다시, 잔류물은 다른 연구를 위해서 보유하고, 10 YM 를 통과한 용액을 마지막으로 3 YM Diaflo 막을 통한 한외여과에적용시켰다. 이후, HA-OS 를 함유하는 잔류물인 약 10 ml의 용액을 추가적인 정제에 사용했다. 이 분획: HAOS 3 - 10 을 하기와 같이 정제하고, 세파로스에의 커플링에 사용했다.
(c) HAOS 3 - 10 의 정제
HA-OS 3 - 10 을 Biogel P2칼럼 상에서 정제(탈염화)했다. 이 칼럼 (4 ㎝ ×100㎝)에 Biogel 2 medium, 200 - 400 메쉬(BioRad)를 충진시키고 칼럼 부피 5 배의 물(Milli Q, Millipore)로 세척했다. 선행 단계로부터 수득한 HAOS 3 - 10 분획(15 ml; 1.5 g의 올리고당)을 이 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 물로 용출하고, 15 ml 분획을 수집하여 HA 올리고당의 존재에 대해 분석했다. 염 전에 용출된 올리고당 함유 분획(염은 AgNO3로 검출됨)을 조합하여 3 YM Diaflo 막 상에서 다시 농축했다.
(d) HAOS 3 - 10 의 분석
세파로스의 커플링 효율을 결정하기 위해, 겔(동일한 뱃치)을 세척하고 물에 현탁시켜 50% 슬러리를 제조했다. 대조군으로 사용되는 세파로스 및 세파로스-HAOS 3 - 10 콘쥬게이트의 현탁액으로부터 100 ㎕의 분취물을 3 번 제거하여, 테플론 스크류 마개 튜브에서 2.5 ml의 2.2 N 트리플루오로아세트산(TFA, Merck KgaA) 에 첨가했다. 가수분해를 위해서, 혼합물을 아르곤으로 플러쉬하여 100℃에서 16 시간 동안 인큐베이션했다. 가수분해 종결 후, 샘플을 질소 하에 건조하고, 물에 재현탁시켜서, 글루코사민 및 우론산의 측정에 사용했다. 각 가수분해에서의 우론산 및 글루코사민 분해 정도를 측정하기 위해, 기지량의 UA 또는 GlcNAc를 함유하는 대조군 샘플을 포함시켜 동일한 조건 하에 인큐베이션시켰다. 상기 기재된 조건 하 5, 8, 9, 11 및 15 mg의 HAOS 3 - 10 을, 두 개의 독립적인 실험에서 배출된 세파로스 겔 1 mL 당 커플링시켰다. 이 결과는 UA 및 글루코사민 분석에 기초한다.
(e) 사용된 분석
분석된 샘플 중의 요산 함량은 문헌[Bitter T. and Muir H.M., Anal. Biochem., 1962, 4, 330 - 334]에 따라 측정했다. 헥소사민의 양은 문헌[Rondle C.J.M and Morgan W.T.J., Biochem. J., 1955, 61, 586 - 593]의 방법으로 분석했다.
실시예 9: 히알루론산 단편들의 세파로스 크로마토그래피(HA-세파로스 크로마토그래피)
8 내지 10 mg/ml 을 함유하는 크로마토그래피 매트릭스를 지시대로 제조했다. 샘플 효소를 20 mM 아세트 완충액 + 0.15 M NaCl pH 4.0 에 대해 투석하고, 25 ml HA-세파로스 칼럼에 적용시켰다. 동일한 완충액으로 세척한 후, 0.15 내지 1 M 의 농도구배의 NaCl 과 함께 20 mM 아세트 완충액으로 용출했다.
1 ml 분획을 히알루로니다아제-활성 측정 테스트에서 시험하고, 합쳐서 밤새 나트륨 아지드 및 17 mg/ml 트레할로오스를 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액 pH 6.0 에 대해 투석했다. 풀의 단백질 및 활성 측정을 실행했다. 이 크로마토그래피 단계의 정제 계수는 약 3 이었다.
실시예 10: 디올-리크로스퍼(Diol-LiChrospher) 크로마토그래피
Milli-Q-H2O 에 대해 투석한 20 ml 활성 샘플을 디올-리크로스퍼 칼럼에 적용했다. 이어서 칼럼을 15 ml Milli-Q-H2O 로 평형화시키고 2 ml의 물로 5 분 동안 세척했다. 활성 샘플의 용출은 20 mM 아세트산 완충액 pH 5.9(0 - 5 mM 농도 구배의 NaCl)로 15 분 동안, 5 mM NaCl 을 함유하는 20 mM - 100 mM 의 농도 구배의 아세트 완충액 pH 5.5 로 35 분 동안 실시하였다. 분획을 히알루로니다아제 활성에 대해 분석했다. 활성 분획을 합치고, 밤새 나트륨 아지드 및 17 mg/ml 트레할로오스를 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액 pH 6.0 로 투석했다. 풀의 단백질 및 활성 측정을 수행했다. 정제 계수: 3.
실시예 11: RP 18e 크로마토그래피
이 정제 단계는 가장 마지막 단계로서만 사용될 수 있으며, 염 및 다른 단백질 불순물(예를 들어, 펩티드 프로테아제 저해제)가 없는 샘플을 수득하는 것을 목적으로 한다. 마닐라아제가 이 단계에서 사용되는 유기 용매에 대한 내성이 없으므로, 히알루로니다아제 활성은 완전히 잃었다. 마닐라아제 샘플을 RP 18e 칼럼에 적용시켰다. 0.25 ml/분 분획을 수집했다. 0.1% TFA 의 존재 하에 용출했으며, 물에서 99% 아세토니트릴 까지의 농도 구배를 사용하였다. RP-정제 샘플은 아미노산 서열분석, MALDI 측정, 탄수화물 구조 분석을 위해서, 그리고 마닐라아제의 다른 뱃치의 정제를 위한 표준 물질로서 직접 사용될 수 있다.
실시예 12: 활성 측정-탁도 감소 테스트
히알루로니다아제 활성 측정은 탁도 감소 측정으로 했다. 히알루로난(다른 동물 조직 및 체액으로부터 분리한 것, 예를 들어 인간 제대, 수탉 계관) 및 히알루로니다아제(소 고환, 돼지 고환, 벌독 유래의 엔도-β-글루코사미니다아제; 스트렙토마이시스 히알루로리티쿠스(Streptomyces hyalurolyticus)로부터의 라이아제)의 시판용 제제를 적합한 활성 분석 조건을 수립하는데 사용했다. 히루도 메디시날리스 유래의 엔도-β-글루쿠로니다아제는 본 연구실에서 부분적으로 정제했다.
히알루로난 원액 용액(농도 2 mg/ml)은 HA를 0.3 M 포스페이트 완충액 pH 5.3 중에 용해시킴으로써 제조했다. 이 용액을 동일한 완충액으로 테스트 직전에 0.2 mg/ml 의 농도로 희석했다. 효소-함유 샘플을, 0.01% 소 알부민 및 77 mM NaCl을 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액(효소 희석 완충액)과 함께 적당한 양의 효소(0.5 내지 5 WHO 단위)로 희석시켰다. 이 샘플 0.1 ml에, 0.1 ml 히알루로난(0.2 mg/ml)의 용액을 첨가하고 혼합하여, 45 분 동안 37℃에 인큐베이션했다. 테스트를 2중으로 했다. 반응을 1.0 ml의 알부민 시약(80 mM 아세트산/40 mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 3.75 중에 용해된 알부민 0.1%)으로 희석함으로써 정지시켰다. RT 또는 37℃ 에서의 10 분 인큐베이션 후, 600 nm 에서의 광학적 밀도를 판독하고, 활성을 표준 물질과 비교(SLT-프로그램)함으로써 WHO(IU) 단위로 나타냈다. 소 고환 히알루로니다아제의 WHO 제제[Humphrey J.H., Bull. World Health Org. 1957, 16, 291-294)를 표준 물질로서 사용했다.
실시예 13: 단백질 평가
칼럼 용출물의 단백질 함량을 280 nm 에서의 용액의 자외선 흡수를 측정함으로써 결정했다. 합친 분획의 단백질 농도는 피어스 마이크로법(Pierce micromethod)으로 결정했다. BSA 용액을 참고 단백질로서 사용했다.
실시예 14: SDS-PAGE 전기영동
전기영동을 Laemmli 과정[Nature, 1970, 227, 680 - 685)에 따라 했다. 하기 겔을 사용했다: 4 내지 20%의 농도구배 또는 12.5%의 분리용 겔 및 4% 스태킹 겔. 샘플을 나트륨 도데실 설페이트 및 β-메르캅토에탄올의 존재 하에 전기영동시켰다. 단백질을 쿠마씨 브릴란트 블루 및/또는 실버 염색으로(Pharmacia 지시에 따라) 염색한 후 가시화하였다.
실시예 15: 등전점 포커싱
마닐라아제 제조 상의 등전점 포커싱 연구를 위해, 공급자(Pharmacia)에 의해 제공된 프로토콜을 채택했다. 포커싱에 이어서, 겔을 고정하여 실버 염색하였다(Pharmacia 프로토콜에 따름).
실시예16: 토끼의 면역 혈청으로부터의 면역글로불린의 제조(항-ConA, 항-헤모글로빈 및 항-펩티드 토끼 항체)
토끼의 혈청을 하기 면역원을 사용하여 구했다:
콘카나발린 A 렉틴, 펩티드-KLH 콘쥬게이트의 혼합물 및 헤모글로빈. 펩티드 서열은 마닐라아제의 N-말단 부분의 14 아미노산의 것과 동일했다 (KEIAVTIDDKNVIA).
혈청을 표준 Pharmacia 지시에 따라 단백질 A 세파로스(Pharmacia, 17-0780-01) 상에서 정제했다. IgG 샘플의 순도는 SDS-PAGE 및 ELISA-테스트로 체크하였다.
실시예 17: 웨스턴-이뮤노블럿 검정
적합한 분취량의 샘플 및 공지된 분자량의 예비염색된 단백질 마커를 상기에 기재한 바와 같이 SDS-PAGE 에 적용했다. 예비염색된 BioRad 분자량 마커를 사용했다. 단백질은 전이 완충액의 존재 하에 폴리아크릴아미드 겔(0.8 mA/cm2) 로부터 고정된 폴리비닐디플루오라이드(PVDF) 막으로 10 분 동안 전기영동적으로 이동되었다. PVDF 막을 블록킹 용액(PBS, pH 7.5 + 2% 탈지 우유)과 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 막을 항체와 함께 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 적절하게 블로킹 용액으로 희석했다. 막을 TBS + 0.05% Tween 20, pH 7.5 로 세척하고, 실온에서 2 시간 동안 BioRad의 염소 항-토끼 알칼리성 포스페이트 콘쥬게이트(2차 항체)와 함께 인큐베이션했다. 막을 TBS + Tween 20 로 두 번 세척하고 10 분 동안 BCIP 알칼리성 포스파타아제 기질 용액과 인큐베이션했다. 정지 완충액을 첨가하여 반응을 종결했다.
실시예 18: 아미노산 서열 분석
마닐라아제의 N-말단 33 아미노산의 서열을 Edman 분해에 의해 수득했다. 마닐라아제-활성 샘플의 SDS-PAGE 후, 밴드를 PDVF 막 상에 옮기고, 쿠마씨 블루로 염색하여 잘라서 서열분석했다. 동일한 아미노산 서열을, RP-칼럼 크로마토그래피를 이용한 마지막 정제 후 수득한 샘플에서도 발견했다.
실시예 19: 효소 활성의 pH 의존성
(히루디나리아 마닐렌시스 및 히루도 메디시날리스 거머리 머리로부터 분리한 히알루로니다아제에 대해서)
이 실험에서 사용된 히알루로니다아제의 샘플은 히루디나리아 마닐렌시스 또는 히루도 메디시날리스 거머리 머리로부터 추출한 것으로, 암모늄 설페이트 침전 및 양이온 교환 크로마토그래피로 부분적으로 정제했다. 500 WHO 단위/ml을 함유하는 각 샘플을, pH 2.6 내지 9.0 의 범위(pH 2.6 내지 5 에서는 20 mM 아세트산; pH 5 내지 9 에서는 20 mM 포스페이트)에서 20℃, +4℃ 및 37℃에서 인큐베이션했다. 1, 2 및 7 일 인큐베이션 기간 후 효소 활성을 측정했다. pH 의 산성 및 염기성 극값에서는, 양쪽 모두의 히알루로니다아제에 대해 동일 정도의 활성의 저해가 관찰되었다. 그러나, 더 긴 인큐베이션 기간 동안에는, 마닐라아제가 히루도 메디시날리스 히알루로니다아제보다 더 안정했다: 예를 들어 pH 7.0 에서, +4℃ 및 37℃에서의 인큐베이션 7 일 후, 마닐라아제는 각각 개시 활성의 75% 및 60%가 잔류했다. 동일 조건에서 인큐베이션한 히루도 메디시날리스 히알루로니다아제는 1 일 후 이미 불활성이었다.
실시예 20: 개 혈청의 존재 하에 히알루로니다아제의 안정성 측정 (히루디나리아 마닐렌시스 및 히루도 메디시날리스 거머리 머리로부터 분리한 히알루로니다아제에 대해서)
마닐라아제, 히루도 메디시날리스 및 소 고환 히알루로니다아제의 5 kU/ml 샘플을 개 또는 래트의 시트레이트 혈장으로 250 U/ml 의 최종 농도로 희석했다. 이어서, 이 용액들을 -20℃, +4℃ 및 37℃ 에서 0 내지 7 일 동안 인큐베이션했다.완충액 중 희석된 동일한 히알루로니다아제를 함유하는 대조군 용액은 이 실험에 포함되었다. 최종적으로, 히알루로니다아제 활성을 측정했다.
실시예 21: 효소 활성의 오염
거머리 히알루로니다아제를 위한 정제 과정의 각 단계에서, 다목적 프로테아제 기질(Boeringer Mannheim, 상품 번호 1080 733)을 이용해 Twining S.S.(Anal. Biochem., 1984, 143, 30-34)에 따라 단백질을 분해할 수 있는 다른 효소에 대해 제제를 체크했다.
실시예 22: 히알루로니다아제 활성에 대한 헤파린의 영향
히알루로니다아제에 의한 히알루로난의 절단 결과 환원당이 유리되었다. 유리된 당의 양은 Park(Park J. & Johnson M.; J. Biol. Chem. 1949, 181, 149)의 변형된 방법에 의해 비색 방법으로 측정했다. 마닐라아제 및 소 고환 히알루로니다아제의 활성에 대한 헤파린의 영향을 측정하기 위해, 두 종의 활성 측정을 수행했다: 헤파린의 존재 하 및 헤파린의 미존재 하. 히알루로니다아제 샘플 25 ㎕(3.2 WHO 단위)을 30 분 동안 37℃에서, 0 내지 24 단위의 헤파린을 함유하는 25㎕의 헤파린(Liquemin, Fa. Hoffmann LaRoch)용액과 인큐베이션했다. 이어서, 50 ㎕의 히알루로난(25 mg/㎕)을 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션을 30 분 동안 지속했다. 반응을 100℃에서 2 분 동안 가열함으로써 종결시켰다. 이어서, 100 ㎕의 카르보네이트-시아나이드 용액 및 100 ㎕의 칼륨 페리시아나이드 용액을 비활성화 절단물에 첨가했다. 샘플을 비등 수조에서 15 분 동안 가열한 후, 얼음 조에서 냉각시켰다. 이후에, 0.75 ㎕의 황산암모늄 제 2 철 용액을 반응 혼합물에 첨가했다. RT 에서의 15 분 인큐베이션 후, Shimadzu 분광계에서 690 nm에서의 발색을 측정했다. 적합한 블랭크 및 무효소 대조군을 각 분석에 포함시켰다. 분석 하의 샘플의 유형에 대한 예상했던 환원당(글루쿠론산 또는 N-아세틸-글루코사민, 1 내지 15 ㎍)을 표준 물질로서 사용했다.
실시예 23: 마닐라아제의 탈글리코실화
마닐라아제의 샘플을 공급자의 지시에 따라 PNGase F 효소(BioLabs, 상품 번호 701 L)로 탈글리코실화했다. 탈글리코실화는 변성 및 천연 조건 하에서 했다. O-글리카나아제, 뉴라미니다아제 및 뉴라미니다아제 + O-글리카나아제 처리를, Boehringer Mannheim 표준 처방에 따라 했다. 모든 샘플은 SDS-PAGE 및 활성 측정 테스트로 특징화했다.
실시예 24: E.coli 발현 벡터(도 11)의 구축
E. coli 에서의 발현을 위해, tet 프로모터 영역을 가진 플라스미드 pASK75{Skerra, Gene 151, (1994), 131 - 135}의 변형된 버전을 사용했다. XbaI 및 HindIII 사이에 신규한 링커를 클로닝함으로써 변형을 실시하였다. 신규한 링커는 ompA 리더 서열, 또다른 다중 클로닝 부위 및 strep-tag 대신에 6xHis-tag 를 포함한다.
pASK75 중에 클로닝된 링커서열.
마닐라아제를 위한 발현 벡터를 구축하기 위해, PCR 방법으로 5' ClaI 및 3' Eco47III 제한효소 부위를 도입해야 했다. 따라서 하기 두 개의 프라이머가 사용되었다:
PCR 생성물을 먼저 PCR II 벡터 시스템(Invitrogen)에 클로닝하여 서열분석하였다.
제 2 단계에서, 마닐라아제 유전자를 제한효소 부위 5'ClaI 및 3'Eco47III을 이용하여 변형된 pASK75 벡터에 클로닝하였다.
발현시키고, 제 2 PCR 반응에서의 이 재조합 마닐라아제의 활성을 증명한 뒤, His-tag 을 제거하고 마닐라아제 유전자의 개시 코돈을 omp A 리더 서열에 직접 융합시켰다. 이 PCR 반응을 위한 프라이머는 하기와 같았다:
실시예 25: 바큘로 공여 플라스미드(도 12)의 구축
바큘로 바이러스 발현 시스템에서의 마닐라아제의 발현을 위해서, GibcoLife Technologies 사로부터의 Bac-To-BacTMBaculovirus Expression System을 이용했다. 섹션 시스템을 구하기 위해, 꿀벌 멜리틴 리더 서열을 마닐라아제 유전자에 융합시키고, 제한효소 부위 5'BamHI 및 3'KpnI을 도입하기 위해, 하나의 단일한 PCR 반응을 수행했다.
PCR 생성물을 PCR II Vector(Invitrogen)에 클로닝하고 서열분석했다. 이어서, 멜리틴-마닐라아제 융합체를 제한효소 부위 5'BamHI 및 3'KpnI을 이용하여 pFastBac 벡터에 클로닝하였다(도 12).
실시예 26: 효모 발현 벡터(도 13)의 구축
효모에서의 발현을 위해, 피키아 멀티 카피(pichia multi copy) 발현 시스템(Invitrogen)을 이용했다. 마닐라아제를 위한 발현 벡터를 구축하기 위해, 적합한 벡터(pPIC9K)로의 라이게이션을 위한 상용성 제한효소 말단(5' EcoRI 및 3'NotI)을 생성하는 방식으로 마닐라아제 유전자의 PCR 증폭 방법을 사용했다. 따라서, 하기 프라이머가 사용되었다:
피키아 스페로플라스트(Pichia Speroplasts)를 형질전환하기 전에, 발현 벡터를 SalI 으로 선형화해야 한다.
실시예 26: E.coli 에서의 발현
omp A 리더 서열에 융합된 사라스타틴(Sarastatin)의 구조 유전자를 함유하는 발현 벡터 pRG72를, W3110 감응세포(competent cell)로 형질전환했다. 세포를 미드-로그 상까지 배양한 후, 200 ㎍ aTC/l을 첨가함으로써 프로모터를 유도했다. 1 시간 후 재조합 마닐라아제가 명확하게 검출될 수 있었다.
실시예 27: 재조합 바큘로바이러스 및 마닐라아제의 생성
Bac-To-Bac발현 시스템의 발현
공여 플라스미드 pTD13 을 mini-attTn7 표적 부위가 있는 박시미드(bacmid) 및 헬퍼 플라스미드를 함유하는 DH10Bac 감응세포로 형질전환시켰다. 공여 플라스미드 상의 mini-Tn7 성분은 헬퍼 플라스미드에 의해 제공되는 전위 단백질의 존재 하에 박시미드 상의 mini-attTn7 표적 부위로 전위될 수 있다. 재조합 박시미드를 함유하는 콜로니들은 lacZ 유전자의 파괴에 의해 동정되었다. 재조합 박시미드를 함유하는 선택된 E. coli 클론으로부터 고분자량의 mini-prep DNA를 제조하여, 이 DNA를 곤충 세포를 형질감염시키는데 사용했다.
상세한 설명은 발현 키트의 지시 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
실시예 28: 효모에서의 발현
마닐라아제 유전자가 통합된 것을 확인하기 위해서는, 콜로니를 His+Mut+-돌연변이에 대해 스크린해야 한다.
단일 콜로니를 사용하여 1 ℓ 플라스크 중 100 ml 배지에 접종한다. 배양 조건: 28 - 30℃, 250 rpm, OD 2 - 6 까지. 발현을 유도하기 위해서, 우선 배양액을 원심분리하여 상층액을 제거하고, 원래 배양 부피의 1/5 을 사용하여 새로운 배지 중에 세포 펠렛을 재현탁한다. 매 24 시간마다 100% 메탄올을 첨가하여 최종 농도가 0.5%가 되도록 하여, 유도하는 것을 유지한다. 최대 6 일 후, 상층액을 SDS-PAGE 및 활성 검정으로 분석한다.
Claims (20)
- 글리코실화에 따라 53 - 60 의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하며, 활성이 헤파린에 의해 영향받지 않는 히알루로니다아제의 생물학적 활성을 가진, 히루디나리아 마닐렌시스(Hirudinaria manillensis) 종의 거머리로부터 분리한 정제된 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 분자량이 58(±2)인 것을 특징으로 하는 글리코실화 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 분자량이 54(±2)인 것을 특징으로 하는 비-글리코실화된 단백질.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 등전점이 7.2 - 8.0 인 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 도 7 및 서열 번호 1 에서 주어진 아미노산 서열을 가진 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 효소 활성이 >100kU/ 단백질mg 인 것을 특징으로 하는 단백질.
- 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에서 정의된 단백질을 분리 및 정제하는 방법:(i) 히루디나리아 마닐렌시스 종의 거머리 머리를 산 완충액과 함께 균질화하고 원심분리하는 단계,(ii) 단계 (i) 의 상층액의 암모늄 설페이트 침전 단계,(iii) 양이온 교환 크로마토그래피 단계,(iv) Con A (콘카나발린 A) 친화 크로마토그래피 단계,(v) 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계,(vi) 히알루론산 단편으로 코팅된 매트릭스 상에서의 친화 크로마토그래피 단계,(vii) 겔 투과 크로마토그래피 단계,및 선택적으로는(viii) 정제된 단백질의 효소적 또는 화학적 탈-글리코실화 단계.
- 글리코실화에 따라 53 - 60 의 분자량을 가지며, 헤파린에 의해 활성이 영향받지 않는 히알루로니다아제의 생물학적 활성을 가진, 제 7 항에 따른 방법 단계로 수득가능한 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제 8 항에 있어서, 특이 효소 활성이 >100 kU/단백질 mg 인 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 또는 제 9 항의 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
- 도 8(서열 번호 2), 도 9(서열 번호 4) 및 도 10(서열 번호 6)으로 도시된 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 8 항의 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
- 제 11 항의 임의의 DNA 서열에 의해 코딩되는, 히알루로니다아제의 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 도 8, 9 및 10(서열 번호 3, 5, 7)에 도시된 임의의 아미노한 서열 또는 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 서열을 갖는, 글리코실화에 따라 55 - 59 의 분자량을 가지며, 히알루로니다아제의 생물학적 활성을 가진 재조합 단백질.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 DNA 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 14 항에 따른 벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 하는, 제 12 항 또는제 13 항에 따른 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포.
- 약제로서의, 제 1 항 내지 제 6 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 12 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 단백질.
- 제 16 항에 따른 단백질 및 이를 위한 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 약리학적으로 활성인 화합물을 추가적으로 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 약리학적으로 활성인 화합물이 헤파린인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 심근, 심혈관 및 혈전 장애 및 종양을 위한 약제의 제조에서의, 제 1 항 내지 제 6 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 12 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
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