WO2023198171A1 - 一种凝血因子x激活酶及其应用 - Google Patents

一种凝血因子x激活酶及其应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2023198171A1
WO2023198171A1 PCT/CN2023/088276 CN2023088276W WO2023198171A1 WO 2023198171 A1 WO2023198171 A1 WO 2023198171A1 CN 2023088276 W CN2023088276 W CN 2023088276W WO 2023198171 A1 WO2023198171 A1 WO 2023198171A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chromatography
coagulation factor
relative content
hour
activating enzyme
Prior art date
Application number
PCT/CN2023/088276
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
廖川
王倩倩
王龙超
赵爱娟
Original Assignee
北京三诺佳邑生物技术有限责任公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 filed Critical 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司
Publication of WO2023198171A1 publication Critical patent/WO2023198171A1/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)

Abstract

一种新的凝血因子X激活酶及包含该激活酶的药物组合物，以及其在制备止血或治疗出血性疾病的药物中的应用。还提供了一种纯化凝血因子X激活酶的方法，采用阴离子交换层析和阳离子交换层析的顺序组合，在保证产物的高纯度和高活性的同时，具有更高的收率，极大地降低了生产成本，有利于大规模的工业化生产。

Description

一种凝血因子X激活酶及其应用 技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种凝血因子X激活酶及其应用。
背景技术
人类的凝血机制是一个非常复杂而精细的过程，到现在为止，发现参与凝血的因子共有12个。其中凝血因子X是凝血系统中非常关键的成分之一。凝血因子X(coagulation factor X，FX)是一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原，其活性形式(FXa)为体内凝血酶原(prothrombin)唯一的生理性激活物，在共同凝血途径中起着关键作用。凝血因子X激活酶可以特异性地激活FX，使活性部位充分的暴露生成FXa，FXa进而与损伤部位激活的血小板、FVa以及钙离子形成凝血酶原复合物，从而增加凝血酶生成，凝血酶激活损伤部位的血小板和V、Ⅷ并通过纤维蛋白原向纤维蛋白的转换形成止血栓，达到出血患者止血的目的。在外科创面出血、内科出血性疾病、凝血系统疾病，例如血友病等方面都有潜在的巨大应用价值。
最早发现也是迄今为止活性最高的凝血因子X激活酶是从圆斑蝰蛇(Daboia russelii siamensis，英文名：Russlli’s viper)的毒液中提取发现的，这些圆斑蝰蛇凝血因子X激活酶(RVV-X)属于一种金属蛋白酶，由一条重链(α链，分子量为57600D)和两条轻链(分子量19400D的β链、分子量16400D的γ链)通过二硫键组成，重链含有催化结构域，轻链和C型凝集素同源，在凝血因子X激活剂钙依赖的活化过程中发挥调节作用。圆斑蝰蛇凝血因子X激活酶在体内的合成过程中往往会经过一系列的翻译后修饰，例如糖基化修饰，而糖基化修饰可能会对其酶活带来影响。
现有技术中已有多种方法可提取或制备圆斑蝰蛇中的凝血因子X激活酶，例如，Kisiel等将圆斑蝰蛇蛇毒经Sephadex G-150分子筛层析、QAE-Sephadex A-50阴离子层析、Sephadex G-25分子筛层析获得两种凝血因子X激活酶，在未还原条件下检测分子量分别为90000和79000的RVV-X；CN101104847A将圆斑蝰蛇蛇毒依次进行DEAE-SephadexA-50阴离子层析、透析、纤维素DEAE-32阴离子层析和凝胶过滤层析获得一种新的凝血X因子激活酶；CN1096523988A将圆斑蝰蛇蛇毒依次分子筛层析和弱阳离子层析，获得分子量分别为79KD和98KD的凝血X因子激活酶。
本发明提供了一种新的圆斑蝰蛇蛇毒凝血因子X激活酶。此外，本发明还提供了一种提取凝血因子X激活酶的方法，该方法能使得产物具有很高的纯度和活性，还显著提高了其收率，有利于大规模的工业化生产。本发明的技术方案对于止血或治疗出血性疾病具有重大意义。
发明内容
凝血因子X激活酶
在一个方面，本发明提供一种新的凝血因子X激活酶，所述凝血因子X激活酶包括α、β、γ三条多肽链，所述α链的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述β链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述γ链的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
在一些实施方式中，所述α、β、和/或γ多肽链具有糖基化修饰。
在一些实施方式中，所述α、β和/或γ多肽链氨基酸序列的至少一个氨基酸残基上共价连接至N-聚糖。
在一些实施方式中，所述氨基酸残基为天冬酰胺(Asn)残基。
所述天冬酰胺(Asn)残基选自如下中的一个或多个：
α链：Asn28，Asn69，Asn163，Asn183；
β链：Asn59；和/或
γ链：Asn24。
在一些实施方式中，所述的凝血因子X激活酶：
α链中Asn28位点上的N-聚糖包括：A2BG2S2，FA2BG2S2，F2A2BG2S2和A3BG3S3；
以及/或者，
α链中Asn69位点上的N-聚糖包括：FA2S2，A2S2，FA3G2S2，A3G2S2，A4G3S3和A3S3；
以及/或者，
α链中Asn163位点上的N-聚糖包括：FA2G2S2，A2BG2S2，FA2BG2S2，F2A2BG2S2，A3G3S3，FA3G3S3，A3BG3S3和FA3BG3S3；
以及/或者，
α链中Asn183位点上的N-聚糖包括：A2G2S1，A2G2S1M4，A2BG1S1，FA2BG1S1，A2BG2S2，FA2BG2S2和M5；
以及/或者，
β链中Asn59位点上的N-聚糖包括：A2BG2S2，FA2BG2S2，F2A2BG2S2，A3BG3S3，还进一步包括末端为半乳糖的N-聚糖，优选地，所述末端为半乳糖的N-聚糖包括：A2BG2S1，FA3G3S2等；
以及/或者，
γ链中Asn24位点上的N聚糖包括：A2BG1S1，FA2BG1S1，FA2BG2S1，A2BG2S2，FA2BG2S2，F2A2BG2S2，还进一步包括带有岩藻糖基和/或乙酰唾液酸的三天线或四天线分支型N-聚糖，优选地，所述三天线或四天线分支型N-聚糖包括FA3G3S2，FA3BG3S3， A3BG2S2，A3BG3S3等。
在一些实施方式中，所述的凝血因子X激活酶：
在α链中Asn28位点上的N-聚糖包括：
A2BG2S2，其相对含量为22-32％，优选25-30％，更进一步优选为25％、25.5％、26％、26.5％、27％、27.5％、28％、28.5％、29％、29.5％或30％；
FA2BG2S2，其相对含量为30-40％，优选34-38％，更进一步优选为34％、34.5％、35％、35.5％、36％、36.5％、37％、37.5％或38％；
F2A2BG2S2，其相对含量为18-28％，优选20-25％，更进一步优选为20％、20.5％、21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％或25％；和
A3BG3S3，其相对含量为5-10％，优选6-9％；更进一步优选为6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％或9％；
以及/或者，
α链中Asn69位点上的N-聚糖包括：
FA2S2，其相对含量为5-10％，优选6-9％，更进一步优选为6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％或9％；
A2S2，其相对含量为5-10％，优选6-8％，更进一步优选为6％、6.5％、7％、7.5％或8％；
FA3G2S2，其相对含量为7-20％，优选9-15％，更进一步优选为9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％或15％；
A3G2S2，其相对含量为20-30％，优选22-29％，更进一步优选为22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％、25％、25.5％、26％、26.5％、27％、27.5％、28％、28.5％或29％；
A4G3S3，其相对含量为10-25％，优选15-20％，更进一步优选为15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％.19.5％或20％；和
A3S3，其相对含量为15-30％，优选16-20％，更进一步优选为16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％；
以及/或者，
α链中Asn163位点上的N-聚糖包括：
FA2G2S2，其相对含量为3-8％，优选4-6％，更进一步优选为4％、4.5％、5％、5.5％或6％；
A2BG2S2，其相对含量为6-12％，优选8-10％，更进一步优选为8％、8.5％、9％、9.5％或10％；
FA2BG2S2，其相对含量为15-25％，优选19-22％，更进一步优选为19％、19.5％、20％、 20.5％、21％、21.5％或22％；
F2A2BG2S2，其相对含量为10-25％，优选15-20％，更进一步优选为15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％.19.5％或20％；
A3G3S3，其相对含量为5-10％，优选7-9％，更进一步优选为7％、7.5％、8％、8.5％或9％；
FA3G3S3，其相对含量为5-10％，优选8-9％，更进一步优选为8％、8.5％或9％；
A3BG3S3，其相对含量为5-10％，优选7-9％，更进一步优选为7％、7.5％、8％、8.5％或9％；和
FA3BG3S3，其相对含量为3-10％，优选5-8％；更进一步优选为5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％或8％；
以及/或者，
α链中Asn183位点上的N-聚糖包括：
A2G2S1，其相对含量为5-15％，优选9-10％，更进一步优选为9％、9.5％或10％；
A2G2S1M4，其相对含量为4-8％，优选5-6％，更进一步优选为5％、5.5％或6％；
A2BG1S1，其相对含量为10-17％，优选12-14％，更进一步优选为12％、12.5％、13％、13.5％或14％；
FA2BG1S1，其相对含量为5-10％，优选7-8％，更进一步优选为7％、7.5％或8％；
A2BG2S2，其相对含量为10-20％，优选14-16％，更进一步优选为14％、14.5％、15％、15.5％、16％；
FA2BG2S2，其相对含量为6-12％，优选8-10％，更进一步优选为8％、8.5％、9％、9.5％或10％；和
M5，其相对含量为3-8％，优选4-7％；更进一步优选为4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％或7％；
以及/或者，
β链中Asn59位点上的N-聚糖包括：
A2BG2S2，其相对含量为15-25％，优选19-24％，更进一步优选为19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％或24％；
FA2BG2S2，其相对含量为30-40％，优选32-34％，更进一步优选为32％、32.5％、33％、33.5％或34％；
F2A2BG2S2，其相对含量为20-30％，优选21-27％，更进一步优选为21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％、25％、25.5％、26％、26.5％或27％；
A3BG3S3，其相对含量为3-10％；优选5-7％，更进一步优选为5％、5.5％、6％、6.5％ 或7％；
末端为半乳糖的N-聚糖，其相对含量为1-5％，优选2-4％，更进一步优选为2％、2.5％、3％、3.5％或4％；
以及/或者，
γ链中Asn24位点上的N聚糖包括：
A2BG1S1，其相对含量为4-10％，优选6-8％，更进一步优选为6％、6.5％、7％、7.5％或8％；FA2BG1S1，其相对含量为20-30％，优选24-28％，更进一步优选为24％、24.5％、25％、25.5％、26％、26.5％、27％、27.5％或28％；
FA2BG2S1，其相对含量为3-8％，优选5-7％，更进一步优选为5％、5.5％、6％、6.5％或7％；
A2BG2S2，其相对含量为9-18％，优选11-14％，更进一步优选为11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％或14％；
FA2BG2S2，其相对含量为20-30％，优选25-28％，更进一步优选为25％、25.5％、26％、26.5％、27％、27.5％或28％；
F2A2BG2S2，其相对含量为4-10％，优选6-8％，更进一步优选为6％、6.5％、7％、7.5％或8％；
带有岩藻糖基和乙酰唾液酸的三天线或四天线分支型N-聚糖，其相对含量为5-12％，优选6-10％，更进一步优选为6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。
在一些实施方式中，所述N-聚糖的相对含量是指，在某个位点上含有该特定N-聚糖的凝血因子X激活酶分子的数量占凝血因子X激活酶总分子数量的百分比。
在一些实施方式中，所述凝血因子X激活酶来源于圆斑蝰蛇(Daboia russelii siamensis)。在一些具体实施方式中，所述凝血因子X激活酶是从圆斑蝰蛇的蛇毒中提取获得，或者是通过基因工程制备获得的。
另一个方面，本发明提供一种药物组合物，所述组合物包含上述的凝血因子X激活酶，以及药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可通过混合具有所需纯度的凝血因子X激活酶与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂获得。进一步地，本发明的药物组合物可制备成冻干制剂或液体制剂形式。
本发明所述的药物组合物还可以包含一种或多种治疗特定病症所必要的其它活性物质，优选具有活性互补且彼此无不良反应的物质。例如，除了凝血因子X激活酶之外，可能需要进一步包含其他可止血或促凝血的药物活性成分。这些成分以对预期目的有效的量组合存在。其它成分的有效量取决于组合物中的凝血因子X激活酶的含量、疾病或病症或治疗的类型，以及如本发明所述的其它因素。
另一个方面，本发明提供一种止血或治疗出血性疾病的方法，所述方法包括向有需要 的个体施用治疗有效量的上述的凝血因子X激活酶或上述的药物组合物。
另一个方面，本发明提供了上述的凝血因子X激活酶或包含上述凝血因子X激活酶的药物组合物在制备止血或治疗出血性疾病的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述的出血性疾病包括外科创面出血、内科出血性疾病、遗传性出血性疾病或凝血系统疾病；在一些实施方式中，所述凝血系统疾病包括血友病；在一些实施方式中，所述血友病为伴抑制物的血友病；在一些实施方式中，所述血友病为血友病A或血友病B。
本发明的凝血因子X激活酶或其药物组合物可通过多种途径施用于个体(如人类)，包括，例如静脉注射、动脉内给药、腹腔注射、肺内给药、口服给药、吸入给药、血管内给药、肌肉注射、气管内给药、皮下注射、眼内给药、鞘内给药、粘膜给药或经皮给药。
用于体内给药的凝血因子X激活酶或其药物组合物必须是无菌的。这可以通过例如应用无菌过滤膜过滤而容易地实现。
另一个方面，本发明还提供了一种制品和/或试剂盒。优选地，所述制品和/或试剂盒可以包括一种容器以及在容器上或随该容器附带的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。通常，该容器内装有能够有效止血或治疗出血性疾病的药物组合物，并且具有一个无菌端口(例如该容器可以是一个静脉输液袋或是一个具有皮下注射针头可刺穿盖子的小瓶)。药物组合物中的至少一种活性物质即为本发明所述的凝血因子X激活酶。标签或包装说明书标示了该组合物可以用于止血或治疗出血性疾病。包装说明书是指通常包含在治疗产品的商业包装内的说明书，其包含与这些治疗产品使用有关的适应症、用法、剂量、施用方式、禁忌症和/或警告信息。此外，所述制品和/试剂盒或还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲液、格林氏溶液或葡萄糖溶液。还可以包括从商业和用户角度而言所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针头和注射器。
另一个方面，本发明还提供一种分离的编码上述的凝血因子X激活酶的核酸分子。
另一个方面，本发明还提供一种包含上述的核酸分子的载体。在一些实施方式中，所述载体为DNA载体。在一些实施方式中所述载体为原核表达载体或真核表达载体。
同时还提供了可将本发明中核酸分子插入到载体中的方法。在本发明的一个实施方式中，将编码凝血因子X激活酶的天然或合成的核酸插入到合适的表达载体中，使得核酸可操作性的连接到5’和3’端调控元件，例如包括启动子和3’非翻译区(UTR)，可表达凝血因子X激活酶。所述载体可适用于在原核和/或真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆与表达载体包含调控目标核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。载体还可以包含一种或更多种选择性标记基因和其他遗传元件。合适启动子的一个示例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是一个很强的组成型启动子序列，可以驱动任何与其可操作性连接的多核苷酸序列高水平表达。合适启动子的另一个示例是延伸因 子1α(EF-1α)启动子。然而，也可以使用其它组成型启动子，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免病缺陷病毒长末端重复序列(HIV-LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，例如包括但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，诱导型启动子也是发明考虑的部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要这种表达时，能启动其与之可操作性连接的多核苷酸序列表达，当不需要时，则关闭表达。诱导型启动子包含，但不局限于，金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子等。
另一个方面，本发明还提供一种分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的凝血因子X激活酶、上述凝血因子X激活酶的核酸分子或上述的载体。在一些实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。在一些实施方式中，所述原核细胞为大肠杆菌细胞。
将核酸分子或载体导入细胞并表达的方法在本领域是已知的。通过本领域的任何方法载体可以很容易地导入宿主细胞中，例如可以通过物理、化学或生物方法。将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、基因枪法、显微注射、电穿孔法以及诸如此类。制备包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是熟知的。在一些实施例中，通过磷酸钙转染法将多核苷酸导入宿主细胞。将目标多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物细胞，例如人类细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1型、腺病毒和腺相关病毒等。将多核苷酸导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如高分子复合物、纳米胶囊、微球、磁珠和以脂质为基础的系统，其包括水包油乳剂、胶团、混合胶团和脂质体。一种在体内和体外被用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊)。
为了确认重组DNA序列存在于宿主细胞中，可以进行多种实验。这类实验包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”实验。例如Southern和Northern blotting，RT-PCR和PCR；“生物化学”实验，例如检测某一特定多肽存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISAs和Western blots)均落入本发明范围内。
一个方面，本发明还提供一种制备上述凝血因子X激活酶的方法，所述方法包括如下步骤：
a)在能有效表达凝血因子X激活酶的条件下培养上述的宿主细胞；
b)从宿主细胞中获得所表达的凝血因子X激活酶。
另一个方面，本发明还提供一种对上述的凝血因子X激活酶进行糖基化修饰的方法，所述方法为通过基因工程改造宿主细胞使其产生具有预定的N-糖基化修饰的凝血因子X激活酶，和/或利用糖基化相关的酶类处理凝血因子X激活酶使其具有预定的N-糖基化修饰。
另一个方面，本发明还提供一种制备上述凝血因子X激活酶的方法，所述方法包括如下步骤：
a)获取圆斑蝰蛇蛇毒原液；
b)将蛇毒原液经过分离纯化提取获得上述的凝血因子X激活酶。
制备和提取凝血因子X激活酶的方法
在本发明的一个方面，本发明提供了一种从圆斑蝰蛇中提取凝血因子X激活酶的方法，所述方法依次包括如下步骤：
(a)获取圆斑蝰蛇蛇毒原液样品；
(b)将样品进行阴离子交换层析；
(c)完成阴离子交换层析纯化之后，将样品进行阳离子交换层析；
(d)获得凝血因子X激活酶。
在一些优选实施方式中，所述阴离子交换层析和阳离子交换层析均只进行一次。
在另一些优选实施方式中，所述阳离子交换层析之后不再进行其他纯化步骤，或者，在阳离子交换层析之后进一步包含分子筛层析步骤，且不再进行其他纯化步骤。
阴离子交换层析
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析的层析柱填料介质为琼脂糖或聚合物；
优选地，所述填料为琼脂糖介质的层析柱选自Sepharose H.P.、Sepharose F.F.、Capto、或Diamond，更优选为Q Sepharose H.P.、Q Sepharose F.F.、Capto Q、EDAE-Sepharose FF、Diamond Q或Diamond MIX-A；
优选地，所述填料为聚合物介质为聚苯乙烯/苯二乙烯、聚丙烯酸酯或二乙基氨基乙基；优选地，所述层析柱为NenoGel 50Q、UniGel 65Q HC或UniGel 30DEAE。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析的洗脱液为含NaCl的pH值为8.0-8.6的Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM-30mM，NaCl的浓度为0.1M-0.5M；
优选地，Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5或8.6，Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM、25mM或30mM；NaCl的浓度为0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M；
优选地，所述阴离子交换柱层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为80cm/小时-120cm/小时，更优选为90cm/小时。
阳离子交换层析
在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的层析柱填料介质为琼脂糖或聚合物；
优选地，所述填料介质为琼脂糖的层析柱选自Capto SP ImpRes、CM Beads 6FF或Diamond MMC；
优选地，所述聚合物介质优选为聚苯乙烯/苯二乙烯；优选地，所述层析柱为NenoGel50SP。
在一些实施方式中，所述阳离子交换层析洗脱液为含NaCl的pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液的浓度为10mM-30mM，NaCl的浓度为0.2M-0.6M；
优选地，所述磷酸缓冲液的pH值为6.5、6.7、6.8、6.9、7.0、7.2或7.5，磷酸缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM、25mM或30mM；NaCl的浓度为0.2M、0.3M、0.4M、0.5M或0.6M；
优选地，阳离子交换柱层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为40cm/小时-100cm/小时，更优选为60cm/小时。
阴离子交换层析之前的纯化步骤
在一些实施方式中，在阴离子交换层析之前，还可进一步包含分子筛层析、肝素亲和层析或疏水层析。
分子筛层析
在一些实施方式中，所述分子筛的层析柱填料选自凝胶过滤介质，优选为Sephacryl、Superdex或Sephadex；进一步优选为Sephacryl S-200HR，Superdex75pg、Superdex200pg或SephadexG25；
优选地，所述分子筛的洗脱液为pH值为8.0-8.6的Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM-30mM；优选地，Tris-HCl缓冲液pH值为8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5或8.6，浓度为10mM、15mM、20mM、25mM或30mM；
优选地，分子筛层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为40cm/小时-120cm/小时，更优选为60cm/小时。
肝素亲和层析
在一些实施方式中，肝素亲和层析的层析柱填料选自琼脂糖介质；优选为Capto heparin、Heparin Berpharose F.F.、Heparin Sepharose 6F.F.、Heparin Sepharose H.P.；
优选地，所述肝素亲和层析的洗脱液为含NaCl的pH值为7.6-8.4的Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM-30mM，NaCl的浓度为0.5M-1.5M；
优选地，Tris-HCl缓冲液的pH值为7.6、7.8、8.0、8.2或8.4，Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM、25mM或30mM；NaCl的浓度为0.5M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M或1.5M、；
优选地，肝素亲和层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为40cm/小时-120cm/小时，更优选为60cm/小时。
疏水层析
在一些实施方式中，疏水层析的层析柱填料选自琼脂糖介质；优选为Butyl Bestarose HP；
优选地，所述疏水层析的洗脱液为含NaCl的pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液的浓度为10mM-30mM，NaCl的浓度为0.5M-2.5M；
优选地，磷酸缓冲液的pH值为6.5、6.6、6.8、7.0、7.2或7.5，磷酸缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM、25mM或30mM；NaCl的浓度为0.5M、1.0M、1.5M、1.7M、1.9M、2.0M、2.1M、2.2M、2.4M或2.5M；
优选地，疏水层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为40cm/小时-120cm/小时，更优选为60cm/小时。
阳离子交换层析之后的分子筛层析
在一些实施方式中，在所述阳离子交换层析之后，还进一步包含分子筛层析；
优选地，所述分子筛层析的填料选自凝胶过滤介质，优选为Sephacryl、Superdex或Sephadex；进一步优选为Sephacryl S-200HR，Superdex75pg、Superdex200pg或SephadexG25。
优选地，所述分子筛层析的洗脱液为pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液浓度为40mM-80mM；更优选为磷酸缓冲液pH值为6.5、6.6、6.8、7.0、7.2或7.5，浓度为40mM、50mM、60mM、70mM或80mM；
优选地，所述分子筛层析的洗脱流速为5cm/小时-80cm/小时，优选为10cm/小时-35cm/小时，更优选为20cm/小时。
超滤
在一些实施方式中，在进行阴离子交换层析之后、阳离子交换层析之前，还包括超滤步骤；
优选地，所述超滤的具体步骤为：收集阴离子交换层析的目标峰对应的组分用超滤膜浓缩5-20倍，再将目标峰对应的组分所在的溶液置换成10mM-30mM磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的pH值为6.5-7.5，超滤膜的截留分子量为10kD-50kD；
优选地，磷酸缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM、25mM或30mM，pH值为6.5、6.6、6.8、7.0、7.2或7.5，超滤膜截留分子量为30kD，浓缩倍数为10倍。
病毒灭活
在一些实施方式中，在获得蛇毒原料液之后，进行阴离子层析纯化之前，还包括将蛇毒原料液进行病毒灭活处理的步骤；优选地，所述病毒灭活处理为S/D法进行病毒灭活处理。
在一些优选实施方式中，上述提取方法可用于提取或制备本发明所述的凝血因子X激活酶。
糖基化分析方法
本发明还提供一种分析凝血因子X激活酶糖基化的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)处理凝血因子X激活酶样品。
(2)对处理后的样品进行酶解。
(3)将酶解后的样品进行分析，以获得凝血因子X激活酶的糖谱或糖基化情况。
在一个具体的实施方式中，所述步骤(1)中处理凝血因子X激活酶样品的步骤包括尿素溶液处理、DTT处理和碘乙酰胺烷基化处理。在一些优选实施方式中，所述步骤(1)为：向凝血因子X激活酶样品中加入尿素溶液，离心；依次用DTT(二硫苏糖醇)还原和碘乙酰胺烷基化处理。
在一些实施方式中，所述尿素的浓度为4M-10M，优选为8M；
在一些实施方式中，所述DTT的浓度为5mM-40mM，优选为10mM，
在一些实施方式中，所述DTT还原条件为45℃-65℃，优选为56℃；
在一些实施方式中，所述碘乙酰胺的浓度为20mM-50mM，优选为30mM。
在另一个具体的实施方式中，所述步骤(2)中的酶解步骤包括如下步骤：加入碳酸氢铵，随后加入胰蛋白酶进行处理，酶解反应后加入甲酸终止反应。在一些优选实施方式中，所述步骤(2)为：加入碳酸氢铵溶液，离心，随后加入胰蛋白酶进行酶解；酶解反应结束后加入甲酸溶液终止反应，将样品进行超滤。
在一些实施方式中，所述碳酸氢铵的浓度为30mM-80mM，优选为50Mm；优选地，加入碳酸氢铵的步骤重复2次；
在一些实施方式中，所述胰蛋白酶的比例为1:30-1:80，优选为1:50，优选地，加入胰蛋白酶的步骤重复2次，37℃反应，
在一个具体的实施方式中，所述步骤(3)中采用液相色谱-质谱法进行分析。
在一些实施方式中，液相色谱的流动相中含有甲酸。在一些优选实施方式中，甲酸的加入比例为1:5-1:30，优选为1:20。
在一些实施方式中，所述液相色谱的色谱柱为C18色谱柱；
在一些实施方式中，所述色谱柱的柱温为35℃-55℃，优选为35℃-45℃，更优选为40℃；
在一些实施方式中，所述液相色谱的流速为0.1ml/min-1ml/min，优选为0.1ml/min-0.8ml/min，更优选为0.2ml/min；
在一些实施方式中，所述液相色谱的进样量为2μl-20μl，优选为4-15μl，更优选为6μl-10μl；
在一些实施方式中，液相色谱的流动相由流动相A和流动相B组成，其中，流动相A为甲酸和三氟乙酸水溶液，优选为(0.01％-0.2％)甲酸+(0.01％-0.2％)三氟乙酸的水溶液；更优选为(0.05％-0.1％)甲酸+(0.05％-0.1％)三氟乙酸的水溶液；
流动相B为甲酸和三氟乙酸乙腈水溶液，优选为(0.01％-0.2％)甲酸+(0.01％-0.2％)三氟乙酸的乙腈溶液；更优选为(0.05％-0.1％)甲酸+(0.05％-0.1％)三氟乙酸的乙腈溶液；优选地，所述乙腈溶液中含(80％-100％)乙腈和(0-20％)水，优选为90％乙腈和10％水。
在一些优选实施方式中，上述糖基化分析方法可用于分析本发明中所述的凝血因子X激活酶。
术语和定义
为了便于理解本发明内容和实施例，特定术语的含义如下所示。
糖基化：是指向蛋白附加糖链进行修饰的过程。糖基化类型通常有两种，分别是O-连接糖基化和N-连接糖基化。O-连接糖基化是指将聚糖连接到蛋白质上的羟基基团，例如丝氨酸(Ser)和/或苏氨酸(Thr)残基。N-连接糖基化是指将聚糖连接到蛋白质上的酰胺基 团，例如天冬酰胺酸(Asn)残基。蛋白质经过糖基化修饰，形成糖蛋白。
聚糖：是指多糖、寡糖或单糖。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，也可以是直链的或分支的。聚糖可以包括天然的糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰基神经氨糖酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等)和/或修饰的糖(例如，2’-氟代核糖、2’-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’-磺基N-乙酰葡糖胺等)。聚糖可包含糖残基的均聚物以及杂聚物。聚糖还涵盖结合糖的一个聚糖组分(例如，一种糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖的聚糖组分)。聚糖还涵盖游离的聚糖，包括一种结合糖种已经被切割的或由其他方式所释放的聚糖。
N-聚糖：是指N-连接的多糖或寡糖。N-连接的多糖或寡糖是指例如通过N-乙酰葡糖胺残基连接到蛋白质中天冬酰胺残基或精氨酸残基的酰胺基团上的多糖或寡糖，其基本结构、组成和类型均是本领域已知的(参见，例如，Drickamer K，Taylor ME(2006)，Introduction to Glycobiology，2nd ed.；Editor:Ajit Varki et.al.,Essentials of Glycobiology,4th edition,Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press；2022等)。具体而言，组成N-聚糖的主要糖类包括：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，唾液酸(Sialic acid，SA)等。在一些实施例中，N-聚糖的核心结构是本领域所已知的，即均具有一个五糖核心(其中，代表乙酰氨基葡萄糖GlcNAc，代表甘露糖Man，也可表示为Man3GlcNAc2)。N-聚糖是在基本的五糖核心上延伸而来。根据N-聚糖的支链组分，可以将N-聚糖分类，包括高甘露糖型、复杂型或杂合型。“高甘露糖型”N-聚糖具有5个或更多个甘露糖残基。“复杂型”N-聚糖通常具有与五糖核心的1,3甘露糖臂连接的至少一个GlcNAc。复杂型N-聚糖也可以具有半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基，所述残基可以被唾液酸或衍生物修饰。复杂型N-聚糖也可以具有在五糖核心上的多个天线，经常被称作“多天线聚糖”。“杂合型”N-聚糖具有在五糖核心的1’3甘露糖臂的末端上的至少一个GlcNAc和在五糖核心的1’6甘露糖臂上的0个或更多个甘露糖。
延伸糖型的命名规则也是本领域技术人员所熟知的，例如，可采用Oxford Notation方式进行命名(例如，参见：David J.Harvey等，Proposal for a standard system for drawing structural diagrams of N-and O-linked carbohydrates and related compounds，Proteomics 2009,9,3796–3801；Margaret Doherty等，Plasma N-glycans in colorectal cancer risk，SCIENTIFIC REPORTS(2018)8:8655；Jerrard M Hayes等，Identification of Fc Gamma Receptor Glycoforms That Produce Differential Binding Kinetics for Rituximab，Mol Cell Proteomics.2017Oct；16(10):1770-1788；https://www.ludger.com/product-catalogue/standards-controls/n-glycan-unlabelled，等)。例如，以F2A3BG3S3为例，其中，F代表岩藻糖，F之后的数字代表其个数，F2表示有2个岩藻糖；A代表天线(Antennary)，即五糖核心的甘露糖(Man)上加入乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，A后面的数字代表其天线个数，即A3表示其糖链为三天线 型；B代表平分型GlcNAc，即在五糖核心中间的甘露糖(Man)上连接一个乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，G代表半乳糖(galactose)，其后的数字代表其个数，G3表示有3个半乳糖，S代表唾液酸(Sialic acid)，其后的数字代表其个数，S3表示有3个唾液酸。
N-糖基化：“N-糖基化”和“N-连接的糖基化”可互换使用，是指糖与包含天冬酰胺残基或精氨酸残基，或包含N-连接的糖基化位点或基序的连接基团发生连接的过程。
分离的：“分离的”生物组分(例如，核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)已经被从其中所述组分天然存在的生物体的细胞或组织中或者生物体本身中的其他生物组分(例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞)中基本上分离或纯化。已经“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子和蛋白质。
药学上接受的载体：包括任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲水溶液、乳液(如油/水或水/油乳液)和各种类型湿润剂。
治疗：一种获得有益的或期望的结果的方法，包括临床结果。鉴于本发明的目的，所述有益的或期望的临床结果，包括但不限于以下一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状，减轻疾病程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病恶化)，预防或延迟疾病复发，延迟或减缓疾病进展，改善疾病状态，缓解疾病(部分或全部)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病进展，改善或提高生活质量，和/或延长生存期。
治疗有效量：足以在用试剂治疗的受试者或者细胞中取得所需效果的特定药物或治疗试剂(例如凝血因子X激活酶)的量。试剂的有效量取决于多种因素，包括但不限于被治疗的受试者或细胞，以及治疗性组合物的给药方式。
信号肽：是指作为N-端肽存在于蛋白前体形式上的前肽。信号肽的功能是促进连接至内质网的表达多肽的易位，信号肽通常在该过程中被信号肽酶切除。信号肽对于产生多肽的生物体可以是异源的或同源的。
本发明的有益效果如下：
1、本发明提供了一种新的圆斑蝰蛇凝血因子X激活酶，其α链的Asn 28、Asn 69、Asn 163、Asn 183等4个位点，β链的Asn 59位点，以及γ链的Asn 24位点均具有特定的N糖基化修饰。相比起现有技术中的其他RVV-X，该凝血因子X激活酶具有更高的活性，将对临床出血以及出血性疾病的治疗发挥重要作用。
2、本发明还提供了一种新的提取圆斑蝰蛇蛇毒中凝血因子X激活酶的方法，相比起现有技术中的方法，该方法在保证产物的高纯度和高活性的同时，具有更高的收率，极大地降低了生产成本，因此更适合规模化生产。
当然，需要说明的是，本发明实施例的方法不必同时实现上述全部优点。
附图说明
图1A-1C所示分别为凝血因子X激活酶α链cDNA翻译序列与序列2008、序列1992的比对结果(图1A)、β链cDNA翻译序列与序列2008的比对结果(图1B)以及γ链cDNA翻译序列与序列2008、序列1992的比对结果(图1C)。
图2A-2C所示分别为凝血因子X激活酶α链(图2A)、β链(图2B)以及γ链(图2C)N末端序列测定及比对结果。
图3A-3C所示分别为凝血因子X激活酶α链(图3A)、β链(图3B)以及γ链(图3C)N-糖基化位点预测结果，其中，竖线表示发生N-糖基化的可能性，其所对应的横坐标表示可能的N-糖基化位点，横线表示发生N-糖基化可能性的阈值。
具体实施方式
实施例1、设计凝血因子X激活酶cDNA特异性扩增引物
根据已知凝血因子X激活酶3条链(即α链、β链和γ链)的序列，利用Vector NTI11.5软件中AlignX功能分析每条链的同源保守序列。根据分析结果设计用于克隆3条链的cDNA编码序列的特异性引物，并由invitrogen(英潍捷基)进行引物合成。引物序列见表1。
表1凝血因子X激活酶cDNA扩增引物
实施例2、扩增凝血因子X激活酶的cDNA序列
1、总RNA提取及反转录
剪取圆斑蝰蛇蛇头，干冰快速冷冻，在冷冻条件下分离两侧毒腺，碾碎后加到含1ml Trizol(Takara，#9108-1)的离心管中，反复吹打至组织块裂解，室温静置5min，再加入 200μl氯仿，漩涡混匀，室温静置5min，12000rpm高速离心10min。小心吸取上清于另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10min，12000rpm高速离心10min。弃上清，加入1ml 75％的乙醇于离心管中，12000rpm高速离心10min，尽量去除上清，空气干燥5min，加入20μl DEPC水溶解RNA，冷冻保存。
利用反转录试剂盒(Fermentas，#K1622)对提取的总RNA进行反转录，根据说明书配置反应液，吸取4μl总RNA，加入7μl DEPC水和1μl Oligo T，混匀后65℃温育5min，立即冰浴。向反应液中加入4μl 5×buffer、1μl Rnase Inhibitor、1μl MMLV和2μl dNTPs，混匀后稍微离心，42℃温育60min，75℃处理5min。获得的cDNA产物可直接用于PCR扩增。
2、反转录cDNA的特异性扩增
以反转录得到的cDNA为模板，利用实施例1合成的3对引物，分别进行PCR扩增。反应体系见表2：
表2凝血因子X激活酶cDNA扩增体系
PCR反应条件为：
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，获得了扩增条带单一、清晰且位置与预期大小一致条带，将条带切下放入EP管中，4℃保存。
3、胶回收、连接T载体与测序
将切下的目的条带用胶回收试剂盒(TIANGEN，#DP209-02)进行胶回收，回收产物连接T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，涂板扩繁，各挑取5个单克隆到LB液体培养基中扩繁，提取质粒并送Takara公司进行核酸测序，分别获得凝血因子X激活酶α链、β链及γ链的cDNA序列信息。
实施例3、确定凝血因子X激活酶氨基酸序列
1、α链分析
基于实施例2中获得的α链的cDNA序列信息，利用Vector NTI进行开放阅读框(ORF)分析。根据分析结果，翻译得到的蛋白质序列如下(SEQ ID NO:7)，其中1-20位氨基酸为信号肽序列(用粗体示出)，21-188位氨基酸为前肽序列(用下划线示出)，189-619位为成熟肽序列。
去除信号肽和前肽的α链的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:8，431个氨基酸)：
2、β链分析
基于实施例2中获得的β链的cDNA序列信息，利用Vector NTI进行开放阅读框(ORF)分析。根据分析结果，翻译得到蛋白质序列如下(SEQ ID NO:9)，其中，第1-23位为信号肽序列(用粗体示出)；第24-158位为成熟肽序列。
去除信号肽的β链的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:10，135个氨基酸)：
3、γ链分析
基于实施例2中获得的γ链的cDNA序列信息，利用Vector NTI进行开放阅读框(ORF)分析。根据分析结果，翻译得到的蛋白质序列如下(SEQ ID NO:11)，其中，第1-23位为信号肽序列(用粗体示出)；第24-146位为成熟肽序列：
去除信号肽的γ链的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:12，123个氨基酸)：
实施例4、凝血因子X激活酶氨基酸序列结构验证
1、氨基酸序列比对
分别将实施例3中得到的3条成熟肽的氨基酸序列(即α链、β链及γ链，用“cDNA翻译”表示)与Chen H.S.等(Chen HS et al.,New insights into the functions and N-glycan structures of factor X activator from Russell's viper venom.FEBS J.2008Aug；275(15):3944-58)于2008年测得的cDNA序列(基因库登陆号分别为DQ137799、AY734997、AY734998)翻译得到的氨基酸序列(用“序列2008”表示)、Takeya H.等(Takeya H et al.,Coagulation factor X activating enzyme from Russell's viper venom(RVV-X).A novel metalloproteinase with disintegrin(platelet aggregation inhibitor)-like and C-type lectin-like domains.J Biol Chem.1992 Jul 15；267(20):14109-17.)于1992年用Edman降解法测得的氨基酸序列(仅检测了α链和γ链序列，用“序列1992”表示)进行比对，比对结果见图1A-1C，其中加粗的字母表示该位置氨基酸残基不同，横线“-”表示该位置氨基酸残基相同，点“.”表示未检测到该位置的氨基酸残基。
α链cDNA翻译序列与序列2008及序列1992的比对结果如图1A所示。β链cDNA翻译序列与序列2008的比对结果如图1B所示。γ链cDNA翻译序列与序列2008、序列1992的比对结果如图1C所示。
2、N端序列分析和确证
为了确认圆斑蝰蛇中存在由上述cDNA翻译获得的成熟肽，进一步从所述圆斑蝰蛇的蛇毒中提取、纯化和获得了凝血因子X激活酶，并委托北京蛋白质组研究中心和北京大学生命科学学院通过串联质谱法和Edamn降解法对所获得的凝血因子X激活酶α链、β链和γ链的N末端序列分别进行测定。
由α链、β链及γ链cDNA序列翻译得到的成熟肽的氨基酸序列(用“cDNA翻译”表示)、质谱法序列鉴定的结果(用“质谱法”表示)、Edman降解法测定的结果(用“Edman法”表示)与“序列1992”进行比对，结果见图2A-2C。
α链N末端序列测定及比对结果如图2A所示，质谱法鉴定到α链N末端35个氨基酸与cDNA翻译序列同位置的氨基酸序列一致。
Edman降解法分析α链N末端的氨基酸序列结果显示，每一个位置的检测结果都不是单一的氨基酸，不能得到完整的序列。与Kisiel W等1976年用Edman降解法检测RVV-Xα链N末端氨基酸时发现N末端存在的不均一性的现象一致(Kisiel W et al.,Factor X activating enzyme from Russell's viper venom:isolation and characterization.Biochemistry.1976 Nov 2；15(22):4901-6.)。
β链N末端序列测定及比对结果如图2B所示，质谱法鉴定的N末端63个氨基酸与cDNA翻译序列同位置的氨基酸序列一致，Edman降解法测定的N末端30个氨基酸序列与cDNA翻译序列同位置的氨基酸序列一致。
γ链N末端序列测定及比对结果如图2C所示，其中“X”表示未确定的氨基酸。用Edman降解法共鉴定了N末端的30个氨基酸，除未捕捉到第24位氨基酸外，其余均与cDNA翻译序列及序列1992一致。用质谱法没有捕捉到γ链N末端的前17个氨基酸，测得的第18至47位氨基酸序列均与cDNA翻译序列及序列1992同位置的氨基酸序列一致。
由后续的糖基化位点确认试验结果可知，在第24位的氨基酸为N(Asn,天冬酰胺)，存在N糖基化修饰，推测未捕捉到第24位氨基酸残基的原因可能是糖基化修饰影响了Edman降解法对该氨基酸的测定。
综上所述，本文所述凝血因子X激活酶的三条链N末端氨基酸序列为：
α链N末端35个氨基酸残基(SEQ ID NO:13)：
β链N末端63个氨基酸残基(SEQ ID NO:14)：
γ链N末端47个氨基酸残基(SEQ ID NO:15)：
凝血因子X激活酶的N末端氨基酸测序结果与由cDNA翻译获得的成熟肽的N末端序列一致，表明上述cDNA翻译获得的成熟肽存在于圆斑蝰蛇毒液中。
通过以上的结构确证及与GeneBank、EMBL文库中的序列进行比对后确认，本发明从圆斑蝰蛇中获得了一种新的凝血因子X激活酶。
实施例5、凝血因子X激活酶糖基化位点确认
利用NeNGlycl.0Server神经网络软件(网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)对凝血因子X激活酶的α链、β链及γ链的cDNA翻译序列进行分析，预测这三条链可能发生糖基化的N-糖基化位点。
α链、β链、γ链的分析结果见图3A-3C。图中竖线所对应的位置表示该位点具有发生N-糖基化修饰的序列特征，即Asn-X-Thr/Ser。竖线表示发生N糖基化的可能性。横线表示发生N-糖基化可能性的阈值，该阈值为0.5，评分值≥0.5即认为该位点为预测的糖基化位点。
α链N糖基化位点预测结果如图3A所示，从N端起可能的N-糖基化位点分别为28NSTA、69NVTS、183NCSI，评分值分别为0.7407、0.7516、0.6519。163NDSS评分值为0.4979，接近0.5，也将其作为可能发生N-糖基化修饰的位点进行后续实验分析。
β链N糖基化位点预测结果如图3B所示，可能的N-糖基化位点为59NITE，评分值为0.7391。
γ链N糖基化位点预测结果如图3C所示，可能的N-糖基化位点为24NWTD，评分值为0.6089。
随后，委托北京蛋白质组研究中心采用质谱法对这三条链的6个N-糖基化位点进行分析和确认，结果显示6个位点均发生了N-糖基化修饰，与预测结果一致。
实施例6、凝血因子X激活酶的新提取方法
1、凝血因子X激活酶的提取
本实施例将对从圆斑蝰蛇蛇毒中提取凝血因子X激活酶的工艺进行探索。
取所述圆斑蝰蛇蛇毒液约10ml，用20mMTris-HCl溶液(pH8.5)稀释至蛋白浓度为约20-30mg/ml，在4℃下12000×g离心20分钟，收集上清液。
采用S/D法对蛇毒原料液进行病毒灭活，具体步骤如下：将收集的上清液用0.45μm滤膜过滤后，先后加入吐温-80和磷酸三丁酯，使吐温-80终体积浓度为1％，磷酸三丁酯终体积浓度为0.3％。充分混匀后，混合物在25℃±2℃水浴2小时，进行病毒灭活。将病毒灭活获得的蛇毒液分别按照表3所列步骤提取凝血因子X激活酶：
表3凝血因子X激活酶提取方法概况
具体步骤如下：
1.1阴离子交换层析-阳离子交换层析
(1)阴离子交换层析
Q Sepharose HP层析柱使用前用20mMTris-HCl(pH8.5)缓冲液平衡3个柱体积。
将经病毒灭活的蛇毒液上样，流速90cm/小时。上样完成后用20mM Tris-HCl(pH8.5)溶液洗杂至基线，流速90cm/小时。用20mM Tris-HCl-0.2M NaCl(pH8.5)溶液进行洗杂，流速90cm/小时。
洗杂完成后再用20％-100％的20mM Tris-HCl-0.4M NaCl(pH8.5)溶液洗脱10个柱体积，流速90cm/小时。当电导升高至10ms/cm时，目标峰开始出现，收集目标峰对应的组分。至目标峰下降至基线停止收集目标峰对应的组分。
(2)超滤浓缩
将经阴离子层析收集的目标峰对应的组分用30kD超滤膜浓缩约10倍。然后将浓缩液用20mM磷酸缓冲液(pH 6.8)进行等体积置换。
(3)阳离子交换层析
Capto SP ImpRes层析柱用10mM(pH 6.8)的磷酸缓冲液平衡3个柱体积，然后将超滤得到的组分进行上样，流速60cm/h；上样完成后使用10mM磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳，流速60cm/h。
平衡完成后0-100％的10mM磷酸+0.4M NaCl(pH 6.8)溶液线性洗脱5个柱体积，流速60cm/h，当电导升值10±1ms/cm且UV出现明显拐点时，收集目标峰；当电导升至18±1ms/cm，UV下降至下一个峰升起时，停止收集。
1.2阳离子交换层析-阴离子交换层析
(1)阳离子交换层析
CM Beads 6FF层析柱用10mM(pH 6.8)磷酸缓冲液平衡3个柱体积，然后将病毒灭活得到的组分进行上样，流速60cm/h；上样完成后使用10mM磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳，流速60cm/h。
平衡完成后0-100％的10mM磷酸+0.4M NaCl(pH 6.8)溶液线性洗脱5个柱体积，流速60cm/h，收集目标峰对应的组分。
(2)超滤
将经阳离子层析收集的目标峰对应的组分用30kD超滤膜浓缩约10倍。然后将浓缩液用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)进行等体积置换。
(3)阴离子交换层析
NenoGel 50Q层析柱使用前用20mMTris-HCl(pH8.5)缓冲液平衡3个柱体积。将经超滤后样品上样，流速90cm/小时。上样完成后用20mM Tris-HCl(pH8.5)溶液再平衡至基线平稳，流速90cm/小时。用20mM Tris-HCl-0.2M NaCl(pH8.5)溶液进行洗杂，流速90cm/小时。
洗杂完成后再用20％-100％的20mM Tris-HCl-0.4M NaCl(pH8.5)溶液洗脱10个柱体积，流速90cm/小时。当电导升高至10ms/cm时，目标峰开始出现，收集目标峰对应的组分。至目标峰下降至基线停止收集目标峰对应的组分。
1.3分子筛层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析
先将经病毒灭活的蛇毒液先经过分子筛层析，具体条件为：使用0.02mol/L Tris-HCl(pH8.5)溶液充分平衡G25层析柱(≥2CV)，流速60cm/小时。将经病毒灭活的蛇毒液进行上样，每次上样体积20％-30％柱体积，上样结束后继续用平衡液冲洗。当紫外吸收值(UV值)升高约至1mAU时，开始收集目标料液，待UV值下降至250±50mAU时停止收集。
将收集的组分参照方法1.1的步骤(1)-(3)依次经过阴离子交换层析、超滤和阳离子交换层析，收集目标峰对应的组分。
1.4分子筛层析-阳离子交换层析-阳离子交换层析
(1)分子筛层析
将经病毒灭活的蛇毒液参照方法1.3进行分子筛层析。
(2)阳离子交换层析
Capto SP ImpRes层析柱用10mM(pH 6.8)磷酸缓冲液平衡3个柱体积，然后将分子筛层析得到的组分进行上样，流速60cm/h；上样完成后使用10mM磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳，流速60cm/h。
平衡完成后0-100％的10mM磷酸+0.4M NaCl(pH 6.8)溶液线性洗脱5个柱体积，流速60cm/h，收集目标峰对应的组分。
(3)超滤
将经阳离子层析收集的目标峰对应的组分用30kD超滤膜浓缩约10倍。然后将浓缩液用10mM磷酸缓冲液(pH 6.8)进行等体积置换。
(4)阳离子交换层析
将超滤后获得的组分用CM Beads 6FF进行阳离子交换层析：CM Beads 6FF层析柱用10mM(pH 6.8)磷酸缓冲液平衡3个柱体积，然后将超滤得到的组分进行上样，流速60cm/h；上样完成后使用10mM磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳，流速60cm/h。
平衡完成后0-100％的10mM磷酸+0.4M NaCl pH(6.8)溶液线性洗脱5个柱体积，流速60cm/h，收集目标峰对应的组分。
1.5分子筛层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析
参照方法1.3纯化经病毒灭活的蛇毒液，不同处仅在于阴离子交换层析的层析柱采用NenoGel 50Q层析柱。
1.6阴离子交换层析-阳离子交换层析-分子筛层析
参照方法1.1的步骤依次将病毒灭活的蛇毒液进行阴离子交换层析、超滤、阳离子交换层析，收集相应的组分。
随后将收集的组分再次进行分子筛层析，具体条件为：Sephacry1 S-200HR层析柱使用前用50mM(pH6.8)磷酸缓冲液充分平衡3个柱体积后上样。上样体积控制在分子筛柱体积的5％。层析流速20cm/h，收集目标峰对应的组分。
1.7分子筛层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析-分子筛层析
参照方法1.3的步骤依次进行分子筛层析、阴离子交换层析、超滤和阳离子交换层析，收集相应的组分。
随后将收集的组分进行分子筛层析，具体条件为：Sephacry1 S-200HR层析柱使用前用50mM(pH6.8)磷酸缓冲液充分平衡3个柱体积后上样。上样体积控制在分子筛柱体积的5％。层析流速20cm/h，收集目标峰对应的组分。
1.8分子筛层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析-分子筛层析
参照方法1.7的步骤纯化经病毒灭活的蛇毒液，不同处仅在于阴离子交换层析的层析柱采用NenoGel 50Q层析柱。
1.9分子筛层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析-分子筛层析
参照方法1.7的步骤纯化经病毒灭活的蛇毒液，不同处仅在于阳离子交换层析的层析柱采用NenoGel 50SP层析柱。
1.10分子筛层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析-分子筛层析
参照方法1.7的步骤纯化经病毒灭活的蛇毒液，不同处仅在于阳离子交换层析的层析柱采用CM Beads 6FF层析柱。
1.11分子筛层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析-疏水层析
参照方法1.3的步骤依次进行分子筛层析、阴离子交换层析、超滤和阳离子交换层析，收集相应的组分，再将收集的组分进行疏水层析，具体条件为：将上样样品电导调至140±5ms/cm；Butyl Bestarose HP层析柱使用前用20mM磷酸+2M NaCl(pH 7.0)缓冲液 充分平衡3个柱体积后上样；流速60cm/h；上样完成后使用20Mm磷酸+2M NaCl pH7.0溶液再次平衡层析柱至基线平稳，流速60cm/h。
平衡完成后用0-100％的20mM(pH 6.8)磷酸缓冲液线性洗脱5个柱体积，流速60cm/h，收集目标峰对应的组分。
1.12分子筛层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析-疏水层析
参照方法1.11的步骤依次进行分子筛层析、阴离子交换层析、超滤、阳离子交换层析、疏水层析，收集相应的组分，不同处仅在于阳离子交换层析的层析柱采用NenoGel 50SP层析柱。
1.13分子筛层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析-肝素亲和层析
参照方法1.3的步骤依次进行分子筛层析、阴离子交换层析、超滤和阳离子交换层析，收集相应的组分，再将收集的组分进行肝素亲和层析，具体条件为：Capto heaparin层析柱用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液充分平衡3个柱体积后进行上样；流速60cm/h。上样完成后再用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳，流速60cm/h。
平衡完成后0-100％的20mM Tris-HCl+1M NaCl(pH 8.0)溶液线性洗脱5个柱体积，流速60cm/h，收集目标峰对应的组分。
1.14肝素亲和层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析
(1)将经病毒灭活的蛇毒液进行肝素亲和层析，具体条件为：
Capto heaparin层析柱用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液充分平衡三个柱体积后进行上样；流速60cm/h。上样完成后再用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳，流速60cm/h。平衡完成后0-100％的20mM Tris-HCl+1M NaCl(pH 8.0)溶液线性洗脱5个柱体积，流速60cm/h，收集目标峰对应的组分。
(2)超滤
将经肝素亲和层析收集的目标峰对应的组分用30kD超滤膜浓缩约10倍。然后将浓缩液用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)进行等体积置换。
随后将经肝素亲和层析的组分参照方法1.1依次进行阴离子交换层析、超滤和阳离子交换层析，收集相应的组分。
1.15肝素亲和层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析-分子筛
参照方法1.14的步骤依次进行肝素亲和层析、阴离子交换层析、超滤和阳离子交换层析，收集相应的组分，再将收集的组分进行分子筛层析，具体条件为：Sephacry1 S-200HR层析柱使用前用50mM(pH6.8)磷酸缓冲液充分平衡3个柱体积后上样。上样体积控制在分子筛柱体积的5％。层析流速20cm/h，收集目标峰对应的组分。
1.16疏水层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析
(1)将经病毒灭活的蛇毒液进行疏水层析，具体条件为：将上样样品电导调至80±5ms/cm；Butyl Bestarose HP层析柱使用前用20Mm磷酸+1M NaCl pH(7.0)缓冲液充分平衡3个柱体积后上样；流速60cm/h；上样完成后使用20Mm磷酸+1M NaCl pH7.0溶液再次平衡层析柱至基线平稳，流速60cm/h。期间收集流穿作为目标峰。
(2)超滤浓缩
将经疏水层析收集的目标峰对应的组分用30kD超滤膜浓缩约10倍。然后将浓缩液用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)进行等体积置换。
将超滤获得的组分参照1.1方法依次进行阴离子交换层析、超滤、阳离子交换层析，收集目标峰对应的组分。
1.17疏水层析-阴离子交换层析-阳离子交换层析-分子筛
参照方法1.16的步骤依次进行疏水层析、超滤、阴离子交换层析、超滤和阳离子交换层析，收集相应的组分，再将收集的组分进行分子筛层析，具体条件为：Sephacry1 S-200HR层析柱使用前用50mM(pH6.8)磷酸缓冲液充分平衡3个柱体积后上样。上样体积控制在分子筛柱体积的5％。层析流速20cm/h，收集目标峰对应的组分。
2、检测方法和结果
(1)检测方法
将方法1.1-1.17获得的凝血因子X激活酶按照下列方法进行检测：
蛋白收率检测：采用BCA法检测投料时蛇毒的总蛋白浓度，根据料液的体积，计算出投料时的总蛋白质量。采用《中国药典》2015年版三部通则0731蛋白质含量测定法第二法福林酚法(Lowry法)检测纯化后的凝血因子X激活剂蛋白浓度，测量体积，获得最终纯化后的蛋白总质量，通过与投料时的总蛋白质量进行比较，获得产品的收率。
蛋白纯度检测：采用尺寸排阻原理的高效液相色谱法(SEC-HPLC)进行纯度检测。
(2)检测结果
方法1.1-1.17获得的凝血因子X激活酶的检测结果见表4。
表4凝血因子X激酶的检测结果

根据上述结果可以得出：
(1)对于从圆斑蝰蛇中提取凝血因子X激活酶，如果依次采取一次阴离子交换层析和一次阳离子交换层析的步骤进行提取(方法1.1)，最终产物经SEC-HPLC鉴定其纯度可达到97.75％，与现有技术中的其他方法相当；而产品收率高达4.96％，显著高于现有技术中的其他方法(例如，CN109943554A实施例5.2-5.3，经阴离子交换层析和CHT纯化后，收率为3.05％-3.49％)。
然而，如果将阴离子层析和阳离子层析的顺序调换(方法1.2)，或者采用两次阳离子交换层析(方法1.4)，最终产物经SEC-HPLC检测纯度仅为41.08％和68.29％，远低于方法1.1。
该结果表明，从圆斑蝰蛇中提取凝血因子X激活剂，阴离子交换层析和阳离子交换层析的顺序组合对于获得高纯度和高收率的凝血因子X激活酶是必需的，且仅需一次阴离子交换层析和一次阳离子交换层析，无需再进行其他纯化步骤即能获得符合要求的高纯度产物。
(2)在包含阴离子交换层析和阳离子交换层析的顺序组合的基础上，在阴离子交换层析之前采用分子筛层析、疏水层析或肝素亲和层析等纯化步骤进行处理(方法1.3、1.5、1.14、1.16)，最终产物能保持高纯度(经由SEC-HPLC检测纯度达到98％以上)，且产品收率仍达到3.52％-5.92％，优于现有技术中的方法(例如，CN109943554A的实施例6-9，经阴离子交换层析、CHT和分子筛层析纯化后，收率为2.69-2.82％)。
(3)在包含阴离子交换层析和阳离子交换层析的顺序组合的基础上，在阳离子交换层析之后再进行一次分子筛层析(方法1.6-1.10、1.15、1.17)，可将最终产物的纯度提升至100％。虽然收率有所下降(3.13％-4.01％)，其可能是由于纯化步骤过多而导致，然而，在纯化步骤数量相同(方法1.6)，甚至本发明还多一步层析(方法1.7-1.10、1.15、1.17)的情况下，本发明方法的收率仍优于现有技术(例如，CN109943554A的实施例6-9，经阴离子交换层析、CHT和分子筛层析纯化后，收率为2.69-2.81％)。
然而，在阳离子交换层析之后再进行疏水层析或肝素亲和层析的情况下(1.11、1.12、1.13)，尽管多了一个纯化步骤，最终产物经SEC-HPLC检测的纯度反而出现下降(11.76％、 13.33％、94.76％)，同时，产品收率也出现了不同程度的降低(1.53％-2.20％)。
上述结果表明，在包含一次阴离子交换层析和一次阳离子交换层析的顺序组合的基础上，可以再加入分子筛层析步骤以进一步提高纯度，或者可以不再进行其他的纯化步骤。
综上所述，本发明方法从圆斑蝰蛇的蛇毒中提取凝血因子X激活酶，能够在保证最终产物高纯度的情况下，提高产品收率，可大大降低生产成本，更适合规模化生产。
实施例7、圆斑蝰蛇凝血因子X激活酶的结构表征及其活性测定
分别选取由实施例6中方法1.1、1.6和1.7纯化获得的凝血因子X激活酶样品，对其进行进一步的结构表征和活性测定。
1、进一步确证凝血因子X激活酶的氨基酸序列
取凝血因子X激活酶，采用质谱进行进一步鉴定，结果显示，其与实施例3确定的凝血因子X激活酶的氨基酸序列完全一致(具体数据未示出)。
2、分析和鉴定凝血因子X激活酶中各个N-糖基化位点上的糖基化修饰
取凝血因子X激活酶，13000rpm离心10min；加入8M尿素溶液400μl，13000rpm离心10min；加入终浓度为10mM的DTT溶液，56℃下反应1h后，加入终浓度为30mM的IAM(碘乙酰胺)溶液，室温暗处反应40min，再次加入终浓度10mM的DTT溶液中和多余的IAM溶液；加入350μl 50mM碳酸氢铵溶液，13000rpm离心10min，弃下层液，重复此步骤2次；按照1:50比例加入胰蛋白酶，37℃反应2h后，按照上述加酶量，再次加入胰蛋白酶，37℃反应过夜；按照1:20比例加入甲酸溶液，终止酶切反应；取样品至于EP管中，洗超滤管两次，定容。
精密量取样品溶液40μl，注入经液相色谱-质谱仪进行分析：
色谱条件：
色谱柱为ACQUITYCSHTM C18，1.7μm,2.1*150mm Column；柱温：40℃，样品温度：7℃，流速：0.2ml/min，检测波长：214nm；进样量：10μl，流动相A：0.05％FA+0.05％TFA/水，流动相B：0.05％FA+0.05％TFA/(90％乙腈+10％水)。
梯度洗脱程序表5所示：
表5洗脱程序

质谱仪检测：
分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-2000m/z，一级质谱分辨率：70,000at m/z 200，二级质谱分辨率：17,500at m/z 200。
鉴定结果显示，上述的三个凝血因子X激活酶样品中，三条肽链的6个糖基化位点上均具有较高的糖基化水平，每个位点上均具有多种N-聚糖修饰。值得注意的是，尽管γ链和β链的序列长度接近，且均仅有一个N糖基化位点，但总体而言，前者Asn24糖基化位点上的糖基化修饰比后者中Asn 59位点上的糖基化修饰更复杂，N-聚糖种类也更多样(具体数据未展示)。
α链4个位点(Asn 28、Asn 69、Asn 163、Asn 183)上的主要N-糖型及其相对含量分析的结果见表6。
表6供试品α链各位点主要糖型及相对含量
β链Asn 59位点主要N糖型及其相对含量分析的结果见表7：
表7供试品β链各位点主要糖型及相对含量
γ链Asn 24位点的主要N糖型及其相对含量分析的结果见表8：
表8供试品γ链各位点主要糖型及相对含量
3、检测凝血因子X激活酶的活性
取上述三个凝血因子X激活酶样品，参考文献《生物底色连续速率法测定圆斑蝰蛇凝血因子X激活剂的活性》(中国医药杂志，2007，第16卷第18期)的方法，对其酶活进行检测。检测结果显示，本发明方法1.1、1.6和1.7获得的凝血因子X激活酶的比活分别为37589.2U/mg、38556.5U/mg和37992.8U/mg。

Claims (33)

  1. 一种凝血因子X激活酶，其特征在于，所述凝血因子X激活酶包括α、β、γ三条多肽链，所述α链的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述β链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述γ链的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
  2. 根据权利要求1所述的凝血因子X激活酶，其特征在于，所述α、β和/或γ多肽链具有糖基化修饰。
  3. 根据权利要求2所述的凝血因子X激活酶，其特征在于，所述α、β和/或γ多肽链氨基酸序列的至少一个氨基酸残基上共价连接至N-聚糖。
  4. 根据权利要求3所述的凝血因子X激活酶，其特征在于，所述氨基酸残基为天冬酰胺(Asn)残基。
  5. 根据权利要求4所述的凝血因子X激活酶，其特征在于，所述天冬酰胺(Asn)残基位点选自如下中的一个或多个：
    α链：Asn28，Asn69，Asn163，Asn183；
    β链：Asn59；和/或
    γ链：Asn24。
  6. 根据权利要求5所述的凝血因子X激活酶，其特征在于，
    α链中Asn28位点上的N-聚糖包括：A2BG2S2，FA2BG2S2，F2A2BG2S2和A3BG3S3；以及/或者，
    α链中Asn69位点上的N-聚糖包括：FA2S2，A2S2，FA3G2S2，A3G2S2，A4G3S3和A3S3；以及/或者，
    α链中Asn163位点上的N-聚糖包括：FA2G2S2，A2BG2S2，FA2BG2S2，F2A2BG2S2，A3G3S3，FA3G3S3，A3BG3S3和FA3BG3S3；以及/或者，
    α链中Asn183位点上的N-聚糖包括：A2G2S1，A2G2S1M4，A2BG1S1，FA2BG1S1，A2BG2S2，FA2BG2S2和M5；以及/或者，
    β链中Asn59位点上的N-聚糖包括：A2BG2S2，FA2BG2S2，F2A2BG2S2，A3BG3S3，还进一步包括末端为半乳糖的N-聚糖，优选地，所述末端为半乳糖的N-聚糖包括：A2BG2S1，FA3G3S2等；以及/或者，
    γ链中Asn24位点上的N聚糖包括：A2BG1S1，FA2BG1S1，FA2BG2S1，A2BG2S2，FA2BG2S2，F2A2BG2S2，还进一步包括带有岩藻糖基和/或乙酰唾液酸的三天线或四天线分支型N-聚糖，优选地，所述三天线或四天线分支型N-聚糖包括FA3G3S2，FA3BG3S3，A3BG2S2，A3BG3S3等。
  7. 根据权利要求6所述的凝血因子X激活酶，其特征在于，
    α链中Asn28位点上的N-聚糖包括：
    A2BG2S2，其相对含量为22-32％，优选25-30％，
    FA2BG2S2，其相对含量为30-40％，优选34-38％，
    F2A2BG2S2，其相对含量为18-28％，优选20-25％，和
    A3BG3S3，其相对含量为5-10％，优选6-9％；
    以及/或者，
    α链中Asn69位点上的N-聚糖包括：
    FA2S2，其相对含量为5-10％，优选6-9％，
    A2S2，其相对含量为5-10％，优选6-8％，
    FA3G2S2，其相对含量为7-20％，优选9-15％，
    A3G2S2，其相对含量为20-30％，优选22-29％，
    A4G3S3，其相对含量为10-25％，优选15-20％，和
    A3S3，其相对含量为15-30％，优选16-20％；
    以及/或者，
    α链中Asn163位点上的N-聚糖包括：
    FA2G2S2，其相对含量为3-8％，优选4-6％，
    A2BG2S2，其相对含量为6-12％，优选8-10％，
    FA2BG2S2，其相对含量为15-25％，优选19-22％，
    F2A2BG2S2，其相对含量为10-25％，优选15-20％，
    A3G3S3，其相对含量为5-10％，优选7-9％，
    FA3G3S3，其相对含量为5-10％，优选8-9％，
    A3BG3S3，其相对含量为5-10％，优选7-9％，和
    FA3BG3S3，其相对含量为3-10％，优选5-8％；
    以及/或者，
    α链中Asn183位点上的N-聚糖包括：
    A2G2S1，其相对含量为5-15％，优选9-10％，
    A2G2S1M4，其相对含量为4-8％，优选5-6％，
    A2BG1S1，其相对含量为10-17％，优选12-14％，
    FA2BG1S1，其相对含量为5-10％，优选7-8％，
    A2BG2S2，其相对含量为10-20％，优选14-16％，
    FA2BG2S2，其相对含量为6-12％，优选8-10％，和
    M5，其相对含量为3-8％，优选4-7％；
    以及/或者，
    β链中Asn59位点上的N-聚糖包括：
    A2BG2S2，其相对含量为15-25％，优选19-24％，
    FA2BG2S2，其相对含量为30-40％，优选32-34％，
    F2A2BG2S2，其相对含量为20-30％，优选21-27％，
    A3BG3S3，其相对含量为3-10％；优选5-7％，
    末端为半乳糖的N-聚糖，其相对含量为1-5％，优选2-4％；
    以及/或者，
    γ链中Asn24位点上的N聚糖包括：
    A2BG1S1，其相对含量为4-10％，优选6-8％，
    FA2BG1S1，其相对含量为20-30％，优选24-28％，
    FA2BG2S1，其相对含量为3-8％，优选5-7％，
    A2BG2S2，其相对含量为9-18％，优选11-14％，
    FA2BG2S2，其相对含量为20-30％，优选25-28％，
    F2A2BG2S2，其相对含量为4-10％，优选6-8％，
    带有岩藻糖基和乙酰唾液酸的三天线或四天线分支型N-聚糖，其相对含量为5-12％，优选6-10％；
    其中，N-聚糖的相对含量是指，在某个位点上含有该特定N-聚糖的凝血因子X激活酶分子的数量占凝血因子X激活酶所有分子总数量的百分比。
  8. 根据权利要求1-7中任一项所述的凝血因子X激活酶，其特征在于，所述凝血因子X激活酶来源于圆斑蝰蛇(Daboia russelii siamensis)；优选地，所述凝血因子X激活酶是从圆斑蝰蛇的蛇毒中提取获得，或者是通过基因工程的方法获得。
  9. 一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-8中任一项所述的凝血因子X激活酶，以及药学上可接受的载体。
  10. 一种止血或治疗出血性疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的权利要求1-8中任一项所述的凝血因子X激活酶或权利要求9所述的药物组合物。
  11. 权利要求1-8中任一项所述的凝血因子X激活酶或权利要求8所述的药物组合物在制备止血或治疗出血性疾病的药物中的应用。
  12. 根据权利要求10所述的方法或权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的出 血性疾病包括外科创面出血、内科出血性疾病、遗传性出血性疾病或凝血系统疾病；优选地，所述凝血系统疾病包括血友病；进一步优选地，所述血友病为伴抑制物的血友病；更进一步优选地，所述血友病为血友病A或血友病B。
  13. 一种分离的编码权利要求1-8中任一项所述的凝血因子X激活酶的核酸分子。
  14. 一种包含权利要求13所述的核酸分子的载体。
  15. 一种分离的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1-8中任一项所述的凝血因子X激活酶、权利要求13所述的核酸分子或权利要求14所述的载体。
  16. 一种制备权利要求1-8中任一项所述凝血因子X激活酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
    a)在能有效表达凝血因子X激活酶的条件下培养权利要求15所述的宿主细胞；
    b)从宿主细胞中获得所表达的凝血因子X激活酶。
  17. 一种对权利要求1-8中任一项所述的凝血因子X激活酶进行糖基化修饰的方法，其特征在于，所述方法为通过基因工程改造宿主细胞使其能够产生具有预定的N-糖基化修饰的凝血因子X激活酶，和/或利用糖基化相关酶类处理凝血因子X激活酶使其具有预定的N-糖基化修饰。
  18. 一种制备权利要求1-8任一项所述凝血因子X激活酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
    a)获取圆斑蝰蛇蛇毒原液；
    b)将蛇毒原液经过分离纯化提取获得权利要求1-8任一项所述的凝血因子X激活酶。
  19. 一种从圆斑蝰蛇中提取凝血因子X激活酶的方法，其特征在于，所述方法依次包括如下步骤：
    (a)获取圆斑蝰蛇蛇毒原液样品；
    (b)将样品进行阴离子交换层析；
    (c)完成阴离子交换层析纯化之后，将样品进行阳离子交换层析；
    (d)获得凝血因子X激活酶。
  20. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析和阳离子交换层析均只进行一次。
  21. 根据权利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析之后不再进行其他纯化步骤，或者，在阳离子交换层析之后进一步包含分子筛层析步骤，且不再进行其他纯化步骤。
  22. 根据权利要求19-21任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析的层析柱填料介质为琼脂糖或聚合物；
    优选地，所述填料为琼脂糖介质的层析柱选自Sepharose H.P.、Sepharose F.F.、Capto、或Diamond，更优选为Q Sepharose H.P.、Q Sepharose F.F.、Capto Q、EDAE-Sepharose FF、Diamond Q或Diamond MIX-A；
    优选地，所述填料为聚合物介质为聚苯乙烯/苯二乙烯、聚丙烯酸酯或二乙基氨基乙基；优选地，所述填料为聚合物介质的层析柱为NenoGel 50 Q、UniGel 65 Q HC或UniGel 30DEAE。
  23. 根据权利要求19-22任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析的洗脱液为含NaCl的pH值为8.0-8.6的Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM-30mM，NaCl的浓度为0.1M-0.5M；
    优选地，Tris-HCl缓冲液的pH值为8.5，Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM；NaCl的浓度为0.4M；
    优选地，所述阴离子交换柱层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为80cm/小时-120cm/小时，更优选为90cm/小时。
  24. 根据权利要求19-23任一项所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析的层析柱填料介质为琼脂糖或聚合物；
    优选地，所述填料介质为琼脂糖的层析柱选自Capto SP ImpRes、CM Beads 6FF或Diamond MMC；
    优选地，所述聚合物介质优选为聚苯乙烯/苯二乙烯；优选地，所述填料为聚合物的层析柱为NenoGel 50 SP。
  25. 根据权利要求19-24任一项所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析洗脱液为含NaCl的pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液的浓度为10mM-30mM，NaCl的浓度为0.2M-0.6M；
    优选地，所述磷酸缓冲液的pH值为6.8，磷酸缓冲液的浓度为10mM；NaCl的浓度为0.4M；
    优选地，阳离子交换柱层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为40cm/小时-100cm/小时，更优选为60cm/小时。
  26. 根据权利要求19-25任一项所述方法，其特征在于，在阴离子交换层析之前，还进一步包含分子筛层析、肝素亲和层析和/或疏水层析。
  27. 根据权利要26所述方法，其特征在于，所述分子筛的层析柱填料选自凝胶过滤介质，优选为Sephacryl、Superdex或Sephadex；进一步优选为Sephacryl S-200HR，Superdex75pg、Superdex200pg或SephadexG25；
    优选地，所述分子筛的洗脱液为pH值为8.0-8.6的Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM-30mM；优选地，Tris-HCl缓冲液pH值为8.5，浓度为20mM；
    优选地，分子筛层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为40cm/小时-120cm/小时，更优选为60cm/小时。
  28. 根据权利要26所述方法，其特征在于，肝素亲和层析的层析柱填料选自琼脂糖介质；优选为Capto heparin、Heparin Berpharose F.F.、Heparin Sepharose 6F.F.、Heparin Sepharose H.P.；
    优选地，所述肝素亲和层析的洗脱液为含NaCl的pH值为7.6-8.4的Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM-30mM，NaCl的浓度为0.5M-1.5M；
    优选地，Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0，Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM；NaCl的浓度为1.0M；
    优选地，肝素亲和层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为40cm/小时-120cm/小时，更优选为60cm/小时。
  29. 根据权利要26所述方法，其特征在于，疏水层析的层析柱填料选自琼脂糖介质；优选为Butyl Bestarose HP；
    优选地，所述疏水层析的洗脱液为含NaCl的pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液的浓度为10mM-30mM，NaCl的浓度为0.5M-2.5M；
    优选地，磷酸缓冲液的pH值为7.0，磷酸缓冲液的浓度为20mM；NaCl的浓度为1.0M；
    优选地，疏水层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时，优选为40 cm/小时-120cm/小时，更优选为60cm/小时。
  30. 根据权利要求19-29中任一项所述方法，其特征在于，在所述阳离子交换层析之后，还进一步包含分子筛层析；
    优选地，所述分子筛层析的填料选自凝胶过滤介质，优选为Sephacryl、Superdex或Sephadex；进一步优选为Sephacryl S-200HR，Superdex75pg、Superdex200pg或SephadexG25。
    优选地，所述分子筛层析的洗脱液为pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液浓度为40mM-80mM；更优选为磷酸缓冲液pH值为6.8，浓度为50mM；
    优选地，所述分子筛层析的洗脱流速为5cm/小时-80cm/小时，优选为10cm/小时-35cm/ 小时，更优选为20cm/小时。
  31. 根据权利要求19-30任一项所述的方法，其特征在于，在进行阴离子交换层析之后、阳离子交换层析之前，还包括超滤步骤；
    优选地，所述超滤的具体步骤为：收集阴离子交换层析的目标峰对应的组分用超滤膜浓缩5-20倍，再将目标峰对应的组分所在的溶液置换成10mM-30mM磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的pH值为6.5-7.5，超滤膜的截留分子量为10kD-50kD；
    更优选地，磷酸缓冲液的浓度为20mM，pH值为6.8，超滤膜截留分子量为30kD，浓缩倍数为10倍。
  32. 根据权利要求19-31任一项所述的方法，其特征在于，在获得蛇毒原料液样品之后，进行阴离子层析纯化之前，还包括将蛇毒原料液进行病毒灭活处理的步骤；优选地，所述病毒灭活处理为S/D法进行病毒灭活处理。
  33. 根据权利要求19-32任一项所述的方法，其特征在于，所述凝血因子X激活酶为权利要求1-8中任一项所述的凝血因子X激活酶。
PCT/CN2023/088276 2022-04-14 2023-04-14 一种凝血因子x激活酶及其应用 WO2023198171A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210394772 2022-04-14
CN202210394772.2 2022-04-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023198171A1 true WO2023198171A1 (zh) 2023-10-19

Family

ID=88329015

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2023/088276 WO2023198171A1 (zh) 2022-04-14 2023-04-14 一种凝血因子x激活酶及其应用

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202346582A (zh)
WO (1) WO2023198171A1 (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5589572A (en) * 1994-10-28 1996-12-31 Cor Therapeutics, Inc. Process for production of inhibited forms of activated blood factors
CN101104847A (zh) * 2007-04-30 2008-01-16 锦州奥鸿药业有限责任公司 圆斑蝰蛇蛇毒凝血x因子激活酶及其提取方法与应用
CN107106662A (zh) * 2014-10-23 2017-08-29 Q-塞拉有限公司 改善的凝血组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5589572A (en) * 1994-10-28 1996-12-31 Cor Therapeutics, Inc. Process for production of inhibited forms of activated blood factors
CN101104847A (zh) * 2007-04-30 2008-01-16 锦州奥鸿药业有限责任公司 圆斑蝰蛇蛇毒凝血x因子激活酶及其提取方法与应用
CN107106662A (zh) * 2014-10-23 2017-08-29 Q-塞拉有限公司 改善的凝血组合物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein 31 December 2012 (2012-12-31), ANONYMOUS : "factor X activator light chain 2 [Daboia siamensis] ", XP093099560, retrieved from NCBI Database accession no. ADK22819 *
GOWDA D CHANNE, JACKSONQ CRAIG M, HENSLEY PRESTON, DAVIDSON EUGENE A: "Factor X-activating Glycoprotein of Russell's Viper Venom - POLYPEPTIDE COMPOSITION AND CHARACTERIZATION OF THE CARBOHYDRATE MOIETIES", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 269, no. 14, 8 April 1994 (1994-04-08), pages 10644 - 10650, XP093099565 *
TAKEYASG HIROYUKI, NISHIDAS SHINJI, MIYATAZQ TOSHIYUKI, KAWADAZ SOH-ICHIRO, SAISAKALL YUKARI, MORITAII TAKASHI, IWANAGAS SADAAKI: "Coagulation Factor X Activating Enzyme from Russell's Viper Venom (RVV-X) - A NOVEL METALLOPROTEINASE WITH DISINTEGRIN (PLATELET AGGREGATION INHIBITOR)-LIKE AND C-TYPE LECTIN-LIKE DOMAINS", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 267, no. 20, 15 July 1992 (1992-07-15), pages 14109 - 14117, XP093099562 *
XIE YUN, XU YUN-LU: "Purification and Haemostatic Effect of Factor X Activator from Venom of Vipera Russellii in Guangxi", CHINA PRACTICAL MEDICINE, CN, vol. 5, no. 24, 31 August 2010 (2010-08-31), CN , pages 9 - 11, XP009549745, ISSN: 1673-7555, DOI: 10.14163/j.cnki.11-5547/r.2010.24.029 *
YEE KHIN THAN, TONGSIMA SISSADES, VASIEVA OLGA, NGAMPHIW CHUMPOL, WILANTHO ALISA, WILKINSON MARK C., SOMPARN POORICHYA, PISITKUN T: "Analysis of snake venom metalloproteinases from Myanmar Russell's viper transcriptome", TOXICON, ELMSFORD, NY, US, vol. 146, 1 May 2018 (2018-05-01), US , pages 31 - 41, XP093099485, ISSN: 0041-0101, DOI: 10.1016/j.toxicon.2018.03.005 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202346582A (zh) 2023-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ERNST et al. Expression in Escherichia coli, purification and characterization of heparinase I from Flavobacterium heparinum
EP0656061B1 (en) Novel glycoforms of soluble complement receptor 1
TWI234583B (en) Hyperglycosylated analogs of human erythropoietin and pharmaceutical composition thereof, DNA sequences encoding said analogs, and host cells comprising said sequences
US5547931A (en) Methods of stimulatory thrombocytopoiesis using modified C-reactive protein
NO301132B1 (no) Fremgangsmåte til fremstilling av superoksid dismutase
BRPI0711898A2 (pt) composiÇço de proteÍna da eritropoietina substancialmente homogÊnea, composiÇço farmacÊutica, e, mÉtodos de aumentar hematàcrito em um mamÍfero, e de produzir uma composiÇço de eritropoietina
KR20020011138A (ko) 히루디나리아 마닐렌시스 유래의 히알루로니다아제, 분리,정제 및 재조합적 제조 방법
JP2002513560A (ja) 組換えヘパラナーゼを発現させるための遺伝的に改変された細胞及び方法、並びに組換えヘパラナーゼの精製方法
CN101875693B (zh) 具备抗血管生成活性的白蛋白变异体及其制备方法
CN102690354B (zh) 重组二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白及其哺乳动物细胞高效表达系统
JP2016535062A (ja) 特異的補体系を標的化する阻害剤ならびにその調製方法および使用
WO2014140103A2 (en) Thrombin sensitive coagulation factor x molecules
CN110950967A (zh) 抗人血清白蛋白纳米抗体与il-2融合蛋白及制备方法
JP2013515474A (ja) 組換え体ｈ因子ならびにそのバリアントおよびコンジュゲート
US20090029907A1 (en) Recombinant Method for Production of an Erythropoiesis Stimulating Protein
CN112424346A (zh) 溶解的腺三磷双磷酸酶、方法和用途
RU2648144C2 (ru) КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ГЕТЕРОГЕННЫЕ ПОПУЛЯЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Ха
WO2023198171A1 (zh) 一种凝血因子x激活酶及其应用
CN116589560B (zh) 生物合成重组人源化纤连蛋白以及制备方法
CN113527523B (zh) 一种重组蛋白及其构建方法和用途
CN104845949B (zh) RGD‑重组葡激酶‑人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用
CN113527524A (zh) 重组蛋白及其构建方法和用途
CN106943588A (zh) 热休克蛋白gp96在治疗银屑病中的应用
CA2332571A1 (en) Novel sugar chain-bonded thrombomodulin-like peptide
WO1999057147A1 (fr) Mutants de la thrombopoietine humaine

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23787813

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1