CN112424346A - 溶解的腺三磷双磷酸酶、方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及溶解的腺三磷双磷酸酶多肽的设计和治疗用途、药物组合物、用于预防和治疗组织损伤的治疗用途和方法。
Description
技术领域
本发明涉及溶解的腺三磷双磷酸酶多肽的设计和治疗用途、药物组合物、以及用于预防和治疗组织损伤的方法。
背景技术
腺三磷双磷酸酶(ATP-二磷酸酶、腺苷二磷酸酶、ADP酶、或ATP二磷酸水解酶)是质膜结合的针对二磷酸核苷酸和三磷酸核苷酸(NDP和NTP)二者都具有活性的酶的酶组，并在两个不同的连续磷酸盐释放步骤中以NDP为中间体将NTP水解成核苷酸一磷酸(NMP)。大多数在细胞表面发生并水解细胞外核苷酸的外部ATP酶属于该酶家族。它们与通过水解ATP和ADP二者来特异性水解ATP的ATP酶不同。
第一种已知的人腺三磷双磷酸酶(外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(基因：ENTPD1，蛋白质：NTPD酶1)，也称为分化簇39(CD39，UniProt P49961，或SEQ ID NO:1))是位于细胞表面的酶，具有面向细胞外的催化位点(extracellularly facing catalytic site)。
在已知的人CD39家族中，成员CD39L3被称为外部-腺三磷双磷酸酶(外部-ATPD酶)，其在CD39和CD39L1(外部-ATP酶)之间具有生物化学活性。具体地，人CD39L3已被溶解并纯化以用于治疗目的，例如，如在US 7247300 B1(通过援引并入本文)中所披露的或作为SEQ ID NO:3包括在本文中。
发明内容
本披露尤其基于如下意想不到的发现：溶解的人腺三磷双磷酸酶(如人CD39)的某些修饰导致具有惊人活性的蛋白质，该蛋白质仍然是安全且易于制造的。
根据本发明的第一方面，提供了一种溶解的人腺三磷双磷酸酶，其具有至少两个修饰，这些修饰选自由以下组成的列表：N末端缺失、C末端缺失和中心修饰。
在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶包含N末端缺失、C末端缺失和修饰缺失。
在一个实施例中，中心修饰包含一个或多个氨基酸的缺失。在另一个实施例中，中心修饰包含一个或多个氨基酸的点突变，如取代突变。在又另一个实施例中，中心修饰是一个或多个氨基酸的缺失和一个或多个氨基酸的点突变(如取代突变)的组合。
N末端缺失可以是从根据SEQ ID NO:1的野生型CD39序列的N末端缺失的30与50个氨基酸之间，如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸的缺失。在优选的实施例中，N末端缺失是34、37、38或45个氨基酸。
C末端缺失可以是从根据SEQ ID NO:1的野生型CD39序列的C末端缺失的20与40个氨基酸之间，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸的缺失。在优选的实施例中，C末端缺失是22、29或37个氨基酸。
中心缺失可以是从根据SEQ ID NO:1的野生型CD39序列缺失的10与15个连续氨基酸之间，如10、11、12、13、14或15个氨基酸的缺失。在优选的实施例中，中心缺失是12个氨基酸，如与根据SEQ ID NO:1的野生型CD39序列相关的氨基酸编号193至204。
在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶包含与根据SEQ ID NO:1的野生型CD39序列相关的一个、两个、三个、四个或五个点突变，这些突变选自由以下组成的组：K71E、N73Q、V95A、G102D、Y104S、T106S、R113M、L149M、V151A、E173D、T229A、L254M、K258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、I319T、N327Q、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412F、L424Q、H436D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P463S、和S469R。
在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶包含如下序列，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:76、和SEQ ID NO:78。
在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶包含如下序列，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:141。
在一个具体的实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶包含如下序列，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:227、SEQ IDNO:217、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:229。
在一个具体的实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶由如下序列组成，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:227、SEQ IDNO:217、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:229。
在优选的实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶包含如下序列，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:229。
在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:58。在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:72。在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:229。
在优选的实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶由如下序列组成，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:229。
在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶由SEQ ID NO:58组成。在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶由SEQ ID NO:72组成。在一个实施例中，溶解的人腺三磷双磷酸酶由SEQ ID NO:229组成。
根据本发明的第二方面，本发明涉及包含治疗有效剂量的根据本发明第一方面的腺三磷双磷酸酶的药物组合物，并提供了一种或多种药学上可接受的运载体。
在一个实施例中，药物组合物进一步包含一种或多种另外的活性成分。
根据本发明的第三方面，提供了用作药物的分离的根据第一方面的腺三磷双磷酸酶。
根据本发明的第四方面，提供了用于治疗组织损伤的分离的根据第一方面的腺三磷双磷酸酶。
组织损伤可以是急性脑损伤(中风)；急性多器官衰竭；肾脏或其他实体器官移植后移植物功能延迟；烧伤；辐射损伤；由于创伤和/或缺氧引起的急性损伤，如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或肺损伤；急性肾损伤，如继发于胸外科手术(例如主动脉瓣置换术、冠状动脉旁路手术)或败血症或横纹肌溶解症或抗生素或其他药物的毒性作用的急性肾损伤；急性心肌损伤。
在另一个实施例中，本披露的第四方面涉及根据本发明第一方面的分离的腺三磷双磷酸酶，该腺三磷双磷酸酶用于治疗心脏手术相关的急性肾损伤。
在另一个实施例中，本披露的第四方面涉及根据本发明第一方面的分离的腺三磷双磷酸酶，该腺三磷双磷酸酶用于治疗移植物功能延迟(DGF)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性心肌梗死(AMI)、创伤性脑损伤(TBI)/急性缺血性中风(AIS)、缺血再灌注损伤(IRI)、或通常被称为多器官衰竭(MOF)的其组合。
在一个实施例中，用于治疗心脏手术相关的急性肾损伤的溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在一个实施例中，用于治疗心脏手术相关的急性肾损伤的溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一个实施例中，用于治疗心脏手术相关的急性肾损伤的溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列。
在另外的优选实施例中，本披露涉及根据本发明第一方面的分离的腺三磷双磷酸酶用于治疗败血症相关的急性肾损伤的用途。
在第四方面的一个实施例中，用于治疗败血症相关的急性肾损伤的溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在第四方面的一个实施例中，用于治疗败血症相关的急性肾损伤的溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
在第四方面的一个实施例中，用于治疗败血症相关的急性肾损伤的溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列。
根据本发明的第五方面，提供了治疗人受试者中的组织损伤的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的根据第一方面的溶解的人腺三磷双磷酸酶。本发明第五方面的一个实施例涉及治疗心脏手术相关的急性肾损伤的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效剂量的根据本发明第一方面的分离的腺三磷双磷酸酶。
本发明第五方面的另一个实施例涉及治疗移植物功能延迟(DGF)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性心肌梗死(AMI)、创伤性脑损伤(TBI)/急性缺血性中风(AIS)、缺血再灌注损伤(IRI)、或通常被称为多器官衰竭(MOF)的其组合的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效剂量的根据本发明第一方面的分离的腺三磷双磷酸酶。
在第五方面的一个实施例中，用于治疗心脏手术相关的急性肾损伤的方法中的溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:229的氨基酸序列。
本发明第五方面的一个实施例涉及治疗败血症相关的急性肾损伤的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效剂量的分离的根据本发明第一方面的腺三磷双磷酸酶。
在第五方面的一个实施例中，用于治疗败血症相关的急性肾损伤的方法中的溶解的人腺三磷双磷酸酶包含SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:229的氨基酸序列。组织损伤可以是急性脑损伤(中风)；急性多器官衰竭；肾脏或其他实体器官移植后移植物功能延迟；烧伤；辐射损伤；由于创伤和/或缺氧引起的急性损伤，如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或肺损伤；急性肾损伤，如继发于胸外科手术(例如主动脉瓣置换术、冠状动脉旁路手术)或败血症或横纹肌溶解症或抗生素或其他药物的毒性作用的急性肾损伤；急性心肌损伤。
根据本发明的第六方面，提供了编码根据第一方面的任何腺三磷双磷酸酶的分离的核酸分子。
根据本发明的第七方面，提供了包含根据第六方面的一种或多种核酸序列的克隆载体或表达载体，其中该载体适用于根据第一方面的分离的腺三磷双磷酸酶的重组产生。
根据本发明的第八方面，提供了包含根据第七方面的一种或多种克隆载体或表达载体的宿主细胞。
根据本发明的第九方面，提供了用于生产根据第一方面的腺三磷双磷酸酶的方法，该方法包括培养根据第八方面的宿主细胞，纯化和回收所述腺三磷双磷酸酶。
附图说明
图1是序列比对；
图2A是根据实施例通过抗APP蛋白质印迹进行的含有人CD39的上清液表达水平的表示；
图2B是根据实施例通过抗APP蛋白质印迹进行的含有半胱氨酸桥缺失的人CD39变体的上清液表达水平的表示；
图3是显示CD39变体的固相ATP酶测定结果的图；
图4是显示根据实施例用人CD39变体转化的HEK293细胞上的固相ATP切割的图。
图5是根据实施例的载体的示意性概述；
图6是基于稳态近似的酶模型；
图7是根据实施例的蛋白质的动力学数据和模型拟合的概述；
图8是根据实施例的蛋白质的动力学数据和模型拟合的概述；
图9是根据实施例的蛋白质的动力学数据和模型拟合的概述；
图10是实验条件的示意性图示；
图11是显示根据实施例的蛋白质的AMP水平的图。以及
图12是显示根据实施例的蛋白质的体内结果的图。
具体实施方式
本披露尤其基于如下意想不到的发现：溶解的CD39的某些修饰导致具有惊人活性的蛋白质，该蛋白质是安全且易于制造的。
如以下具体实例中所示，优选的实施例是一种溶解的人腺三磷双磷酸酶，其具有至少两个修饰，这些修饰选自由以下组成的列表：N末端缺失、C末端缺失和中心缺失，如包含如下序列的溶解的人腺三磷双磷酸酶，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76、和SEQ ID NO:78。
发明人尝试了若干种不同的序列修饰策略以获得兼具保留活性和待表达能力的溶解的人腺三磷双磷酸酶，同时因为免疫原性增加的风险并因此增加了安全性风险，仍未引入太多修饰。令人惊讶的是，一种被发现既增加效率又增加表达人腺三磷双磷酸酶的能力的序列修饰是中心部分的缺失，即所谓的δMIL(ΔMIL)修饰，同时不添加过多的免疫原性风险。
为了增加根据本发明实施例的溶解的人腺三磷双磷酸酶的表达，测试了N末端表达标签。各种N末端表达标签是本领域已知的，但令人惊讶的是并非所有标签都起作用。发明人发现有几个标签起作用，这是不可预见的。
这些N末端标签是SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:141。如本文所示，特别优选的标签是SEQ ID NO:133、SEQID NO:135或SEQ ID NO:137。
具体细节在以下实例9至13中列出。然而，为了展示这些实例的不可预测的性质，表1中呈现了比较总结。
表1.优选实施例的总结。
1.定义
为了便于本领域技术人员实施本发明，在整个说明书中使用以下术语。
术语“CD39”和“hCD39”在整个披露中同义使用，并且除非另有说明，否则意指根据UniProt P49961或SEQ ID NO:1的人分化簇39(CD39)。
除非另有说明，否则术语“腺三磷双磷酸酶”是指人腺三磷双磷酸酶。如本文所使用的，“溶解的腺三磷双磷酸酶”意指作为野生型蛋白质存在的与细胞膜结合的腺三磷双磷酸酶已被修饰，使得其不再与细胞膜结合而是以可溶状态存在，即不再锚定至细胞膜上。
缩写“MIL”是指膜相互作用环，其是与细胞膜相互作用的野生型(人)CD39蛋白质的中心部分，除了通过细胞膜物理锚定的N末端和C末端部分。术语“δMIL(delta MIL或ΔMIL)”是指来自野生型(人)CD39的MIL序列的缺失。
与数值x相关的术语“约”意指例如+/-10％。当在数值范围或数字列表前使用时，术语“约”适用于系列中的每个数字，例如，短语“约1-5”应被解释为“约1-约5”，或例如，短语“约1、2、3、4”应被解释为“约1、约2、约3、约4等”。
词语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在必要的情况下，可以从本披露的定义中省略词语“基本上”。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括另外的一些，例如X+Y。
关于天然多肽及其功能衍生物的“同一性”在本文中定义为：在比对序列并且引入空位(如果需要的话)以实现最大同一性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中氨基酸残基与相应天然多肽的残基相同的百分比。N-末端或C-末端延伸与插入均不应解释为降低同一性。用于比对的方法及计算机程序是熟知的。百分比同一性可通过标准比对算法来确定，例如Altshul等人描述的基本局部比对搜索工具(BLAST)((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],215:403 410)；Needleman等人的算法((1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:444 453)；或Meyers等人的算法((1988)Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用],4:11 17)。一组参数可以是具有空位罚分12、空位延伸罚分4、以及移码空位罚分5的Blosum 62评分矩阵。也可使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS,4:11-17)的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性。
“一个或多个氨基酸”是指例如所有天然存在的L-α-氨基酸并且包括D-氨基酸。短语“氨基酸序列变体”是指与根据本披露的序列相比在其氨基酸序列中具有一些差异的分子。根据本披露的蛋白质(例如，指定序列)的氨基酸序列变体，仍然具有腺三磷双磷酸酶活性。氨基酸序列变体包括取代性变体(去除至少一个氨基酸残基且在根据本披露的多肽中的相同位置插入不同氨基酸的那些变体)、插入性变体(紧邻根据本披露的多肽中的特定位置处的氨基酸插入一个或多个氨基酸的那些变体)以及缺失性变体(在根据本披露的多肽中去除一个或多个氨基酸的那些变体)。
术语“治疗(treatment或treat)”在本文中定义为：向受试者应用或施用根据本发明的腺三磷双磷酸酶，或者向受试者或来自受试者的分离的组织或细胞系应用或施用包含所述腺三磷双磷酸酶的药物组合物，其中该受试者具有组织损伤，与组织损伤相关的症状，其目的是尤其是通过降低细胞外ATP的水平来缓解、减轻或改善组织损伤或与组织损伤相关的任何症状。
“治疗”还旨在向受试者应用或施用包含腺三磷双磷酸酶的药物组合物，或者向来自受试者的分离的组织或细胞系应用或施用包含本发明的腺三磷双磷酸酶的药物组合物，其中该受试者具有组织损伤或与组织损伤相关的症状，其目的是缓解、减轻或改善组织损伤或与组织损伤相关的任何症状。
术语“预防(prevent/preventing)”是指预防性(prophylactic/preventative)处理；其关注的是延迟或防止与之相关的疾病、障碍和/或症状的发作。
如本文所使用的，如果受试者将在生物学上、在医学上或在生活质量上从治疗中获益，则这类受试者是“需要”这种治疗的。
术语“药学上可接受的”意指不干扰一种或多种活性成分的生物活性的有效性的无毒性材料。
如本文所使用的，术语“施用(administration/administering)”主题化合物意指向需要治疗的受试者提供本发明的化合物及其前药。与一或多种其他治疗剂“组合”施用包括以任何顺序和任何施用途径同时(并行)施用和连续施用。
如本文所使用的，“治疗有效剂量”是指腺三磷双磷酸酶在以单剂量或多剂量向患者(如人)施用时有效地治疗、预防、防止发病、治愈、延迟、降低严重程度、减轻障碍或复发障碍的至少一种症状、或延长患者的存活期超出无此治疗存在时所预期存活期的剂量(量)。当应用于单独施用的单独活性成分(例如腺三磷双磷酸酶)时，该术语是指单独的该成分。当应用于组合时，该术语是指产生治疗作用的活性成分(无论连续还是同时组合施用)的组合剂量或量。
短语“剂量方案”意指用于治疗疾病的方案，例如在组织损伤治疗期间使用的给药方案。
短语“施用装置”用于表示向患者全身性地施用药物的任何可用器具，包括但不限于预填充注射器、小瓶及注射器、注射笔、自动注射器、静脉内(i.v.)滴注器和袋、泵、贴片泵等。使用这些物品，患者可自施用药物(即自行施用药物)，或可由医师施用药物。
2.实例1：无膜CD39
野生型人腺三磷双磷酸酶CD39(hCD39，UniProt P49961或SEQ ID NO:1)通过N-末端的跨膜结构域(推定的aa 17-37)、中心推定的膜相互作用环(MIL推定的aa 193-204)和C-末端的跨膜结构域(推定的aa479-499)天然锚定在细胞膜中。为了能够使用哺乳动物宿主细胞表达CD39的可溶变体，已经修饰了CD39序列的若干个元件以获得无膜的或溶解的蛋白质。天然前导序列和N-末端跨膜区被分泌前导序列和纯化标签(SEQ ID NO:133)取代。已经改变CD39的细胞外结构域的边界以优化表达、纯化和活性参数(分别为SEQ ID NO:1的氨基酸编号38-476、SEQ ID NO:1的氨基酸编号39-469、SEQ ID NO:1的氨基酸46-461、和SEQID NO:1的氨基酸46-476)。通过用丙氨酸取代半胱氨酸或通过缩短由二硫桥(SEQ ID 107、109、111、113和115)构成的环，系统地评估半胱氨酸和二硫桥对聚集倾向和酶活性的影响。在大鼠CD39的结构工作(Zebisch等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志](2012),415,288-306，野生型大鼠CD39，Uniprot P97687，列出在SEQ ID NO:2中)中描述了一段疏水性氨基酸，并且据认为，该环可能与细胞膜(MIL)相互作用。我们通过序列比对将结果翻译成人CD39序列，并生成具有环缺失的CD39变体(CD39ΔMIL或EP28，如SEQ ID NO:4中所列出的)。评估MIL的缺失(或δ/Δ)对功能性CD39的表达水平和热稳定性的影响。
从图1(显示了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的序列比对)中可以看出，N末端氨基酸1至27、C末端氨基酸477至510和中心膜相互作用环(MIL)氨基酸193至204从wtCD39(SEQ IDNO:1)缺失以形成CD39ΔMIL(SEQ ID NO:4)。
研究了不同序列修饰对热稳定性的影响。此外，研究了不同序列修饰对CHO细胞表达产率和单体含量的影响。
(1)方法
(a)表达质粒的生成
编码不同hCD39边界变体和膜相互作用环(MIL)缺失的DNA序列在GeneArt(生命技术公司(Life Technologies Inc.)，雷根斯堡(Regensburg)，德国)处订购，包括针对智人的密码子优化。通过标准分子生物学技术将编码hCD39变体的序列从GeneArt衍生的载体或其内部生成的变体亚克隆到适用于在哺乳动物细胞中分泌的表达载体中。存在于半胱氨酸桥缺失变体中的半胱氨酸至丙氨酸突变被经修饰的寡核苷酸靶向，并且在随后的组装PCR步骤后，将生成的片段亚克隆到先前提及的相同表达载体中。表达载体的元件包括启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和吉欧霉素标记)。表2中展示了截短的、溶解的人CD39版本的列表，其中氨基酸修饰参考SEQ ID NO:1进行编号。
表2.截短的、溶解的人CD39版本。
(b)hCD39变体的微规模表达
选择293-6E细胞(如WO 2006096989 A2中所披露，通过援引并入本文)用于微规模实验，将其作为在不存在血清的情况下瞬时表达蛋白质的优选宿主细胞系之一。使用FuGene HD(罗氏应用科学部(Roche Applied Science)，目录号04709705001)作为转染试剂进行转染。使用V3无血清培养基(生物概念公司(Bioconcept)，目录号V3-K)在悬浮培养中培养293-6E细胞，用于转染和繁殖细胞。细胞在Corning摇瓶(科宁公司(Corning)，特克斯贝里(Tewksbury)，马萨诸塞州)中在轨道振荡器(100-120rpm)上在5％CO2的加湿培养箱中生长(种子烧瓶)。种子培养物中的细胞应保持在指数生长期(细胞密度在5x 105与3x106/mL之间)，并且展现出>90％的转染活力。超出该范围的细胞密度将导致稀释后的迟滞期或降低的转染效率。
对于微规模(0.5ml)转染，从种子培养物中取出等分试样的细胞，并在V3无血清培养基中调节至0.5x 106个细胞/mL。通过在14μl的V3无血清培养基中稀释0.5μg的hCD39表达质粒来制备DNA溶液(称为溶液1)，然后也将2.3μl的FuGene HD溶液稀释于14μl的V3无血清培养基中(溶液2)。将两种溶液在室温(RT)下孵育5-10min。此后，在温和混合下将溶液2添加到溶液1中，并在室温下再孵育5-15分钟。然后将转染混合物以0.5x 106个细胞/mL添加到0.5ml的细胞中，接种于48孔组织培养板(科宁公司，特克斯贝里，马萨诸塞州)中，并将板置于在5％CO2的加湿培养箱中的轨道振荡器(300rpm)上。转染后3天通过在4℃下以4000rpm离心10分钟来收获培养物(贺利氏公司(Heraeus)，Multifuge 3S-R，赛默科技公司(Thermo Scientific)，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州)。将回收的细胞上清液储存在4℃下直至进一步处理。
(c)对微规模表达上清液进行的蛋白质印迹分析
对微规模表达上清液进行蛋白质印迹分析，以检查重组hCD39变体的表达和正确形成。将8μl的上清液稀释在E-PAGETM加载缓冲液(4x，英杰公司(Invitrogen)，#EPBNF-01)中，并在非还原条件下加载到E-Page48，8％凝胶上(英杰公司，#EP04808)。将凝胶在E基母装置(E-base mother device)(英杰公司)上运行23min，并根据制造商的说明(运行7min)使用iBlot系统(英杰公司)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(英杰公司IB301001)。在TBS/0.05Tween20(TBST)中洗涤3次后，将膜与5％乳/TBST在温和搅拌下孵育1h，随后与在2％乳/TBST中稀释的4μg/ml的抗APP小鼠抗体(诺华公司内部抗体，针对用于蛋白质标记的淀粉样前体蛋白(APP)的肽段产生)溶液孵育1hr。在另外3次洗涤步骤后，将膜与在2％乳/TBST中稀释的抗小鼠IgG-碱性磷酸酶(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，A5153-1ML)的1:1000稀释液一起孵育，并在TBST中再次洗涤3次，随后在TBS中进行冲洗步骤。根据制造商的说明使用SIGMAFASTTM 
/NBT(西格玛奥德里奇公司，#B5655-25TAB)，将信号显影1-5分钟，并通过用水冲洗膜来停止信号。
(d)固相AxP酶测定
使用Pi ColorLock Gold磷酸盐检测系统(伊诺华生物科学公司(InnovaBiosciences)，目录号303-0030)在来自微规模表达上清液(固相Axp酶测定)的板捕获的hCD39变体上确定ATP酶的、ADP酶的和AMP酶的活性。发现该方法与制造商推荐的基于溶液的测定(液相Axp酶测定)相比更不敏感，但是具有降低可能存在于微规模表达上清液中的宿主细胞酶介导的AxP酶活性的优点。将在PBS中稀释的20μl的抗APP小鼠抗体10μg/ml溶液抗体(诺华公司内部抗体，针对用于蛋白质标记的淀粉样前体蛋白(APP)的肽段产生)添加到maxisorp 384孔透明板(Nunc)的每个孔中，并在4℃下孵育过夜。用TBST洗涤三次后，在室温下在温和搅拌下使用100μl的5％乳/TBST将孔封闭1h。在另外三个洗涤步骤后，将20μl的在2％乳/TBST中连续稀释的微规模表达上清液一式三份添加到孔中，并在室温下在温和搅拌下孵育2hr。然后将孔用100μl的TBST再次洗涤四次，并用80μl的50mM Tris-Cl/5mMMgCl2 pH 7.5洗涤两次。将在50mM Tris-Cl/5mM MgCl2 pH 7.5(ATP：西格玛公司(SIGMA)A2383，ADP：西格玛公司A2754)中稀释的30μl的80μM腺苷磷酸盐溶液添加到每个一式三份中，并在37℃下孵育24hr。使用根据制造商的说明制备的7.5μl的金试剂混合物，将信号显影10分钟，并使用3μl的稳定剂停止反应。使用TECAN Genios Pro仪器读取620nm处的吸光度。
(2)结果
(a)边界、膜相互作用环(MIL)缺失和半胱氨酸桥缺失对hCD39表达水平的影响
为了评估不同hCD39变体的表达水平，将相应的表达质粒在0.5ml的293-6E细胞中一式两份转染，并在转染后3天收集的上清液上进行蛋白质印迹(抗APP检测Ab)。结果在图2A和图2B中展示。
结果表示，与aa46相比，从aa38处起始的hCD39的表达水平更高。N末端边界以及MIL缺失似乎对表达水平没有重大影响。还观察到在hCD39(aa46-461)的背景下，缺失第一或第四半胱氨酸桥的hCD39的更高表达水平。使用hCD39(aa46-461)ΔMIL骨架也证实了第一半胱氨酸桥缺失的更高表达水平。
(b)边界、膜相互作用环(MIL)缺失和半胱氨酸桥缺失对hCD39活性的影响
通过固相AxP酶测定对上述上清液样品测量CD39酶活性。结果在图3和图4以及表3中展示。
表3.对CD39变体进行的固相ATP测定
MIL的缺失似乎增加了功能性表达的CD39重组蛋白的级分。不同边界不显示对活跃的hCD39活性的任何重大影响。结果表示所有半胱氨酸桥缺失的变体的ATP酶活性强烈降低或完全消除。使用固相ADP酶测定获得了相似的结果。因此，令人惊讶的是，既提高效率又提高表达CD39的能力的序列修饰是δMIL(ΔMIL)修饰。
3.实例2：表达标签
为了改善候选物的表达特性，测试了不同的表达标签。
如表4中所列出的，测试了基于IL-2(SEQ ID NO:131)的N-末端部分的不同表达标签。根据SEQ ID NO:131，表达标签1-16aa由Geneart合成。
表4.IL-2表达标签变体概述
| 参考 | 氨基酸序列ID | 正向引物序列ID | 反向引物序列ID |
| 表达标签aa1-16 | SEQ ID NO:131 | n/a | n/a |
| 表达标签aa1-15 | SEQ ID NO:133 | SEQ ID NO:157 | SEQ ID NO:158 |
| 表达标签aa1-6 | SEQ ID NO:135 | SEQ ID NO:159 | SEQ ID NO:158 |
| 表达标签aa1-3 | SEQ ID NO:137 | SEQ ID NO:161 | SEQ ID NO:158 |
| 表达标签aa1-9 | SEQ ID NO:139 | SEQ ID NO:162 | SEQ ID NO:158 |
| 表达标签aa1-12 | SEQ ID NO:141 | SEQ ID NO:163 | SEQ ID NO:158 |
| 表达标签aa4-12 | SEQ ID NO:143 | SEQ ID NO:164 | SEQ ID NO:158 |
如SEQ ID NO:4中所列出的，测试了与CD39ΔMIL相关的所有表达标签。所有构建体都包括APP标签和His标签。
如图5中所列出的，载体pRS5a用于表达。引物对如在表4中所列出的。
在所有情况下退火温度均为64℃。
通过混合1μl模板DNA储备液，25μl Kapa高保真热启动聚合酶(来自卡帕生物系统公司(kappa Biosystems)/KK2602)来制备PCR溶液。1.5μl正向引物，1.5μl反向引物，并用H2O将终体积调节至50μl。
根据表5中的时间表运行PCR反应。
表5.PCR时间表
完成PCR反应后，根据制造商的说明，使用
SV凝胶和PCR清除试剂盒(PCR Clean-Up Kit)(普洛麦格公司(Promega)，编号9282，1柱，在30μl中洗脱)进行DNA提取。
在CutSmart(R)缓冲液中用新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，NEB)提供的酶NruI-HF(NEB#R3192)和NotI-HF(NEB#R3189)切割插入物和载体。反应时间在37℃下3h。
根据生产者的有效方案，用快速DNA去磷酸化(Rapid DNA Dephosphorylation)和连接试剂盒(Ligation Kit)(Fa.罗氏公司，编号04898117001)的去磷酸化载体进行过夜连接。
第二天，挑选单菌落用于DNA-微量制备并用正向引物P270(SEQ ID NO:165)和反向引物P271(SEQ ID NO:166)进行序列分析。
此外，根据表6，测试了本领域已知的一些增加表达的蛋白质序列。
表6.现有技术标签
| 参考 | 序列标识符 |
| 泛素 | SEQ ID NO:167 |
| Cκ | SEQ ID NO:168 |
| HSA结构域I | SEQ ID NO:169 |
| HSA结构域II | SEQ ID NO:170 |
测试的所得组合在表7中列出。
表7.测试的构建体
来自表6的现有技术标签均未给出蛋白质的表达(数据未显示)。这是意想不到的，因为现有技术教导这些序列应该增加表达。
4.实例3：其他突变
为了改善可溶CD39的特征并使其适用于药物开发，在SEQ ID NO:4中列出的CD39ΔMIL、EP28中引入了其他修饰。不同的突变和突变的变体见于表8中，并根据如SEQ ID NO:1中所列出的野生型CD39的氨基酸位置编号。
表8.点突变
活性位点中的两个突变导致更高的活性(365和412)。
5.实例4：糖基化位点去除
基于上述EP14变体，通过引入根据表9的点突变来检查糖基化位点的作用，所述点突变根据如SEQ ID NO:1所列出的野生型CD39的氨基酸位置编号。
表9.糖基化位点突变
| 突变位置 | 糖基化位点 | 引物 |
| N73Q | NDT | P928/P929 |
| T229A | NQT | P930/P931 |
| N292Q | NVS | P932/P933 |
| N327Q | NTS | P934/P935 |
| N371Q | NLT | P936/P937 |
| N457Q | NLT | P938/P939 |
(a)材料与方法
将表达载体pRS5a(图5)用于克隆。使用如在表10中所列出的引物。
表10.引物序列
| 引物 | 序列 | 描述 |
| P928 | SEQ ID NO:171 | 用于去除糖基化位点N73Q的正向引物 |
| P929 | SEQ ID NO:172 | 用于去除糖基化位点N73Q的反向引物 |
| P930 | SEQ ID NO:173 | 用于去除糖基化位点T229A的正向引物 |
| P931 | SEQ ID NO:174 | 用于去除糖基化位点T229A的反向引物 |
| P932 | SEQ ID NO:175 | 用于去除糖基化位点N292Q的正向引物 |
| P933 | SEQ ID NO:176 | 用于去除糖基化位点N292Q的反向引物 |
| P934 | SEQ ID NO:177 | 用于去除糖基化位点N327Q的正向引物 |
| P935 | SEQ ID NO:178 | 用于去除糖基化位点N327Q的反向引物 |
| P936 | SEQ ID NO:179 | 用于去除糖基化位点N371Q的正向引物 |
| P937 | SEQ ID NO:180 | 用于去除糖基化位点N371Q的反向引物 |
| P938 | SEQ ID NO:181 | 用于去除糖基化位点N457Q的正向引物 |
| P939 | SEQ ID NO:182 | 用于去除糖基化位点N457Q的反向引物 |
根据制造商的说明，使用QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(安捷伦公司(Agilent)，编号210519-5)进行PCR。
第二天，挑选单菌落用于DNA-微量制备并用正向引物P270(SEQ ID NO:165)和反向引物P271(SEQ ID NO:166)进行序列分析。
同样地，为了确保载体骨架的正确性(由于诱变)，使用以下方法将测序的插入物片段克隆到pRS5a(图5)的新载体骨架中。
使用SEQ ID NO:36(具有表达标签SEQ ID NO:135，含有APP_HIS-标签，储备液浓度3.3μg/μl)的载体骨架制备载体。
通过混合10μg载体-DNA、0.4μl HindIII(100U/μl，NEB)、2μl EcoRI(20U/μl，NEB)、5μl Cutsmart缓冲液10x浓度(NEB)、H2O至终体积为50μl，来消化载体。将消化在37℃下运行3h。
用碱性磷酸酶，牛小肠(CIP，NEB，编号M0290L，10U/μl)进行去磷酸化。消化后直接将3μl的CIP添加到消化的载体中，并在37℃下孵育30min。将消化的和去磷酸化的载体加载到制备型0.8％TAE琼脂糖凝胶上，切下了约6100bp的载体的正确条带大小。用
SV凝胶和PCR清除试剂盒(普洛麦格公司，编号9282，1柱，在100ul中洗脱)进行清除。OD260nm显示浓度为64ng/μl。
通过混合42.5μl DNA(每种DNA约3-5ug)、5μl Cutsmart缓冲液(10x浓度，NEB编号B7204S)、0.4μl HindIII-HF(100U/μl，NEB编号R3104S)、2μl EcoRI-HF(20U/μl，NEB编号R3103L)，并用H2O调节体积至50μl，进行突变的插入物片段的消化。消化在37℃下在PCR仪中进行3h。将消化的插入物加载到制备型0.8％TAE琼脂糖凝胶上，切下了约1400bp的载体的正确条带大小。用
SV凝胶和PCR清除试剂盒(普洛麦格公司，编号9282，1柱，在30μl中洗脱)进行清除。OD260nm显示浓度为1-25ng/μl。
使用(载体:插入物比例约1:10)，用快速DNA连接试剂盒(编号K1423，Fa.赛默科技公司)进行连接。将4μl 5x连接缓冲液与1μl连接酶、2μl载体片段(HindIII/EcoRI消化的，储备液浓度64ng/μl)、13μl插入物片段(HindIII/EcoRI消化的，储备液浓度1-25ng/μl)混合。将连接在RT下运行10分钟。
通过将10μl的连接与80μl化学感受态XL1Blue细胞(诺华公司，FS/RL)在冰上孵育30min进行转化。在Eppendorf培养箱中在42℃下热休克45sec，随后在冰上孵育2min。之后，添加1ml 2YT培养基，随后在Eppendorf振荡器(800rpm)上在37℃下孵育1.5h。将细胞以7000rpm离心3min，并将菌落铺板在LB/Carb/Gluc上。板，随后在37℃下孵育过夜。
第二天，挑选单菌落用于DNA-微量制备并用正向引物P270(SEQ ID NO:165)和反向引物P271(SEQ ID NO:166)进行序列分析。
根据7天的表达，200ml规模将正确的序列转染到HEK293细胞中。
使用了以下材料：
组成型表达SV40大T抗原的人胚肾细胞(HEK293-T)(例如ATCC11268)
聚乙烯亚胺“MAX”MW 40.000(PEI)(波利塞斯公司(Polysciences)，目录号24765)，在RT下溶解于H20中，用NaOH调节至pH 7.05。
M11V3无血清培养基(生物概念公司，CH，目录号：V3-K)
DNA：根据供应商推荐的方案，用凯杰公司(Qiagen)DNA试剂盒，中量制备试剂盒(Midiprep-Kit)(编号12943)制备
用于瞬时转染的所有细胞培养工作均使用在无血清M11V3培养基中生长的悬浮适应的HEK293-T细胞进行。
细胞在Corning摇瓶(科宁公司，美国)中在轨道振荡器(115rpm)上在具有5％CO2的加湿CO2培养箱中生长(种子烧瓶)。
使用的细胞已处于指数生长期(细胞密度在5x 105和3x 106/ml之间)并且具有>90％的活力。
使用已计数，并且已用M11V3培养基调节至1.4x 106个细胞/ml的相应细胞量的细胞，以小规模(此处为20/50ml或100ml)进行转染。使用终转染体积的36％细胞悬浮液。
通过在7％终体积M11V3中稀释1mg/L终体积DNA并温和混合来制备DNA溶液(溶液1)。为了防止由于未经过无菌过滤的DNA导致的培养物污染，在进料后已将Penc./Strep添加到转染中。然后，将3mg/L终体积PEI溶液在7％终体积M11V3中稀释并温和混合(溶液2)。将两种溶液在室温(RT)下孵育5-10min。此后，在温和混合下将溶液2添加到溶液1中，并在RT下再孵育5-15分钟。孵育后，将转染混合物添加到细胞中，并将培养物培养四小时(115rpm，37℃，5％CO2)。
表达7天后收获上清液。
离心4500rpm，15min，4℃(贺利氏公司，Multifuge 3S-R)
通过无菌过滤器(0.22μm，Stericup过滤器，赛默科技公司，目录号567-0020)澄清
将上清液递送至纯化用于进一步的步骤。将1ml的上清液样品用于在开放存取APP柱(Open Access APP-column)上的IPC。
样品小瓶是玻璃钳口瓶(2ml，安捷伦公司，目录号5182-0543)和帽(钳口11mm，目录号5040-4667)。
根据以下方案，使用5ml Histrap HP柱(GE生命科学公司集团(GE LifeSciences)，订购号17-5248-02)，在Aekta Pure或Aekta Avant(GE医疗集团(GEHealthcare))上使用固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化蛋白质。说明在表11中列出。
表11.IMAC方案
| CV | 流速(ml/min) | 缓冲液 | |
| 平衡 | 5 | 5 | IMAC A |
| 样品加载 | 3 | 细胞上清液 | |
| 柱洗涤 | 10 | 3 | IMAC A |
| 洗脱 | 10 | 3 | 梯度0-20％IMAC B |
| 10 | 3 | 100％IMAC B | |
| 分级 | 2ml级分 |
使用的缓冲液根据表12和表13组成。
表12.IMAC A，平衡-和洗涤缓冲液
| 浓度 | 化学物 |
| 10mM | Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> |
| 10mM | NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> |
| 500mM | NaCl |
| 20mM | 咪唑(默克公司(Merck)) |
表13.IMAC B，洗脱缓冲液
| 浓度 | 化学物 |
| 10mM | Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> |
| 10mM | NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> |
| 500mM | NaCl |
| 500mM | 咪唑(默克公司(Merck)) |
根据表14，储存所得蛋白质。
表14.构建体
| 构建体 | 突变位置 |
| C1140 | N73A/F365S |
| C1141 | T229A/F365S |
| C1142 | N292Q/F365S |
| C1143 | N334Q/F365S |
| C1144 | F365S/N371Q |
| C1145 | F365S/N457Q |
| C1058 | F365S |
(b)结果和解释
关于分析SEC的产率和单体峰，突变体没有改善。具有根据SEQ ID NO:137的表达标签的亲本蛋白(EP14)在分析中给出最佳产率和最高单体峰。用突变体N371Q实现最低产率以及最差单体峰。
6.实例5：组合
为了尝试和进一步改善特性，根据下表15组合了上述实例3中引入的一些突变。根据如SEQ ID NO:1中所列出的野生型CD39的氨基酸位置对突变进行编号。
表15.构建体的组合
(a)材料与方法
使用根据表16的引物。
表16.引物
| 引物 | 序列 |
| P878 | SEQ ID NO:183 |
| P879 | SEQ ID NO:184 |
| P880 | SEQ ID NO:185 |
| P881 | SEQ ID NO:186 |
| P882 | SEQ ID NO:187 |
| P883 | SEQ ID NO:188 |
| P884 | SEQ ID NO:189 |
| P885 | SEQ ID NO:190 |
使用以下移液方案建立PCR反应：
5μl的10x反应缓冲液、
1μl ds-DNA-模板(储备液浓度100ng/μl)、
1.5μl引物1、
1.5μl引物2、
1μl dNTP混合物
1.5μl QuickSolution公司(QuickSolution)试剂、
35.5μl H2O(终体积为50μl)、和
1μl QuickChange Lightning Enzyme。
使用根据表17的PCR循环参数。
表17.PCR循环参数
反应后直接将2μl DpnI酶添加到每个反应中，混合并在37℃下孵育5min。
如下进行到XL10-金超-感受态细胞的转化。将细胞在冰上解冻。使用45μl/转化，并将2μl B-ME添加到每个小瓶中。然后，添加3μl DpnI消化的PCR产物，并在冰上在15ml BD管中孵育30min。此后，将样品热休克40秒并在冰上孵育2min。接下来，添加950μl SOC培养基，随后在37℃下在振荡培养箱中孵育1.5h。最后，将细胞铺板在LB-carb-板上并在37℃下孵育过夜。第二天，挑选单菌落用于DNA-微量制备和序列分析。
如实例4中所述，将正确的序列转染到HEK293细胞中。
根据以下使用固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化蛋白质。使用95ml上清液(保留全部的约4ml用于分析(IPC))。
使用的材料：
镍-NTA琼脂糖(凯杰公司，目录号/ID：30230)、Poly-Prep色谱柱(空，伯乐公司(BioRad)，编号731-1550)、IMAC A缓冲液pH 7.4(含有20mM NaPO4缓冲液和50mM咪唑)。IMAC B缓冲液pH 7.4(含有20mM NaPO4缓冲液和300mM咪唑)。TBS(10x浓度，用MilliQ水稀释至1x浓度)。Amicon Ultra-4离心过滤单元，具有Ultracel-10膜，10K，UFC 801096。
方法步骤：
1.用1ml凯杰公司(＝0.5ml CV)的镍-NTA-琼脂糖制备柱；
2.用10CV IMAC A平衡；
3.在柱上加载15/45ml SN(收集流过物)；
4.用10CV IMAC A洗涤(收集在15ml Falcon管中)；
5.在6.5CV的IMAC B中洗脱；
6.洗脱液浓度的确定；
7.用Amicon Ultra-4离心过滤单元10K将3.5ml样品浓缩至约400μl；
8.通过添加TBS和离心5000进行缓冲液交换；
使用具有40μl每种样品的分析SEC并使用具有12μl每种样品的蛋白质凝胶分析样品。
储存所得蛋白质。
(b)结果和解释
结果显示在表18中。
表18.结果概述
| 名称 | 产率(mg/l) | IPC(app，mg/l) | 聚集(％单体峰) |
| EP14xEP19 | 6.85 | 4.5 | 75.1 |
| EP17xEP19 | 13.35 | 11.5 | 68.9 |
| EP14xEP17 | 17.27 | 11.5 | 69.2 |
| EP10xEP19_H436D | 7.42 | 4.3 | 74.3 |
| EP19w/o H436D | 8.28 | 2.5 | 55.6 |
| EP1xEP17 | 13.46 | 13.2 | 77.4 |
| EP28 | 7.8 | 2.8 | 57.5 |
蛋白酶位点：
插入蛋白裂解酶时，没有产率/产率非常低。具有弗林蛋白酶位点时，有约40％的产率(但对于转染，同样仅使用了50％的DNA，因为它是与弗林蛋白酶质粒的共转染)。
IL2-截短：
包括aa1-3的所有截短都给出了可比较的结果，aa1-3与其他相比可能仅会略更低，但这可能是样品之间的差异。截短aa4-12导致无蛋白质表达。与所有其他EP变体一样，在含有IL2-起始和hCD39-蛋白之间的TSS接头的EP28之间没有发现差异。
组合：
与EP19(L424Q)的组合不会导致蛋白质表达的显著改善。
与EP1(R113M)组合在分析SEC中展现出更低的聚集。NEG726表达良好，但显示所有测试的最差聚集(约37％)。EP14xEP17的组合不会导致任何进一步的改善(F365S+Y412F)。
7.实例6：最终候选物的克隆
表达了如下表19中所列出的临床候选物的选择用于进一步测试。
表19.最终候选物的概述。
| 构建体 | 克隆的组合 | IL2前导序列 | 主序列 |
| 1 | EP1xEP14xEP19aa1-3 | SEQ ID NO:137 | SEQ ID NO:233 |
| 2 | EP1xEP17xEP19 aa1-3 | SEQ ID NO:137 | SEQ ID NO:217 |
| 3 | EP14aa1-3 | SEQ ID NO:137 | SEQ ID NO:229 |
| 4 | EP17aa1-3 | SEQ ID NO:137 | SEQ ID NO:237 |
| 5 | EP19aa1-3 | SEQ ID NO:137 | SEQ ID NO:243 |
| 6 | EP28aa1-3(前导/亲本) | SEQ ID NO:137 | SEQ ID NO:58 |
| 7 | EP1xEP14xEP19 aa1-6 | SEQ ID NO:135 | SEQ ID NO:235 |
| 8 | EP1xEP17xEP19 aa1-6 | SEQ ID NO:135 | SEQ ID NO:219 |
| 9 | EP14aa1-6 | SEQ ID NO:135 | SEQ ID NO:231 |
| 10 | EP17aa1-6 | SEQ ID NO:135 | SEQ ID NO:239 |
| 11 | EP19aa1-6 | SEQ ID NO:135 | SEQ ID NO:245 |
| 12 | EP28aa1-6(前导/亲本) | SEQ ID NO:135 | SEQ ID NO:80 |
使用以下引物：
表20.引物
| 引物 | 序列 |
| R113Mtempl | SEQ ID NO:191 |
| R113MFW | SEQ ID NO:192 |
| R113MRev | SEQ ID NO:193 |
| F330StempI | SEQ ID NO:194 |
| F330SFW | SEQ ID NO:195 |
| F330SRev | SEQ ID NO:196 |
| Y377FtempI | SEQ ID NO:197 |
| L389CtempI | SEQ ID NO:198 |
| Y377F/L389QtempI | SEQ ID NO:199 |
| FW | SEQ ID NO:200 |
| Rev | SEQ ID NO:201 |
| WT | SEQ ID NO:202 |
使用以下移液方案建立PCR反应：
0.25μl DMSO、
20ng载体
1.5μl插入物(45ng/μl)、
2μl 5x HF缓冲液、
0.1μl Phusion pol、
0.08μl dNTP混合物
10-Xμl ddH2O
使用根据表17的PCR循环参数。
表21.PCR循环参数
反应后直接将0.5μl DpnI酶添加到每个反应中，混合并在37℃下孵育2h。
如下进行到XL10-金超-感受态细胞的转化。将细胞在冰上解冻。使用45μl/转化，并将2μl B-ME添加到每个小瓶中。然后，添加3μl DpnI消化的PCR产物，并在冰上在15ml BD管中孵育30min。此后，将样品热休克40秒并在冰上孵育2min。接下来，添加950μl SOC培养基，随后在37℃下在振荡培养箱中孵育1.5h。最后，将细胞铺板在LB-carb-板上并在37℃下孵育过夜。第二天，挑选单菌落用于DNA-微量制备和序列分析。
将所有构建体亚克隆到新的载体背景中以确保序列是正确的。为此，用PCR扩增所有构建体，插入G4S-接头，随后用HindIII/EcoRI消化。
储存所得蛋白质。
8.实例7：比较蛋白的生成
(1)无效突变
为了生成用于体内研究的阴性对照蛋白，将一个/两个突变插入到亲本人CD39ΔMIL蛋白(EP28)中。已经在文献中描述了这些突变以去除或降低该蛋白质的酶活性。突变位置是E174A和S218A。
使用以下引物：
表22.引物
| 引物 | 序列 |
| P910 | SEQ ID NO:203 |
| P911 | SEQ ID NO:204 |
| P914 | SEQ ID NO:205 |
| P915 | SEQ ID NO:206 |
使用以下移液方案建立PCR反应：
5μl的10x反应缓冲液、
1μl ds-DNA-模板(储备液浓度100ng/μl)、
1.5μl引物1、
1.5μl引物2、
1μl dNTP混合物
1.5μl QuickSolution公司(QuickSolution)试剂、
35.5μl H2O(终体积为50μl)、和
1μl QuickChange Lightning Enzyme。
使用根据表17的PCR循环参数。
表23.PCR循环参数
反应后直接将2μl DpnI酶添加到每个反应中，混合并在37℃下孵育5min。
如下进行到XL10-金超-感受态细胞的转化。将细胞在冰上解冻。使用45μl/转化，并将2μl B-ME添加到每个小瓶中。然后，添加3μl DpnI消化的PCR产物，并在冰上在15ml BD管中孵育30min。此后，将样品热休克40秒并在冰上孵育2min。接下来，添加950μl SOC培养基，随后在37℃下在振荡培养箱中孵育1.5h。最后，将细胞铺板在LB-carb-板上并在37℃下孵育过夜。第二天，挑选单菌落用于DNA-微量制备和序列分析。
根据以下方案，将正确的序列转染到HEK293细胞中。
使用10μg载体-DNA、0.4μl HindIII(100U/μl，NEB)、2μl EcoRI(20U/μl，NEB)、5μlCutsmart缓冲液10x浓度(NEB)和H2O来制备消化缓冲液至终体积为50μl。将消化反应在37℃下运行3h。
消化后立即运行去磷酸化反应。将牛小肠碱性磷酸酶(10U/μl，CIP，NEB，编号M0290L)添加到(3μl)消化的载体混合物中并在37℃下孵育30min。
将消化的和去磷酸化的载体亚克隆以检查序列。
根据以下方案，将正确的序列转染到HEK293细胞中。
使用以下材料进行7天的表达；1.组成型表达SV40大T抗原的人胚肾细胞(HEK293-T，ATCC11268)；2.聚乙烯亚胺“MAX”MW40.000(PEI)(波利塞斯公司，目录号24765)。
通过在室温(RT)下将1g PEI小心地溶解在900ml细胞培养级水中来制备PEI溶液。然后用NaOH中和，最终pH为7.05。最后，将体积调节至1L并将溶液通过0.22μm过滤器过滤，以等分试样分布并在-80℃下冷冻直至进一步使用。解冻后，等分试样可在-20℃下重新冷冻3次，但不应在-20℃下长期保存。
M11V3无血清培养基(生物概念公司，CH，目录号：V3-K)。
用于瞬时转染的所有细胞培养工作均使用在无血清M11V3培养基中生长的悬浮适应的HEK293-T细胞进行。
对于小规模(<5L)转染，细胞在Corning摇瓶(科宁公司，美国)中在轨道振荡器(100rpm)上在具有5％CO2的加湿CO2培养箱中生长(种子烧瓶)。
通常，种子培养物中的细胞应处于指数生长期(细胞密度在5x 105与3x 106/ml之间)，并且具有>90％的活力。超出该范围的细胞密度将导致分裂后的迟滞期或降低的转染功效。
对于小规模(此处为2L)转染，从种子培养物中取出等分试样的细胞，并将这些细胞用M11V3培养基在36％的终体积中调节至1.4x 106个细胞/ml。
通过在7％终体积M11V3中稀释1mg/L终体积DNA并温和混合来制备DNA溶液(溶液1)。为了预防培养物污染，可以使用0.22μm过滤器(例如Millipore Stericup)过滤该溶液。此处因为体积小，所以尚未进行无菌过滤。然后，将3mg/L终体积PEI溶液在7％终体积M11V3中稀释并温和混合(溶液2)。将两种溶液在室温(RT)下孵育5-10min。此后，在温和混合下将溶液2添加到溶液1中，并在RT下再孵育5-15分钟(在孵育期间不要再混合，因为PEI将DNA覆盖/浓缩成带正电荷的颗粒，这些颗粒与阴离子细胞表面残留物结合并通过胞吞作用进入细胞)。孵育后，将转染混合物添加到细胞中，并将培养物培养四小时(10rpm，37℃，6％CO2)。
最后，根据以下实例用剩余的50％终体积M11V3培养基进料培养物：接种体积：36ml，其中1.4x 106个细胞/ml。
溶液1：含有100μg质粒DNA的7ml M11V3培养基。溶液2：含有300μg PEI(300μl)的7ml M11V3培养基
进料：50ml M11V3，总共100ml。
根据以下使用固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化蛋白质。使用95ml上清液(保留全部的约4ml用于分析(IPC))。
使用的材料：
镍-NTA琼脂糖(凯杰公司，目录号/ID：30230)、Poly-Prep色谱柱(空，伯乐公司(BioRad)，编号731-1550)、IMAC A缓冲液pH 7.4(含有20mM NaPO4缓冲液和50mM咪唑)。IMAC B缓冲液pH 7.4(含有20mM NaPO4缓冲液和300mM咪唑)。TBS(10x浓度，用MilliQ水稀释至1x浓度)。Amicon Ultra-4离心过滤单元，具有Ultracel-10膜，10K，UFC 801096。
方法步骤：
1.用1ml凯杰公司(＝0.5ml CV)的镍-NTA-琼脂糖制备柱；
2.用10CV IMAC A平衡；
3.在柱上加载15/45ml SN(收集流过物)；
4.用10CV IMAC A洗涤(收集在15ml Falcon管中)；
5.在6.5CV的IMAC B中洗脱；
6.洗脱液浓度的确定；
7.用Amicon Ultra-4离心过滤单元10K将3.5ml样品浓缩至约400μl；
8.通过添加TBS和离心5000进行缓冲液交换；
使用具有40μl每种样品的分析SEC并使用具有12μl每种样品的蛋白质凝胶分析样品。
储存所得蛋白质。
(2)plusMIL
用重叠延伸PCR进行具有膜相互作用环(aa193-204)的EP14aa1-3的克隆。
使用以下引物：
表24.引物
| 引物 | 序列 |
| FW | SEQ ID NO:207 |
| REV | SEQ ID NO:208 |
| 反义 | SEQ ID NO:98 |
使用以下移液方案建立PCR反应：
1.2μl Phusion热启动聚合酶、
24μl 5x HF-缓冲液、
0.96μl 100mM dNTPs(每种dNTP的25mM)、
0.6μl Fw引物、
0.6μl Rev引物、
92.64μl DEPC H2O。
使用根据表17的PCR循环参数。
表25.PCR循环参数
反应后直接将2μl DpnI酶添加到每个反应中，混合并在37℃下孵育2h。
通过将2μl PCR产物转移到96孔PCR板并在冰上冷却，来进行转化。添加20μlSTELLAR化学组分细菌，并通过上下移液一次小心地混合。将样品在冰上孵育30min，然后在42℃下在PCR仪中孵育45sec，随后在冰上再孵育60sec。最后，添加90μl SOC培养基并在37℃下孵育1hr。将整个转染混合物铺板在LB-氨苄青霉素或LB-羧苄青霉素板上，并在37℃下生长过夜。
储存所得蛋白质EP14_plusMIL，该蛋白质具有根据SEQ ID NO:155的氨基酸序列。
9.实例8：酶活性
使用酶活性测定表征在先前实例中生成的候选物。
使用以下试剂：Pi游离缓冲液，无磷酸盐的生理盐水溶液(140mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，2mM CaCl2，10mM Hepes，pH 7.4)；和Pi游离缓冲液+2％BSA，具有20mg/ml BSA的无磷酸盐的生理盐水溶液；CD39蛋白(根据SEQ ID NO:1)；ATP。
以2μg/ml制备重复的CD39溶液。从15μl ATP储备液+1185μl缓冲液(总共1.2ml)中以1000μM制备重复的ATP溶液。
通过将60μl ATP与60μl CD39或60μl含Pi游离缓冲液混合用于对照，在填充有120μl终/孔的48孔PCR板中研究酶反应。终浓度为500μM ATP和1μg/ml CD39。
将样品在37℃下分别孵育0、5、15、30、60、90和150分钟。然后，通过Pi释放测定或HPLC评估样品。
(1)Pi释放测定
(a)材料与方法
根据制造商的说明，从标准Pi检测试剂盒制备试剂。
通过在水中的稀释制备具有Pi的标准曲线。制备1:2系列稀释的Pi储备液(100μM)：450μl+450μl水。标准曲线浓度为：50μM/25μM/12.5μM/6.25μM/3.1μM/1.5μM/0μM。
制备金试剂混合物：4ml金试剂+40μl加速剂(用于3个板)。在96孔板中，将样品在H2O中1:10稀释(在水中稀释：10μl样品+90μl H2O)。将50μl，1:10稀释的样品分布在96个半区域孔板(科宁公司，3690)的每个孔中。将12.5μl金试剂混合物添加到每个孔中(25％样品体积)，并将样品在室温下孵育10min。在635nm处读取吸光度。
(b)结果和解释
候选物的比较结果显示在表26中。
表26.候选物的比较结果。
通过将500μM ATP添加到酶中并用HPLC(方法描述如下)随时间分析ATP、ADP、AMP的浓度来测量酶活性。所得的动力学曲线拟合图6中的模型以获得酶常数。就酶常数Kcat而言，这些酶显示以下顺序(低活性至高活性)：EP28(wt)、EP17、EP14、EP15。
图7显示了EP28的动力学数据和模型拟合。图8显示了EP14的动力学数据和模型拟合。图9显示了EP15的动力学数据和模型拟合。
EP28(wt)、EP14、EP15和EP17的酶常数概述显示在表27中。与野生型(WT)相比，三种新型变体显示出增加的催化活性。重要的是，这些新变体显示出催化速率常数(kcat)、催化效率(kcat/Km)的明显增加。由于在组织损伤和血栓形成期间报告的ATP和ADP底物浓度高于报告的Km，所以kcat和kcat/Km的这种增加可能转化为更高的体内活性。
表27.酶常数
(2)HPLC验证测定(动力学和剂量响应)
(a)材料与方法
用HPLC验证测定测试候选物。将70μl的每种样品转移到用于HPLC的玻璃小瓶中。
如表28所示，用5mM的储备溶液制备校准样品。
表28.储备溶液
| 5mM | 重量 | H<sub>2</sub>O | |
| 腺苷 | 1336.2μg/mL | 1.862mg | 1394μL |
| 肌苷 | 1341.2μg/mL | 2.668mg | 1989μL |
| AMP | 1736.1μg/mL | 2.182mg | 1257μL |
| ADP | 2506.6μg/mL | 2.500mg | 997μL |
| ATP | 2755.7μg/mL | 4.834mg | 1754μL |
使用具有毛细管泵(CapPump)(G1376A)、脱气器(G1379A)、ALS(G1329A)、恒温器(G1330B)、ColComp(G1316A)和DAD(G1315A)的安捷伦公司1100系统进行HPLC分离。溶剂A：10mM KH2PO4(04243，Riedel-de
)+2mM TBA溴化物，pH 7.0(86857-10G-F，佛鲁卡公司(Fluka))和溶剂B：10mM KH2PO4/ACN1/1+2mM TBA溴化物，pH 5.5。柱：Nucleodur 300-5C18ec，2x 150mm，5μm，Macherey-Nagel公司(Macherey-Nagel)760185.20批次E1410025836654055。柱温为40℃，注射体积为10μL，流速为0.3ml/min，以及梯度为0-3'：0％B；3-23'：0-95％B，线性；23-28'：95％B，线性；28-29'：95-0％B，线性；5'后时间"。DAD：247nm和259nm。
使用Waters UPLC I class类进行UPLC分离。溶剂A：10mM KH2PO4/10mM K2HPO4 1/1+2mM TBA溴化物，pH 7.0。溶剂B：10mM KH2PO4/ACN 1/1+2mM TBA溴化物，pH 5.5。柱：福蒂斯生物公司(Fortis Bio)C18，2.1x 50mm，5μm，di2chrom BIO318-020301SN H03161210-2。柱温为40℃，注射体积为10μL，流速为0.5ml/min，以及梯度为0-1'：0％B；1-8'：0-55％B，线性；8-10'：55％B；10-11'：55-0％B，线性；14'停止时间。DAD是247nm和259nm。
(b)结果
结果可以见于图7、8、9和11中，显示了根据不同实施例的候选物的动力学数据和模型拟合。
10.实例9：体外活性，初始筛选
将先前实例中描述的CD39版本EP1至EP24克隆到哺乳动物表达载体pRS5a_前导序列_APP_His(图5)中，不含IL2-前导序列且不含IL2-起始。
(a)材料与方法
在HEK293(PEI-转染)中进行7天EP-Hits的小规模表达(20/50ml规模)，随后在APP-HPLC上进行IPC(如上所述)。
用Ni-NTA柱(0.5ml CV)对15/45ml细胞上清液进行蛋白质纯化；
用6CV IMAC B缓冲液(20mM NaPO4-缓冲液，300mM咪唑，pH7.4)洗脱；
在TBS，pH 7.4中浓缩和再缓冲纯化的蛋白；
用蛋白质凝胶、分析SEC对蛋白质进行分析；
所有变体和三个对照(亲本hCD39-dMIL，或含有和不含IL2-起始的EP28，以及不含IL2-起始的8M-版本)的递送：在TBS，pH 7.4中90-200ul的纯化的蛋白
(b)结果和解释
结果总结在下表29中。
所有样品均在TBS pH 7.4中并且具有APP-(SEQ ID N:247)和His-标签(SEQ IDNO:249)。
仅亲本人CD39ΔMIL(EP28)具有15个氨基酸长的IL2-起始，aa1-15(SEQ ID NO:133)。
Pi释放测定BOENKTH1-0252824，双重检测。持续60min和180min。值
表29.体外活性
Pi释放测定，0.25
ug/ml+500uM ATP
11.实例10：体外活性，精致筛选
第二次测试了12个突变体的子集，但含有IL-2起始允许更大的表达规模。
(a)材料与方法
哺乳动物表达载体pRS5a_前导序列_APP_His，具有15个氨基酸长的IL2-起始，aa1-15(SEQ ID NO:133)(图5)。在HEK293(PEI-转染)中持续7天的EP-Hits的小规模表达(50/100ml规模)，随后在APP-HPLC上进行IPC(如上所述)。
用Ni-NTA柱(0.5ml CV)对45/95ml细胞上清液进行蛋白质纯化
用6CV IMAC B缓冲液(20mM NaPO4-缓冲液，300mM咪唑，pH7.4)洗脱；
在TBS，pH 7.4中浓缩和再缓冲纯化的蛋白，
用蛋白质凝胶、分析SEC对蛋白质进行分析；
所有变体和对照(亲本hCD39-dMIL、或EP28(含有IL2-起始aa1-15(SEQ ID NO:133))的递送：
在TBS，pH 7.4中500ul的纯化的蛋白
(b)结果和解释
结果总结在下表30、表31和表32中。
表30.EP-Hits 06.07.2016的蛋白质纯化，第1部分
表31.EP-Hits 06.07.2016的蛋白质纯化，第2部分
表32.蛋白质纯化EP-Hits 15.07.2016
表33.点突变，与根据SEQ ID NO:1的野生型CD39序列相关。
12.实例11：体内活性，pK
(a)材料与方法
对于体内PK，经由尾静脉向4只清醒的雌性C57BL/6小鼠静脉内(1ml/kg)施用PBS缓冲液中终浓度为10mg/ml的10mg/kg化合物。小鼠获自WIGA获得并且体重约22g。所有生命工作都是根据瑞士动物福利法(Swiss animal welfare law)进行的。
使用POCT Minivettes，在小体积血清管中在给药后0.25、3、8、24和48h收集全血(每个时间点50μL)。分离血清并用于浓度确定。
Gyrolab技术是使用亲和流通物形式的纳米级自动化免疫测定，其通过离心力和激光诱导的荧光检测起作用。将链霉亲和素包被的珠预包装在Gyrolab Bioaffy CD上的亲和柱中。每个CD含有112个柱。每个微结构的亲和捕获柱包含15nl。注射的样品通过毛细作用进入。生物素化的捕获试剂与链霉亲和素包被的珠结合。然后，注射分析物溶液，其与捕获的分子结合。最后，应用荧光团标记的检测试剂。在CD39的情况下，取决于APP标签的可用性，使用两种不同的测定读数。
1)抗-CD39(40035)和抗-APP(27431)见于图10A中。
2)Fab(40035)和抗-Fc/抗-CD39(40044)1:1预混合物(所有EP28aa1-16构建体)见于图10B中。当通过胺偶联被生物素化时，抗体40044丧失活性，因此，仅抗体40035被生物素化。
将CD39构建体的所有标准曲线在含有5％(v/v)小鼠血清的Rexxip A中以1:2的稀释系列稀释。APP标记构建体的应用浓度范围为5000ng/ml-9.77ng/ml，并且EP28aa1-16的应用浓度范围为10000ng/ml-9.77ng/ml。将所有小鼠血清样品在含有5％(v/v)小鼠血清的Rexxip A中以1:100稀释。将CD39构建体的QC样品在含有5％(v/v)小鼠血清的Rexxip A中稀释(对于具有APP标签的构建体为50和500ng/ml，对于EP28aa1-16为500和1000ng/ml)。所有生物素化的捕获试剂的终浓度为0.1mg/ml，并且将荧光标记的检测抗体在Rexxip F中稀释至10nM。
(b)结果和解释
结果总结在表33中。可以看出，所有候选物都显示出相同的PK。因此，候选物的选择不是基于PK特性。
表34.pK值
13.实例12：体内活性，AKI模型
(a)材料与方法
在I/R设置开始之前进行右肾的肾切除术。去除第二肾以避免改变生物学的整个动态的补偿机制。将自主呼吸麻醉的动物置于恒温监测系统的恒温毯上并用无菌纱布覆盖。通过直肠探针记录体温并控制在36.5℃-37.5℃的范围内以避免体温过低。对动物进行麻醉、剃毛和消毒(Betaseptic)。在中线切开/剖腹术之后，将腹部内容物缩回到左侧并去除右侧肾。将输尿管和血管断开并结扎(9-0爱惜康公司(Ethicon))，然后去除肾脏。
I/R损伤诱导：在右肾的肾切除术后立即将腹部内容物缩回到右侧，并且解剖左肾动脉游离用于肾缺血诱导。
微动脉瘤夹用于夹持肾蒂以阻断血液流向肾脏并诱导肾缺血。肾缺血的持续时间从夹持的时间开始。通过几秒钟内肾脏从红色到深紫色的颜色变化证实了成功缺血。缺血后，去除微动脉瘤夹并通过肾脏颜色变为红色来表明再灌注。
(b)结果和解释
结果见于图12中。候选物显示出体内剂量响应，这与它们具体的体外活性相关。图12A显示了亲本EP28的结果，图12B显示了EP1xEP17的结果，图12C显示了EP14的结果。可以看出，EP28和EP1xEP17显示了相似的剂量响应，而具有较高体外活性的EP14在更低剂量下显示出完全功效。
14.实例13：滴度、产率和可展性
为了以商业规模制造选择的候选物，重要的是能够以相对高的产率表达它们。治疗蛋白与治疗抗体相比可能不是那么简单，因为除了缺乏能够选择高产克隆的富集技术之外还存在形式复杂性。
EP14aa1-3和EP28aa1-3这两种候选物具有可比较的技术特征，这是具有挑战性的。特别地，早期表达批次(数据未显示)的低表达滴度影响生产成本，或者由于对宿主细胞蛋白质的控制不稳健，甚至可能在扩大规模后甚至更低。
为了通过两种候选物的早期克隆选择来尝试改善蛋白质表达，需要定制的纯化工艺。为此，生成表达候选物EP28aa1-3和EP14aa1-3的细胞库。
将亲本CHO细胞系用作宿主细胞系，用于产生表达EP28aa1-16/EP14aa1-3的细胞系。宿主细胞系衍生自本领域技术人员熟知的CHO-K1细胞系，其方式描述于例如专利申请WO 2015092737和WO 2015092735中，将两者通过援引以其全文并入本文。来自CHO系的单个小瓶用于制备EP28aa1-16/EP14aa1-3重组细胞系。
细胞在化学成分确定的培养基中生长。每次转染添加一μg的SwaI线性化的质粒DNA、编码EP28aa1-16/EP14aa1-3的表达载体。转染反应在化学成分确定的培养基中进行。
根据制造商的说明，使用AMAXA Gene Pulser通过电穿孔进行转染。用于转染的亲本CHO细胞处于指数生长期，具有高于95％的细胞活力。总计，用5x 106个细胞/转染进行三次转染。转染后立即将细胞转移到含有中等大小的化学成分确定的培养基的摇瓶中。
在开始选择过程之前，将细胞库在36.5℃和10％CO2下孵育48小时。使用在表达载体中编码的选择标记进行选择程序。在低叶酸条件下转染和生长48小时后，通过向化学成分确定的培养基中添加10nM MTX来施加另外的选择压力。在MTX选择开始后21天，出现了主要由MTX抗性细胞组成的库群。库回收后冷冻细胞。在化学成分确定的培养基中设置标准进料批次用于确定EP28aa1-16/EP14aa1-3的浓度。反相色谱(RPC)用于确定产物浓度。将产生EP28aa1-16/EP14aa1-3的CHO细胞库用于FACS单细胞分选/细胞印制程序以获得个性化的克隆细胞系。
15.实例14：治疗用途
激活P2X7R的细胞外ATP已明确地与若干种疾病相关联，如增强移植物抗宿主病(Wilhelm等人,Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATPactivating P2X7R.[激活P2X7R的细胞外ATP增强移植物抗宿主病],Nature Medicine[自然医学]16:12,第1434-1439页,(2010))。
此外，体外和体内研究均表示CD39通过调节ADP的水平代表心血管健康中重要的腺三磷双磷酸酶。已知腺三磷双磷酸酶通过代谢细胞外ADP来抑制血小板聚集。
与其他疗法(像氯吡格雷(PlavixTM))相反，人腺三磷双磷酸酶不与血小板共价结合，其不可逆地与血小板上的ADP受体结合。这允许治疗阻断的更快消失，并因此允许对于血小板活化过度的患者更安全的方法。这为血小板活化过度的患者提供了更安全的方法。
因此，对于降低细胞外ATP水平的化合物(如，根据本发明的化合物)的治疗用途存在明确的基础。
根据本发明的化合物的治疗用途的具体非限制性实例是由于创伤和/或缺氧引起的急性器官损伤，如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺损伤、肾功能衰竭、急性肾损伤(AKI)(包括冠状动脉旁路移植手术后的急性肾损伤)、肾脏或其他实体器官移植(包括异种器官移植)后的移植物功能延迟，或血管疾病(如闭塞性血管疾病)，移植和异种器官移植，治疗患有由以下引起的中风、冠状动脉疾病或损伤的个体：心肌梗塞、动脉粥样硬化、动脉硬化、栓塞、子痫前期、血管成形术、血管损伤、移植、新生儿缺氧缺血性脑病，血小板相关的缺血性疾病(包括肺缺血、冠状动脉缺血和脑缺血)，缺血再灌注损伤(IRI)血栓性疾病(包括冠状动脉血栓形成、脑动脉血栓形成、心内血栓形成、外周动脉血栓形成、以及静脉血栓形成)，肾脏或其他实体器官移植(包括异种器官移植)后的移植物功能延迟。根据本发明的化合物的治疗用途的其他非限制性实例是治疗烧伤或辐射损伤、败血症，改善伤口愈合，减少出血或出血风险，预防器官损伤、移植物抗宿主病或预防移植排斥。
特别地，根据本发明的化合物的优选治疗用途是急性肾损伤(AKI)，如冠状动脉旁路移植手术或败血症或横纹肌溶解术后的急性肾损伤。这种情况增加患者的死亡率，并且没有标准护理(SoC)。重症监护病房中AKI的主要原因是：败血症(47.5％)、大手术(34％)、心源性休克(27％)、血容量不足(26％)和肾毒性化合物(19％)。此外，AKI是发展为慢性肾病(CKD)的独立强风险因素。20％-30％的主要心脏手术患者获得急性肾损伤。另一个优选实施例涉及分离的根据本发明的腺三磷双磷酸酶用于治疗心脏手术相关的急性肾损伤的用途。
在另一个实施例中，本披露涉及分离的根据本发明的腺三磷双磷酸酶，该腺三磷双磷酸酶用于治疗移植物功能延迟(DGF)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性心肌梗死(AMI)、创伤性脑损伤(TBI)/急性缺血性中风(AIS)、或通常被称为多器官衰竭(MOF)的其组合。16.急性肾损伤(AKI)是败血症的常见并发症。28％的败血症患者获得AKI。在另外的优选实施例中，本披露涉及根据本发明的分离的腺三磷双磷酸酶用于治疗败血症相关的急性肾损伤的用途。实例15：治疗组合物
治疗蛋白通常被配制成水性形式以备施用或者配制成冻干物以在施用前与适合的稀释剂重构。蛋白质可以被配制成冻干物，或配制成水性组合物，例如在预填充注射器中。
适合的制剂可以提供水性药物组合物或冻干物，该冻干物可以重构以给出具有高浓度的治疗蛋白活性成分和低水平的蛋白质聚集的溶液用于递送至患者。高浓度的蛋白质之所以有用，是因为高浓度降低了必须被递送给患者的材料量(剂量)。降低的给药体积使得向患者递送固定剂量所花费的时间降至最低。具有高浓度蛋白质的本发明的水性组合物特别适合皮下施用。
因此，本发明提供了适用于在受试者中施用(例如用于皮下施用)的水性药物组合物，该水性药物组合物包含治疗蛋白。
当与药学上可接受的运载体组合时，治疗蛋白可以用作药物组合物。除治疗蛋白外，这种组合物可含有运载体、各种稀释剂、填料、盐、缓冲液、稳定剂，增溶剂和本领域熟知的其它材料。运载体的特征将取决于施用途径。在所披露的方法中使用的药物组合物还可以含有用于治疗特定靶向障碍的另外的治疗剂。
17.实例16：施用途径
通常，例如通过静脉内、腹膜内或皮下注射来施用根据本发明的蛋白质。完成此施用的方法是本领域普通技术人员已知的。还可能获得可以局部或口服施用的组合物，或者能够透过黏膜传递的组合物。如本领域技术人员所理解的，可以使用任何适合的施用方式，如适合于特定的所选施用途径。
可能的施用途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内(I.V.或IV)、肌内(IM)、真皮内、皮下(S.C.或SC)、或输注)、口服和肺(例如吸入)、经鼻、经皮(局部)、经黏膜、动脉内、持续输注、以及直肠施用。被用于胃肠外、真皮内、或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；并且用于调节渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
可以通过向需要疗法的受试者施用根据本发明的蛋白质的“负荷剂量”来启动腺三磷双磷酸酶疗法。“负荷剂量”旨在施用于受试者的根据本发明的蛋白质的初始剂量，其中施用的根据本发明的蛋白质的剂量落入更高给药范围内。“负荷剂量”可以单次施用，例如，单次输注，其中IV施用蛋白质，或多次施用，例如，多次输注，其中IV施用蛋白质，只要在约24小时的时间段内(或基于疾病的严重程度，如果需要多次静脉内施用的话，则在第一个月内)施用完整的“负荷剂量”。施用“负荷剂量”后，再向受试者施用一个或多个另外的治疗有效剂量的根据本发明的蛋白质。可以例如根据每周给药方案、或者每两周一次、每三周一次或每四周一次施用后续治疗有效剂量。在这类实施例中，后续治疗有效剂量通常落在更低给药范围内。
可替代地，在一些实施例中，在“负荷剂量”后，根据“维持方案”施用后续治疗有效剂量的根据本发明的蛋白质，其中施用治疗有效剂量的根据本发明的蛋白质每月一次、每6周一次、每两个月一次、每10周一次、每三个月一次、每14周一次、每四个月一次、每18周一次、每五个月一次、每22周一次、每六个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次或者每12个月一次。在这类实施例中，根据本发明的蛋白质的治疗有效剂量落在更低给药范围内，特别是以更高频率间隔(例如每两周一次至每月一次)施用后续剂量时，或者落在更高给药范围内，特别是以更低频率间隔施用后续剂量时，例如，在间隔一个月至12个月施用后续剂量的情况下。
给药的时间通常从第一剂量活性化合物的当天(也称为“基线”)测量。然而，不同的医疗服务人员使用不同的命名惯例。
值得注意的是，一些医疗服务人员可能称第零周为第1周，而一些医疗服务人员可能称第零天为第一天。因此，有可能不同医师将指明剂量例如在第3周/在第21天期间、在第3周/在第22天期间、第4周/在第21天期间、第4周/在第22天期间给予，而指的是相同给药时间表。为了一致性，给药的第一周将在本文中称为第0周，而给药的第一天将被称为第1天。然而，本领域技术人员将理解，该命名规则仅用于一致性并且不应被解释为限制，即，每周给药是提供每周剂量的蛋白质，无论医生是否参考特定的一周为“第1周”或“第2周”。如本文所述的剂量方案的实例见图1和图2。应理解，无需在精确时间点提供剂量，例如大约预定在第29天的剂量可例如在第24天至第34天(例如第30天)提供，只要提供在适当的星期中即可。
如本文所使用的，短语“具有足够量的蛋白质的容器以允许[指定剂量]的递送”用于表示给定容器(例如，小瓶、笔、注射器)已在其中配置可用于提供所需剂量的一定体积的蛋白质(例如，作为药物组合物的一部分)。作为一种实例，如果所希望的剂量是500mg，那么临床医生可能使用来自含有浓度为250mg/ml的蛋白质配制品的容器中的2ml、来自含有浓度为500mg/ml的蛋白质配制品的容器中的1ml、来自含有浓度为1000mg/ml的蛋白质配制品的容器中的0.5ml等。在每个这样的情况下，这些容器具有足够量的蛋白质以允许递送所希望的500mg的剂量。
如本文所使用的，短语“以允许[施用途径]递送[指定剂量]的剂量配制”用于表示给定的药物组合物可用于通过指定的施用途径(例如s.c.或i.v.)提供所需剂量的蛋白质。作为一种实例，如果所希望的皮下剂量是500mg，那么临床医生可能使用具有浓度为250mg/ml的2ml蛋白质配制品、具有浓度为500mg/ml的1ml蛋白质配制品、具有浓度为1000mg/ml的0.5ml蛋白质配制品等。在每个这样的情况下，这些蛋白质配制品处于足够高的浓度以允许皮下递送蛋白质。皮下递送通常需要递送小于约2ml的体积，优选约1ml或更小的体积。然而，可以使用例如贴片/泵机制随时间递送更高的体积。
本文披露了蛋白质用于制造治疗患者中的组织损伤的药物的用途，其中该药物被配制成包含容器，每个容器具有足够量的蛋白质以允许每单位剂量递送至少约75mg、150mg、300mg或600mg的蛋白质。
本文披露了蛋白质用于制造治疗患者中的组织损伤的药物的用途，其中该药物以一定剂量被配制以允许每单位剂量全身递送(例如，i.v.或s.c.递送)75mg、150mg、300mg或600mg的蛋白质。
18.实例17：试剂盒
本披露还涵盖用蛋白质治疗患有组织损伤(视情况而定)的患者的试剂盒。此类试剂盒包含蛋白质(例如，以液体或冻干形式)或包含该蛋白质(如上所述)的药物组合物。另外，此类试剂盒可包含用于施用蛋白质的装置(例如注射器和小瓶、预填充注射器、预填充笔、贴片/泵)及使用说明书。说明书可以披露将蛋白质作为具体给药方案的一部分提供给患者。这些试剂盒还可以含有用于治疗银屑病，例如用于与所装入的蛋白质组合递送的另外的治疗剂(如上所述)。
短语“施用装置”用于表示向患者全身性地施用药物的任何可用器具，包括但不限于预填充注射器、小瓶及注射器、注射笔、自动注射器、静脉内滴注器和袋、泵、贴片/泵等。使用这些物品，患者可自施用药物(即自行施用药物)，或可由护理给予者或医师施用药物。
本文披露了用于治疗患有组织损伤的患者的试剂盒，这些试剂盒包含：a)药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的蛋白质；b)用于向患者施用蛋白质的装置；和c)说明书，该说明书提供了向有需要的患者皮下施用蛋白质。
序列表
表34中披露了用于实施本发明的有用的氨基酸和核苷酸序列。
表35.用于实施本发明的序列。
Claims (28)
1.一种溶解的人腺三磷双磷酸酶，其具有至少两个修饰，这些修饰选自由以下组成的列表：N末端缺失、C末端缺失和中心修饰。
2.如权利要求1所述的溶解的人腺三磷双磷酸酶，该溶解的人腺三磷双磷酸酶具有N末端缺失、C末端缺失和中心修饰。
3.如权利要求1或2所述的溶解的人腺三磷双磷酸酶，其中
a)该N末端缺失长度在30与50个氨基酸之间，
b)该C末端缺失长度在20与40个氨基酸之间，和
c)该中心修饰包含缺失和/或点突变。
4.如前述权利要求中任一项所述的溶解的人腺三磷双磷酸酶，其中该中心修饰包含10至15个连续氨基酸的缺失。
5.如权利要求4所述的溶解的人腺三磷双磷酸酶，其中该中心缺失是与根据SEQ IDNO:1的野生型CD39序列相关的氨基酸编号193至204的缺失。
6.如前述权利要求中任一项所述的溶解的人腺三磷双磷酸酶，其中该中心修饰包含点突变，该点突变包含与根据SEQ ID NO:1的野生型CD39序列相关的一个、两个、三个、四个或五个点突变，所述点突变选自由以下组成的组：K71E、N73Q、V95A、G102D、Y104S、T106S、R113M、L149M、V151A、E173D、T229A、L254M、K258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、I319T、N327Q、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412F、L424Q、H436D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P463S、和S469R。
7.如前述权利要求中任一项所述的溶解的人腺三磷双磷酸酶，该溶解的人腺三磷双磷酸酶包含如下序列，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76、和SEQ ID NO:78。
8.如前述权利要求中任一项所述的溶解的人腺三磷双磷酸酶，该溶解的人腺三磷双磷酸酶包含如下序列，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:141。
9.如权利要求8所述的溶解的人腺三磷双磷酸酶，该溶解的人腺三磷双磷酸酶包含如下序列或由如下序列组成，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:221、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:229。
10.如权利要求9所述的溶解的人腺三磷双磷酸酶，该溶解的人腺三磷双磷酸酶由如下序列组成，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:229。
11.一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效剂量的如权利要求1至10中任一项所述的腺三磷双磷酸酶、和一种或多种药学上可接受的运载体。
12.如权利要求11所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含一种或多种另外的活性成分。
13.一种分离的如权利要求1至10所述的腺三磷双磷酸酶，该分离的腺三磷双磷酸酶用作药物。
14.一种分离的如权利要求1至10所述的腺三磷双磷酸酶，该分离的腺三磷双磷酸酶用于治疗组织损伤。
15.用于根据权利要求14所述使用的分离的腺三磷双磷酸酶，其中该组织损伤是急性脑损伤(中风)；急性多器官衰竭；肾脏或其他实体器官移植后移植物功能延迟；烧伤；辐射损伤；由于创伤和/或缺氧引起的急性损伤，如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或肺损伤；急性肾损伤，如继发于胸外科手术(例如主动脉瓣置换术、冠状动脉旁路手术)或败血症或横纹肌溶解症或抗生素或其他药物的毒性作用的急性肾损伤；急性心肌损伤。
16.一种分离的如权利要求1-10所述的腺三磷双磷酸酶，该分离的腺三磷双磷酸酶用于治疗心脏手术相关的急性肾损伤。
17.一种分离的如权利要求1-10所述的腺三磷双磷酸酶，该分离的腺三磷双磷酸酶用于治疗移植物功能延迟(DGF)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性心肌梗死(AMI)、创伤性脑损伤(TBI)/急性缺血性中风(AIS)、缺血再灌注损伤(IRI)、或通常被称为多器官衰竭(MOF)的其组合。
18.一种分离的如权利要求1-10所述的腺三磷双磷酸酶，该分离的腺三磷双磷酸酶用于治疗败血症相关的急性肾损伤。
19.一种治疗人受试者中的组织损伤的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的溶解的人腺三磷双磷酸酶。
20.如权利要求19所述的方法，其中该溶解的人腺三磷双磷酸酶是如权利要求1至10所述的腺三磷双磷酸酶。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中该组织损伤是急性脑损伤(中风)；急性多器官衰竭；肾脏或其他实体器官移植后移植物功能延迟；烧伤；辐射损伤；由于创伤和/或缺氧引起的急性损伤，如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或肺损伤；急性肾损伤，如继发于胸外科手术(例如主动脉瓣置换术、冠状动脉旁路手术)或败血症或横纹肌溶解症或抗生素或其他药物的毒性作用的急性肾损伤；急性心肌损伤。
22.一种治疗心脏手术相关的急性肾损伤的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效剂量的溶解的人腺三磷双磷酸酶。
23.一种治疗移植物功能延迟(DGF)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性心肌梗死(AMI)、创伤性脑损伤(TBI)/急性缺血性中风(AIS)、缺血再灌注损伤(IRI)、或通常被称为多器官衰竭(MOF)的其组合的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效剂量的溶解的人腺三磷双磷酸酶。
24.一种治疗败血症相关的急性肾损伤的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效剂量的溶解的人腺三磷双磷酸酶。
25.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码如权利要求1至10中所述的任何腺三磷双磷酸酶。
26.一种克隆载体或表达载体，该克隆载体或表达载体包含一种或多种如权利要求25所述的核酸序列，其中该载体适用于分离的如权利要求1至10中所述的腺三磷双磷酸酶的重组产生。
27.一种宿主细胞，该宿主细胞包含一种或多种如权利要求26所述的克隆载体或表达载体。
28.一种用于生产如权利要求1至10中任一项所述的腺三磷双磷酸酶的方法，该方法包括培养如权利要求27所述的宿主细胞，纯化和回收所述腺三磷双磷酸酶。
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